JP6059017B2 - ゼラチナーゼによるＥｐｈＡ４の切断反応を指標としたスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、ゼラチナーゼ(MMP-2又はMMP-9)によるEphA4の切断反応を指標としたスクリーニング方法に関する。

Eph receptor A4（EphA4）は、レセプター型チロシンキナーゼファミリーの一つであり、ポストシナプスの形態形成を制御している分子である。EphA4のノックアウト、又はドミナント−ネガティブ（dominant negative）変異体の発現により、樹状突起の上に小さなとげ状の隆起であるスパイン（spine）の数が減少し、スパインの形が細長くなることが知られている（非特許文献１）。記憶や学習の過程がスパインの数や形に反映されていることは一般的に提唱されている。

最近、このEphA4がγ-セクレターゼにより切断を受け、切断された細胞内断片が低分子量GTP結合蛋白質であるRacを活性化させ、スパイン形成を促進させることが明らかにされている（特許文献１，２、非特許文献２）。γ−セクレターゼの基質は、まず、当該基質の細胞外領域が別のプロテアーゼにより切断され、その後、γ−セクレターゼにより切断される。EphA4の細胞外領域の切断は、神経活動依存的に誘導されることが知られている（非特許文献２）。一方、この一連の切断プロセスにおいて、最初の細胞外領域の切断反応が律速ステップであることが知られている。

EphA4の細胞外領域を切断する酵素であるMMP（matrix metalloproteinase）ファミリーは、classical MMPファミリーとADAMファミリーに分別され、全て含めると、50種類近くに及ぶ。NotchやAPPなど、多くのγ−セクレターゼの基質は、ADAM proteaseにより切断されていることが知られている（非特許文献３）。MMPファミリーの中のclassical MMPに分類される分子の中で、ゼラチナーゼ（gelatinase）ファミリーに属する MMP-2とMMP-9は、中枢神経系で高い発現を示し、神経活動依存的に活性化され、スパイン形成に関与することが知られている（非特許文献４）。
しかしながら、ゼラチナーゼファミリーとEphA4との関係については、一切報告されておらず、EphA4がゼラチナーゼファミリー分子に切断されるかについては、まったく明らかにされていない。

国際公開2008/150010号パンフレット 国際公開2009/069808号パンフレット

Murai KK, Nguyen LN, Irie F, Yamaguchi Y, Pasquale EB. Control of hippocampal dendritic spine morphology through ephrin-A3/EphA4 signaling. Nat Neurosci. 2003 Feb;6(2):153-60. Inoue E, Deguchi-Tawarada M, Togawa A, Matsui C, Arita K, Katahira-Tayama S, Sato T, Yamauchi E, Oda Y, Takai Y. Synaptic activity prompts gamma-secretase-mediated cleavage of EphA4 and dendritic spine formation. J Cell Biol. 2009 May 4;185(3):551-64. Landman N, Kim TW.. Got RIP? Presenilin-dependent intramembrane proteolysis in growth factor receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 2004 Oct;15(5):337-51. Ethell IM, Ethell DW. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 2007 Oct;85(13):2813-23.

本発明は、ゼラチナーゼファミリー分子(MMP-2, -9)によるEphA4の切断反応を指標としたスクリーニング方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、海馬初代培養神経細胞内で神経活動依存的に誘導されるEphA4の細胞外領域の切断反応がゼラチナーゼ(MMP-2, -9)選択的剤阻害剤mmp-2/9 Inhibitor IIにより完全に阻害されることを見出し、これを利用して、γ-セクレターゼを通じてEphA4のプロセシングを増加又は減少させる化合物をスクリーニングし、あるいは、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片を通じてスパイン形成を増加又は減少させる化合物をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（ａ）ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片を含む第１の生物学的組成物と、EphA4を含む第２の生物学的組成物とを、候補物質の存在下及び非存在下で接触させ、
（ｂ）EphA4の細胞外領域及び/又は細胞内領域の断片の存在又は量を測定し、そして
（ｃ）候補物質の存在下における前記（ｂ）の測定結果が、候補物質の非存在下における前記（ｂ）の測定結果と比較して変化したときは、前記候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質として選択すること、
を含む、前記方法を提供する。

本発明において、前記（ａ）において、γ−セクレターゼをさらに存在させることもできる。
本発明においては、前記（ｃ）において、候補物質の存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域及び/又は細胞外領域の断片が、候補物質の非存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域及び/又は細胞外領域の断片と比較して増加したときは、当該候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質であると同定することを含む。ここで、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質は、さらにγ-セクレターゼによるEphA4の切断反応を促進する物質であると評価することができる。また、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質は、さらにEphA4の細胞内断片を介したスパインの形成反応を促進する物質であると評価することができる。
他方、前記（ｃ）において、候補物質の存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域及び/又は細胞外領域の断片が、候補物質の非存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域及び/又は細胞外領域の断片と比較して減少したときは、当該候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質であると同定することを含む。ここで、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質は、さらにγ-セクレターゼによるEphA4の切断反応を阻害する物質であると評価することができる。また、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質は、さらにEphA4の細胞内断片を介したスパインの形成反応を阻害する物質であると評価することができる。

さらに、本発明は、ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片を含む、EphA4の細胞外領域切断剤を提供する。
さらに、本発明は、ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片を含む第１の生物学的組成物と、EphA4を含む第２の生物学的組成物とを含む、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを測定するための検査キットまたはスパイン形成を測定するための検査キットを提供する。
本発明の検査キットは、γ-セクレターゼを含む生物学的組成物をさらに含んでいてもよい。

本発明により、EphA4の切断反応を指標としたスクリーニング方法が提供される。本発明によれば、EphA4の切断反応を促進または阻害する物質をスクリーニングすることができる。本発明によれば、スパイン形成を増加又は減少させる物質をスクリーニングすることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。

EphA4の切断プロセシング及びスパイン形成を示す模式図である。 EphA4の細胞外領域の切断反応の結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質をスクリーニングする方法であり、ゼラチナーゼがEphA4を切断するという知見を見出したことにより完成されたものである。
図１は、EphA4の切断プロセシング及びスパイン形成を示す模式図である。
図１に示すように、神経活動が起こり、神経伝達物質がグルタミン酸受容体であるNMDA受容体（NMDAR)に作用すると、MMP（マトリックスメタロプロテイナーゼ）によるEphA4の切断反応が誘発され、切断された細胞内領域の断片（膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含む断片）をさらにγ-セクレターゼが切断し、EphA4の細胞内ドメイン（EICD：EphA4 intracellular domain）が産生される。このEICDはスパインを形成及び安定化させる活性を有する。
脳内では多くの種類のMMPが発現しているが、本発明においては、その中でもMMP-2又はMMP-9（これらをゼラチナーゼという）がEphA4を切断していることを明らかにした。
従って、ゼラチナーゼの活性を促進する物質は、
(i) ゼラチナーゼによるEphA4の切断反応を促進し、その結果EphA4はその細胞外領域断片と、細胞内領域断片（膜貫通ドメイン及びEICDを含む断片）とに開裂し、続いて、
(ii) γ-セクレターゼによるEphA4の細胞内領域断片の切断、そして、
(iii) EICDの産生
という一連のプロセシングを促進する物質であり、ゼラチナーゼの活性を抑制する物質は、上記プロセシングを抑制する物質であると言える。

