KR20230124547A

KR20230124547A - 근위축성 측삭 경화증에 대한 치료적 약학 조성물

Info

Publication number: KR20230124547A
Application number: KR1020237015047A
Authority: KR
Inventors: 가츠히사 다시로; 료타 다구치
Original assignee: 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-08-25
Also published as: US20240010735A1; CA3195085A1; AU2021410290A1; MX2023004848A; JPWO2022138707A1; TW202241503A; EP4268847A1; WO2022138707A1; CN116710133A

Abstract

EphA4에 결합할 수 있고 EphA4의 절단을 향상시킬 수 있는 항-EphA4 항체를 활성 성분으로서 포함하는, ALS를 치료하기 위한 신규 약학 조성물이 제공된다. 항-EphA4 항체를 포함하는, ALS를 치료하기 위한 약학 조성물이 제공되며, 여기서 항-EphA4 항체는 SEQ ID NO. 44에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO. 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2, 및 SEQ ID NO. 28에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄, 그리고 SEQ ID NO. 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO. 30에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO. 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다.

Description

근위축성 측삭 경화증에 대한 치료적 약학 조성물

본 개시내용은 EphA4에 결합하는 항체를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

EphA4는 수용체-유형 티로신 키나제 패밀리의 구성원이다. 에프린 유형 A 및 유형 B는 EphA4의 리간드로서 알려져 있으며, EphA4가 이의 리간드인 에프린에 결합할 때 탈-부착 신호가 유도된다. EphA4는 운동 뉴런에서 발현되며, 정확한 축삭 인도는 신경 회로 형성 단계 동안에 척수 내의 운동 뉴런의 비-돌출 영역에서 에프린의 발현에 의해 제어된다. EphA4는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), ADAM(디스인테그린 및 메탈로프로테이나제) 및 γ-세크레타제에 의해 신경 활동-의존적으로 절단되는 것으로 알려져 있다.

종래의 연구로부터, EphA4의 기능적 억제는 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, 이하 "ALS"로도 지칭됨) 또는 알츠하이머병 및 척수 손상과 같은 신경퇴행성 질환에 대한 효과적인 요법 수단인 것으로 제시되어 왔다.

EphA4는 ALS의 표현형을 조정하는 유전자인 것으로 보고되어 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1). EphA4의 유전적 결핍 또는 예를 들어, EphA4-Fc에 의한 길항작용은 마우스 및 랫트에서 축삭 성장 또는 척수 손상 시 기능적 회복을 촉진하는 것으로 나타났다(비특허 문헌 2 및 3).

KYL 펩티드 또는 화합물 1은 이미 존재하는 EphA4 억제제로서 알려져 있다(특허 문헌 1, 비특허 문헌 1 및 2). EphA4와 이의 리간드 사이의 결합을 억제하는 활성을 갖는 항체도 알려져 있지만(특허문헌 2 및 3), EphA4의 절단을 향상시키는 활성을 갖는 항체는 지금까지 보고된 바 없다.

WO2012/156351 A1 WO2016/019280 A1 WO2017/043466 A1

Van Hoecke et al., Nature Medicine, vol18: 1418-1422, 2012 Goldshmit et al., PLoS one, vol6: e24636, 2011 Spanevello et al., Journal of Neurotrauma,vol30: 1023-1034, 2013

본 개시내용의 목적은 ALS를 치료하기 위한 신규 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 위의 문제점을 해결하기 위한 광범위한 조사의 결과로서, EphA4에 결합할 수 있고 EphA4의 절단을 향상시킬 수 있는 ALS 요법에 효과적인 항체를 획득하게 되었다.

본 개시내용은 다음의 특징을 포함한다.

(1) 항-EphA4 항체를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물로서,

항-EphA4 항체는

(a) SEQ ID NO. 44에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1;

(b) SEQ ID NO. 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2; 및

(c) SEQ ID NO. 28에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3

을 포함하는 중쇄; 그리고

(d) SEQ ID NO. 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1;

(e) SEQ ID NO. 30에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2; 및

(f) SEQ ID NO. 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3

을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.

(2) (1)에 있어서, 항-EphA4 항체는 인간화된, 약학 조성물.

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합하고, EphA4의 절단을 향상시키는, 약학 조성물.

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합하고, EphA4와 에프린 사이의 결합을 억제하는, 약학 조성물.

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서,

중쇄는 SEQ ID NO. 45에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함하며,

경쇄는 SEQ ID NO. 46에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.

(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 중쇄의 불변 영역 및 경쇄의 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.

(7) (6)에 있어서, 중쇄의 불변 영역은 인간 IgG의 불변 영역인, 약학 조성물.

(8) (7)에 있어서, 인간 IgG의 불변 영역은 인간 IgG₂의 불변 영역인, 약학 조성물.

(9) (8)에 있어서, 인간 IgG₂의 불변 영역은 SEQ ID NO. 47에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.

(10) (6) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 경쇄의 불변 영역은 인간 Igκ의 불변 영역인, 약학 조성물.

(11) (10)에 있어서, 인간 Igκ의 불변 영역은 SEQ ID NO. 48에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.

(12) 항-EphA4 항체를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물로서,

항-EphA4 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고,

중쇄는 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고,

경쇄는 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며,

중쇄의 C-말단 리신은 선택적으로 결실될 수 있는, 약학 조성물.

(13) (12)에 있어서, 중쇄의 C-말단 리신은 결실되는, 약학 조성물.

(14) 항-EphA4 항체를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물로서,

항-EphA4 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고,

중쇄는 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며,

경쇄는 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.

(15) 항-EphA4 항체를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물로서,

항-EphA4 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고,

중쇄는 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고,

경쇄는 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며,

중쇄의 C-말단 리신은 결실되는, 약학 조성물.

(16) (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 약학 조성물.

(17) 항-EphA4 항체로서,

항-EphA4 항체는

(a) SEQ ID NO. 44에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1;

(c) SEQ ID NO. 28에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3

을 포함하는 중쇄; 그리고

(d) SEQ ID NO. 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1;

(f) SEQ ID NO. 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3

을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항-EphA4 항체.

(18) (17)에 있어서, 항-EphA4 항체는 인간화된, 항-EphA4 항체.

(19) (17) 또는 (18)에 있어서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합하고, EphA4의 절단을 향상시키는, 항-EphA4 항체.

(20) (17) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합하고, EphA4와 에프린 사이의 결합을 억제하는, 항-EphA4 항체.

(21) (17) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서,

경쇄는 SEQ ID NO. 46에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함하는, 항-EphA4 항체.

(22) (17) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 중쇄의 불변 영역 및 경쇄의 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는, 항-EphA4 항체.

(23) (22)에 있어서, 중쇄의 불변 영역은 인간 IgG의 불변 영역인, 항-EphA4 항체.

(24) (23)에 있어서, 인간 IgG의 불변 영역은 인간 IgG₂의 불변 영역인, 항-EphA4 항체.

(25) (24)에 있어서, 인간 IgG₂의 불변 영역은 SEQ ID NO. 47에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 항-EphA4 항체.

(26) (22) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 경쇄의 불변 영역은 인간 Igκ의 불변 영역인, 항-EphA4 항체.

(27) (26)에 있어서, 인간 Igκ의 불변 영역은 SEQ ID NO. 48에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 항-EphA4 항체.

(28) 항-EphA4 항체로서,

항-EphA4 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고,

중쇄는 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고,

경쇄는 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며,

중쇄의 C-말단 리신은 선택적으로 결실될 수 있는, 항-EphA4 항체.

(29) (28)에 있어서, 중쇄의 C-말단 리신은 결실되는, 항-EphA4 항체.

(30) 항-EphA4 항체로서,

항-EphA4 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고,

중쇄는 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며,

경쇄는 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 항-EphA4 항체.

(31) 항-EphA4 항체로서,

항-EphA4 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고,

중쇄는 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고,

경쇄는 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며,

중쇄의 C-말단 리신은 결실되는, 항-EphA4 항체.

(32) 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 치료에 사용하기 위한 (17) 내지 (31) 중 어느 하나에 따른 항-EphA4 항체.

(33) 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에, (17) 내지 (31) 중 어느 하나에 따른 항-EphA4 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

(34) 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 (17) 내지 (31) 중 어느 하나에 따른 항-EphA4 항체의 용도.

(35) (34)에 있어서, 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 항-EphA4 항체의 용도.

(36) (17) 내지 (31) 중 어느 하나에 따른 항-EphA4 항체를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)에 대한 치료제.

본 개시내용에 따르면, ALS를 치료하기 위한 신규 약학 조성물이 제공된다. 약학 조성물은 EphA4에 결합할 수 있고 EphA4의 절단을 향상시킬 수 있는 항-EphA4 항체를 활성 성분으로서 포함한다.

도 1은 마우스 및 인간 EphA4에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)의 결합 친화도를 보여준다.
도 2는 해마 뉴런을 이용한, 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)의 EphA4 절단 향상 활성을 보여준다.
도 3은 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)의 마우스 EphA4-마우스 리간드 결합 억제 활성을 보여준다.
도 4는 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)의 인간 EphA4-인간 리간드 결합 억제 활성을 보여준다.
도 5는 각각의 인간 Eph 수용체에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)의 선택성을 보여준다.
도 6은 각각의 마우스 Eph 수용체에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)의 선택성을 보여준다.
도 7은 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)의 반응성을 보여준다.
도 8은 인간 EphA4 세포외 영역(ECD), 리간드 결합 도메인(LBD), 피브로넥틴 유형 III 도메인 1(FN1) 및 피브로넥틴 유형 III 도메인 2(FN2)에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)의 반응성을 보여준다.
도 9는 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)에 의한 해마 뉴런에서의 가시의 수에 대한 증가 효과를 보여준다.
도 10a는 수평 축에서 EphA4-리간드 결합 도메인(EphA4-LBD)의 아미노산, 및 수직 축에서 항체 A-Fab의 구조 영역을 보여준다. 흑색 비트는 상호작용이 존재하는 조합의 교차점을 보여준다.
도 10b는 EphA4-리간드 결합 도메인(EphA4-LBD)의 표면 구조를 보여준다. 도 10b에서, 결합 영역에 함유된 아미노산의 명칭 및 잔기 번호는 상응하는 위치에 표시되며, 결합 항체 A-Fab의 H 쇄 및 L 쇄의 CDR은 리본 모델로 표시된다.
도 11은 인간 EphA4에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 친화도를 보여준다.
도 12는 해마 뉴런에서 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 EphA4 절단 향상 활성을 보여준다.
도 13은 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 인간 EphA4-인간 리간드 결합 억제 활성을 보여준다.
도 14는 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 마우스 EphA4-마우스 리간드 결합 억제 활성을 보여준다.
도 15는 인간 Eph 수용체에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 선택성을 보여준다.
도 16은 마우스 Eph 수용체에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 선택성을 보여준다.
도 17은 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 반응성을 보여준다.
도 18은 인간 EphA4 세포외 영역(ECD), 리간드 결합 도메인(LBD), 피브로넥틴 유형 III 도메인 1(FN1) 및 피브로넥틴 유형 III 도메인 2(FN2)에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 반응성을 보여준다.
도 19는 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)에 의한 해마 뉴런에서의 가시의 수에 대한 증가 효과를 보여준다.
도 20은 해마 뉴런에서 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 인간 EphA4 절단 향상 활성을 보여준다.
도 21은 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)에 의한 MMP 및 ADAM을 통한 해마 뉴런에서의 가시의 수에 대한 증가 효과를 보여준다.
도 22는 실시예 13에서 수행된 평가 시스템의 개략도를 보여준다.
도 23은 돌연변이된 인간 SOD1(G93A)-발현 성상세포에 의해 유도된 인간 iPS 세포-유래된 운동 뉴런 사멸에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 B)의 효과를 보여준다.

본원에 사용된 SEQ ID NO.에 의해 명시되거나 코딩된 영역은 다음과 같다:

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 EphA4를 인식하고 그에 결합할 수 있는 항체이며, 아래 기재된 바와 같이, 전술한 항체는 온전한 항체일 수 있거나, EphA4와 결합 친화도를 갖는 한 합성 항체(예컨대, 재조합 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체)일 수 있다. 본 명세서에서, EphA4는 인간, 마우스, 랫트 및 원숭이-유래된 EphA4를 지칭하는 것으로서 인식될 수 있다. 인간, 마우스, 랫트 및 원숭이-유래된 EphA4는 미국 국립 생명공학 정보 센터에 의해 제공된 Genbank와 같은 서열 정보가 등록되는 공용 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 또한, 밀접하게 관련된 동물종의 EphA4의 염기 서열 정보에 기반한 프라이머를 설계하고, 원하는 동물종으로부터 추출된 RNA로부터 클로닝함으로써 EphA4 유전자의 서열 정보를 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간, 마우스, 랫트 및 원숭이 EphA4의 염기 서열 정보는 각각 Genbank 수탁 번호 NM_004438.5, NM_007936.3, NM_001162411.1, NM_001260870.1로서 데이터베이스에 등록된다.

일 양태에서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합하는 항체이다. 용어 "특이적 결합"은 전술한 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 용어이며, 항원 또는 에피토프에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특이적 결합을 결정하는 방법도 잘 알려져 있다. 일 구현예에서, "특이적 결합"은 항-EphA4 항체가 다른 표적 분자와의 결합에 비해 더 큰 결합 친화도 및 결합 활성으로, 더 신속하게 및/또는 더 긴 지속기간 동안 면역학적 반응에 의해 EphA4에 결합할 수 있는 것으로서 인식된다. 이는 EphA4에 특이적으로 결합하는 항체가 다른 표적 분자에 결합하지 않는다는 것을 의미하지 않는다. 다른 구현예에서, "특이적 결합"은 EphA4에 대해, 적어도 약 10^-7 M, 또는 적어도 약 10^-8 M, 또는 적어도 약 10^-9 M, 또는 그 미만의 KD를 갖는 항체에 의해 표시될 수 있다. 더욱이, 또 다른 구현예에서, "특이적 결합"은 면역학적 반응에 의해 EphA4에 결합하는 것으로서 인식되지만, Eph 수용체의 다른 패밀리 분자에는 실질적으로 결합하지 않는다.

일 양태에서, 항-EphA4 항체는 EphA4의 세포외 영역에 결합하는 항체이다. 일 구현예에서, 항-EphA4 항체는 EphA4의 세포외 영역 중 리간드 결합 도메인(LBD)에 결합하는 항체이다.

일 구현예에서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합할 수 있고, EphA4의 절단을 향상시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합하고, 기질 메탈로프로테아제(MMP) 또는 ADAM(디스인테그린 및 메탈로프로테이나제)에 의한 EphA4 세포외 도메인의 절단을 향상시킬 수 있다.

일 구현예에서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합할 수 있고, EphA4와 이의 리간드 에프린 사이의 결합을 억제할 수 있다.

다른 구현예에서, 항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합할 수 있고, 해마 뉴런에서의 가시의 수를 증가시키거나 해마 뉴런의 가시를 안정화시킬 수 있다.

다른 구현예에서, 항-EphA4 항체는 SOD1 유전자 이상에 의해 유발된 세포 사멸로부터 운동 뉴런을 보호할 수 있다.

일 구현예에서, 본 개시내용은 인간 EphA4, 마우스 EphA4, 랫트 EphA4 및 원숭이 EphA4 중 적어도 하나에 특이적으로 결합할 수 있고 이의 리간드와의 결합을 억제할 수 있는 항-EphA4 항체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 개시내용은 인간 EphA4, 마우스 EphA4, 랫트 EphA4 및 원숭이 EphA4 중 2 개 이상에 특이적으로 결합할 수 있고 이의 리간드와의 결합을 억제할 수 있는 항-EphA4 항체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 인간 EphA4, 마우스 EphA4, 랫트 EphA4 및 원숭이 EphA4 모두에 특이적으로 결합할 수 있고 이의 리간드와의 결합을 억제할 수 있는 항-EphA4 항체를 포함한다.

