JP6057214B2 - 培養容器、培養システム及び培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、少数の細胞から培養、継代を行うことで細胞を増殖させ、細胞数を増大させる培養に用いる培養容器、培養システム及び培養装置に関する。

本技術分野の背景技術として、米国特許出願公開第２００２／００４５２５２号明細書（特許文献１）及び米国特許出願公開第２００７／００６５９３３号明細書（特許文献２）などがある。

特許文献１には、セルファクトリーと呼ばれる培養容器について記載されている。この容器は、容器全体を９０度回転させ、回転させた状態で培地を注液し、所定量注液したところで、再び、容器全体を９０度回転することによって、多層構造になっている各層に培地が配分される構造になっている。

特許文献２には、積層された細胞培養容器が記載されている。この積層された細胞培養容器は少なくとも一つの開口部を有するガス交換器を備え、迅速かつ概ね均一に各容器内にガスを分配する。

米国特許出願公開第２００２／００４５２５２号明細書 米国特許出願公開第２００７／００６５９３３号明細書

上記の特許文献に示した培養容器では所定量の培地が多層構造の各層に入れられ、気相に関しても気相の入力ポートから十分送ることができる。しかし、培地を入れる場合などに容器全体を９０度回転させる必要がある。このため、大きな容器を用いる場合には労力が掛かり、特に、継代を行い大量に細胞を培養することを目的とした自動培養システムでは、９０度回転させるためにその駆動系が大掛かりとなる。加えて、この回転動作を急に行うと細胞に対して少なからぬ衝撃を与える可能性がある。

そこで、本発明では９０度回転させること無く、多層構造の各層に所定量培地を送ることができ、かつ気相に関しても十分な送気を可能とする培養容器を提供するものである。本発明の主要な目的を列挙すると次の通りである。まず、接着性細胞を培養し増殖させることで細胞数を増大させる培養装置、特に自動培養を可能とする培養装置において、装置全体の占める体積に対して、単位体積あたりの培養面積増大を図ることである。つまり、培養のために必要な処理を行う装置自体を小型化するとともに、それに内蔵される培養容器の面積を最大限に大きくすることである。

また、あわせて、培養に必要なチューブ系を簡単化することである。

これらを満たしながら、積層化し多層にわたる培養容器の各層には所定の量を均等に入れられることである。

加えて、これらの容器装置システムにおいて、コンタミネーションの可能性を低減することである。

そして、このように効率的な培養容器において、培養環境としての気相、液相を最適に維持できることである。

さらに、装置の維持及び管理を容易化することである。

上記の課題を解決するために、本発明は、液体の培地を貯留する、上方が開口した培養空間の底面と、前記培養空間を囲み、前記培養空間の底面より高い辺部と、を有する培養容器であって、前記辺部は、上下方向に貫通する複数の貫通穴と、上方が開口した非貫通穴と、前記複数の貫通穴の一つと前記非貫通穴とを連結する第１流路と、前記非貫通穴と前記培養空間とを連結する第２流路と、を有し、前記第１流路の底の高さは、前記辺部の上面の高さより低く、かつ、前記培養空間の底面及び前記第２流路の底の高さのいずれより高いことを特徴とする。

本発明の一実施形態によれば、単位体積あたりの培養面積を増大させ、さらにチューブ系を簡素化することができる。

上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明によって明らかにされる。

本発明の実施例１の培養システムを構成する最上層の培養容器の説明図である。 本発明の実施例１の積層状態の培養容器及び培地の流路の説明図である。 本発明の実施例１の積層状態の培養容器及び培地の流路の詳細な説明図である。 本発明の実施例１の各層の貫通穴及び非貫通穴の位置関係の説明図である。 本発明の実施例１の培養容器への液体の注入及び培養容器からの液体の排出の説明図である。 本発明の実施例２の培養システムを構成する最上層の培養容器の説明図である。 本発明の実施例２の積層状態の培養容器の説明図である。 本発明の実施例２の各層の貫通穴及び非貫通穴の位置関係の説明図である。 本発明の実施例の密閉容器に収容された培養システムの第１の例の斜視図である。 本発明の実施例の密閉容器に収容された培養システムの第１の例の三面図である。 本発明の実施例の密閉容器に収容された培養システムの第２の例の斜視図である。 本発明の実施例の密閉容器に収容された培養システムの第３の例の三面図である。 本発明の実施例の培養装置の説明図である。