上記の通り、ゼラチナーゼの作用はEphA4を細胞外領域の断片と細胞内領域の断片とに切断するというものである。ゼラチナーゼにより切断されたEphA4の細胞外領域断片は細胞外へ放出されるので、候補物質とともにゼラチナーゼをEphA4に作用させ、放出された断片を回収してELISA等で測定すれば、切断効率の変化を定量することができ、ゼラチナーゼの作用に影響を与える物質をスクリーニングすることができる。ゼラチナーゼにより切断されたEphA4の細胞内領域断片は、細胞を回収して細胞内（細胞膜画分を含む）に存在する断片する断片をELISA等で測定すれば、切断効率の変化を定量することができ、ゼラチナーゼの作用に影響を与える物質をスクリーニングすることができる。また、ゼラチナーゼによる切断作用を受けたEphA4の細胞内領域断片はさらにγ-セクレターゼによる切断を受け、細胞内ドメイン（EICD）を産生する。そこで、EphA4のC末端（細胞内領域断片の末端）に転写因子を結合させた融合遺伝子を作製しておいて、これを神経細胞に発現させると、γ-セクレターゼによる切断を受けたEICD-転写因子融合分子は核に移行し、該転写因子によって発現が制御されるように作成されたレポーター遺伝子の発現を上昇させることができる。これにより、EICDの産生を定量することができる。

従って、候補物質の存在下で神経細胞等にゼラチナーゼを作用させた場合、EphA4の細胞外領域の断片の存否又は量、あるいは細胞内領域断片、特に細胞内領域のドメインであるEICDの存否又は量を測定することによって、候補物質がゼラチナーゼの活性に影響を与える物質であるかどうかを調べることができる。

本発明者は、海馬初代培養神経細胞内で神経活動依存的に誘導されるEphA4の細胞外領域の切断反応がゼラチナーゼ(MMP-2, -9)選択的阻害剤であるmmp-2/9 Inhibitor IIにより完全に阻害されることを初めて証明した。また、EphA4の細胞外領域に対する特異的な抗体を用いたELISA法やEphA4の細胞内領域の断片に対する特異的な抗体を用いたWestern blot法によって、ゼラチナーゼによる切断反応が定量できることを初めて見出した。
すなわち、本発明者は、EphA4のγ-セクレターゼによる切断反応の効率を決定する細胞外領域の切断反応は、ゼラチナーゼ阻害剤によって抑制されることを示した。これにより、EphA4のゼラチナーゼによる切断反応を利用したスクリーニング方法が有効であることを示した。
本発明のスクリーニング方法によって得られる、EphA4のゼラチナーゼによる切断反応の促進剤及び阻害剤は、それぞれ、ゼラチナーゼの活性化及び不活性化に関与し、また、これらの促進剤及び阻害剤はEphA4に作用して、それぞれゼラチナーゼの酵素反応を活性化、不活性化させる物質（例えば化合物）である。
さらに、EphA4の細胞外領域の切断反応は、γ-セクレターゼによる切断反応の効率を決定する因子であることから、EphA4のゼラチナーゼによる切断反応の促進剤及び阻害剤は、γ-セクレターゼを介するEphA4のプロセシングをそれぞれ増加、減少させる物質（例えば化合物）であるとともに、γ-セクレターゼによりプロセシングされたEphA4細胞内断片を通じて、それぞれ、スパイン形成を増加、減少させる物質（例えば化合物）であるといえる。

２．スクリーニング方法
上記「１．概要」の項で説明した通り、候補物質の存在下で神経細胞等におけるEphA4にゼラチナーゼを作用させた場合、EphA4の細胞外領域の断片の存否又は量、あるいは細胞内領域の断片（特にEICD）の存否又は量を測定することによって、候補物質がゼラチナーゼの活性に影響を与える物質であるかどうかを調べることができる。
従って、本発明は、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質をスクリーニングする方法であり、以下の工程を含む。
(a) ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片を含む第１の生物学的組成物と、EphA4を含む第２の生物学的組成物とを、候補物質の存在下及び非存在下で接触させ、
(b) EphA4の細胞外領域及び/又は細胞内領域の断片の存在又は量を測定し、そして
(c) 候補物質の存在下における前記（b）の測定結果が、候補物質の非存在下における前記（b）の測定結果と比較して変化したときは、前記候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質として選択する工程。

ここで、「接触」とは、第１の生物学的組成物と第２の生物学的組成物とが所定条件下で反応し得る環境下に両者を置くことを意味し、第１の生物学的組成物に第２の生物学的組成物を混合すること、第２の生物学的組成物に第１の生物学的組成物を混合すること、両者の混合物を培養すること、ゼラチナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体とEphA4をコードする遺伝子を含む形質転換体とを共培養すること、ゼラチナーゼをコードする遺伝子及びEphA4をコードする遺伝子を共発現させることなどを意味する。
第１の生物学的組成物には、ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片が含まれており、第２の生物学的組成物にはEphA4が含まれている。両組成物を接触させると、ゼラチナーゼによりEphA4の切断反応が進行する。この反応系が、γ-セクレターゼが存在する無細胞系又は細胞系の場合、候補物質を存在させて第１の生物学的組成物と第２の生物学的組成物との反応を進めると、候補物質がゼラチナーゼの作用を促進する物質であれば、ゼラチナーゼの作用によるEphA4の切断断片が産生され、続いてγ-セクレターゼによるEphA4の細胞内領域断片の切断反応が起こり、EICDが生じる。候補物質が存在しなくても、ゼラチナーゼによる酵素反応は進行するので、候補物質が存在しない反応系を対照として用いれば、対照よりも細胞外領域断片、細胞内領域断片又はその両者の量が増えたときは、候補物質はゼラチナーゼの作用を促進する物質であると評価でき、対照よりも細胞外領域断片、細胞内領域断片又はその両者の量が減少したときは、候補物質はゼラチナーゼの作用を阻害する物質であると評価できる。これにより、細胞外領域の切断断片及び/又は細胞内領域断片（特にEICD）の産生を指標として、候補物質がゼラチナーゼの作用を促進するのか否かについて評価することができる。

従って、本発明の方法の一態様では、候補物質の存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域の断片及び/又は細胞外領域の断片が、候補物質の非存在下のときと比較して増加したときは、当該候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質であると同定し、候補物質の非存在下のときと比較して減少したときは、当該候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質であると同定する。そして、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質は、さらにγ-セクレターゼによるEphA4の切断反応を増加させる物質であると評価し、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質はγ-セクレターゼによるEphA4の切断反応を阻害する物質であると評価することができる。
また、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質は、さらにEphA4の細胞内断片を介したスパインの形成反応を増加させる物質であると評価し、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質はEphA4の細胞内断片を介したスパインの形成反応を阻害する物質であると評価することができる。
細胞外領域の切断断片及び/又は細胞内領域断片（特にEICD）の存否又は量の測定は、これらの断片の抗体等を用いたELISAやウエスタンブロッティング等により行なうことができる（詳細は後述する）。

本明細書において、「ゼラチナーゼ」（gelatinase）とは、MMPファミリーの中のclassical MMPに分類される分子であり、MMP-2及びMMP-9が含まれる。本発明において、ゼラチナーゼは各種動物由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド及び合成ポリペプチドのいずれであってもよい。また、ゼラチナーゼは完全長であることが好ましいが、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性を有する限り、その生物学的に活性な断片（部分配列）でも全長又は部分断片の変異型配列であってもよい。ゼラチナーゼの変異体又は生物学的に活性な断片（部分配列等）は、完全長又は部分配列のゼラチナーゼに1〜複数個（好ましくは1又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてもよく、あるいはこれらの組合せによるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、かつゼラチナーゼと機能的に実質的に同一なポリペプチドである。
ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片は、上記の通りEphA4の細胞外領域を切断する作用を有することから、EphA4の細胞外領域切断剤として使用される。