항원에 대한 항-EphA4 항체의 결합 특성(예컨대, 결합 친화도 및 종간 반응성)을 측정하는 방법에 대해, 전술한 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도는 비제한적으로 Biacore^TM 바이오센서, KinExA 바이오센서, 신틸레이션 근접 검정, ELISA, (IGEN으로부터의) ORIGEN 면역검정, 유세포 측정법, 형광 소광, 형광 전이, 효모 디스플레이 및/또는 면역염색을 사용하여 측정될 수 있다. EphA4와 이의 리간드 사이의 결합에 대한 항-EphA4 항체의 중화 활성은 비제한적으로 Biacore^TM 바이오센서, ELISA 및/또는 유세포 측정법을 사용하여 측정될 수 있다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 EphA4에 결합하는 한 모노클로날 항체일 수 있다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 서브클래스)과 같은 임의의 부류일 수 있으며, 특정 부류에 제한되지 않는다. 면역글로불린은 중쇄의 불변 영역(때때로 H 쇄로도 지칭됨)의 항체 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 분류된다. 주요 면역글로불린 부류는 5 개(IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)가 있으며, 그 중 일부는 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂와 같은 하위부류(아이소타입)으로 더 세분될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 중쇄의 상응하는 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 더욱이, 항체의 경쇄(때때로 L 쇄로도 지칭됨)의 유형은 λ 쇄 및 κ 쇄이다. 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 IgG 항체일 수 있으며, 예를 들어, IgG₁ 항체 또는 IgG₂ 항체 등일 수 있다. 더욱이, 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 일부 경우에 단량체, 이합체 또는 다합체의 형태일 수 있다.

본 개시내용에 따른 항체의 가변 영역은 항체 경쇄의 가변 영역 및/또는 항체 중쇄의 가변 영역을 의미할 수 있으며, 항체의 불변 영역은 항체 경쇄의 불변 영역 및/또는 항체 중쇄의 불변 영역을 의미할 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 상보성-결정 영역으로도 알려진 3 개의 CDR에 의해 연결된 4 개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄의 CDR은 FR에 근접하여 유지되며, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 기술은 예를 들어, (1) 종간 서열 가변성에 기반한 접근법(예컨대, 문헌[Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정 구조 연구에 기반한 접근법(Al-lazikani et al., 1997 J. Molec. Biol. 273:927-948)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 및 다른 접근법은 조합하여 이용될 수 있다.

본 명세서에서, 모노클로날 항체는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미할 수 있다. 즉, 집단에 함유된 개별 항체는 존재할 수 있는 몇 가지 가능한 자연 돌연변이체를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 지시되고, 극도로 특이적이다. 또한, 상이한 항원 또는 상이한 에피토프를 표적화하는 전형적인 폴리클로날 항체와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원의 단일 에피토프를 표적화한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로서 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 마우스 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 키메라 항체는 예를 들어, 인간 항체의 불변 영역과 융합된 비-인간(예컨대, 마우스 또는 랫트) 항체의 가변 영역을 갖는 항체이며, 예를 들어, 가변 영역이 비-인간 항체로부터 유래되고 불변 영역이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭할 수 있다. 인간화된 항체는 예를 들어, 인간 항체에 도입된 비-인간 항체의 상보성-결정 영역(CDR(때때로 초가변 영역으로도 지칭됨))을 갖는 항체이며, 예를 들어, CDR이 비-인간 항체로부터 유래되고 나머지 항체 영역이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭할 수 있다. 키메라 항체와 인간화된 항체 사이의 경계가 반드시 명확할 필요는 없으며, 이것이 키메라 항체 또는 인간화된 항체라고 칭할 수 있는 상태일 수 있음에 주목한다. 또한, 키메라 항체 또는 인간화된 항체에서, 인간 항체-유래된 항체 영역(FR, 불변 영역)은 반드시 모두 인간 항체로부터 유래된 아미노산으로 구성될 필요는 없으며, 인간 대상체에서 정상적으로 사용될 수 있는 한, 하나 이상의 비-인간 항체-유래된 아미노산을 포함할 수 있다. 인간화된 항체의 일 구현예는 CDR이 설치류 항체로부터 유래되고 나머지 항체 영역이 인간 항체로부터 유래된 항체이다. 인간화된 항체의 특정 구현예는 CDR이 마우스 항체로부터 유래되고 나머지 항체 영역이 인간 항체로부터 유래된 항체이다. 이들 구현예에서, CDR은 하나 이상의 비-설치류 항체로부터 유래된 아미노산 또는 하나 이상의 비-마우스 항체로부터 유래된 아미노산을 포함할 수 있고, CDR 이외의 항체 영역은 하나 이상의 비-인간 항체로부터 유래된 아미노산을 포함할 수 있다. 여기서, "더 많은"은 2 내지 20개, 또는 2 내지 15개, 예컨대, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개, 또는 아미노산 서열 내의 아미노산의 수의 10% 이내, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내 또는 1% 이내이나, 이에 제한되지 않는다. 인간화는 CDR 이식 방법(문헌[Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001)] 및 문헌[Tsurushita et al., Methods 36:69-83 (2005)])을 이용하여 수행될 수 있거나, 이는 전술한 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 인간 항체의 상응하는 서열을 갖는 CDR 서열을 치환함으로써 수행될 수도 있다(예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)]; 및 문헌[Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)] 참고).

항원성을 감소시키기 위해서는, 인간화된 항체 생성 시 경쇄 및 중쇄 둘 모두에 대한 인간 가변 영역의 사용을 선택하는 것이 중요할 수 있다. "최적" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 영역의 서열은 알려진 인간 FR 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 다음으로, 설치류 서열에 가장 근접한 인간 서열은 인간화된 항체의 인간 FR로서 인정된다. 예를 들어, 문헌[Sims et al., J. Immunol. 151:2296-2308 (1993)] 및 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)] 참고. 다른 방법에서, 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 전체 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크가 이용된다. 여러 상이한 인간화된 항체에 대해 동일한 프레임워크가 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 89:4285-4289 (1992)] 및 문헌[Presta et al., J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993)] 참고.

또한, 인간화된 항체는 일반적으로 항원 및 다른 바람직한 생물학적 성질에 대해 높은 결합 친화도를 유지하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 하나의 방법에 따르면, 모 서열 및 인간화된 서열의 3 차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념의 인간화된 산물을 분석하는 단계에 의해 인간화된 항체가 제조된다. 3 차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용 가능하며, 당업자에게 알려져 있다. 선택된 후보인 면역글로불린 서열의 유망한 3 차원 입체형태를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이들 디스플레이를 조사함으로써, 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 이의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능할 것이다. 이 방법에 의해, FR 잔기는 수용자 서열 및 임포트(import) 서열로부터 선택되고 조합될 수 있으므로, 단일 또는 다중 표적 항원(예컨대, EphA4 또는 이의 단편)에 대한 결합 친화도의 증가와 같은 바람직한 항체 특성이 달성된다.

또한 (대안적으로, 전술한 항체에 첨가하거나, 이의 기능을 개선시키기 위해) 위에 예시된 키메라 항체 또는 인간화된 항체가 전술한 항체의 기능을 유지하면서 적절히 변경된 항체(예컨대, 항체의 변형 또는 항체의 아미노산 서열의 부분적 치환, 첨가 및/또는 결실)가 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체에 포함되는 것은 말할 필요도 없다. 보다 구체적으로, 항체의 이펙터 기능을 변형시키기 위해 불변 영역의 아미노산 서열이 변경된 항체도 본 개시내용의 범주에 포함되며, 예를 들어, 항체 의존적 세포 독성(ADCC) 활성 및/또는 항체-의존적 세포 식세포작용(ADCP) 활성을 감소시키기 위해 Eu 넘버링에 대해 인간 IgG₂ 항체의 위치 234에서의 발린(Val)이 알라닌(Ala)으로 치환되고 위치 237에서의 글리신(Gly)이 알라닌(Ala)으로 치환되는 항체 등도 본 개시내용의 범주에 포함된다. 또한, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위와 함께 조합된 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체의 CDR 서열을 갖는 항체 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체(Kontermann (2012), mAbs 4, 182-97)도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 원하는 경우 변형될 수 있다. 항-EphA4 항체의 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태와 같은 변형 영역에서 아미노산 서열의 3 차원 구조; (b) 표적 부위에서의 분자 전하 또는 소수성 상태; 또는 (c) 측쇄 부피 유지에 대한 변형의 효과를 변화시키는 변형일 수 있거나, 이들 변화가 명확하게 관찰되지 않는 변형일 수 있다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체의 변형은 예를 들어, 구성 아미노산 잔기의 치환, 결실 및 첨가 등에 의해 달성될 수 있다.

본 명세서에서, 아미노산은 이의 가장 넓은 의미로 이용되며, 자연 아미노산, 예를 들어, 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp) 및 프롤린(Pro)뿐만 아니라 비-자연 아미노산, 예컨대, 아미노산 변이체 및 유도체를 포함한다. 당업자는 이러한 광범위한 정의를 고려할 때 본원의 아미노산이 예를 들어, L-아미노산; D-아미노산; 화학적으로 변형된 아미노산, 예컨대, 아미노산 변이체 및 아미노산 유도체; 체내에서 단백질의 구성요소가 아닐 것인 아미노산, 예컨대, 노르류신, β-알라닌 및 오르니틴; 뿐만 아니라 당업자에게 잘 알려진 아미노산 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 포함한다는 것을 자연스럽게 인식할 것이다. 비-자연 아미노산의 예는 α-메틸아미노산(예컨대, α-메틸알라닌), D-아미노산(예컨대, D-아스파르트산 및 D-글루탐산), 히스티딘-유사 아미노산(예컨대, 2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘), 측쇄에 과량의 메틸렌을 갖는 아미노산("호모" 아미노산), 및 측쇄에서의 카복실레이트 기능 기 아미노산이 설포네이트 기(예컨대, 시스테인산)로 치환되는 아미노산 등을 포함한다.

예를 들어, 자연-발생 아미노산 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 기반하여 다음의 그룹으로 분류될 수 있다.

(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Asn, Gln, Cys, Ser, Thr;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

항체를 구성하는 아미노산 서열의 비보존적 치환은 이들 그룹 중 하나에 속하는 아미노산을 다른 그룹에 속하는 아미노산으로 교환함으로써 수행될 수 있다. 보다 보존적인 치환은 이들 그룹 중 하나에 속하는 아미노산을 동일한 그룹 내의 다른 아미노산으로 교환함으로써 수행될 수 있다. 유사하게, 아미노산 서열의 결실 또는 치환이 적절하게 수행될 수 있다.

항체를 구성하는 아미노산의 변형은 예를 들어, 당에 의한 글리코실화, 아세틸화 또는 인산화와 같은 번역-후 변형일 수 있다. 항체는 이의 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화될 수 있다. 항체의 글리코실화는 일반적으로 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화이다. N-연결된은 아스파라긴 잔기 측쇄에 대한 당 부분의 결합을 의미한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인(여기서 X는 프롤린 이외의 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 당 부분을 효소적으로 첨가하기 위한 인식 서열이다. 잠재적인 글리코실화 부위는 항체에 이러한 트리펩티드 서열 중 임의의 것의 존재에 의해 존재한다. O-연결된 글리코실화는 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 임의의 것의 하이드록시 아미노산(예컨대, 세린 또는 트레오닌)에 대한 결합일 수 있으며, 일부 경우에 5-하이드록시 프롤린 또는 5-하이드록시 리신에 대한 결합일 수 있다. 글리코실화 조건(예를 들어, 글리코실화가 생물학적 수단에 의해 수행되는 경우 숙주 세포 또는 세포 배지의 유형, 및 pH 등)은 목적에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 다른 변형 방법 단독 또는 조합에 의해 당업자에게 잘 알려진 기술적 상식에 기반하여 추가로 변형될 수 있다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체는, 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체를 인코딩하는 핵산을 발현 벡터로 통합하고, 전술한 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 전술한 숙주 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 항-EphA4 항체를 인코딩하는 핵산, 전술한 핵산을 포함하는 벡터, 전술한 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 전술한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-EphA4 항체를 생성하는 방법을 포함한다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체를 인코딩하는 핵산은 신호 서열을 인코딩하는 DNA를 가질 수 있으며, 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA의 5'-말단에 신호 서열을 인코딩하는 DNA를 가질 수 있다. 신호 서열은 분비 단백질 또는 내재성 막 단백질이 리보솜에서 합성된 후 지질 이중층을 통과하기 위해 필요한 단백질의 N-말단에 존재하는 아미노산 잔기이며, 본 개시내용에서 이 기능을 갖는 서열인 한 특별히 제한되지 않는다. 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체가 포함할 수 있는 신호 서열은 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 당나귀, 염소, 말, 새, 개, 고양이 및 효모 등으로부터 유래된 신호 서열을 포함한다. 본 개시내용에서, 구체적으로, 중쇄와 관련된 신호 서열은 SEQ ID NO. 12 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있으며, 경쇄와 관련된 신호 서열은 SEQ ID NO. 14 또는 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다. 더욱이, SEQ ID NO. 12 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO. 14 또는 18로 표시되는 아미노산 서열은 기능적으로 동등한 경우 하나 이상의(예컨대, 2, 3, 4 또는 5 개의) 아미노산의 치환, 첨가 및/또는 결실을 가질 수 있다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 단리 또는 정제된 것들일 수 있다.

본 명세서에서, "단리된" 또는 "정제된"은 자연 상태로부터 인공적으로 단리되거나 정제된 것을 의미한다. 분자 또는 조성물이 자연적으로 발생하는 경우, 이것이 원래의 환경으로부터 변화되거나 제거되거나 둘 모두일 때 이는 "단리"되거나 "정제"된다. 단리 또는 정제 방법의 예는 전기영동, 분자생물학, 면역학적 또는 크로마토그래피 방법 등을 포함하며, 구체적으로는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 HPLC 크로마토그래피, 등전점 전기영동 또는 알칼리 추출 방법 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일 구현예에서, 항-EphA4 항체는 다음의 CDR을 포함한다:

(a) SEQ ID NO. 44에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1;

(b) SEQ ID NO. 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2;

(c) SEQ ID NO. 28에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3;

(d) SEQ ID NO. 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1;

(f) SEQ ID NO. 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3.

일 구현예에서, 항-EphA4 항체는 인간화된 항체 또는 키메라 항체이며, 특정 구현예에서는 인간화된 항체이다.

다른 구현예에서, 항-EphA4 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 SEQ ID NO. 45에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함하며, 경쇄는 SEQ ID NO. 46에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 전술한 구현예에서, 중쇄의 가변 영역 및/또는 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO. 45에 나타낸 아미노산 서열 및/또는 SEQ ID NO. 46에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환되고/치환되거나, 첨가되고/첨가되거나, 결실된 아미노산 서열을 포함할 수 있음에 주목한다. 여기서, "더 많은"은 EphA4에 대한 결합 친화도가 유지되고 EphA4의 절단이 향상되는 한 제한되지 않으며, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개, 예컨대, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개, 또는 아미노산 서열 내의 아미노산의 수의 10% 이내, 예컨대, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 또는 1% 이내이다.

일 구현예에서, 항-EphA4 항체의 중쇄는 인간 IgG₂의 불변 영역을 포함한다.

특정 구현예에서, 인간 IgG₂의 불변 영역은 SEQ ID NO. 47의 아미노산 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 항-EphA4 항체의 경쇄는 인간 Igκ의 불변 영역을 포함한다.