以下、図面を用いて実施例を説明する。

本実施例では、大きな姿勢変化を伴わずに培養操作でき、かつ単位体積あたりの培養面積を拡大した培養容器、培養システム及び培養装置について説明する。図１を用いて、本発明の特長を示す最上層の培養容器１００の例を説明する。

図１は、本発明の実施例１の培養システムを構成する一枚の培養容器の例を示す。具体的には、図１には、培養システムを構成する複数の培養容器のうち、最上層の培養容器１００の上面図を示し、さらに、その下に、培養容器１００のＡ−Ａ断面図を示す。なお、後述するように、培養容器１００は、他の培養容器及び蓋とともに積層され、密閉容器に収容されることによって培養システムを構成する。

最上層の培養容器１００は、培養面１０１と、培養面１０１の四方を囲む辺部とを有する。辺部の上面の高さは、培養面１０１より高く、この高さが培養容器１００全体の高さとなる。培養面１０１と、その四方の辺部とによって囲まれ、上方が開口した培養空間には、後述するように、液相の培地を貯留することができる。すなわち、培養面１０１は培養容器１００の培養空間の底面に相当する。

一方の辺部には、上下に貫通している複数の貫通穴１０５、１０６等が設けられる。各貫通穴は、培養容器１００の下に設置された下層の培養容器につながる。培養容器１００に設けられた貫通穴１０５、１０６等の数は、培養容器１００より下層の培養容器の数と同一である。

貫通穴１０５等が設けられた辺部にはさらに上面側に開口し下面側に貫通していない穴１０２が設けられる。この非貫通穴１０２は、流路１０３によって培養面１０１に連結される。言い換えると、非貫通穴１０２に注入された液体は、流路１０３を通って培養面１０１上の培養空間に流入する。非貫通穴１０２の底面、流路１０３の底面及び培養面１０１の高さは同一であってもよい。非貫通穴１０２の底面と培養面１０１の高さが異なる場合、流路１０３の底面はそれらをなだらかに連結するように傾斜している。なお、例えば非貫通穴１０２の底面、流路１０３の底面及び培養面１０１の高さが同一である場合、非貫通穴１０２、流路１０３及び培養面１０１は、一体化された均一の深さの窪みを形成する。

この非貫通穴１０２の側面上部には、隣接する貫通穴１０５につながる流路１０４が形成されている。流路１０４の底面の高さは、培養面１０１、非貫通穴１０２及び流路１０３のいずれの底面より高く、辺部の上面の高さよりは低い。すなわち、流路１０４は、培養面１０１側から見ると、培養面１０１から流路１０４の底面までの高さを有する堰のように構造になっている。

一方、非貫通穴１０２、流路１０３等が設けられた辺部とは培養面１０１を挟んで反対側の辺部には、貫通穴１９１及び１９３が設けられている。図１では当該反対側の辺部の両端近傍にそれぞれ貫通穴１９１及び１９３が設けられるが、どちらか一方のみが設けられてもよい。

貫通穴１９１が設けられた辺部には、貫通穴１９１と培養空間とを連結する流路１９２が形成されている。この流路１９２の底面の高さは、培養面１０１より高く、辺部の上面の高さよりは低い。つまり、流路１９２は、培養面１０１から見ると、培養面１０１から流路１９２の底面までの高さを有する堰のような構造になっている。同様に、貫通穴１９３と培養面１０１とを連結する流路１９４が設けられる。この流路１９４も流路１９２と同様の構造を有する。

通常の培養時には培養容器１００は水平に静置されており、上記で説明した堰の高さより培地の水面が低くなるため、培地は培養面１０１上にとどまり、培養面１０１の外に移動することはない。

培養容器１００は、さらに、培養面１０１に設けられた支柱１１５を有する。この支柱１１５の高さは、培養容器１００の辺部の高さと同一である。このため、後述する図２Ａ等に示すように複数の培養容器が積層された場合、一つの培養容器の支柱１１５の上面が、その上層の培養容器の支柱１１５が設けられた位置の底面に接する。この支柱１１５は、培養面１０１を形成する部材が自重及び培地の重さによって下方にたわむことを防ぎ、培養面１０１の水平を維持するために設けられるものである。図１には培養面１０１の中心に設けられた円柱状の一つの支柱１１５を示すが、支柱１１５の形状は円柱以外であってもよく、また複数の支柱１１５が設けられてもよい。培養面１０１の面積とそれを形成する部材の強度との関係で、当該部材のたわみが十分に小さい場合には、支柱１１５を設けなくてもよい。複数の培養容器を積層した時の単位体積当たりの全層の培養面の合計面積を増やすためには、各層の培養容器の高さを小さくすることが望ましく、そのためには培養面の部材も薄くすることが望ましいが、それによる強度不足を支柱１１５によって補い、培養面の水平を維持することができる。