本明細書において「EphA4」とは、シナプス形成及び／又は維持の制御因子である公知のポリペプチドである（Murai KK et al., Nat Neurosci. 2003 Feb;6(2):153-60.）。例えば、ヒトEphA4（NM_004438.3、BC026327、NP_004429.1、BAG35298.1）、アカゲザル（Macaca mulatta）EphA4（XM_001106493.1、XM_001106620、XM_001106561、XM_001106876、XM_001106943、XM_001106806、XP_001106430.1）、チンパンジー（Pan troglodytes）EphA4（XM_001164636.1、XM_001164828、XM_526042、XM_001164899、XM_001164862、 XM_001164676）、ラットEphA4（XM_244186）、マウスEphA4（NM_007936.3、BC052164、X65138、BC004782、AK132203、AAH04782.1、NP_031962.2）、ハイイロジネズミオポッサム（Monodelphis domestica）EphA4（XM_001365826）、イエイヌ（Canis familiaris）EphA4（XM_536084）、ニワトリ（Gallus gallus ）EphA4（NM_204781、CAA79509.1）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）EphA4（NM_001085992、L26099、NM_001096714、NP_001079461.1）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）EphA4（NM_001005919、XM_001342436）、ウマ(Equus caballus) EphA4(XP_001494588.1）、ブタ(Sus scrofa) EphA4（NP_001128439.1）、カモノハシ(Ornithorhynchus anatinus) EphA4(XP_001506050.1）などが本発明におけるEphA4に含まれる。好ましくは、哺乳動物のEphA4である。EphA4は、構造上、γ-セクレターゼ開裂部位、膜貫通ドメイン、キナーゼ活性部位を含み、そのリガンドは、EphrinAファミリーである（Aoto, J et al., Brain Res. 2006 11）。

本発明において、EphA4は前記動物由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド及び合成ポリペプチドのいずれであってもよい。本発明において、EphA4は、完全長であることが好ましいが、少なくともEphA4のゼラチナーゼによる切断部位及びγ-セクレターゼによる切断部位を含む限り、その部分配列のものでも変異型配列のものでもよい。EphA4の変異体は、完全長又は部分配列のEphA4に1〜複数個（好ましくは1又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてもよく、あるいはこれらの組合せによるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、かつEphA4と機能的に実質的に同一なポリペプチドである。「EphA4と機能的に実質的に同一なポリペプチド」は、EphA4の有する活性、例えば、ゼラチナーゼ又はγ-セクレターゼ依存的に切断活性を有するポリペプチドを意味する。

本明細書において、「γ-セクレターゼ」とは、プレセニリン（プレセニリン１または２）と３種類のコファクタータンパク質（ニカストリン、Aph-1、Pen-2）から形成されるタンパク質分解酵素である。本発明において、γ-セクレターゼを構成する各タンパク質は、各種動物由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド及び合成ポリペプチドのいずれであってもよい。また、γ-セクレターゼを構成する各タンパク質は、完全長であることが好ましいが、γ-セクレターゼがタンパク質分解活性を有する限り、その部分配列のものでも変異型配列のものでもよい。γ-セクレターゼを構成する各タンパク質の変異体は、完全長又は部分配列の各構成タンパク質に1〜複数個（好ましくは1又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されてもよく、あるいはこれらの組合せによるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、かつ形成するγ-セクレターゼと機能的に実質的に同一なポリペプチドである。「γ-セクレターゼと機能的に実質的に同一なポリペプチド」は、γ-セクレターゼの有する活性、例えば、タンパク質（例えば、細胞外領域を切断されたEphA4）を分解する活性を有するポリペプチドを意味する。

各種動物由来のEphA4の塩基配列及びアミノ酸配列の対応関係を表1に、ヒト由来のゼラチナーゼの塩基配列及びアミノ酸配列の対応関係を表２に示す。また、各種動物由来のγ-セクレターゼの塩基配列及びアミノ酸配列の対応関係を表３に示す。

本明細書において「候補物質」とは、ゼラチナーゼの活性、好ましくは哺乳動物のゼラチナーゼの活性を変化させることができるかどうかを試験するための物質であり、種類や由来などは特に限定されるものではない。例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、天然又は合成の低分子化合物（ライブラリーに含まれる化合物を含む）、核酸（オリゴDNA、オリゴRNA）、天然又は合成ペプチド（ライブラリーに含まれるペプチドを含む）、抗体、細菌放出物質（細菌の代謝により放出される物質を含む）、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）抽出液、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）培養上清、精製又は部分精製ペプチド、各種生物（海洋生物、植物又は動物）由来の抽出物、土壌、及びランダムファージペプチドディスプレイライブラリーに含まれるペプチドからなる群から選ばれる1つ又は複数の物質などが挙げられる。
前記候補物質は新規物質であってもよく、公知物質であってもよい。さらに、前記候補物質は、従来の化学的手段、物理的手段及び／又は生化学的手段により改変したものであってもよく、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの直接的化学修飾又はランダムな化学修飾に付して構造的類似体に改変した化合物であってもよい。前記候補物質は、化合物のファーマコフォア検索、コンピューターを用いた構造比較プログラムなどにより同定される化合物であってもよい。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに候補化合物及びその塩は溶媒和物（水和物含む）を形成していてもよい。
さらに、候補物質は、ゼラチナーゼのプロセシングに関係する公知のゼラチナーゼ促進剤又はゼラチナーゼ抑制剤、あるいはその構造的類似体であってもよい。ゼラチナーゼの活性を促進又は阻害する公知の化合物を、合理的な薬剤設計を通じて設計することのできる化合物であってもよい。これらの化合物としては、例えばNMDA、mmp-2/9 Inhibitor IIなどが挙げられる。
mmp-2/9 Inhibitor II(Merck)の構造を以下に示す。

(2R)-[(4-Biphenylylsulfonyl)amino]-N-hydroxy-3-phenylpropionamide (BiPS)

候補物質は、一般的には、約1nM〜1mM、通常約10μM〜1mMの範囲の濃度で反応系に含める（例えば添加する）ことができる。ゼラチナーゼのEphA4切断活性を変化させる物質を同定するため、候補物質の存在下と非存在下で上記の各ステップを実施し、候補物質の存在下でのゼラチナーゼのEphA4切断活性を、候補物質の非存在下での活性と比較することによって、ゼラチナーゼによるEphA4の切断活性を変化させる物質を同定する。
候補物質の存在下でEphA4の量又は程度（存否）がいくらかでも変化するということは、候補物質の存在下でゼラチナーゼによるEphA4の切断活性が変化したことの指標であり、ゼラチナーゼの活性のモジュレーターとなる物質が同定されたことになる。例えば、コントロールと比べてEphA4開裂産物を増加させる物質は、ゼラチナーゼのタンパク質分解活性の促進剤であると評価される。一方、コントロールと比べてEphA4開裂産物を減少させる物質は、ゼラチナーゼのタンパク質分解活性の阻害剤であると評価される。
本発明の方法により得られるゼラチナーゼの促進剤又はそのモジュレーターは、アルツハイマー病（AD）の治療に有用である可能性がある。また、本発明の方法により得られるゼラチナーゼの阻害剤は、シナプス、特にスパインの過形成を伴う疾患の治療に有用である可能性がある。