특정 구현예에서, 인간 Igκ의 불변 영역은 SEQ ID NO. 48의 아미노산 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 항-EphA4 항체는 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

다른 구현예에서, 예를 들어, 항체-생산 세포에 의해 생산된 항체의 불균일성을 감소시키려는 목적으로(미국 특허 출원 공개공보 번호 2010/0297697 또는 문헌[Liu H et al., MAbs. 2014 Sep-Oct; 6 (5): 1145-1154]), 항-EphA4 항체에는 중쇄의 C-말단(카복시 말단)에 위치한 리신이 결실되어 있다. 본 개시내용에서, 중쇄의 C-말단 리신이 결실된 항-EphA4 항체는 유전적 변형에 의해 중쇄의 C-말단 리신이 결실된 항-EphA4 항체, 또는 중쇄의 C-말단 리신이 카복시펩티다제 등에 의해 번역-후 절단된 항-EphA4 항체 등을 포함한다. 더욱이, 본 개시내용에서, 중쇄의 C-말단 리신이 결실된 항-EphA4 항체는 두 중쇄 모두에서 C-말단 리신이 결실된 항-EphA4 항체뿐만 아니라, 하나의 중쇄에서만 C-말단 리신이 결실된 항-EphA4 항체도 포함한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 항-EphA4 항체를 인코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 항-EphA4 항체를 인코딩하는 단리된 핵산은 항-EphA4 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 본 개시내용에 따른 핵산은 항-EphA4 항체의 중쇄를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 본 개시내용에 따른 핵산은 항-EphA4 항체의 경쇄를 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용에 따른 핵산은 항-EphA4 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩한다. 본 개시내용에 따른 핵산은 항-EphA4 항체의 중쇄를 인코딩하는 제1 핵산 분자 및 항-EphA4 항체의 경쇄를 인코딩하는 제2 핵산 분자도 포함한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 항-EphA4 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 개시내용에 따른 벡터는 항-EphA4 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터를 지칭한다. 일 구현예에서, 본 개시내용에 따른 벡터는 항-EphA4 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산 및 항-EphA4 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터이다. 다른 구현예에서, 본 개시내용에 따른 벡터는 항-EphA4 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용에 따른 벡터는 항-EphA4 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항-EphA4 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 본 개시내용에 따른 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 및 파지 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 바이러스 벡터로서, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 또는 단순 헤르페스 바이러스 벡터 등도 본 개시내용에 따른 벡터에 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용에는 본 개시내용에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 전술한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항-EphA4 항체를 생성하는 방법도 포함된다. 본 개시내용에 따른 숙주 세포는 E. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 및 NS0 세포 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 항-EphA4 항체를 생성하는 방법은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 전술한 숙주 세포(또는 숙주 세포의 배양 배지)로부터 분비된 항-EphA4 항체를 수집하는 단계를 포함한다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 ALS 치료에 사용된다. 따라서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체를 포함하는, ALS를 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 ALS를 앓고 있는 대상체에 항-EphA4 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, ALS 치료 방법도 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 ALS에 대한 치료적 약물을 제조하기 위한 항-EphA4 항체의 용도도 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 ALS 치료에 사용하기 위한 항-EphA4 항체도 포함한다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 치료적 방법에서 단독으로 또는 다른 제제 또는 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체는 다른 제제와 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 이러한 조합 요법은 조합 투여(동일한 또는 별도의 제형에 2 개 이상의 제제가 함유됨) 및 개별 투여(예컨대, 동시 또는 순차적)를 포함한다. 2 개 이상의 제제가 개별적으로 투여되는 경우, 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체의 투여는 동시 치료 방법 전 또는 후에 수행될 수 있다.

본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체가 투여될 대상체는 제한되지 않으며, 예를 들어, 본 발명은 인간 또는 비-인간 포유동물(예컨대, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 소, 말, 염소)에 이용될 수 있다.

대상체에 대한 본 개시내용에 따른 항-EphA4 항체의 투여 방법(투여 경로, 투여량, 1 일당 투여 횟수, 및 투여 시기 등)은 특별히 제한되지 않으며, 이는 대상체의 건강 상태, 질환의 정도, 및 조합하여 사용되는 제제의 유형 등에 따라 당업자(예컨대, 의사)에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본 개시내용에 따른 약학 조성물은 본 개시내용에 따른 위의 항-EphA4 항체를 포함한다. 본 개시내용에 따른 약학 조성물은 예를 들어, 일본 약전(JP), 미국 약전(USP) 또는 유럽 약전(EP)에 기재된 방법과 같은 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다.

당업자는 기술적으로 모순되지 않는 한, 본 개시내용을 수행하기 위해 본원에 기재된 임의의 그리고 모든 양태 중 어느 하나 이상이 적절하게 조합될 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 당업자는 기술적으로 모순되지 않는 한, 본 개시내용을 수행하기 위해 본원에 기재된 임의의 그리고 모든 바람직하거나 유리한 양태가 적절하게 조합되는 것이 바람직할 것임을 인식할 것이다.

본원에 인용된 문헌의 모든 개시내용은 참조로 본원에 명확하게 인용된 것으로서 간주되어야 하며, 당업자는 이러한 문헌 내의 관련된 개시된 내용을 본 개시내용의 사상 및 범주로부터 벗어남 없이 본원의 문맥에 따라 본 명세서의 일부로서 인용하고 인식할 수 있다.

본원에 인용된 문헌은 본 출원의 출원일 이전의 관련된 기술을 개시할 목적으로만 제공되며, 본 발명이 선행 발명 또는 임의의 다른 이유로 인해 상기 개시내용에 선행할 권리를 보유하지 않는다는 것을 본 발명자들이 인정하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 이들 문헌 내의 모든 설명은 본 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며, 어떠한 방식으로든 이러한 설명의 내용이 정확하다는 점을 구성하지 않는다.

본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위해 이용되며, 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.

본원에 사용된 용어 "포함하다(comprise)"는 그 내용이 달리 이해되도록 명확하게 나타내지 않는 한, 기재된 항목(예컨대, 구성요소, 단계, 요소 또는 숫자)의 존재를 의도하며, 다른 항목(예컨대, 구성요소, 단계, 요소 및 숫자)의 존재를 배제하지 않는다. 용어 "이루어지다(consist of)"는 용어 "이루어지다" 및/또는 "본질적으로 이로 이루어지다(consist essentially of)"로 기재된 양태를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "중화 활성"은 EphA4와 이의 리간드 사이의 결합을 억제하는 활성 및/또는 살아있는 인간의 신체에서 이의 리간드에 결합함으로써 EphA4에 의해 유도되는 세포의 신호 전달 및 분자 발현 반응 또는 기능적 변화를 억제하는 활성을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, (기술적 또는 과학적 용어를 포함하여) 본원에 사용되는 모든 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 광범위하게 인식되는 것과 동일한 의미를 갖고 있다. 본원에 사용된 용어는 달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본원 및 관련된 기술 분야에서의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로서 해석되어야 하며, 이상화되거나 과도하게 형식적인 의미를 갖는 것으로서 해석되어서는 안 된다.

제1 및 제2와 같은 용어는 다양한 요소를 표현하기 위해 사용되며, 이들 요소는 이들 용어 자체에 의해 제한되지 않음을 인식해야 한다. 이들 용어는 단지 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위한 목적으로만 사용되며, 예를 들어, 제1 요소를 제2 요소로서 기재하고, 유사하게, 본 개시내용의 범주로부터 벗어남 없이 제2 요소를 제1 요소로서 기재하는 것이 가능하다.

구성요소 함량 또는 수치 범위 등을 나타내기 위해 본원에 사용된 수치는 명시적으로 나타내지 않는 한, 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로서 이해되어야 한다. 예를 들어, "4℃"는 명시적으로 표시하지 않는 한, "약 4℃"의 의미로서 인식되며, 당업자가 기술적 상식 및 본 명세서의 의미에 따라 자연스럽게 그 정도를 합리적으로 인식할 수 있다.

문맥상 달리 의미하는 것으로 명확하게 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 본원의 청구범위에서 사용되는 경우, 기술적으로 모순되지 않는 한, 단수 형태로 표현된 각각의 양태는 복수 형태일 수도 있으며, 그 역도 마찬가지임이 인식되어야 한다.

본 개시내용은 이제 실시예를 참조하여 더 상세히 설명될 것이다. 그러나, 본 개시내용은 다양한 양태로 구현될 수 있으며, 본원에 기재된 실시예에 제한되는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 관련 기술 분야의 당업자는 다양한 변형, 부가, 삭제, 및 치환 등으로 본 개시내용의 사상 및 범주를 변화시키지 않으면서 본 개시내용을 수행할 수 있다.

실시예

참고예 1: 항-EphA4 모노클로날 항체의 생성

(A) 마우스 항-EphA4 모노클로날 항체의 생성

마우스 EphA4(Genbank 수탁 번호 NP_031962.2, SEQ ID NO. 1)에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 마우스 EphA4의 세포외 영역에 융합된 분비성 알칼리성 포스파타제(SEAP) 및 히스티딘 태그를 갖는 단백질(위치 20 내지 547)(SEQ ID NO. 2)(이하 "마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질"로 지칭됨, SEQ ID NO. 3)을 다음의 단계에 의해 제조하였다.

먼저, 마우스 EphA4의 신호 서열(SEQ ID NO. 4) 및 세포외 영역(SEQ ID NO. 2)을 인코딩하는 DNA 서열을 마우스 뇌로부터 유래된 총 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, SEAP 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pENTR1A 벡터(Invitrogen/Life Technologies)의 SalI/NotI 부위 내로 클로닝하였다. 다음으로, 마우스 EphA4의 신호 서열 및 세포외 영역, SEAP 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 게이트웨이 시스템(Invitrogen/Life Technologies)의 LR 반응에 의해 pcDNA 3.1_rfcB 벡터에 옮기고, pcDNA 3.1-마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 발현 벡터를 작제하였다. 작제된 pcDNA 3.1-마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 발현 벡터를 TransIT-LT1(TAKARA)로 HEK293EBNA 세포(Invitrogen/Life Technologies) 내로 형질주입시켰다. 6 일의 항온처리 후(5% CO₂, 37℃), 배양 상층액을 수집하였다. 수집된 배양 상층액으로부터, 마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질(SEQ ID NO. 3)을 Protino 컬럼(MACHEREY-NAGEL)으로 정제하였다.

20 마이크로그램의 마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질을 동일한 양의 TiterMax Gold 아쥬반트(TiterMax USA) 또는 GERBU 아쥬반트(GERBU Biotechnik GmbH)와 혼합하고, Balb/c 마우스의 발바닥에 피하 주사하였다. 마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질을 3 일차, 7 일차 및 10 일차에 유사하게 투여하였다. 그렇게 함으로써, TiterMax Gold 아쥬반트(TiterMax USA)는 10 일차에만 사용하고, GERBU 아쥬반트(GERBU Biotechnik GmbH)는 3 일차, 7 일차 및 10 일차에 사용하였다. 13 일차에 마우스를 희생시키고, 림프절 세포를 제조하기 위해 말초 림프절을 사용하였다. GenomeONE-CF(Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.)의 존재 하에, 제조된 림프절 세포 및 P3U1 골수종 세포(Kyoto University로부터 기증됨)를 5:1의 비율로 융합시켰다. 융합된 세포를 96-웰 플라스틱 플레이트에서 배양하였다. 7 일의 항온처리 후(5% CO₂, 37℃), 배양 상층액을 수집하였다.

마우스, 랫트 및 인간 EphA4에 대한 반응성을 갖는 웰을 채취하기 위해, 수득된 배양 상층액을 이용하였다.

마우스, 랫트 및 인간 EphA4에 대한 반응성을 인간 IgG₁의 Fc 영역, 및 마우스 EphA4의 세포외 영역, 랫트 EphA4(Genbank 수탁 번호 NP_001155883.1)의 세포외 영역(위치 20 내지 547) 또는 인간 EphA4(Genbank 수탁 번호 NP_004429.1, SEQ ID NO. 5)의 세포외 영역(위치 20 내지 547)(SEQ ID NO. 6)에 융합된 히스티딘 태그를 갖는 단백질(이하 각각 "마우스 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질", "랫트 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질" 또는 "인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질")을 이용한 ELISA로 평가하였다.

마우스, 랫트 또는 인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질을 다음의 단계에 의해 제조하였다. 우선, pcDNA 3.1-마우스, 랫트 또는 인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 발현 벡터를 작제하였다. 먼저, 마우스, 랫트 또는 인간 EphA4의 신호 서열 및 세포외 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 마우스, 랫트 또는 인간 뇌로부터 유래된 총 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, Fc 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pENTR1A 벡터(Invitrogen/Life Technologies)의 SalI/NotI 부위 내로 클로닝하였다. 다음으로, 마우스, 랫트 또는 인간 EphA4의 신호 서열 및 세포외 영역, Fc 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 게이트웨이 시스템(Invitrogen/Life Technologies)의 LR 반응에 의해 pcDNA 3.1_rfcB 벡터에 옮기고, pcDNA 3.1-마우스, 랫트 또는 인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 발현 벡터를 작제하였다. 이러한 작제된 발현 벡터를 TransIT-LT1(TAKARA)로 HEK293EBNA 세포(Invitrogen/Life Technologies) 내로 형질주입시켰다. 6 일의 항온처리 후(5% CO₂, 37℃), 배양 상층액을 수집하였다.

마우스, 랫트 또는 인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질을 이용한 ELISA를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1 x Block Ace(Dainippon Pharmaceutical)에 의해 차단하였다. 0.02% Tween 20/PBS(Nacalai Tesque)로 3 회 세척한 후, 마우스, 랫트 또는 인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질을 포함하는 배양 상층액을 각각의 웰에 첨가하고(최종 농도 1 nM), 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 융합된 세포의 배양 상층액을 각각의 웰에 보충하였다. 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고 3 회 세척한 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척한 후, TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 5 내지 20 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 동등한 양의 켄칭 용액(2N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 각각의 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

한계 희석법으로 위의 단계를 거친 후 채취한 웰로부터 하이브리드도마를 클로닝하여, 궁극적으로 마우스, 랫트 및 인간 EphA4에 대한 결합 활성을 갖는 마우스 항-EphA4 항체를 발현하는 하이브리드도마 클론을 산출하였다.

수득된 하이브리도마 클론을 배양하고, 단백질 A(GE Healthcare)를 이용하여 배양 상층액으로부터 마우스 항-EphA4 모노클로날 항체를 정제하였다.

(B) EphA4 절단 향상 활성의 평가

랫트 해마 뉴런의 제조를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 임신 18 일차에 랫트로부터 태아를 적출하고(Charles River Laboratories Japan), 뇌를 적출하기 위해 머리를 절개하였다. 입체현미경 하에서 해마 영역을 잘라낸 후, 이들을 소화 용액(137 mM NaCl(Wako Pure Chemicals), 5 mM KCl(Wako Pure Chemicals), 7 mM Na₂HPO₄(Wako Pure Chemicals), 25 mM Hepes(DOJINDO), 0.5 mg/mL DNase(Sigma), 0.25% 트립신(Life technologies))에 넣고, 10 분 동안 37℃에서 진탕하였다. 용액을 제거하고, 20% 태아 소 혈청/행크스 완충액(Sigma)을 첨가하였다. 액체를 제거하고, 이를 행크스 완충액으로 2 회 세척한 다음, 해마 조직을 행크스 완충액에 피펫팅하여, 세포 현탁액을 생성하였다. 세포를 배양 배지(Neurobasal 배지(Life technologies), 1 x B-27 보충제(Life technologies), 0.5 mM L-글루타민(Life technologies))로 충전된 폴리 L-리신으로 코팅된 96-웰 접시(Falcon)에 씨딩하였다.

해마 뉴런을 이용한 EphA4 절단 향상 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 96-웰 접시(Falcon)에 씨딩된 랫트 해마 뉴런을 항-EphA4 모노클로날 항체(67 nM) 및 γ-세크레타제 억제 약물 화합물 E(50 nM, Enzo Life Sciences)로 처리하고, 16 시간 후 PBS(Wako Pure Chemicals)로 세척하고, SDS 샘플 완충액(Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad) 및 5% 2-머캅토에탄올(Bio-Rad))을 첨가하고, 세포를 수집하고, 이를 5 분 동안 끓였다. 이 샘플로 SDS-PAGE를 수행하고, 항-EphA4 모노클로날 항체(Abnova)를 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하고, 밴드 강도를 정량화하고, EphA4 C-말단 단편/전장 EphA4의 값을 계산하였다.

EphA4의 절단을 향상시키는 활성을 갖는 마우스 항-EphA4 모노클로날 항체(항체 A)를 수득하였다. 항체 A의 아이소타입을 모노클로날 항체 아이소타이핑 키트(Serotec)에 의해 중쇄의 경우 IgG₁, 경쇄의 경우 κ인 것으로 결정하였다.