次に、図２Ａ及び図２Ｂを用いて、本発明の実施例１の積層状態の培養容器及び培地の流路について説明する。

図２Ａには、積層状態の複数の培養容器及び蓋からなる培養システムの上面図、及び、そのＢ−Ｂ断面図を示す。積層された培養容器の最上部に設置された部材Ｃ０００は、培養容器１００等の蓋に相当し、以後蓋Ｃ０００と記載する。そのすぐ下の層は最上層の培養容器１００、その下に培養容器２００、さらにその下には培養容器３００というように、必要な数の培養容器が積層される。図２ＡのＢ−Ｂ断面図は、蓋Ｃ０００及び第５層までの積層した培養容器１００〜５００を示している。

なお、以下の説明で引用される参照符号のいくつかは、図２Ａでは省略されているが、図２Ｂ又は図３等に記載されている。また、図２Ａ等では省略されているが、本実施例の培養システムはさらに積層された複数の培養容器の全体を収容する密閉容器を含む。密閉容器については図８等を参照して後述する。

蓋Ｃ０００は複数の貫通穴Ｃ００１〜Ｃ００６等が開いているだけの板状の部材である。最上層である第１層の培養面１０１は、非貫通穴１０２と流路１０３でつながっている。Ｂ−Ｂ断面図では、培養面１０１と流路１０３の底面が同じ高さであるため、流路１０３を示している。同様に、第２層の培養面２０１は流路２０３で非貫通穴２０２とつながっている。以下同様に、第３層、第４層及び第５層の培養面は、それぞれ流路３０３、流路４０３及び流路５０３で非貫通穴３０２、４０２及び５０２とつながっている。点線で囲ったＤ部の拡大図を図２Ｂに示す。

第１層の培養容器１００において、非貫通穴１０２は、流路１０３を通じて培養面１０１とつながっている。さらに、非貫通穴１０２は、その隣に設けられた貫通穴１０５と、非貫通穴１０２の側面上部の高い位置で、流路１０４を通じて連結される。第１層の培養容器１００と第２層の培養容器２００とが積層されている状態では、第１層の貫通穴１０５は、第２層の培養容器２００の非貫通穴２０２に連結される。したがって、非貫通穴１０２は、流路１０４、貫通穴１０５、非貫通穴２０２及び流路２０３を通じて培養面２０１につながる。

同様に、第２層の培養容器２００においても、非貫通穴２０２が流路２０４を通じて隣の貫通穴２０５につながる。貫通穴２０５は、第３層の非貫通穴３０２に連結し、さらに流路３０３を通じて、第３層の培養容器３００の培養面３０１につながる。以下同様にして、非貫通穴３０２は、流路３０４を通じて貫通穴３０５につながり、貫通穴３０５は第４層の培養容器４００の非貫通穴４０２に連結し、流路４０３を通じて第４層の培養容器４００の培養面（図示省略）につながる。非貫通穴４０２は、流路４０４を通じて貫通穴４０５につながり、第５層の培養容器５００の非貫通穴５０２に連結し、流路５０３を通じて第５層の培養容器５００の培養面（図示省略）につながる。非貫通穴５０２は、流路５０４及び貫通穴５０５を通じてさらに下層の培養容器（図示省略）の培養面（図示省略）につながる。このように、本実施例の培養容器システムは、各層の非貫通穴が、隣の貫通穴につながる流路を通じて、下層の培養面につながる構造を有している。このような貫通穴と非貫通穴との位置関係は、後述する図３にも示される。

蓋Ｃ０００にある貫通穴Ｃ００１の上部から液体（例えば培地）を注入すると、図２ＢのＢ−Ｂ断面図では、第１層の培養面１０１につながる流路１０３の底面で液体は受け止められ、培養面１０１に広がっていく。液体の高さＬＬが、第１層の流路１０４の底面の高さを越えると、液体は、流路１０４を伝わって貫通穴１０５を通り、非貫通穴２０２にはいり、第２層の培養面２０１につながる流路２０３で受け止められ、培養面２０１に広がっていく。このように順次流路及び貫通穴を伝ってより下段の層に液体は流れていく。