本明細書において、「細胞外領域の断片」とは、EphA4がゼラチナーゼにより切断を受けたN末端側の断片であって細胞の外に放出される断片である（図１参照）。
本明細書において、「細胞内領域の断片」とは、EphA4がゼラチナーゼにより切断を受けた後の開裂産物、すなわちEphA4のC末端側の断片であって細胞外領域断片以外の断片を指す。細胞内領域の断片は、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含んでおり、γ-セクレターゼの基質となる断片である。γ-セクレターゼにより切断され産生する細胞内領域の断片をEphA4の細胞内ドメイン（EICD：EphA4 intracellular domain）という。従って、EICDは「細胞内領域の断片」に含まれる概念である。

本明細書において「置換」とは、好ましくは、ポリペプチドの活性を実質的に改変しないように、1又は複数個（好ましくは1又は数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換える保存的置換を意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行なうことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
前記の欠失、置換、挿入及び／又は付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個である。

前記ゼラチナーゼ及びEphA4並びにγ-セクレターゼを構成する各タンパク質の変異型のアミノ酸配列は、それぞれの野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、そして最も好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。EphA4と実質的に同じ活性（例えば、ポストシナプスの形態を変化させる、特に、EphrinA依存的な形態変化を起こす活性）、あるいはゼラチナーゼと実質的に同じ活性（例えば、EphA4を切断する活性）、あるいはγ-セクレターゼと実質的に同じ活性（例えば、EphA4の細胞内領域の断片を切断する活性）を有する限り、上記相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは本発明において使用される変異型ポリペプチドに含まれる。これらのポリペプチドは、前記動物由来のポリペプチド、組み換えポリペプチド、及び合成ポリペプチドのいずれであってもよい。
前記の同一性は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）の相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。

本発明において使用されるゼラチナーゼ、及び解析の対象となるEphA4、並びに使用され得るγ-セクレターゼは、他のポリペプチドと融合させた融合ポリペプチド、例えばタグ若しくは標識物を付加したポリペプチド、又はそれ以外の修飾を施されたポリペプチドの形態であってもよい。これらのポリペプチドは、遺伝子組み換え技術、部位指定突然変異誘発、突然変異誘発剤処理（例えばヒドロキシルアミン）、又は自動化したペプチド合成によって得ることができる。
ゼラチナーゼ及びγ-セクレターゼによる切断部位を少なくとも含むあらゆるEphA4誘導体を本発明において使用することができる。これらのポリペプチドは、EphA4を検出、精製する上で特に有用である。

本明細書において「生物学的組成物」とは、ゼラチナーゼ又はEphA4を含む組成物であれば特に限られず、例えば、無細胞の再構成系、遺伝子工学的手法による発現産物、哺乳動物又はその一部、あるいはゼラチナーゼ又はEphA4を過剰発現するように操作したトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はその一部などである。本発明において、生物学的組成物は、γ-セクレターゼを含む組成物であってもよい。
本明細書において、ゼラチナーゼ及び/又はEphA4は、内因性のものであっても、外因性のものであってもよい。内因性の場合は、前記動物の一部に由来するゼラチナーゼ又はEphA4を含む組成物であれば特に限られない。前記動物の一部は、例えば前記動物由来の組織、細胞、細胞膜分画、精製された膜などが挙げられる。当該細胞は、例えば中枢神経系の細胞、脳由来の神経細胞、大脳皮質由来の神経細胞、大脳皮質由来の初代培養神経細胞、海馬由来の初代培養神経細胞などの神経細胞、グリア細胞などが挙げられる。
またこれらの細胞において、ゼラチナーゼ及び/又はEphA4は、哺乳動物又はその一部に含有されたままの状態であってもよいし、哺乳動物から調製された細胞溶解物のゼラチナーゼ分画又はEphA4分画であってもよい。当該細胞溶解物は、例えばゼラチナーゼ又はEphA4を含有する細胞を低張液若しくは界面活性剤による溶解、又は超音波破砕若しくは物理的な破砕により調製されたものであってもよく、場合によっては、カラムなどの精製手段を処置したものであってもよい。外因性の場合は、ゼラチナーゼをコードするポリヌクレオチド又はEphA4をコードするポリヌクレオチドを含む各発現ベクターの全て又はその一部を用いて、宿主細胞に発現させた場合の、ゼラチナーゼ発現細胞又はEphA4発現細胞であってもよいし、あるいはゼラチナーゼ発現細胞に由来する細胞溶解物のゼラチナーゼ分画又はEphA4発現細胞に由来する細胞溶解物のゼラチナーゼ分画であってもよい。当該細胞溶解物は、例えばゼラチナーゼ又はEphA4を含有する細胞を低張液若しくは界面活性剤による溶解、又は超音波破砕若しくは物理的な破砕により調製されたものであってもよく、場合によっては、カラムなどの精製手段を処置したものであってもよい。当該発現ベクターは、宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションされ、一過性に遺伝子を発現するもの、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれ、安定に遺伝子を発現するものであってもよい。

本明細書において「形質転換」又は「トランスフェクション」とは、真核細胞のDNA含量を変化させるあらゆる方法を意味する。例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合トランスフェクション、エレクトロポレーショントランスフェクション、DEAE−デキストラン処理トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ポリブレントランスフェクション、直接マイクロインジェクショントランスフェクションなどが挙げられる（Sambrook，et al.，Molecular Cloning 3：16.30-16.31（1989））。
前記形質転換又はトランスフェクションに使用される発現ベクターは、ゼラチナーゼをコードするポリヌクレオチド又はEphA4をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。例えば、哺乳動物の細胞では、強い転写活性を与えるのにCMV前初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター（例えばMLVやMMTVからのLTR）、SV40、RSV LTR、HIV-1 LTR、HIV-2 LTRのプロモーター、アデノウイルスのプロモーター（例えばE1A領域、E2A領域、MLP領域からのもの）、AAV LTR、カリフラワー・モザイク・ウイルス、HSV-TK、トリ肉腫ウイルスのプロモーターなどがある。
前記形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞も、ゼラチナーゼをコードするポリヌクレオチド又はEphA4をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいはゼラチナーゼ又はEphA4を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。

前記発現ベクターを形質転換又はトランスフェクションされる宿主細胞は、遺伝子を発現することができる細胞又は細胞株であればよく、公知の培養細胞が挙げられる。例えば哺乳動物の細胞又は細胞株として、HEK293細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、線維芽細胞、一次内皮細胞（HUVEC細胞）、ヒト神経膠腫細胞、Hela細胞、COS細胞、PC12細胞、リンパ芽球、メラノーマ細胞、ハイブリドーマ細胞、卵母細胞、胚性幹細胞など、又は公知の微生物として、例えば大腸菌、酵母など、あるいは昆虫細胞（例えばBmN4細胞）などが挙げられる。前記細胞は、内因性のものであっても外因性のものであっても特に限定されないが、ゼラチナーゼ及びEphA4のうち少なくとも一つを発現している細胞であれば、どの細胞でもよい。
前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対してはpUC、pTV、pGEX、pKK、又はpTrcHisなどを、酵母に対してはpEMBLY又はpYES2などを、動物細胞（CHO細胞、HEK293細胞及びCOS細胞）に対してはpcDNA3、pMAMneo又はpBabe Puroなどを、昆虫細胞（BmN4細胞）に対してはカイコ核多角体ウイルス（BmNPV）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えばpBK283）などを挙げることができる。