(C) 항체 A의 서열 분석

항체 A의 중쇄 및 경쇄의 신호 서열뿐만 아니라 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 5'-RACE(5'-cDNA 단부의 신속한 증폭) 방법에 의해 증폭하였다. 하이브리도마로부터, RNeasy(QIAGEN)로 총 RNA를 제조하고, DNase(QIAGEN, RNase free DNase 세트)로 처리하였다. cDNA 합성 키트(TAKARA)를 이용하여 총 RNA로부터 이중-가닥 cDNA를 제조하였다. 올리고 DNA ad29S(ACATCACTCCGT)(SEQ ID NO. 7) 및 올리고 DNA ad29AS(ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT)(SEQ ID NO. 8)의 어닐링으로부터 수득된 5' 어댑터를 cDNA에 첨가하였다. 수득된 cDNA를 5' 정방향 프라이머(5'-PCR4 프라이머, AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG)(SEQ ID NO. 9), 및 3' 역방향 프라이머(GCCAGTGGATAGACTGATGG(SEQ ID NO. 10)는 마우스 IgG 중쇄의 증폭에 이용하였고, GATGGATACAGTTGGTGCAGC(SEQ ID NO. 11)는 마우스 Igκ 경쇄의 증폭에 이용하였음)를 이용하여 증폭시켰다. 증폭된 cDNA를 pCR2.1 벡터(Invitrogen/Life Technologies) 내로 삽입하였다. 항체 A의 유전자 서열을 ABI3130XL로 분석하였다. 이 분석에 의해 식별된 항체 A의 유전자 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열로서, 중쇄 신호 서열은 SEQ ID NO. 12에 나타낸 서열이고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO. 13에 나타낸 서열이고, 경쇄 신호 서열은 SEQ ID NO. 14에 나타낸 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO. 15에 나타낸 서열이다. 항체 A의 유전자 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 중쇄 신호 서열은 SEQ ID NO. 16에 나타낸 서열이고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO. 17에 나타낸 서열이고, 경쇄 신호 서열은 SEQ ID NO. 18에 나타낸 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO. 19에 나타낸 서열이다.

항체 A의 중쇄 및 경쇄의 전장 서열을 다음의 단계로 수득하였다. 하이브리도마로부터, RNeasy(QIAGEN)로 총 RNA를 제조하고, DNase(QIAGEN, RNase free DNase 세트)로 처리하였다. RNA PCR 키트(TAKARA)를 이용하여 총 RNA로부터 역전사 산물을 제조하였다. 수득된 역전사 산물을 주형으로서 사용하여, 항체 A의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자 서열을 5' 정방향 프라이머(GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTGTCCTGGTGCTGCTCC(프라이머 ID 7455)(SEQ ID NO. 20)는 중쇄의 증폭에 사용하였고, GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGACATGAGGGTTCCTGCTCACG(프라이머 ID 7453)(SEQ ID NO. 21)는 경쇄의 증폭에 사용하였음), 및 3' 역방향 프라이머(GCGGAATTCATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC(프라이머 ID 7257)(SEQ ID NO. 22)는 중쇄의 증폭에 사용하였고, CGCGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC(프라이머 ID 7249)(SEQ ID NO. 23)는 경쇄의 증폭에 사용하였음)를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰고, 각각 pEE6.4 및 pEE12.4 벡터(Lonza) 내로 클로닝하였다. 유전자 서열을 ABI3130XL로 분석하였다. 이 분석에 의해 식별된 항체 A의 유전자 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열로서, 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO. 24에 나타낸 서열이며, 경쇄 불변 영역은 SEQ ID NO. 25에 나타낸 서열이다.

항체 A의 CDR을 다음의 방법으로 결정하였다. 항체 A의 아미노산 서열을 Kabat 넘버링 시스템에 따라 Abysis 소프트웨어(UCL)로 넘버링하였다. 이 숫자에 기반하여, CDR의 식별을 위해 Kabat 정의에 따라 결정이 이루어졌다. 항체 A의 CDR의 아미노산 서열은 표 1에 나타나 있다.

[표 1]

항체 A의 CDR의 아미노산 서열

참고예 2: 마우스 및 인간 EphA4에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체의 결합 친화도

마우스 및 인간 EphA4에 대한 항체 A의 결합 친화도를 Biacore T200(GE Healthcare)을 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR 방법)에 의해 결정하였다. 먼저, 항-His 항체(GE Healthcare, 28-9950-56)를 센서 칩 CM5에 고정시켰다. N-하이드록시석신이미드(NHS)와 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드 염(EDC)을 이용한 아민 커플링 방법에 의해 고정을 수행하고, 차단을 위해 에탄올아민을 이용하였다(고정을 위한 센서 칩 및 시약은 모두 GE Healthcare제임). 이를 고정 완충액(10 mM 아세트산나트륨, pH 4.5)으로 3.5 μg/mL까지 희석하고, Biacore T200에 수반되는 프로토콜에 따라 센서 칩 상에 고정시켰다. 마우스 또는 인간 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 10을 전개 완충액 HBS-EP(GE Healthcare, BR-1001-88)로 희석하고, 120 초 동안 유동 세포 상에 용액을 투입하고 포획하였다(약 10 RU의 포획량). 후속하여, HBS-EP를 이용하여 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.2, 1.6, 0 nM의 범위까지 연속 희석된 항체 A를 센서 칩에 120 초 동안 첨가하고, 첨가 시(결합 단계, 120 초) 및 첨가를 완료한 후(해리 단계, 600 초)에 결합 반응 곡선을 순차적으로 관찰하였다. 각각의 관찰의 완료 시, 4 M MgCl₂(60 초, Wako Pure Chemicals)를 첨가하여, 센서 칩을 재생시켰다. 수득된 결합 반응 곡선에 대해 시스템에 수반되는 소프트웨어인 BIA 평가 소프트웨어를 이용한 1:1 결합 모델에 의한 적합 분석을 수행하고, 마우스 및 인간 EphA4에 대한 결합 친화도(KD = kd/ka)를 계산하였다.

마우스 및 인간 EphA4에 대한 항체 A의 결합 친화도(KD 값)는 각각 1.32 x 10^-9 M 및 1.19 x 10^-9 M이었다(도 1). 마우스 및 인간 EphA4에 대한 다른 결합 매개변수는 거의 유사하였다. 따라서, 항체 A는 마우스 및 인간 EphA4에 대해 유사한 결합 친화도를 갖는 것으로 생각된다.

참고예 3: 해마 뉴런에서 항-EphA4 모노클로날 항체의 EphA4 절단 향상 활성

항체 A에 대해, 해마 뉴런을 이용한 EphA4 절단 향상 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 96-웰 접시(Falcon)에 씨딩된 랫트 해마 뉴런을 항체 A(2.0, 6.7, 20 nM) 및 γ-세크레타제 억제 약물 화합물 E(50 nM, Enzo Life Sciences)로 처리하고, 24 시간 후 PBS(Wako Pure Chemicals)로 세척하고, SDS 샘플 완충액(Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad) 및 5% 2-머캅토에탄올(Bio-Rad))을 첨가하고, 세포를 수집하고, 이를 5 분 동안 끓였다. 이 샘플로 SDS-PAGE를 수행하고, 항-EphA4 모노클로날 항체(Abnova)를 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하고, 밴드 강도를 정량화하고, EphA4 C-말단 단편/전장 EphA4의 값을 계산하였다.

항체 A는 해마 뉴런에서 EphA4 절단 반응을 농도-의존적으로 향상시켰다(도 2).

참고예 4: 항-EphA4 모노클로날 항체의 마우스 EphA4-마우스 리간드 결합 억제 활성

항체 A에 대해, 마우스 EphA4와 마우스 리간드 사이의 결합 억제 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 항-알칼리성 포스파타제 항체(Thermo SCIENTIFIC)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.02% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질을 웰에 첨가하고(최종 농도 10 nM), 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 리간드 및 항체 A(0, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 nM)를 웰에 보충하였다. 비오티닐화된 마우스 에프린A1-Fc 키메라(R&D Systems, 최종 농도 6 nM) 및 비오티닐화된 마우스 에프린B2-Fc 키메라(R&D Systems, 최종 농도 2.5 nM)를 리간드로서 이용하였음에 주목한다. 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고 3 회 세척한 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘(GE Healthcare)을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척한 후, TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 웰에 첨가하고, 2 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 A는 마우스 EphA4와 마우스 리간드 사이의 결합을 농도-의존적으로 억압하였고, 마우스 에프린A1 및 에프린B2 결합에 대한 IC₅₀값은 각각 약 5.9 nM 및 3.1 nM이었다(도 3). 따라서, 항체 A는 마우스 EphA4와 마우스 리간드 사이의 결합을 강력하게 억제하는 것으로 나타났다.

참고예 5: 항-EphA4 모노클로날 항체의 인간 EphA4-인간 리간드 결합 억제 활성

항체 A에 대해, 인간 EphA4와 인간 리간드 사이의 결합 억제 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 항-알칼리성 포스파타제 항체(Thermo SCIENTIFIC)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.05% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 인간 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질을 웰에 첨가하고(최종 농도 10 nM), 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 리간드 및 연속 희석된 항체 A(0, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 nM)를 웰에 보충하였다. 비오티닐화된 인간 에프린A5-Fc 키메라(R&D Systems, 최종 농도 0.7 nM) 및 비오티닐화된 인간 에프린B3-Fc 키메라(R&D Systems, 최종 농도 2.3 nM)를 리간드로서 이용하였음에 주목한다. 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고 3 회 세척한 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘(GE Healthcare)을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척한 후, TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 웰에 첨가하고, 2 내지 5 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices 또는 PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 A는 인간 EphA4와 인간 리간드 사이의 결합을 농도-의존적으로 억압하였고, 인간 에프린A5 및 에프린B3 결합에 대한 IC₅₀값은 각각 약 2.8 nM 및 1.4 nM이었다(도 4). 따라서, 항체 A는 인간 EphA4와 인간 리간드 사이의 결합도 강력하게 억제하는 것으로 나타났다.

참고예 6: 인간 Eph 수용체에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체의 선택성

참고예 1에 기재된 마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질의 제조 방법에 따라, 인간의 각 Eph 수용체(EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB6)의 신호 서열 및 세포외 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 조직으로부터 유래된 총 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, SEAP 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pENTR1A 벡터(Invitrogen/Life Technologies) 내로 클로닝하였다. 다음으로, 인간의 각 Eph 수용체의 신호 서열 및 세포외 영역, SEAP, 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 게이트웨이 시스템(Invitrogen/Life Technologies)의 LR 반응에 의해 pcDNA 3.1_rfcB 벡터에 옮기고, 인간의 각 Eph 수용체의 세포외 영역에 융합된 SEAP 및 His 태그를 갖는 단백질("Eph 수용체 세포외 영역-SEAP-His 단백질"로 지칭됨)을 발현하는 벡터("Eph 수용체 세포외 영역-SEAP-His 단백질 발현 벡터"로 지칭됨)를 작제하였다.

다음으로, Expi293 발현 시스템(Gibco/Thermo Fisher)을 이용하여, 인간의 각 Eph 수용체 세포외 영역-SEAP-His 단백질에 대한 발현 벡터를 Expi293F 세포(Gibco/Thermo Fisher) 내로 도입하였다. 5 일의 배양(5% CO₂, 37℃, 120 rpm) 후, 배양 상층액을 수집하고, 실온에서 1500 rpm으로 5 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 상층액을 0.45 μm 필터(Millipore)로 여과하였다.

항체 A에 대해, 인간 Eph 수용체의 결합 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

토끼 항-6-His 항체(Bethyl Laboratories)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.05% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 인간의 각 Eph 수용체 세포외 영역-SEAP-His 단백질(최종 농도 1 nM)을 각각의 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 인간 IgG 용액(100 μg/mL, Mitsubishi Pharma Corporation) 및 항체 A(10 μg/mL)를 웰에 보충하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 웰에 TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 첨가하고, 적당한 착색이 확인될 시, 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 A는 인간 Eph 수용체 패밀리 중에서 인간 EphA4에만 특이적인 결합 활성을 가졌다(도 5).

참고예 7: 마우스 Eph 수용체에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체의 선택성

참고예 1에 기재된 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질의 제조 방법에 따라, 마우스의 각 Eph 수용체(EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB6)의 신호 서열 및 세포외 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 조직으로부터 유래된 총 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, 인간 IgG₁의 Fc 영역 및 히스티딘 태그(Invitrogen/Life Technologies)를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pENTR1A 벡터 내로 클로닝하였다. 다음으로, 마우스의 각 Eph 수용체(EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB6)의 신호 서열 및 세포외 영역, Fc 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 게이트웨이 시스템(Invitrogen/Life Technologies)의 LR 반응에 의해 pcDNA 3.1_rfcB 벡터에 옮기고, 마우스의 각 Eph 수용체의 세포외 영역-Fc-His 단백질에 대한 발현 벡터를 작제하였다. 마우스 EphA2 세포외 영역-Fc-His 단백질 발현 벡터의 작제를 위해, 마우스 EphA2의 신호 서열 및 세포외 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 조직으로부터 유래된 총 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, Fc 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pcDNA 3.1 벡터 내로 클로닝하고, 마우스 EphA2 세포외 영역-Fc-His 단백질 발현 벡터를 작제하였다.

다음으로, Expi293 발현 시스템(Gibco/Thermo Fisher)을 이용하여, 마우스의 각 Eph 수용체 세포외 영역-Fc-His 단백질에 대한 발현 벡터를 Expi293F 세포(Gibco/Thermo Fisher) 내로 도입하였다. 5 일의 배양(5% CO₂, 37℃, 120 rpm) 후, 배양 상층액을 수집하고, 실온에서 1500 rpm으로 5 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 상층액을 0.45 μm 필터(Millipore)로 여과하였다.

항체 A에 대해, 마우스 Eph 수용체의 결합 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

토끼 항-6-His 항체(Bethyl Laboratories)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.05% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 마우스의 각 Eph 수용체 세포외 영역-Fc-His 단백질(최종농도 1 nM)을 각각의 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 인간 IgG 용액(100 μg/mL, Sigma) 및 항체 A(10 μg/mL)를 웰에 보충하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 웰에 TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 첨가하고, 적당한 착색이 확인될 시, 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 A는 마우스 Eph 수용체 패밀리 중에서 마우스 EphA4에만 특이적인 결합 활성을 가졌다(도 6).

참고예 8: 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체의 반응성

마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질의 생성을 다음의 단계에 따라 수행하였다. 먼저, 참고예 1에 기재된 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질의 제조 방법에 따라, 원숭이 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질 발현 벡터를 작제하였다. 벡터 작제에 활용된 원숭이 EphA4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 32에 나타나 있으며, 이의 세포외 영역은 SEQ ID NO. 33에 나타나 있다. 참고예 1에 기재된 원숭이 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질 발현 벡터뿐만 아니라 마우스, 랫트 및 인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질 발현 벡터를 이용하여, 다양한 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질을 제조하였다.

항체 A에 대해, 다양한 EphA4 세포외 영역과의 결합 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

당나귀 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.05% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질(최종 농도 1 nM)을 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 인간 IgG 용액(100 μg/mL, Mitsubishi Pharma Corporation) 및 항체 A(0, 0.00013, 0.00064, 0.0032, 0.016, 0.08, 0.4, 2, 10 μg/mL)를 웰에 보충하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 웰에 TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 첨가하고, 적당한 착색이 확인될 시, 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 A는 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4 중 임의의 것에서 동등한 결합 활성을 가졌다(도 7).

참고예 9: 인간 EphA4 세포외 영역, 리간드 결합 도메인, 피브로넥틴 유형 III 도메인 1 및 피브로넥틴 유형 III 도메인 2에 대한 항-EphA4 모노클로날 항체의 반응성

말토스-결합 단백질(MBP)에 융합된 인간 EphA4의 세포외 영역(ECD), 리간드 결합 도메인(LBD), 피브로넥틴 유형 III 도메인 1(FN1) 또는 피브로넥틴 유형 III 도메인 2(FN2), 및 히스티딘 태그를 갖는 단백질(이하 "인간 EphA4 세포외 영역-MBP-His 단백질", "인간 EphA4 리간드 결합 도메인-MBP-His 단백질", "인간 EphA4 피브로넥틴 유형 III 도메인 1-MBP-His 단백질", 및 "인간 EphA4 피브로넥틴 유형 III 도메인 2-MBP-His 단백질"로 지칭됨)의 생성을 다음의 단계에 따라 수행하였다. 우선, pcDNA 3.4-인간 EphA4 세포외 영역, 리간드 결합 도메인, 피브로넥틴 유형 III 도메인 1 또는 피브로넥틴 유형 III 도메인 2-MBP-His 발현 벡터를 작제하였다. 먼저, 인간 EphA4의 신호서열(SEQ ID NO. 34) 또는 프리프로트립신의 신호 서열(SEQ ID NO. 35) 및 인간 EphA4의 각 도메인을 인코딩하는 DNA 서열을 PCR에 의해 증폭시키고, MBP 및 히스티딘 태그(Invitrogen/Life Technologies)를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pcDNA 3.4 벡터 내로 클로닝하고, 인간 EphA4 세포외 영역-MBP-His 단백질, 인간 EphA4 리간드 결합 도메인-MBP-His 단백질, 인간 EphA4 피브로넥틴 유형 III 도메인 1-MBP-His 단백질 및 인간 EphA4 피브로넥틴 유형 III 도메인 2-MBP-His 단백질용 발현 벡터를 작제하였다. 벡터 작제에 활용된 인간 EphA4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 5에 나타나 있고, 이의 세포외 영역은 SEQ ID NO. 36에 나타나 있고, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO. 37에 나타나 있고, 피브로넥틴 유형 III 도메인 1은 SEQ ID NO. 38에 나타나 있으며, 피브로넥틴 유형 III 도메인 2는 SEQ ID NO. 39에 나타나 있다. Expi293 발현 시스템(Thermo SCIENTIFIC)을 이용하여, 위의 발현 벡터를 Expi293F 세포(Thermo SCIENTIFIC) 내로 형질주입시켰다. 4 일 후, 배양 상층액을 수집하고, 0.45 μm 필터(Millipore)를 통과시켰다. 거친 정제(crude purification)를 아밀로스 수지(NEB)로 수행하고, 완충액을 Zeba Spin 탈염 컬럼(Thermo SCIENTIFIC)을 사용하여 PBS(Wako Pure Chemicals)로 대체하였다. 단량체 분획을 Superdex 200 10/300(GE Healthcare)으로 분획 정제하였다.

항체 A에 대해, 인간 EphA4 내의 다양한 도메인과의 결합 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

토끼 항-6-His 항체(Bethyl Laboratories)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.02% Tween 20/PBS(Nacalai Tesque)로 2 회 세척한 후, 인간 EphA4 세포외 영역-MBP-His 단백질, 인간 EphA4 리간드 결합 도메인-MBP-His 단백질, 인간 EphA4 피브로넥틴 유형 III 도메인 1-MBP-His 단백질, 및 인간 EphA4 피브로넥틴 유형 III 도메인 2-MBP-His 단백질(최종 농도 10 nM)을 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 항체 A(최종 농도 10 nM)를 웰에 보충하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 염소 항-마우스 IgG Fcγ 단편 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 5 회 세척 후, TMB 용액(KPL)을 웰에 첨가하고, 적당한 착색이 확인될 시, 동등한 양의 켄칭 용액(2 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm 및 650 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 A는 인간 EphA4 세포외 영역(ECD) 및 리간드 결합 도메인(LBD)과의 결합 활성을 가졌다(도 8). 이는 피브로넥틴 유형 III 도메인 1(FN1) 및 피브로넥틴 유형 III 도메인 2(FN2)에는 반응하지 않았다. 따라서, 항체 A는 인간 EphA4 세포외 영역의 리간드 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다.

참고예 10: 항-EphA4 모노클로날 항체의, 해마 뉴런에서의 가시의 수에 대한 증가 효과

랫트 해마 뉴런의 제조를 위의 참고예 1(B)에 기재된 바와 같이 수행하였다. EGFP 유전자를 Nucleofector(Lonza)를 이용하여 랫트 해마 뉴런 내로 도입하고, 유전자 도입 없이 랫트 해마 뉴런과 혼합하고, 폴리 L-리신으로 코팅된 커버 글라스(Matsunami Glass Ind.,Ltd.)를 포함하는 24-웰 플레이트(Falcon)에 씨딩하였다.

해마 뉴런을 이용한 가시의 계수를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 폴리 L-리신으로 코팅된 커버 글라스(Matsunami Glass Ind.,Ltd.)를 포함하는 24-웰 플레이트(Falcon)에 씨딩되는 배양 13 일차에 EGFP-도입된 랫트 해마 뉴런을 대조군 항체(마우스 IgG1; BioLegend) 또는 항체 A(6.7, 20 nM)로 24 시간 동안 처리하였다. 이어서, 커버 글라스를 2% PFA(Wako Pure Chemicals)/4% 수크로스(Wako Pure Chemicals)/PBS에 옮기고, 20 분 동안 그대로 두어, 세포를 고정시켰다. 고정 용액을 제거하고 세포를 PBS로 3 회 세척한 후, 0.25% TritonX-100(Wako Pure Chemicals)/PBS를 첨가하고, 15 분 동안 세포 투과화를 수행하였다. 용액을 제거하고, 커버 글라스를 2% BSA(Sigma)/0.25% TritonX-100/Opti-MEM(GIBCO)에 옮기고, 1 시간의 차단을 실시한 후, 항-GFP 항체(Nacalai Tesque)를 1 시간 30 분 동안 반응시켰다. 일차 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후, 이차 항체를 1 시간 동안 반응시켰다. 이차 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후, Prolong Gold antifade 시약(Molecular probes)을 첨가하고 밀봉하였으며, LSM800(ZEISS)으로 관찰을 수행하였다. 위에 기재된 실험을 3 회 수행하고, 실험당 2 개의 커버 글라스로부터 뉴런을 추출하고, 각각의 수상돌기에 존재하는 가시를 이미지 분석 소프트웨어인 Imaris^TM(Bitplane)로 계수하고, 각각의 뉴런에서의 10 μm당 가시의 수를 계산하였다.

항체 A는 해마 뉴런에서의 가시의 수를 증가시켰다(도 9). 이 결과는 항체 A가 해마 뉴런에서의 가시를 안정화시키는 활성을 가짐을 보여준다.

참고예 11: X-선 결정 구조 분석에 의한 EphA4-리간드 결합 도메인(EphA4-LBD)의 에피토프 맵핑

항체 A-Fab의 제조를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 항체 A 101.1 mg을 30 mM L-시스테인 및 2 mM EDTA를 포함하는 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.0)에 15 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 이 항체 용액에, 파파인(Sigma)을 항체에 대해 1/200 양으로 첨가하고, 37℃에서 18 시간 동안 효소 소화(enzyme digestion)를 수행하였다. 항체 A 효소 소화액을 PBS에 대해 투석한 후, 원심분리에 의해 침전물을 제거하였다(생산된 침전물을 PBS에 재용해시키고 원심분리 상층액과 혼합하였다). 다음으로, 항체 A-Fab 이외의 불순물을 제거하기 위한 목적으로 다음의 단계를 수행하였다.

1) 단백질 A 컬럼에 의한 정제

이 효소 소화 용액을 PBS로 평형화된 2 mL ProSep vA 고 용량(Millipore)에 적용하고, 통과 분획뿐만 아니라 PBS 세척 분획을 수집하였다.

2) 항-인간 IgG Fcγ 항체를 이용한 친화도 정제

NHS-활성화된 세파로스 4FF(GE Healthcare)에 공유적으로 결합된 항-인간 IgG Fcγ 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 갖는 친화도 컬럼을 이 세파로스의 매뉴얼에 따라 제조하였다. 위의 1)에서 수집된 용액을 이 친화도 컬럼에 충전하고, 통과 용액뿐만 아니라 이의 PBS 세척 용액을 수집하였다.

3) 겔 여과에 의한 정제

위의 2)에서 수득된 통과 분획을 한외여과막을 이용하여 농축시켰다. Superose 12(GE Healthcare)를 PBS로 평형화하고, 농축된 샘플을 분리 및 정제에 적용하였다. 분리되고 정제된 분획의 일부를 SDS-PAGE로 분석하고, 고 순도를 갖는 항체 A-Fab를 포함하는 분획을 수집하고 풀링하였다. 이와 같이 정제된 샘플을 항체 A-Fab로서 설정하였다.

항체 A-Fab와 항원 EphA4-LBD 간의 복합체를 생성하기 위해, EphA4-LBD를 제조하였다(Qin H. et al., J. Biol. Chem., 283: 29473-29484 (2008)). EphA4-LBD가 항체 A-Fab에 대해 약 1.5 배의 몰비가 될 수 있도록 하기 위해, 0.68 μmol(200 μM, 3.4 mL)의 EphA4-LBD 및 0.45 μmol(300 μM, 1.5 mL)의 항체 A-Fab를 혼합하였다. 다음으로, 혼합된 용액을 HILOAD 26/60 Superdex 75 prep grade(GE Healthcare)에 적용하고, 크로마토그래피 완충액(25 mM Tris/HCl(pH 7.5), 100 mM NaCl)으로 용출하였다. 복합체를 포함하는 분획을 SDS PAGE로 분석하고, 고 순도를 갖는 분획을 수집하고 약 40.8 mg/mL까지 농축시키고, 이를 결정화에 이용하였다.

복합체의 결정화를 자동 결정화 장치인 Hydra II Plus One 시스템(Matrix Technologies Corp., Ltd.)을 이용한 적하 증기 확산법에 의해 수행하였다. MRC-2(Molecular Dimensions)를 플레이트로서 사용하였다. 리저버 용액(reservoir solution)의 조성은 100 mM HEPES(pH 7.5), 10% 폴리에틸렌 글리콜 8000 및 8% 에틸렌 글리콜이었으며, 이 리저버 용액과 위의 복합체 용액을 1:1의 부피비로 혼합함으로써 결정화된 액적을 생성하였다. 생성된 결정화 플레이트를 20℃에서 그대로 두었다.

위의 조건으로 결정화를 수행하고, 공간 그룹 P212121, 격자 상수 a = 71.0 Å, b = 84.5 Å, 및 c = 116.1 Å의 결정을 수득하였다. 방사선 X-선(1.0 Å)을 수득된 결정에 조사하여, 1.79 Å에서 회절 데이터를 수득하였다. 회절 데이터를 HKL2000(HKL Research Inc.)에 의해 처리하고, 상 결정을 분자 치환법에 의해 수행하였다. 분자 치환법의 경우, CCP4 Software Suite(Collaborative computational project number 4, [CCP4] 버전 6.5.0, Acta Cryst. D 67:235-242 (2011))에 포함된 프로그램 PHASER(버전 2.5.0, McCoy A. J. et al., J. Appl. Cryst. 40:658-674 (2007))를 이용하였다. EphA4-LBD(PDBID:3CKH)의 결정 구조, 및 IgG의 Fab 영역(PDBID:2VXT(L 쇄) 및 1FGN(H 쇄))의 결정 구조를 분자 치환법에 대한 검색 모델로서 이용하였다. 프로그램 COOT를 이용하여 분자 모델을 작제하고(Emsley P. et al., Acta Cryst. D 60: 2126-2132n (2004)), 그에 따라 이를 결정된 상으로부터 수득된 전자 밀도에 적합시키고, 프로그램 REFMAC를 이용하여 구조 개량을 수행하였다(Murshudov G.N., Acta Cryst. D 53:240-255 (1997)).

2.0 Å 분해능의 복잡한 결정 구조를 위의 구조 계산(R = 0.212, Rfree = 0.258)에 의해 수득하였다.

수득된 항체 A-Fab/EphA4-LBD 복합체의 결정 구조를 계산 화학 시스템 MOE 2018.0101(Chemical Computing Group Inc.)에 로딩된 상호작용 검출 도구로 분석하고, 항체 A-Fab와 직접 접촉하는 EphA4-LBD 상의 아미노산 잔기를 식별하였다(도 10a). 식별된 아미노산 잔기는 Glu51, Gly52, Ile59, Gln71, Cys73, Asn74, Val75, Met76, Glu77, Thr104, Arg106, Leu111, Pro112, Met115, Arg162, Met164, Cys191, Ala193, 및 Val195이다. 도 10b는 Maestro(버전 11.0, Schrodinger, LLC)를 이용하여 생성된 EphA4-LBD의 표면 구조를 보여준다. 그 결과, 본 발명자들은 이들 아미노산 잔기가 존재하는 영역이 EphA4-LBD에서 항체 A-Fab 결합 영역이라고 결론지었다.

실시예 1: 항체 A의 인간화된 항체의 생성

인간화된 항-EphA4 항체의 제조

인간화된 항체의 가변 영역을 설계하였다. 항체 A의 프레임워크 영역(FR)에 대한 높은 상동성에 기반하여, 인간화된 항체의 FR로서 인간 항체의 FR 중에서, 중쇄의 경우 IGHV3-33*03(SEQ ID NO. 42) 및 JH6(SEQ ID NO. 43), 및 경쇄의 경우 IGKV1-17*01(SEQ ID NO. 40) 및 JK4(SEQ ID NO. 41)를 선택하였다. 그런 다음, 마우스 항체 A의 3D 구조 예측 모델을 이용하여, CDR의 아미노산과 상호작용하는 FR 내의 아미노산을 예측하고, 중쇄의 CDR1 내에 Y32F 돌연변이를 갖는 항체 A의 CDR(SEQ ID NO. 44, 27, 28, 및 29 내지 31)과 함께 이식하고, HK2-42(SEQ ID NO. 45)를 인간화된 항체의 중쇄 가변 영역으로서 설계하고, L1-8(SEQ ID NO. 46)을 인간화된 항체의 경쇄 가변 영역으로서 설계하였다. 이식된 CDR의 아미노산 서열은 표 2에 나타나 있고, 핵산 서열은 표 3에 나타나 있다.

중쇄 불변 영역으로서, 인간 IgG₂의 불변 영역(SEQ ID NO. 47)을 이용하였다. 경쇄 불변 영역으로서, 인간 Igκ(SEQ ID NO. 48)를 이용하였다. Expi293 발현 시스템(Gibco/Thermo Fisher)을 이용하여, 인간화된 항체의 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터(pcDNA 3.4)를 Expi293F 세포(Gibco/Thermo Fisher) 내로 형질주입시켰다. 인간화된 항체의 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자 서열로서, 각각, 중쇄 가변 영역에 대해 SEQ ID NO. 55에 나타낸 핵산 서열을 이용하고, 경쇄 가변 영역에 대해 SEQ ID NO. 56에 나타낸 핵산 서열을 이용하고, 중쇄 불변 영역에 대해 SEQ ID NO. 57에 나타낸 핵산 서열을 이용하며, 경쇄 불변 영역에 대해 SEQ ID NO. 58에 나타낸 핵산 서열을 이용하였다. 인간화된 항체의 중쇄 전장의 아미노산 서열(신호 서열을 포함하지 않음)은 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열이며, 경쇄 전장의 아미노산 서열(신호 서열을 포함하지 않음)은 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열이다. 인간화된 항체의 중쇄 전장을 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO. 61에 나타낸 핵산 서열이며, 경쇄 전장을 인코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO. 62에 나타낸 핵산 서열이다. 상층액을 수집하고, MabSelect SuRe(GE Healthcare)를 이용하여, 항체 A(항체 B)의 인간화된 항체를 정제하였다.

[표 2]

항체 B의 CDR의 아미노산 서열

[표 3]

항체 B의 CDR의 핵산 서열

실시예 2: 인간 EphA4에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 친화도

인간 EphA4에 대한 실시예 1에서 수득된 항체 B의 결합 친화도를 Biacore T200(GE Healthcare)을 이용한 표면 플라즈몬 공명(SPR 방법)에 의해 결정하였다. 먼저, 항-His 항체(GE Healthcare, 28-9950-56)를 센서 칩 CM5에 고정시켰다. N-하이드록시석신이미드(NHS)와 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드 염(EDC)을 이용한 아민 커플링 방법에 의해 고정을 수행하고, 차단을 위해 에탄올아민을 이용하였다(고정을 위한 센서 칩 및 시약은 모두 GE Healthcare제임). 이를 고정 완충액(10 mM 아세트산나트륨, pH 4.5)으로 3.5 μg/mL까지 희석하고, Biacore T200에 수반되는 프로토콜에 따라 센서 칩 상에 고정시켰다. 인간 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 10을 전개 완충액 HBS-EP(GE Healthcare, BR-1001-88)로 희석하고, 120 초 동안 유동 세포 상에 용액을 투입하고 포획하였다(약 10 RU의 포획량). 후속하여, HBS-EP를 이용하여 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.2, 1.6, 0 nM의 범위까지 연속 희석된 항체 B를 센서 칩에 120 초 동안 첨가하고, 첨가 시(결합 단계, 120 초) 및 첨가를 완료한 후(해리 단계, 600 초)에 결합 반응 곡선을 순차적으로 관찰하였다. 각각의 관찰의 완료 시, 4 M MgCl₂(60 초, Wako Pure Chemicals)를 첨가하여, 센서 칩을 재생시켰다. 수득된 결합 반응 곡선에 대해 시스템에 수반되는 소프트웨어인 BIA 평가 소프트웨어를 이용한 1:1 결합 모델에 의한 적합 분석을 수행하고, 인간 EphA4에 대한 친화도(KD = kd/ka)를 계산하였다.