前記のゼラチナーゼ及び／又はEphA4を含有する細胞は特に限定されるものではないが、例えば、ゼラチナーゼ及びEphA4の一方が内因性で他方が外因性であるゼラチナーゼ及びEphA4を発現する細胞、あるいは外因性のゼラチナーゼ及び外因性のEphA4を共に発現する細胞は、ゼラチナーゼ及び／又はEphA4の発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
あるいは、適当な細胞に、ゼラチナーゼをコードするRNA及び／又はEphA4をコードするRNAを注入し、ゼラチナーゼ及び／又はEphA4の発現が可能な条件下で培養することにより目的の細胞を得ることもできる。

前記細胞膜画分は、例えば本発明のゼラチナーゼ又はEphA4を発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダー又はポリトロンによる破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法又は密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
細胞膜画分を精製する場合、公知のタンパク質精製法を利用することができる。その方法には、1つの段階として、細胞を粗分画してポリペプチド分画と非ポリペプチド分画に分ける操作が含まれる。ゼラチナーゼ又はEphA4を他のポリペプチドから分離した後は、クロマトグラフィ法又は電気泳動法を利用して所望のゼラチナーゼ又はEphA4をさらに精製し、部分的精製又は完全精製（又は精製による均一化）する。

純粋なペプチドの調製及び精製に特に適した分析法は、例えば硫酸アンモニウム、PEG、抗体などを用いた沈降、又は熱変性を行なった後の遠心分離などがあり、さらに各種クロマトグラフィ・ステップ、例えばイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、アフィニティ・クロマトグラフィ、高速タンパク質液体クロマトグラフィ（FPLC）、高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）又は固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィ（IMAC）など、さらには等電点電気泳動、ゲル電気泳動、SDS（Sodium dodecyl sulfate）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）などを単独で、又は適宜組み合わせて使用することができる。これらの方法のほかに、他の方法を組み合わせて使用することも可能である。

あるいは、予めゼラチナーゼ又はEphA4にタグを付けておき、当該タグを認識するタンパク質が結合している精製カラムに通し、所望のゼラチナーゼ又はEphA4をカラム内に吸着させ、適当な流出溶媒を流すことで、カラムから脱着させて精製する。さまざまな精製ステップを実施する順番を変えても、あるいはいくつかのステップを省略してもよい。分画の純度を評価する好ましい1つの方法は、分画の比活性を計算し、それを最初の抽出液の比活性と比較し、純度の大きさを計算して評価するというものである。

本発明において、ゼラチナーゼ又はEphA4について記載された上記方法と同様の方法で調製されるγ-セクレターゼまたはγ-セクレターゼを含む生物学的組成物を使用することもできる。

本明細書において「EphA4のプロセシング」は、EphA4タンパク質が修飾を受ける過程を意味する。プロセシング（修飾）には、アミノ酸またはペプチド鎖の付加、修飾、切断および除去、タンパク質の折りたたみ等が含まれる。本発明において、EphA4のプロセシングは、好ましくはEphA4の切断過程またはEphA4が切断される反応を意味する。
本明細書において「ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質」とは、ゼラチナーゼによるEphA4の切断活性を阻害する物質（ゼラチナーゼ阻害剤）、あるいはゼラチナーゼによるEphA4の切断活性を促進する物質（ゼラチナーゼ促進剤）のいずれかを意味する。ここで、ゼラチナーゼ阻害剤には、アンタゴニストが含まれ、ゼラチナーゼ促進剤には、アゴニストが含まれる。ゼラチナーゼ阻害剤及びゼラチナーゼ促進剤には、ゼラチナーゼによるEphA4の切断部位を変化させ、ペプチドの長さの異なるEphA4開裂産物を生成させる物質も含まれる。

本発明の方法は、ゼラチナーゼとEphA4とを含む適切な細胞系又はセルフリー系（細胞を含まない系）で実施することができる。ゼラチナーゼとEphA4を含む細胞系では、使用される細胞は、内在性遺伝子発現細胞系であってもよいが、外来性遺伝子を含む細胞系のいずれであってもよい。そして、候補物質の存在下と非存在下で、ゼラチナーゼとEphA4を含む細胞を適切な培地で培養し、ゼラチナーゼ活性によるEphA4の切断反応が可能となる反応条件でインキュベーションすることができる。本発明において、接触時に、NMDA等の神経伝達物質で反応系中に存在するグルタミン酸受容体を活性化させてもよい。
外来性遺伝子を含む細胞系の場合は、その遺伝子が発現できる培養条件で実施することができる。内在性遺伝子発現細胞系では、初代培養神経細胞の場合、例えば、MEM(Invitrogen)培地に, 5％FBS(Hyclone), 1X B27 Supplement (Invitrogen ), 0.5mM L-Glutamine (Invitrogen), 25μg/ml Insulin (SIGMA), 8μM AraC(SIGMA)を加えた5％CO₂、37℃の培養条件で培養することができる。外来性遺伝子を含む系では、HEK293細胞株の場合、例えば、10％FBS(Hyclone) / DMEM(Invitrogen) で5％ CO₂、37℃の培養条件で培養することができる。細胞を含まない系では、候補化合物の存在下と非存在下で、ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性なその断片を含む第１の生物学的組成物（例えば、ゼラチナーゼを含む細胞膜分画）と、EphA4を含む第２の生物学的組成物（例えば、EphA4を含む細胞膜分画）とを混合することによってインキュベーションする。これらはゼラチナーゼ活性によるEphA4の切断反応が可能となる反応条件で混合することができる。ゼラチナーゼ又はEphA4は、精製されたゼラチナーゼ又はEphA4、その生物学的に活性な断片、そのアナログ、その変異体のいずれであってもよい。

EphA4の開裂の解析は、EphA4のN末端断片とC末端断片の一方又は両方について、開裂を示す指標を測定する。ゼラチナーゼによるEphA4の切断、あるいはその後に続くγ-セクレターゼによる細胞内領域の切断をモニターするため、抗EphA4抗体を使用することができるが、EphA4が開裂する結果として生成される断片を認識する抗体、好ましくはEphA4の細胞外領域の断片を認識する抗体、EphA4の細胞内領域の断片を認識する抗体、さらに好ましくはEphA4のC末端領域の断片（特にEICD）を認識する抗体を用いることができる。EphA4のタグ付きポリペプチド開裂産物を検出する場合は、選択されたタグを認識する抗体を用いることができる。例えば、EphA4のC末端にHAタグを付けた場合、抗HAタグ抗体を用いて検出することができる。この場合、EphA4が開裂する結果として生成されるEphA4のC末端の存在と濃度を明らかにすることができる。
タグ付きポリペプチドとして特に有用な系としては、ヘマグルチニン（HA）系、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）系、マルトース結合タンパク質系、6×ヒスチジン系、8×ヒスチジン系などが挙げられる。
EphA4又はタグ付のEphA4が標識された場合は、その標識の消光状態を検出することができる。

また、本発明においては、EphA4のC末端に転写因子を結合させた融合遺伝子を作製し、これを細胞に発現させてγ-セクレターゼによる切断反応を起こさせるアッセイ系を用いることができる。その場合、EphA4の細胞内領域がγ-セクレターゼの作用を受けると、EICD-転写因子融合分子が核に移行され、レポーター遺伝子の発現を上昇させることができる。これにより、EICDの産生を定量することができる。
本発明において、前記転写因子は、酵母GAL4（Yeast GAL4）、熱ショック因子(Heat shock factor)、低酸素誘導因子(Hypoxia inducing factor)等が挙げられる。EICD-転写因子融合分子が核に移行すると、当該転写因子部分がレポーター遺伝子の上流に配置する当該転写因子に対する応答配列に作用し、その結果、レポーター遺伝子の発現が上昇する。
本発明において、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ（luciferase）、耐熱性アルカリフォスファターゼ(heat stable alkaline phosphatase)、GFP(Green fluorescent protein)等の遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子の発現量は、レポーター遺伝子の性質によって、蛍光、発光等の検出器を用いて測定することができる。

前記標識は、例えばビオチン標識、放射性標識、蛍光標識、化学的発光標識などがある。また、標識以外の検出可能な部分を組み込む修飾を施すことも可能である。本発明においては、いずれのEphA4も、これら標識又は修飾のうちの1つ、2つ、又はそれ以上を備えることができる。

本発明の好ましい態様のEphA4は、ラットEphA4であり、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドである。さらに本発明の好ましい態様のEphA4は、ラットEphA4のHAタグ付きポリペプチドである。例えば、ラットEphA4のC末端にHAタグをさらに備えたポリペプチド(配列番号４)である。もちろん、ヒトEphA4配列の全体又は一部、例えば配列番号６、８、１０又は１２のアミノ酸配列もラットEphA4と同様に用いることができる。
本発明ではさらに、前記EphA4をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。当該EphA4をコードするポリヌクレオチドの一例は、ラットEphA4をコードするポリヌクレオチドであり、例えば配列番号１のポリヌクレオチドである。さらに本発明の好ましい態様のEphA4をコードするポリヌクレオチドは、ラットEphA4のHAタグ付きポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば、ラットEphA4のC末端にHAタグをさらに備えたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）である。もちろん、ヒトEphA4配列の全体又は一部、例えば配列番号５、７、９又は１１のヌクレオチド配列もラットEphA4と同様に用いることができる。

EphA4の抗体は、EphA4を認識する抗体であれば特に限定されないが、好ましくはEphA4の細胞内領域を認識する抗体である。例えば、Tremblay et al., J. Comp. Neurol 501 691-702に記載の抗体、又は市販の抗ラットEphA4抗体（Upstate、Zymed、Santacruze）を利用することができる。また、当業者であれば免疫原（抗原）を免疫し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従って製造することができる。例えば、当該抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、非ヒト哺乳動物に免疫する。ポリクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た当該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）から融合細胞（ハイブリドーマ）を調製し、当該ハイブリドーマをクローン化し、当該哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをin vitro、又は非ヒト哺乳動物、好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスの腹水中などでのin vivoで行い、得られた培養上清、又は当該哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清又は腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAE又はDE52など）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。当該モノクローナル抗体には、当該抗体を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなるモノクローナル抗体も包含される。

本発明の方法は、ゼラチナーゼとEphA4を候補物質の存在下又は非存在下でインキュベーションし、スパイン形成細胞のスパインの数を指標として、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質を評価することができる。
すなわち、本発明の方法においては、ゼラチナーゼとEphA4との接触後、ゼラチナーゼによるEphA4の細胞外領域の切断、その後のγ-セクレターゼによるEphA4の細胞内領域の切断、及びEICDの産生、そして細胞内シグナル伝達を介してスパインを形成する過程が観察可能な細胞系で実施することが可能である。この場合において、「ゼラチナーゼとEphA4を含む適切な細胞系」とスパイン形成細胞は別細胞で構成されていてもよいし、同一の細胞で構成されていてもよい。「スパイン形成細胞」とは、スパインを形成することが可能な細胞であり、例えば、中枢神経系における興奮性シナプスをもつ神経細胞などが挙げられる。

本明細書において「スパイン」とは、化学シナプスを構成する微細構造であり、シナプス後部の樹状突起上に形成される棘状隆起物（棘状突起）をいう（Hering et al., Nat Rev Neurosci. 2001 Dec;2(12):880-8.参照。）。一般に、成熟した脳では、2種類のシナプス（針状突起；Dendritic Filopodiaと棘状突起；Dendritic Spine）が存在しており、記憶・学習が行われる時に針状突起から棘状突起へ移行していくことで、スパインが記憶や学習の過程に関与することが提唱されている。

本態様における好ましい細胞系としては、例えば初代培養神経細胞、脳切片スライス培養細胞などが挙げられる。当該細胞系は、初代培養神経細胞の場合、後述する実施例を参照して得ることが可能であり、脳切片スライス培養細胞は、海馬の場合、例えば以下のようにして得ることが可能である。
生後8-9日齢のラットの全脳を取り出し、GBSS溶液（HBSS(SIGMA)/MEM(Invitrogen)/Horse serum(SIGMA)=1:2:1）を入れたビーカーに入れ、1分程度全脳を冷却させる。冷却後、全脳をビーカーから取り出してステージへ載せ、小脳と大脳の吻側側半分を切り落とした後、接着剤を用いてステージに固定する。固定後の組織片から海馬を切り出す。得られた切片（300-400μm）を予め準備したウェル上のメンブレンに載せ、メンブレン上で培養した初代培養細胞を使用することも可能である（Stoppini, L., Buchs, P.-A. and Muller, D. J. Neurosci. Methods.37 (1991) 173-182、Gahwiler, B. H. Trends Neurosci. 11 (1988) 484-489、Sakaguti, T., Okada, M. and Kawasaki, K. Neurosci. Res. 20 (1994) 157-164参照。）。

本発明において測定されるスパインは、シナプス上のスパインであり、好ましくは、針状突起及び棘状突起の段階にあるシナプス上のスパインである。針状突起及び棘状突起の段階にあるシナプスは、実際に記憶や学習が行われる時に存在する形態のシナプスであり、当該シナプス上のスパインを測定することで、生体内で機能している状態にあるシナプスあるいはその前段階にあるシナプスにおけるスパインを測定することができる。
スパインの数の測定に際しては、スパインに特異的に発現する分子を認識する抗体を用いたり、スパインに特異的に発現する分子にタグを付けたポリペプチドを認識する抗体を用いたり、又は、細胞自体が標識されたスパイン形成細胞を用いることでスパインの検出が可能である。
細胞自体が標識されたスパイン形成細胞を用いる場合には、当該標識を検出することが可能な顕微鏡を用いてスパイン形成細胞上の棘状突起物を目印にスパインの検出が行われる。この場合における標識としてはEGFPが挙げられる。
スパインに特異的に発現する分子を認識する抗体を用いる場合、スパインに特異的に発現する分子を認識する抗体として、例えば、抗PSD-95（Postsynaptic Density-95）抗体，抗Glutamate Receptor1抗体, 抗Actin抗体, 抗Homer抗体, 抗Shank抗体などが挙げられる。
また、スパインに特異的に発現する分子にタグを付けたポリペプチドを検出する場合は、選択されたタグに対する抗体を用いることができる。スパインに特異的に発現する分子としてPSD-95を選択して、PSD-95のC末端にEGFPタグを付けた場合、抗EGFPタグ抗体を用いて検出することができる。この場合、PSD-95のC末端の存在と濃度を明らかにすることができる。