인간 EphA4에 대한 항체 B의 결합 친화도(KD 값)는 1.34 x 10^-9 M이었다(도 11). 항체 B는 인간화 전의 항체 A의 친화도와 거의 동등한 친화도를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3: 해마 뉴런에서 인간화 항-EphA4 모노클로날 항체의 EphA4 절단 향상 활성

실시예 1에서 수득된 항체 B에 대해, 해마 뉴런을 이용한 EphA4 절단 향상 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

96-웰 접시(Falcon)에 씨딩된 랫트 해마 뉴런을 항체 B(2.0, 6.7, 20 nM) 및 γ-세크레타제 억제 약물 화합물 E(50 nM, Enzo Life Sciences)로 처리하고, 24 시간 후 PBS(Wako Pure Chemicals)로 세척하고, SDS 샘플 완충액(Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad) 및 5% 2-머캅토에탄올(Bio-Rad))을 첨가하고, 세포를 수집하고, 이를 5 분 동안 끓였다. 이 샘플로 SDS-PAGE를 수행하고, 항-EphA4 모노클로날 항체(Abnova)를 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하고, 밴드 강도를 정량화하고, EphA4 C-말단 단편/전장 EphA4의 값을 계산하였다.

항체 B는 해마 뉴런에서 EphA4 절단 반응을 농도-의존적으로 향상시켰다(도 12).

실시예 4: 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 인간 EphA4-인간 리간드 결합 억제 활성

실시예 1에서 수득된 항체 B에 대해, 인간 EphA4와 인간 리간드 사이의 결합 억제 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 항-알칼리성 포스파타제 항체(Thermo SCIENTIFIC)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.05% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 인간 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질(최종 농도 10 nM)을 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 리간드 및 연속 희석된 항체 B(0, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 nM)를 웰에 보충하였다. 비오티닐화된 인간 에프린A5-Fc 키메라(R&D Systems, 최종 농도 0.7 nM) 및 비오티닐화된 인간 에프린B3-Fc 키메라(R&D Systems, 최종 농도 2.3 nM)를 리간드로서 이용하였음에 주목한다. 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고 3 회 세척한 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘(GE Healthcare)을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척한 후, TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 웰에 첨가하고, 2 내지 5 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices 또는 PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 B는 인간 EphA4와 인간 리간드 사이의 결합을 농도-의존적으로 억압하였고, 인간 에프린A5 및 에프린B3 결합에 대한 IC₅₀값은 각각 약 4.9 nM 및 1.6 nM이었다. 따라서, 항체 B는 인간 EphA4와 인간 리간드 사이의 결합을 강력하게 억제하며, 인간화 전의 항체 A의 활성과 거의 동등한 억제 활성을 나타냄을 밝혀냈다(도 13).

실시예 5: 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 마우스 EphA4-마우스 리간드 결합 억제 활성

실시예 1에서 수득된 항체 B에 대해, 마우스 EphA4와 마우스 리간드 사이의 결합 억제 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 항-알칼리성 포스파타제 항체(Thermo SCIENTIFIC)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.02% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질을 웰에 첨가하고(최종 농도 10 nM), 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 리간드 및 연속 희석된 항체 B(0, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 nM)를 웰에 보충하였다. 비오티닐화된 마우스 에프린A1-Fc 키메라(R&D Systems, 최종 농도 6 nM) 및 비오티닐화된 마우스 에프린B2-Fc 키메라(R&D Systems, 최종 농도 2.5 nM)를 리간드로서 이용하였음에 주목한다. 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고 3 회 세척한 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘(GE Healthcare)을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척한 후, TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 웰에 첨가하고, 2 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices 또는 PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 B는 마우스 EphA4와 마우스 리간드 사이의 결합을 농도-의존적으로 억압하였고, 마우스 에프린A1 및 에프린B2 결합에 대한 IC₅₀값은 각각 약 8.7 nM 및 4.2 nM이었다. 따라서, 항체 B는 마우스 EphA4와 마우스 리간드 사이의 결합을 강력하게 억제하며, 인간화 전의 항체 A의 활성과 거의 동등한 억제 활성을 나타냄을 밝혀냈다(도 14).

실시예 6: 인간 Eph 수용체에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 선택성

참고예 1에 기재된 마우스 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질의 제조 방법과 유사하게, 인간의 각 Eph 수용체(EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB6)의 신호 서열 및 세포외 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 조직으로부터 유래된 총 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, SEAP 단백질 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pENTR1A 벡터(Invitrogen/Life Technologies) 내로 클로닝하였다. 다음으로, 인간의 각 Eph 수용체의 신호 서열 및 세포외 영역, SEAP 단백질, 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 게이트웨이 시스템(Invitrogen/Life Technologies)의 LR 반응에 의해 pcDNA 3.1_rfcB 벡터에 옮기고, 인간의 각 Eph 수용체의 세포외 영역에 융합된 SEAP 단백질 및 His 태그를 갖는 단백질("Eph 수용체 세포외 영역-SEAP-His 단백질"로 지칭됨)을 발현하는 벡터("Eph 수용체 세포외 영역-SEAP-His 단백질 발현 벡터"로 지칭됨)를 작제하였다.

다음으로, Expi293 발현 시스템(Gibco/Thermo Fisher)을 이용하여, 인간의 각 Eph 수용체 세포외 영역-SEAP-His 단백질에 대한 발현 벡터를 Expi293F 세포(Gibco/Thermo Fisher) 내로 도입하였다. 5 일의 항온처리(5% CO₂, 37℃) 후, 배양 상층액을 수집하고, 실온에서 1500 rpm으로 5 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 상층액을 0.45 μm 필터(Millipore)로 여과하였다.

실시예 1에서 수득된 항체 B에 대해, 인간 Eph 수용체의 결합 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

토끼 항-6-His 항체(Bethyl Laboratories)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.05% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 인간의 각 Eph 수용체 세포외 영역-SEAP-His 단백질(최종 농도 1 nM)을 각각의 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 인간 IgG 용액(100 μg/mL, Mitsubishi Pharma Corporation) 및 항체 B(10 μg/mL)를 웰에 보충하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 웰에 TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 첨가하고, 적당한 착색이 확인될 시, 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

인간화 전의 항체 A와 유사하게, 항체 B는 인간 Eph 수용체 패밀리 중에서 인간 EphA4에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다(도 15).

실시예 7: 마우스 Eph 수용체에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 선택성

참고예 1에 기재된 EphA4 세포외 영역-Fc-His 단백질의 제조 방법에 따라, 마우스의 각 Eph 수용체(EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB6)의 신호 서열 및 세포외 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 조직으로부터 유래된 총 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, 인간 IgG₁의 Fc 영역 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pENTR1A 벡터(Invitrogen/Life Technologies) 내로 클로닝하였다. 다음으로, 마우스의 각 Eph 수용체(EphA1, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB6)의 신호 서열 및 세포외 영역, Fc 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 게이트웨이 시스템(Invitrogen/Life Technologies)의 LR 반응에 의해 pcDNA 3.1_rfcB 벡터에 옮기고, 마우스의 각 Eph 수용체의 세포외 영역-Fc-His 단백질에 대한 발현 벡터를 작제하였다. 마우스 EphA2 세포외 영역-Fc-His 단백질 발현 벡터의 작제를 위해, 마우스 EphA2의 신호 서열 및 세포외 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 조직으로부터 유래된 총 RNA를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, Fc 및 히스티딘 태그를 인코딩하는 DNA 서열을 갖는 pcDNA 3.1 벡터 내로 클로닝하고, 마우스 EphA2 세포외 영역-Fc-His 단백질 발현 벡터를 작제하였다.

항체 B에 대해, 마우스 Eph 수용체의 결합 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

토끼 항-6-His 항체(Bethyl Laboratories)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.05% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 마우스의 각 Eph 수용체 세포외 영역-Fc-His 단백질(최종농도 1 nM)을 각각의 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 인간 IgG 용액(100 μg/mL, Sigma) 및 항체 B(10 μg/mL)를 웰에 보충하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 염소 항-인간 카파 경쇄 항체(IBL)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 웰에 TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 첨가하고, 적당한 착색이 확인될 시, 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 B는 마우스 Eph 수용체 패밀리 중에서 마우스 EphA4에만 특이적 결합 활성을 가졌다(도 16).

실시예 8: 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 반응성

항체 B에 대해, 다양한 EphA4와의 결합 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

항-알칼리성 포스파타제 항체(Thermo SCIENTIFIC)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.05% Tween 20/PBS(Thermo SCIENTIFIC)로 3 회 세척한 후, 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4 세포외 영역-SEAP-His 단백질(최종 농도 1 nM)을 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 인간 IgG 용액(100 μg/mL, Mitsubishi Pharma Corporation) 및 항체 B(0, 0.00013, 0.00064, 0.0032, 0.016, 0.08, 0.4, 2, 10 μg/mL)를 웰에 보충하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 웰에 TMBZ(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Sigma) 용액을 첨가하고, 적당한 착색이 확인될 시, 동등한 양의 켄칭 용액(1 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 B는 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 EphA4 중 임의의 것에서 동등한 결합 활성을 가졌다(도 17).

실시예 9: 인간 EphA4 세포외 영역, 리간드 결합 도메인, 피브로넥틴 유형 III 도메인 1 및 피브로넥틴 유형 III 도메인 2에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 반응성

실시예 1에서 수득된 항체 B에 대해, 인간 EphA4 내의 다양한 도메인과의 결합 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

토끼 항-6-His 항체(Bethyl Laboratories)를 96-웰 플레이트(Nunc)의 웰에 코팅하였다. 밤새 4℃에서 항온처리한 후, 웰을 실온에서 1 시간 동안 1% Block Ace(DS Pharma Biomedical)에 의해 차단하였다. 0.02% Tween 20/PBS(Nacalai Tesque)로 2 회 세척한 후, 인간 EphA4 세포외 영역-MBP-His 단백질, 인간 EphA4 리간드 결합 도메인-MBP-His 단백질, 인간 EphA4 피브로넥틴 유형 III 도메인 1-MBP-His 단백질, 및 인간 EphA4 피브로넥틴 유형 III 도메인 2-MBP-His 단백질(최종 농도 10 nM)을 웰 내로 씨딩하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 3 회 세척 후, 항체 B(최종 농도 10 nM)를 웰에 보충하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제-표지된 토끼 항-인간 IgG Fcγ 단편 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 5 회 세척 후, TMB(KPL) 용액을 웰에 첨가하고, 적당한 착색이 확인될 시, 동등한 양의 켄칭 용액(2 N H₂SO₄, Wako Pure Chemicals)을 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)로 450 nm 및 650 nm에서의 흡광도를 판독하였다.

항체 B는 인간 EphA4 세포외 영역(ECD) 및 리간드 결합 도메인(LBD)과의 결합 활성을 가졌다(도 18). 이는 피브로넥틴 유형 III 도메인 1(FN1) 및 피브로넥틴 유형 III 도메인 2(FN2)에는 반응하지 않았다. 따라서, 항체 B는 인간 EphA4 세포외 영역의 리간드 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 10: 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의, 해마 뉴런에서의 가시의 수에 대한 증가 효과

랫트 해마 뉴런의 제조를 참고예 1(B)에 기재된 바와 같이 수행하였다. EGFP 유전자를 Nucleofector(Lonza)를 이용하여 랫트 해마 뉴런 내로 도입하고, 폴리 L-리신으로 코팅된 커버 글라스(Matsunami Glass Ind.,Ltd.)를 포함하는 24-웰 플레이트(Falcon)에 씨딩하였다.

해마 뉴런을 이용한 가시의 계수를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 폴리 L-리신으로 코팅된 커버 글라스(Matsunami Glass Ind.,Ltd.)를 포함하는 24-웰 플레이트(Falcon)에 씨딩되는 배양 13 일차에 EGFP-도입된 랫트 해마 뉴런을 대조군 항체(인간; Sigma) 또는 항체 B(6.7, 20 nM)로 24 시간 동안 처리하였다. 이어서, 커버 글라스를 2% PFA(Wako Pure Chemicals)/4% 수크로스(Wako Pure Chemicals)/PBS에 옮기고, 20 분 동안 그대로 두어, 세포를 고정시켰다. 고정 용액을 제거하고 세포를 PBS로 3 회 세척한 후, 0.25% TritonX-100(Wako Pure Chemicals)/PBS를 첨가하고, 15 분 동안 세포 투과화를 수행하였다. 용액을 제거하고, 커버 글라스를 2% BSA(Sigma)/0.25% TritonX-100/OPTI-MEM(GIBCO)에 옮기고, 1 시간의 차단을 실시한 후, 항-GFP 항체(Nacalai Tesque)를 1 시간 30 분 동안 반응시켰다. 일차 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후, 이차 항체를 1 시간 동안 반응시켰다. 이차 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후, Prolong Gold antifade 시약(Molecular probes)을 첨가하고 밀봉하였으며, LSM800(ZEISS)으로 관찰을 수행하였다. 위에 기재된 실험을 3 회 수행하고, 실험당 2 개의 커버 글라스로부터 뉴런을 추출하고, 각각의 수상돌기에 존재하는 가시를 이미지 분석 소프트웨어인 Imaris^TM(Bitplane)로 계수하고, 각각의 뉴런에서의 10 μm당 가시의 수를 계산하였다.

항체 B는 해마 뉴런에서의 가시의 수를 증가시켰다(도 19). 이 결과는 항체 B가 해마 뉴런에서의 가시를 안정화시키는 활성을 가짐을 보여준다.

실시예 11: 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 인간 EphA4 절단 향상 활성

실시예 1에서 수득된 항체 B에 대해, 인간 EphA4에 대한 절단 향상 활성의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다.

랫트 해마 뉴런의 제조를 참고예 1(B)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 인간 EphA4-HA 단백질 발현 벡터를 Nucleofector(Lonza)를 이용하여 랫트 해마 뉴런 내로 도입하고, 폴리 L-리신으로 코팅된 96-웰 접시(Falcon)에 씨딩하였다. 씨딩된 랫트 해마 뉴런을 항체 B(6.7, 20, 67 nM) 및 γ-세크레타제 억제 약물 화합물 E(50 nM, Enzo Life Sciences)로 처리하고, 약 24 시간 후 PBS(Wako Pure Chemicals)로 세척하고, SDS 샘플 완충액(Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad) 및 5% 2-머캅토에탄올(Bio-Rad))을 첨가하고, 세포를 수집하고, 이를 5 분 동안 끓였다. 이 샘플로 SDS-PAGE를 수행하고, 랫트 항-HA 모노클로날 항체(Roche)를 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하고, 밴드 강도를 정량화하고, EphA4 C-말단 단편/전장 EphA4의 값을 계산하였다.

항체 B는 해마 뉴런에서 인간 EphA4 절단 반응을 향상시켰다(도 20).

실시예 12: 해마 뉴런에서의 가시의 수에 대한 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 증가 효과에 대한 MMP 및 ADAM의 관여

랫트 해마 뉴런의 제조를 참고예 1(B)에 기재된 바와 같이 수행하였다. EGFP 유전자를 Nucleofector(Lonza)를 이용하여 일부 랫트 해마 뉴런 내로 도입하고, 폴리 L-리신으로 코팅된 커버 글라스(Matsunami Glass Ind.,Ltd.)를 포함하는 24-웰 플레이트(Falcon)에 씨딩하였다.