ゼラチナーゼによるEphA4の切断活性を変化させる物質を同定するため、候補物質の存在下と非存在下で上記の各ステップを実施し、候補物質の存在下でのスパイン形成活性を候補物質の非存在下での活性と比較することによって、ゼラチナーゼによるEphA4の切断活性を変化させる物質を同定する。
候補物質の存在下でスパインの数がいくらかでも変化するということは、候補物質の存在下でゼラチナーゼによるEphA4の切断活性が変化したことの指標であり、ゼラチナーゼの活性のモジュレーターとなる物質が同定されたことになる。例えば、コントロールと比べてスパインの数を増加させる化合物は、ゼラチナーゼのタンパク質分解活性のモジュレーター又はゼラチナーゼのタンパク質分解活性の促進剤であると評価される。一方、コントロールと比べてスパインの数を減少させる化合物は、ゼラチナーゼのタンパク質分解活性の阻害剤であると評価される。

本発明においては、スクリーニングの結果同定される物質を用いて、ポストシナプスの形態、あるいは神経伝達の機能を評価する方法も含まれる。例えば、前記ポストシナプスの形態の評価は、スパイン（Spine）の数、スパインの形状を評価する方法である（Pak D et al. Neuron 2001 31. 289-303）。また、神経伝達機能の評価は、例えば、培養細胞や培養スライスを用いて、シナプス膜上でおこる電気的な変化を評価する方法である (Saura et al., Neuron 2004 42 23-36)。
本発明の方法には、多数の候補物質を同時に試験する当業者に公知のハイスループット・スクリーニング（HTS）法も含まれる（US5876946、US5902732、JayawickremeとKost,Curr. Opin. Biotechnol., 8, pp.629-634, 1997, HoustonとBanks, Curr. Opin. Biotechnol., 8, pp.734-740, 1997）。

本発明の方法には、公知のモデル動物の利用も含まれる。本発明のin vitroの方法によって選択された化合物を、例えばEphA4のプロセシングの非ヒトモデルを利用して、その化合物の生体内における効果を解析することができる。例えば、EphA4遺伝子を導入したトランスジェニックマウスに公知のゼラチナーゼ阻害剤であるmmp-2/9 Inhibitor II、又は本発明の方法によって選択された化合物を投与したときの脳内、脳脊髄液中、血清中の各Aβ量を測定する方法（J. Pharmacol. Exp. Ther. 305, 864-871, 2003）による評価、γ-セクレターゼの活性が変化したことの脳の変化（例えばAβの産生量変化、脳の萎縮程度）の病理学的検査、生存率、運動量、又は摂食量を評価する方法などがある。
また、本発明の方法により、ポストシナプスの形態あるいは神経伝達の機能を評価する方法を利用して、スパイン形成に影響を与える化合物であるか否かを二次評価する方法（スクリーニング方法）が提供される。この方法は、適切な細胞系の中で行うことができる。

３．本発明の方法により得られた物質を含む治療用組成物
本発明の方法により得られる、ゼラチナーゼによるEphA4の切断活性を促進する物質、その塩又はそれらの溶媒和物は、EICDの産生を促進し、そしてEICDはスパイン形成を促進する。従って、上記物質、その塩又はそれらの溶媒和物は認知機能改善剤として期待することができ、例えば認知症、特にADの治療に有用である可能性がある。
一方、シナプスの過剰な形成、特にスパインの過形成を伴う疾患の治療には、ゼラチナーゼによるEphA4の切断活性を阻害する物質、その塩又はそれらの溶媒和物が有用であると考えられる。
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果及び/又は生理学的効果を得ることを意味する。例えばADの場合、臨床学的症状又は病理学的徴候の減少又は改善により示される。
ここで、アルツハイマー病（AD）の臨床学的症状としては、進行性見当識障害、記憶喪失、及び失語症が挙げられ、最終的には、無能力、言語喪失及び無動が起こる。ADの病理学的徴候としては、例えば、神経原繊維変化、老人斑及びアミロイド血管障害の存在が挙げられる。
患者のAD診断は、公知の種々の方法を用いて実施することができる。典型的には、臨床及び病理学的評価を組み合わせて、ADを診断する。例えば、ADの進行又は重症度は、ミニ精神状態検査（Mini Mental State Examination）（MMSE）（Mohsら（1996）Int Psychogeriatr 8：195-203）、アルツハイマー病評価スケール−認識要素（ADAS-cog）（Galaskoら（1997）Alzheimer Dis Assoc Disord, 11 suppl 2：S33-9）、アルツハイマー病共同研究−日常生活動作スケール（ADCS-ADL）（McKhannら（1984）Neurology 34：939-944）、国立神経伝達障害研究所（National Institute of Neurologic Communicative Disorders）及び発作−アルツハイマー病及び関連障害協会（Stroke-Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association）（NINCDS-ADRDA）基準（Folsteinら（1975）J Psychiatr Res 12：189-198、McKhannら（1984）Neurology 34：939-944、）を用いて、判定することができる。さらに、脳の様々な領域について評価し、老人斑や神経原繊維変化の頻度の推定を可能にする方法を用いることができる（Braakら（1991）Acta Neuropathol 82：239-259；Khachaturian（1985）Arch Neuro 42：1097-1105；Mirraら（1991）Neurology 41：479-486；ならびに、Mirraら（1993）Arch Pathol Lab Med 117：132-144）。

本明細書において「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、前記物質（例えば化合物）と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えばハロゲン化水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩（例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など）、有機スルホン酸塩（例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩（例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など）などが挙げられる。

本発明の方法によって同定される物質（例えば化合物）を含む医薬組成物、好ましくは本発明のAD治療剤は、患者に、種々の形態、経口又は非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明の物質（例えば化合物）を含有する医薬組成物は、単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容され得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することが可能である。
好ましい剤形としては、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤などによる経口剤、吸入剤、坐剤、注射剤（点滴剤を含む）、軟膏剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤、リポソーム剤などによる非経口剤が挙げられる。
これらの製剤の製剤化に用いる担体には、例えば通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化することが可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば大豆油、牛脂、合成グリセライドなどの動植物油；例えば流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィンなどの炭化水素；例えばミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピルなどのエステル油；例えばセトステアリルアルコール、ベヘニルアルコールなどの高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーなどの界面活性剤；例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなどの水溶性高分子；例えばエタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール；例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール（ポリオール）；例えばグルコース、ショ糖などの糖；例えば無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなどの無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩；精製水などが挙げられる。

賦形剤としては、例えば乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミンなどが、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウムなどが、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末などが、それぞれ用いられる。上記の成分は、それらの塩又はその溶媒和物であってもよい。

例えば経口製剤は、本発明の物質（例えば化合物）に賦形剤、さらに必要に応じて例えば結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤などとする。錠剤・顆粒剤の場合には、例えば糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。シロップ剤や注射用製剤などの場合は、例えばpH調整剤、溶解剤、等張化剤などとともに、また必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化する。また、外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品などに通常使用される各種原料を用いることが可能であり、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、必要に応じ、pH調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができる。さらに、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤などの成分を配合することもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量％の間で変動され得る。本発明に使用する化合物類、本発明に使用するペプチド類又は本発明に使用するポリヌクレオチド類を前記治療に使用する場合は、少なくとも90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。

本発明の物質（例えば化合物）を含有する本発明の医薬組成物の有効な投与量は、例えば症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、塩の種類、疾患の具体的な種類などに応じて異なるが、通常、成人の場合は体重60kg、1日あたり経口投与では約30μg〜10g、好ましくは100μg〜5g、さらに好ましくは100μg〜100mgをそれぞれ1回又は数回に分けて投与し、注射投与では約３０μg〜1g、好ましくは100μg〜500mg、さらに好ましくは100μg〜30mgをそれぞれ1回又は数回に分けて投与する。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。小児に投与される場合は、用量は成人に投与される量よりも少ない可能性がある。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