해마 뉴런을 이용한 가시의 계수를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 폴리 L-리신으로 코팅된 커버 글라스(Matsunami Glass Ind.,Ltd.)를 포함하는 24-웰 플레이트(Falcon)에 씨딩되는 배양 13 일차에 EGFP-도입된 랫트 해마 뉴런을 대조군 항체(인간 IgG2; Sigma) 또는 항체 B(20 nM) 및 DMSO(Sigma), 또는 MMP 및 ADAM의 억제제인 GM6001(2.5 μM, MedChemExpress)로 24 시간 동안 처리하였다. 이어서, 커버 글라스를 2% PFA(Wako Pure Chemicals)/4% 수크로스(Wako Pure Chemicals)/PBS에 옮기고, 20 분 동안 그대로 두어, 세포를 고정시켰다. 고정 용액을 제거하고 세포를 PBS로 3 회 세척한 후, 0.25% TritonX-100(Wako Pure Chemicals)/PBS를 첨가하고, 15 분 동안 세포 투과화를 수행하였다. 0.25% TritonX-100/PBS를 제거하고, 커버 글라스를 2% BSA(Sigma)/0.25% TritonX-100/OPTI-MEM(GIBCO)에 옮기고, 1 시간의 차단을 실시한 후, 항-GFP 항체(Nacalai Tesque)를 1 시간 30 분 동안 반응시켰다. 일차 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후, 이차 항체를 1 시간 동안 반응시켰다. 이차 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 세척한 후, Prolong Gold antifade 시약(Molecular probes)을 첨가하고 밀봉하였으며, LSM800(ZEISS)으로 관찰을 수행하였다. 위에 기재된 실험을 3 회 수행하고, 실험당 2 개의 커버 글라스로부터 뉴런을 추출하고, 각각의 수상돌기에 존재하는 가시를 이미지 분석 소프트웨어인 Imaris^TM(Bitplane)로 계수하고, 각각의 뉴런에서의 10 μm당 가시의 수를 계산하였다.

항체 B에 의한 해마 뉴런에서의 가시의 수의 증가를 GM6001과의 동시 처리에 의해 억제하였다(도 21). 이 결과는 항체 B가 해마 뉴런에서 MMP 및 ADAM을 통해 가시 안정화 활성을 가짐을 보여준다.

실시예 13: 시험관 내 ALS 모델에서 인간화된 항-EphA4 모노클로날 항체의 인간 iPS 세포-유래된 운동 뉴런 보호 효과

(A) 인간 iPS 세포의 유지 배양

인간 iPS 세포의 유지 배양을 다음의 단계에 따라 수행하였다. Stem cell banker(Takara)에서 액체 질소 중 동결보존된 인간 iPS 세포(201B7)를 액체 질소 가스층으로부터 제거하고, 미리 37℃까지 가온된 5 mL의 인간 iPS 세포 배양 배지(Essential 8, Thermo Fisher Scientific)에 현탁시키고, 용해시켰다. 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브(Thermo Fisher Scientific)에 수집하고, 실온에서 5 분 동안 1000 rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 신선한 배지에 현탁시킨 다음, 미리 0.3 μg/cm² iMatrix-511(Nippi)로 코팅된 φ60 mm 세포 배양 접시(Corning)에 씨딩하고, 10 μM Y-27632(WAKO)를 첨가한 후, CO₂항온처리기(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 배지는 매일 교환하고, 인간 iPS 세포의 유지 배양을 수행하기 위해 서브컨플루언시(subconfluency)에 도달 시 계대 배양을 수행하였다. 계대 배양을 다음과 같이 수행하였다. 서브컨플루언시 상태(subconfluent state)의 인간 iPS 세포의 배양 배지를 흡인하고, 2 mL의 PBS(WAKO)로 세척한 다음, Accutase(Nacalai Tesque) 1 mL를 첨가하고, CO₂항온처리기(37℃, 5% CO₂)에서 5 분 동안 항온처리하였다. 인간 iPS 세포를 10 μM Y-27632를 포함하는 4 mL의 인간 iPS 세포 배양 배지에 현탁시킴으로써 단일 세포로 해리한 다음, 15 mL 원추형 튜브에 수집하였다. 실온에서 1000 rpm으로 5 분 동안 원심분리를 수행하고, 상층액을 흡인한 다음, 인간 iPS 세포를 10 μM Y-27632를 포함하는 1 mL의 인간 iPS 세포 배양 배지에 현탁시켰다. 세포의 수를 계수하고, 2 x 10⁵개의 인간 iPS 세포를 4 mL의 인간 iPS 세포 배양 배지에 현탁시킨 다음, 0.3 μg/cm² iMatrix-511로 코팅된 φ60 mm 세포 배양 접시에 씨딩하고, CO₂항온처리기(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 1 회 이상 계대 배양을 거친 인간 iPS 세포를 실험에 이용하였다.

(B) 성상세포의 확립 및 유지 배양

신생아 마우스로부터의 성상세포의 확립 및 유지 배양을 다음의 단계에 따라 수행하였다. 생후 2 일째에 야생형 신생아 마우스(C57BL/6JJmsSlc(Japan SLC, Inc.)) 및 야생형 마우스와 돌연변이된 인간 SOD1(G93A) Tg-(B6.Cg-Tg(SOD1 G93A) 1Gur/J(Jackson Laboratories)) 마우스 간의 신생아 교배 마우스를 이소플루란(Intervet K.K.) 하에서 참수하여 안락사시킨 다음, 대뇌 피질을 분리하고, 0.25% 트립신-EDTA(Thermo Fisher Scientific)로 37℃에서 15 분 동안 처리하여 분산시켰다. 효소 처리 후, 이를 10% FBS(Thermo Fisher Scientific) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(Nacalai Tesque)을 함유하는 4 mL의 둘베코 변형 이글 배지(Thermo Fisher Scientific)(10% FBS-DMEM)로 희석하여, 효소 소화를 정지시켰다. 이어서, 단일 세포 이외의 불순물을 셀 스트레이너(Corning)로 여과하고, 1500 rpm으로 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 흡인하고, 세포를 4 mL의 신선한 10% FBS-DMEM에 희석하고, 각각의 개체에 대해 φ60 mm 세포 배양 접시에 씨딩하고, 37℃에서 배양하였다. 씨딩 2 일 후에 배지를 흡인하고, 4 mL의 신선한 10% FBS-DMEM을 세포에 첨가하여, 배지 교환을 수행하였다. 컨플루언시(confluency)에 도달할 시, 계대 배양을 수행하였다. 신생아 마우스로부터 유래된 성상세포의 계대 배양을 다음과 같이 수행하였다. φ60 mm 세포 배양 접시에서 컨플루언시에 도달한 후 성상세포의 10% FBS-DMEM을 흡인한 다음, 2 mL의 PBS(WAKO)로 세척하고, 1 mL의 0.25% 트립신-EDTA를 첨가하고, 3 분 동안 CO₂항온처리기(37℃, 5% CO₂)에서 항온처리하였다. 성상세포를 3 mL의 10% FBS-DMEM으로 현탁시킴으로써 단일 세포로 해리한 다음, 15 mL 원추형 튜브에 수집하였다. 이를 실온에서 1500 rpm으로 3 분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인한 다음, 8 mL의 신선한 10% FBS-DMEM을 세포에 첨가하고, φ100 mm 세포 배양 접시에 씨딩하였다(계대 1). 세포가 컨플루언시에 도달했을 때와 유사한 방법으로 계대 배양을 수행하였다. φ100 mm 세포 배양 접시에서 배양된 성상세포의 계대 배양을 수행할 때, 4 mL의 PBS 및 2 mL의 0.25% 트립신-EDTA를 사용하였음에 주목한다. 더욱이, 계대 배양을 수행할 때, 세포 현탁액의 일부를 수집하고, 돌연변이된 인간 SOD1(G93A)의 지노타이핑을 실시하였다. 총 3 회 계대 배양을 수행한 후의 성상세포를 Cell banker(NIPPON ZENYAKU KOGYO CO.,LTD.)로 희석하고, 테스트될 때까지 -80℃에서 동결보존하였다. 테스트 시, 동결보존된 세포 현탁액을 항온 배쓰에 각각 용해한 다음, 미리 37℃까지 가온된 10% FBS-DMEM으로 희석하였다. 각각의 세포 현탁액을 원심분리(1500 rpm, 3 분, 실온)한 후, 상층액을 제거하고, 신선한 배지에 현탁시킨 다음, 8-웰 챔버(ibidi)에 씨딩하고, CO₂항온처리기(37℃, 5% CO₂)에서 유지 배양을 수행하였다.

돌연변이된 인간 SOD1(G93A)의 지노타이핑을 REDExtract-N-Amp^TM조직 PCR 키트(Sigma)를 이용하여 수행하였다. 성상세포의 계대 배양을 수행할 때 수집된 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브에 옮기고, 1500 rpm으로 3 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 흡인하고, 1 mL의 PBS를 세포에 첨가하고, 세척하고, 다시 원심분리한 다음, 흡인하였다. 50 마이크로리터의 추출된 용액과 12.5 μL의 조직 제조 용액을 혼합하고, 샘플에 첨가하였다. 혼합 후, 이를 중합효소 연쇄 반응(PCR) 튜브에 옮기고, GeneAmp™ PCR 시스템 9700(Applied biosystems^TM)에서 55℃에서 10 분 동안, 그리고 95℃에서 3 분 동안 반응시킨 다음, 키트에 수반되는 50 μL의 중화 용액을 첨가하여, 게놈 DNA를 제조하였다.

표 4에 나타낸 조성을 이용하여 게놈 PCR을 수행하기 위해, 추출된 게놈 DNA를 이용하였다. PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 5에 나타나 있다. PCR 후, 1% 아가로스 겔/100 V/20 분으로 전기영동을 수행하였다. 324 bp의 내부 표준물질 및 236 bp의 돌연변이된 인간 SOD1(G93A)의 2 개의 밴드가 검출된 것들은 돌연변이된 인간 SOD1(G93A)-발현 성상세포로서 식별되었다.

[표 4]

게놈 PCR 혼합물

Red 믹스 = REDExtract-N-Amp PCR 반응 믹스.

[표 5]

프라이머의 뉴클레오티드 서열

(C) 시험관 내 ALS 모델에서 인간 iPS 세포-유래된 운동 뉴런 보호 효과의 평가

시험관 내 ALS 모델에서 인간 iPS 세포-유래된 운동 뉴런 보호 효과의 평가를 다음의 단계에 따라 수행하였다. 위의 (A)의 계대 배양과 유사한 방법으로 인간 iPS 세포의 단일 세포 현탁액을 수득한 후, 실온에서 1000 rpm으로 5 분 동안 원심분리를 수행하고, 상층액을 흡인하였다. 인간 iPS 세포를 DFK20 배지(20% 녹아웃 혈청 대체물(KSR, Thermo Fisher Scientific), 1% 비-필수 아미노산(NEAA, Thermo Fisher Scientific), 1% GlutaMAX-I 보충제(Thermo Fisher Scientific), 100 개 단위/mL 페니실린 - 100 μg/mL 스트렙토마이신(Nacalai Tesque), 및 100 μM β-머캅토에탄올(Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific))에 현탁시킨 후, 세포의 수를 계수하였다. 3 x 10⁵개의 인간 iPS 세포를 10 μM SB431542(Sigma), 100 nM LDN193189(Sigma), 3 μM CHIR99021(Cayman Chemical), 10 μM Y-27632를 포함하는 2 mL의 DFK20 배지에 현탁시키고, 저 접착 6-웰 세포 배양 플레이트(Corning)의 하나의 웰에 씨딩하고, CO₂항온처리기(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 배양 3 일차에, 인간 iPS 세포 분화된 세포 응집물(SFEB)을 배지와 함께 15 mL 원추형 튜브에 수집하고, 상온에서 300 rpm으로 2 분 동안 원심분리하여, 세포 덩어리를 침전시켰다. 이 상층액을 흡인하고, SFEB를 10 μM SB431542, 100 nM LDN193189, 3 μM CHIR99021(Cayman), 5 μM Y-27632 및 1 μM 레티노산(Sigma)을 포함하는 DFK20 배지에 부드럽게 현탁시키고, 배지 교환을 수행하기 위해 원래의 웰로 되돌렸다. 배양 5 일차에도 유사한 방법으로 배지 교환을 수행하였다. 배지 교환은 2.5 μM의 Y-27632의 농도로 수행하였음에 주목한다(다른 화합물은 배양 3 일차와 동일함). 배양 7 일차에, SFEB를 배지와 함께 15 mL 원추형 튜브에 수집하고, 상온에서 10 분 동안 그대로 두어, SFEB를 침전시켰다. 이 상층액을 흡인하고, SFEB를 1 μM 레티노산, 1 μM 퓨르모르파민(Myltenyi Biotech)을 포함하는 3 mL의 DFK5 배지(5% KSR, 1% NEAA, 1% GlutaMAX-I 보충제, 100 개 단위/mL 페니실린 - 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 100 μM β-머캅토에탄올을 포함하는 DMEM/F12)에 현탁시키고, 원래의 웰로 되돌리고, CO₂항온처리기(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 이어서, 배양 7 일차와 동일한 단계로 2 내지 3 일마다 배지 교환을 수행하고, 인간 iPS 세포를 운동 뉴런으로 분화 유도시켰다. 배양 33 일차에, SFEB를 배지와 함께 15 mL 원추형 튜브에 수집하고, 상온에서 5 분 동안 그대로 두어, SFEB를 침전시켰다. 상층액을 흡인하고, 10 μM Y-27632를 포함하는 2 mL의 Accutase를 첨가하고, 37℃ 항온 배쓰에서 10 분 동안 항온처리하였다. 이어서, P1000 피펫으로 30 회 피펫팅함으로써 세포 덩어리를 분산시킨 다음, 10 μM Y-27632를 포함하는 10 mL의 DFK5 배지를 이용하여 효소 반응을 정지시켰다. 세포 현탁액을 신선한 15 mL 원추형 튜브에 수집하고, 실온에서 1000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하였다. 10 μM Y-27632를 포함하는 DFK5 배지로 세포를 재현탁시킨 후, 이를 셀 스트레이너(Corning)로 여과한 다음, 세포의 수를 계수하였다. 세포를 공동-배양 배지(2% B27 보충제(Thermo Fisher Scientific), 10 μM Y-27632, 1% GlutaMax-I 보충제, 100 개 단위/mL 페니실린 - 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 신경기저 배지(Thermo Fisher Scientific))를 이용하여 5 x 10⁵개의 세포/mL의 현탁액으로 제조하고, 대조군 그룹, 비히클 첨가 그룹, 및 약물 치료 그룹으로 나누었다. 약물을 희석하기 위해 공동-배양 배지를 이용하였다. 각각의 그룹에 비히클(공동-배양 배지), 및 항체 B인 약물을 첨가한 후, 8 x 10⁴개의 세포/웰의 마우스-유래된 야생형 성상세포 또는 돌연변이된 인간 SOD1(G93A)-발현 성상세포로 미리 씨딩된 8-웰 챔버 내에 200 μL/웰로 이들을 씨딩하고, 평가를 위해 성상세포와 운동 뉴런의 공동-배양 세포로서 사용하였다. 야생형 성상세포와 운동 뉴런의 공동-배양물을 이용하여 관찰된 운동 뉴런의 수를 대조군으로서 설정하였다. 비히클 첨가 그룹 및 약물 처리 그룹에서, 돌연변이된 인간 SOD1(G93A)-발현 성상세포와 운동 뉴런의 공동-배양을 수행하고, 조건을 비히클 첨가(1% 공동-배양 배지) 및 항체 B(10, 30, 100 nmol/L)로서 설정하였다. CO₂항온처리기(37℃, 5% CO₂)에서 각각의 조건 하에서 2 일 동안 배양한 후, 운동 뉴런 세포를 항-ISL1 항체(Abcam) 및 항-인간 핵 항원(HNA) 항체(Millipore)를 이용하여 면역세포화학적으로 염색하였다. 웰당 ISL1/HNA 공동-양성 세포를 생존한 운동 뉴런으로서 계수하고, 운동 뉴런 생존율을 대조군에 대한 %로서 계산하였다. 도 22는 평가 시스템 단계를 보여주는 간단한 개략도를 나타낸다.