４．キット
本発明において、ゼラチナーゼは、EphA4の切断活性を有することから、in vitro実験や非ヒトを対象とした動物実験などを行なうためにEphA4、特にEphA4細胞外領域の切断剤、γ-セクレターゼによるEphA4の細胞内領域断片の切断促進用試薬、あるいはγ-セクレターゼを介したEICD産生用試薬として使用することができる。その場合は、ゼラチナーゼのほかに、緩衝液、細胞培養液、EphA4又はその断片に対する抗体、蛍光色素などから選ばれる少なくとも１つを含むキットの形態とすることができる。キットには、ゼラチナーゼの酵素活性、EICDの核内移行を試験する方法などが記載された使用説明書を同封することもできる。
さらに、本発明は、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシング、好ましくはゼラチナーゼによるEphA4の切断反応のレベルを測定するための検査キット及びスパイン形成を測定するための検査キットを提供する。
本発明のキットは、ゼラチナーゼ又はそれを含む生物学的組成物と、EphA4を含む生物学的組成物とを含むものである。本発明のキットには、γ-セクレターゼを含む生物学的組成物を含んでいてもよい。当該キットには、イムノブロッティング、ウエスタンブロッティング技術に用いられる器具（例えば、反応容器、ブロッティングメンブレンなど）、試薬（例えば、緩衝液、培養液、抗EphA4抗体など）、説明書などを含んでいてもよい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

ゼラチナーゼ選択的阻害剤の、神経活動依存的なEphA4の細胞外領域の切断反応への影響
神経活動依存的に、EphA4の細胞外領域を切断しているプロテアーゼを同定する目的で、まず、脳で重要な機能をもっているゼラチナーゼファミリー分子(MMP-2, -9)の特異的阻害剤を用いて解析を行なった。神経刺激は、50μM NMDAで行い、阻害剤は、mmp-2/9 Inhibitor II（(2R)-[(4-Biphenylylsulfonyl)amino]-N-hydroxy-3-phenylpropionamide、Merck)を用いた。切断反応の検出は、EphA4の細胞内領域を認識する抗体を用いたWestern blot法とEphA4の細胞外領域を認識する抗体を用いたELISA法の2種類の抗体を用いた方法で確認を行なった。

１．実験条件及び実験方法
（１）海馬神経細胞の培養
胎生18日齢のSD系ラット（チャールズリバー社）より海馬を単離し培養に供した。具体的には、妊娠ラットより無菌的に胎仔を摘出した。その胎仔より脳を摘出し、それらを20％ FBS (Hyclone) / HBSS (SIGMA)に浸した。その摘出した脳から、実体顕微鏡下で海馬を採取した。採取した海馬を、0.25 %トリプシン（trypsin）（Invitrogen）及び0.5 mg/ml DNase (SIGMA)を含有した酵素溶液中、37℃、10分間の酵素処理することにより、細胞を分散させた。この際、酵素反応は20％ FBS(Hyclone) /HBSS (SIGMA)を加えることで停止させた。得られた細胞は、HBSS (SIGMA)を2 ml加えた。HBSS (SIGMA)が加えられた細胞塊を、緩やかなピペッティング操作により細胞を再分散させた。この神経細胞懸濁液を培地にて希釈し、35mm dishに初期細胞密度、2×10⁵cells / dishにて播種した。培地にはNeurobasal (Invitrogen)培地に, 1 X B27 Supplement (Invitrogen), 0.5 mM L-Glutamine (Invitrogen)を添加したものを用いた。播種した細胞は5％CO₂、95％空気、37℃インキュベーター中にて培養した。培養3週間後、50μM NMDA含有培地に培地交換し、30分後に、培養液を回収し、ELISAに用いた。また、神経細胞は、PBSで回収した後、タンパク質定量し、それぞれ10μgずつSDS-PAGEし、細胞内領域を認識する抗EphA4抗体を用いて、ウェスタンブロットした。

実験結果
図２にその結果を示す。
図２において、海馬神経細胞を50μM NMDAで刺激すると、EphA4の切断反応が誘導され、EphA4細胞内領域断片が検出される。この刺激条件に、0μM, 1μM, 5μM, 10μM, 25μMのmmp-2/9 Inhibitor IIを加えると、濃度依存的に切断反応が阻害された（図２Ａ）。また、この切断現象は、EphA4の細胞外領域を認識する抗体を用いて作製したELISAでも検出され、5μMのmmp-2/9 Inhibitor IIにより完全に阻害された（図２Ｂ）。これらの結果から、EphA4の細胞外領域を切断しているプロテアーゼは、ゼラチナーゼファミリー分子(MMP-2, -9)であることが明らかとなった。

ゼラチナーゼによるEphA4の切断反応を促進する化合物は、EICDの産生を増やし、スパイン形成を促進し、認知機能改善効果を示すことができる。従って、MMP2/9によるEphA4の切断反応を検出又は定量できるアッセイ系は、認知機能改善薬のスクリーニングに有用である。

Claims (9)

1. ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
   （ａ）ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片を含む第１の生物学的組成物と、EphA4を含む第２の生物学的組成物とを、候補物質の存在下及び非存在下で接触させ、
   （ｂ）EphA4の細胞外領域及び/又は細胞内領域の断片の存在又は量を測定し、そして
   （ｃ）候補物質の存在下における前記（ｂ）の測定結果が、候補物質の非存在下における前記（ｂ）の測定結果と比較して変化したときは、前記候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質として選択すること、
   を含み、
   ここで、前記ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片は、完全長のMMP-2 又はMMP-9 のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ、EphA4 の細胞外領域を切断することのできるポリペプチドである、前記方法。
2. 前記（ｃ）において、候補物質の存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域及び/又は細胞外領域の断片が、候補物質の非存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域及び/又は細胞外領域の断片と比較して増加したときは、当該候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質であると同定することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記（ｃ）において、候補物質の存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域及び/又は細胞外領域の断片が、候補物質の非存在下における前記（ｂ）で測定されたEphA4の細胞内領域及び/又は細胞外領域の断片と比較して減少したときは、当該候補物質を、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質であると同定することを含む、請求項１に記載の方法。
4. ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質は、さらにγ-セクレターゼによるEphA4の切断反応を促進する物質であると評価する、請求項２に記載の方法。
5. ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質は、さらにγ-セクレターゼによるEphA4の切断反応を阻害する物質であると評価する、請求項３に記載の方法。
6. ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを促進する物質は、さらにEphA4の細胞内断片を介したスパインの形成反応を促進する物質であると評価する、請求項２に記載の方法。
7. ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングを阻害する物質は、さらにEphA4の細胞内断片を介したスパインの形成反応を阻害する物質であると評価する、請求項３に記載の方法。
8. ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片を含む、EphA4の細胞外領域切断剤であって、
   ここで、前記ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片は、完全長のMMP-2 又はMMP-9 のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ、EphA4 の細胞外領域を切断することのできるポリペプチドである、前記切断剤。
9. ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片を含む第１の生物学的組成物と、EphA4を含む第２の生物学的組成物とを含む、ゼラチナーゼによるEphA4のプロセシングに影響を与える物質をスクリ ーニングするための検査キットであって、
   ここで、前記ゼラチナーゼ又はその生物学的に活性な断片は、完全長のMMP-2 又はMMP-9 のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ、EphA4 の細胞外領域を切断することのできるポリペプチドである、前記キット。