돌연변이된 인간 SOD1(G93A)-발현 성상세포/인간 iPS 세포-유래된 운동 뉴런 공동-배양물(시험관 내 ALS 모델)에서, 운동 뉴런 생존율이 유의하게 감소하였다. 항체 B는 돌연변이된 인간 SOD1(G93A)-발현 성상세포에 의해 유도된 인간 iPS 세포-유래된 운동 뉴런 사멸을 농도-의존적으로 억압하였다(도 23). 이 결과는 항체 B가 시험관 내 ALS 모델에서 운동 뉴런의 생존을 촉진한다는 것을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD. <120> A pharmaceutical composition for treating amyotrophic lateral sclerosis <130> ESAP2001F <150> JP2020-214739 <151> 2020.12.24 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 986 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ala Gly Ile Phe Tyr Phe Ile Leu Phe Ser Phe Leu Phe Gly Ile 1 5 10 15 Cys Asp Ala Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr 20 25 30 Leu Leu Asp Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser 35 40 45 Pro Leu Glu Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn 50 55 60 Thr Pro Ile Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Ala Ser Gln 65 70 75 80 Asn Asn Trp Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg 85 90 95 Val Tyr Ile Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro 100 105 110 Gly Val Met Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu 115 120 125 Ser Asp Asn Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Ser Gln Phe Gly Lys 130 135 140 Ile Asp Thr Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val 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Ser Lys Tyr 565 570 575 Ser Lys Ala Lys Gln Glu Ala Asp Glu Glu Lys His Leu Asn Gln Gly 580 585 590 Val Arg Thr Tyr Val Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala 595 600 605 Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile Asp Ala Ser Cys Ile Lys Ile Glu 610 615 620 Lys Val Ile Gly Val Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Ser Gly Arg Leu 625 630 635 640 Lys Val Pro Gly Lys Arg Glu Ile Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys 645 650 655 Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Gln Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser 660 665 670 Ile Met Gly Gln Phe Asp His Pro Asn Ile Ile His Leu Glu Gly Val 675 680 685 Val Thr Lys Cys Lys Pro Val Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn 690 695 700 Gly Ser Leu Asp Ala Phe Leu Arg Lys Asn Asp Gly Arg Phe Thr Val 705 710 715 720 Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg Gly Ile Gly Ser Gly Met Lys Tyr 725 730 735 Leu Ser Asp Met Ser Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile 740 745 750 Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Met Ser 755 760 765 Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro Glu Ala Ala Tyr Thr Thr Arg Gly Gly 770 775 780 Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Tyr Arg Lys 785 790 795 800 Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu 805 810 815 Val Met Ser Tyr Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp 820 825 830 Val Ile Lys Ala Ile Glu Glu Gly Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp 835 840 845 Cys Pro Ile Ala Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Glu 850 855 860 Arg Ser Asp Arg Pro Lys Phe Gly Gln Ile Val Asn Met Leu Asp Lys 865 870 875 880 Leu Ile Arg Asn Pro Asn Ser Leu Lys Arg Thr Gly Ser Glu Ser Ser 885 890 895 Arg Pro Asn Thr Ala Leu Leu Asp Pro Ser Ser Pro Glu Phe Ser Ala 900 905 910 Val Val Ser Val Gly Asp Trp Leu Gln Ala Ile Lys Met Asp Arg Tyr 915 920 925 Lys Asp Asn Phe Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Thr Leu Glu Ala Val Val 930 935 940 His Met Ser Gln Asp Asp Leu Ala Arg Ile Gly Ile Thr Ala Ile Thr 945 950 955 960 His Gln Asn Lys Ile Leu Ser Ser Val Gln Ala Met Arg Thr Gln Met 965 970 975 Gln Gln Met His Gly Arg Met Val Pro Val 980 985 <210> 2 <211> 528 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Val Thr Gly Ser Arg Val Tyr Pro Ala Asn Glu Val Thr Leu Leu Asp 1 5 10 15 Ser Arg Ser Val Gln Gly Glu Leu Gly Trp Ile Ala Ser Pro Leu Glu 20 25 30 Gly Gly Trp Glu Glu Val Ser Ile Met Asp Glu Lys Asn Thr Pro Ile 35 40 45 Arg Thr Tyr Gln Val Cys Asn Val Met Glu Ala Ser Gln Asn Asn Trp 50 55 60 Leu Arg Thr Asp Trp Ile Thr Arg Glu Gly Ala Gln Arg Val Tyr Ile 65 70 75 80 Glu Ile Lys Phe Thr Leu Arg Asp Cys Asn Ser Leu Pro Gly Val Met 85 90 95 Gly Thr Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Asp Asn 100 105 110 Asp Lys Glu Arg Phe Ile Arg Glu Ser Gln Phe Gly Lys Ile Asp Thr 115 120 125 Ile Ala Ala Asp Glu Ser Phe Thr Gln Val Asp Ile Gly Asp Arg Ile 130 135 140 Met Lys Leu Asn Thr Glu Ile Arg Asp Val Gly Pro Leu Ser Lys Lys 145 150 155 160 Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Val Gly Ala Cys Ile Ala Leu Val 165 170 175 Ser Val Arg Val Phe Tyr Lys Lys Cys Pro Leu Thr Val Arg Asn Leu 180 185 190 Ala Gln Phe Pro Asp Thr Ile Thr Gly Ala Asp Thr Ser Ser Leu Val 195 200 205 Glu Val Arg Gly Ser Cys Val Asn Asn Ser Glu Glu Lys Asp Val Pro 210 215 220 Lys Met Tyr Cys Gly Ala Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Asn 225 230 235 240 Cys Leu Cys Asn Ala Gly His Glu Glu Gln Asn Gly Glu Cys Gln Ala 245 250 255 Cys Lys Ile Gly Tyr Tyr Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ala Ser Cys Ala 260 265 270 Lys Cys Pro Pro His Ser Tyr Ser Val Trp Glu Gly Ala Thr Ser Cys 275 280 285 Thr Cys Asp Arg Gly Phe Phe Arg Ala Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met 290 295 300 Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro Leu Asn Leu Ile Ser Asn Val 305 310 315 320 Asn Glu Thr Ser Val Asn Leu Glu Trp Ser Ser Pro Gln Asn Thr Gly 325 330 335 Gly Arg Gln Asp Ile Ser Tyr Asn Val Val Cys Lys Lys Cys Gly Ala 340 345 350 Gly Asp Pro Ser Lys Cys Arg Pro Cys Gly Ser Gly Val His Tyr Thr 355 360 365 Pro Gln Gln Asn Gly Leu Lys Thr Thr Arg Val Ser Ile Thr Asp Leu 370 375 380 Leu Ala His Thr Asn Tyr Thr Phe Glu Ile Trp Ala Val Asn Gly Val 385 390 395 400 Ser Lys Tyr Asn Pro Ser Pro Asp Gln Ser Val Ser Val 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Synthetic polynucleotide <400> 49 agatttggag tgcat 15 <210> 50 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 50 gtgatctgga ggggaggatc caccgactac aacgctgctt ttatgagc 48 <210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 51 gagagcctgt tcggcgtgta ctatgactac ggctactatt ctatggatta t 51 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 52 cgcgcctccc aggagatctc tggctacctg tcc 33 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 53 gctgcctcca ccctggactc t 21 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 54 ctgcagtacg cttcctatcc actgacc 27 <210> 55 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 55 caggtgcagc tggtggagag cggaggagga gtggtgcagc ctggcaggtc cctgaggctg 60 agctgtgccg tgtccggctt cagcctgaca agatttggag tgcattgggt gcgccaggct 120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggccgtg atctggaggg gaggatccac cgactacaac 180 gctgctttta tgagccggct gacaatctct aaggataact ccaagaatac cgtgtatctg 240 cagatgaact ccctgagggc tgaggacacc gccgtgtact attgcgccaa ggagagcctg 300 ttcggcgtgt actatgacta cggctactat tctatggatt attggggcca gggcaccaca 360 gtgacagtgt cctcc 375 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 56 gatatccaga tgacacagtc cccttccagc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgtc gcgcctccca ggagatctct ggctacctgt cctggctgca gcagaagcca 120 ggcaaggctc ccaagcgcct gatctatgct gcctccaccc tggactctgg agtgccttcc 180 aggttcagcg gctctcggtc cggcacagag tacaccctga caatctcttc cctgcagcct 240 gaggatttcg ccacctacta ttgcctgcag tacgcttcct atccactgac ctttggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 57 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 57 gcctccacca agggaccatc cgtgttccca ctggccccat cttcccggag cacatctgag 60 tccaccgccg ctctgggctg tctggtgaag gattacttcc ctgagccagt gacagtgtct 120 tggaactccg gcgctctgac atccggcgtg cacacctttc ctgccgtgct gcagagctct 180 ggcctgtaca gcctgtccag cgtggtgacc gtgccctctt ccaatttcgg cacccagaca 240 tatacctgca acgtggacca taagccttcc aatacaaagg tggataagac cgtggagaga 300 aagagctgcg tggagtgtcc accttgccca gctccaccag ccgctgcccc tagcgtgttc 360 ctgtttcctc caaagccaaa ggacacactg atgatctctc gcacacccga ggtgacctgc 420 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggatcca gaggtgcagt ttaactggta cgtggatggc 480 gtggaggtgc ataatgctaa gaccaagccc agggaggagc agttcaactc cacatttcgg 540 gtggtgagcg tgctgaccgt ggtgcaccag gactggctga acggcaagga gtataagtgt 600 aaggtgagca ataagggcct gcccgcccct atcgagaaga caatctctaa gaccaagggc 660 cagcctagag agccacaggt gtacaccctg cccccttctc gcgaggagat gacaaagaac 720 caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctatccta gcgacatcgc tgtggagtgg 780 gagtctaatg gccagccaga gaacaattac aagaccacac cacccatgct ggacagcgat 840 ggctctttct ttctgtattc taagctgaca gtggataagt ccaggtggca gcagggcaac 900 gtgtttagct gctctgtgat gcatgaggcc ctgcacaatc attacaccca gaagtccctg 960 agcctgtctc caggcaag 978 <210> 58 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 58 aggacagtgg ccgctccatc cgtgttcatc tttcccccta gcgacgagca gctgaagagc 60 ggcaccgcct ctgtggtgtg cctgctgaac aatttctacc ccagggaggc caaggtgcag 120 tggaaggtgg ataacgctct gcagagcggc aattctcagg agtccgtgac cgagcaggac 180 agcaaggatt ctacatattc cctgagctct accctgacac tgagcaaggc cgattacgag 240 aagcacaagg tgtatgcttg cgaggtgacc catcagggcc tgtccagccc agtgacaaag 300 tcttttaaca ggggcgagtg t 321 <210> 59 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Phe 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Glu Ser Leu Phe Gly Val Tyr Tyr Asp Tyr Gly Tyr Tyr Ser Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 210 215 220 Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala 225 230 235 240 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 60 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 61 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 61 caggtgcagc tggtggagag cggaggagga gtggtgcagc ctggcaggtc cctgaggctg 60 agctgtgccg tgtccggctt cagcctgaca agatttggag tgcattgggt gcgccaggct 120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggccgtg atctggaggg gaggatccac cgactacaac 180 gctgctttta tgagccggct gacaatctct aaggataact ccaagaatac cgtgtatctg 240 cagatgaact ccctgagggc tgaggacacc gccgtgtact attgcgccaa ggagagcctg 300 ttcggcgtgt actatgacta cggctactat tctatggatt attggggcca gggcaccaca 360 gtgacagtgt cctccgcctc caccaaggga ccatccgtgt tcccactggc cccatcttcc 420 cggagcacat ctgagtccac cgccgctctg ggctgtctgg tgaaggatta cttccctgag 480 ccagtgacag tgtcttggaa ctccggcgct ctgacatccg gcgtgcacac ctttcctgcc 540 gtgctgcaga gctctggcct gtacagcctg tccagcgtgg tgaccgtgcc ctcttccaat 600 ttcggcaccc agacatatac ctgcaacgtg gaccataagc cttccaatac aaaggtggat 660 aagaccgtgg agagaaagag ctgcgtggag tgtccacctt gcccagctcc accagccgct 720 gcccctagcg tgttcctgtt tcctccaaag ccaaaggaca cactgatgat ctctcgcaca 780 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg atccagaggt gcagtttaac 840 tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gctaagacca agcccaggga ggagcagttc 900 aactccacat ttcgggtggt gagcgtgctg accgtggtgc accaggactg gctgaacggc 960 aaggagtata agtgtaaggt gagcaataag ggcctgcccg cccctatcga gaagacaatc 1020 tctaagacca agggccagcc tagagagcca caggtgtaca ccctgccccc ttctcgcgag 1080 gagatgacaa agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta tcctagcgac 1140 atcgctgtgg agtgggagtc taatggccag ccagagaaca attacaagac cacaccaccc 1200 atgctggaca gcgatggctc tttctttctg tattctaagc tgacagtgga taagtccagg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt tagctgctct gtgatgcatg aggccctgca caatcattac 1320 acccagaagt ccctgagcct gtctccaggc aag 1353 <210> 62 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 62 gatatccaga tgacacagtc cccttccagc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgtc gcgcctccca ggagatctct ggctacctgt cctggctgca gcagaagcca 120 ggcaaggctc ccaagcgcct gatctatgct gcctccaccc tggactctgg agtgccttcc 180 aggttcagcg gctctcggtc cggcacagag tacaccctga caatctcttc cctgcagcct 240 gaggatttcg ccacctacta ttgcctgcag tacgcttcct atccactgac ctttggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa gaggacagtg gccgctccat ccgtgttcat ctttccccct 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 420 cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagagcgg caattctcag 480 gagtccgtga ccgagcagga cagcaaggat tctacatatt ccctgagctc taccctgaca 540 ctgagcaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac ccatcagggc 600 ctgtccagcc cagtgacaaa gtcttttaac aggggcgagt gt 642 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 63 catcagccct aatccatctg a 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 64 cgcgactaac aatcaaagtg a 21 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 65 ctaggccaca gaattgaaag atct 24 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 66 gtaggtggaa attctagcat catcc 25

Claims

항-EphA4 항체를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물로서,
항-EphA4 항체는
(a) SEQ ID NO. 44에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO. 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO. 28에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3
을 포함하는 중쇄; 그리고
(d) SEQ ID NO. 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO. 30에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO. 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3
을 포함하는 경쇄를 포함하는, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
항-EphA4 항체는 인간화된, 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합하고, EphA4의 절단을 향상시키는, 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
항-EphA4 항체는 EphA4에 특이적으로 결합하고, EphA4와 에프린 사이의 결합을 억제하는, 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
중쇄는 SEQ ID NO. 45에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함하며,
경쇄는 SEQ ID NO. 46에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
중쇄의 불변 영역 및 경쇄의 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
제6항에 있어서,
중쇄의 불변 영역은 인간 IgG의 불변 영역인, 약학 조성물.
제7항에 있어서,
인간 IgG의 불변 영역은 인간 IgG₂의 불변 영역인, 약학 조성물.
제8항에 있어서,
인간 IgG₂의 불변 영역은 SEQ ID NO. 47에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
경쇄의 불변 영역은 인간 Igκ의 불변 영역인, 약학 조성물.
제10항에 있어서,
인간 Igκ의 불변 영역은 SEQ ID NO. 48에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
항-EphA4 항체를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물로서,
항-EphA4 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고,
중쇄는 SEQ ID NO. 59에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고,
경쇄는 SEQ ID NO. 60에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며,
중쇄의 C-말단 리신은 선택적으로 결실될 수 있는, 약학 조성물.
제12항에 있어서,
중쇄의 C-말단 리신은 결실되는, 약학 조성물.
근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 항-EphA4 항체의 용도로서,
항-EphA4 항체는
(a) SEQ ID NO. 44에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO. 27에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO. 28에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3
을 포함하는 중쇄; 그리고
(d) SEQ ID NO. 29에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO. 30에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO. 31에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3
을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항-EphA4 항체의 용도.
제14항에 있어서,
중쇄는 SEQ ID NO. 45에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함하며,
경쇄는 SEQ ID NO. 46에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 가변 영역을 포함하는, 항-EphA4 항체의 용도.