図３は、本発明の実施例１の各層の貫通穴及び非貫通穴の位置関係を説明する図であり、平面図における各流路の関係を示すために、各層をずらした状態の積層された培養容器の上面図を示している。本来は、図３の矢印で示すように、各層の培養容器は蓋Ｃ０００の端面にそろえて積層される。

各培養容器の培養空間は、積層されていない状態では、図１に示すように上方が開口しているが、積層された状態では、上層の培養容器の下面（最上層の培養容器の場合は蓋Ｃ０００の下面）によって上方が区切られる。各培養容器の辺部のうち、貫通穴、非貫通穴及び流路以外の部分の上面がその上層の培養容器の下面（又は蓋Ｃ０００の下面）と密着する。このため、例えば培養容器１００の外部から培養容器１００の培養空間に通じる流体の経路は、流路１０３等、非貫通穴１０２等及び貫通穴Ｃ００１（又は貫通穴１９１等）を経由する経路以外に存在しない。

培養容器１００の貫通穴１０５の隣の貫通穴１０６は、培養容器２００の貫通穴２０５に連結し、さらにその隣の貫通穴１０７は、培養容器２００の貫通穴２０６に連結する。第２層の貫通穴２０５の隣の貫通穴２０６は、培養容器３００の貫通穴３０５に連結する。蓋Ｃ０００の貫通穴Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３及びＣ００４は、それぞれ、非貫通穴１０２、貫通穴１０５、１０６及び１０７に連結する。これら以外の貫通穴及び非貫通穴の位置関係は、図２Ａ、図２Ｂを参照して説明した通りであるため、説明を省略する。

なお、最下層の培養容器（図示省略）は、非貫通穴１０２と同様の貫通穴（図示省略）、流路１０３と同様の流路（図示省略）、貫通穴１９１及び１９３と同様の貫通穴（図示省略）、並びに流路１９２及び１９４と同様の流路（図示省略）を有するが、貫通穴１０５と同様の貫通穴及びそれにつながる流路１０４と同様の流路は有しない。

培養システムの全体が水平に静置されていれば、流路１０４の高さになるまで、液体は充満する。通常、培地は高価なため、最下層から溢れることがないように、あらかじめ決められた量が注入される。例えば、全ての培養容器に流路１０４等の高さまで注液した場合の培地の総量をあらかじめ計算し、その量だけの培地を注液すれば、各層には流路１０４等の高さの量の培地が注入され、最下層の培養容器から培地が溢れることなく注液が終了する。

このとき、切断線Ｂ−Ｂと平行な軸の周りに培養システム全体を回転させ、傾斜させる。そのための駆動機構については後述する（図９等参照）。図４は、このように傾斜させたときの培養容器１００のＡ−Ａ断面図を示している。図４（ａ）は水平状態のときを示しており、培養状態（すなわち培養面１０１の上に培地が貯留し、そこで細胞等が培養されている状態）がこれにあたる。図４（ｂ）は、蓋Ｃ０００の貫通穴Ｃ００１から、つまり図４（ｂ）の注入口Ｓから培地を注入するときの傾斜した培養容器１００のＡ−Ａ断面図を示している。水平線Ｈに平行に液面は形成されるから、流路１０４の高さまで液面がくれば、この流路を通じて液体がオーバーフローし、次の下層の培養容器２００に液体は移っていくため、第１層にはこれ以上培地は入らない。

図４（ｂ）のように、非貫通穴１０２等を有する辺部が、培養面１０１を挟んでそれに対向する貫通穴１９１等を有する辺部より低くなるように、培養システム全体を一様に傾斜させると、液体は、培養面１０１等の上の培養空間全体に充満する前に流路１０４等からオーバーフローする。すなわち、液体は傾きの量が大きいほど、より早く次の層に伝わっていくことになり、各培養容器の培養面上に貯留する液体の体積を傾き角度によって調整することができる。もちろん、注入する液体の量は、予め所定量を注入することで各層に所定量を注入することになる。これによって、積層された全ての培養容器に、図４（ｂ）に示す培養容器１００と同等の量の培地が注入された時点で注入を終了させることができる。

このように、液体の注入は注入口である貫通穴Ｃ００１の一箇所で行い、培養システム全体を傾けることで、各層の液体体積を所望の体積に調整することができる。すなわち、注入するチューブの本数は１本で十分であり、層ごとに液体を注入するためのチューブを設ける必要がなくなるため、構成の簡素化が図られ、かつ容易に液量の調整ができる。

廃液する場合には、図４（ｃ）に示すように、培養システム全体を注液時とは逆の方向に傾けることで、液体は流路１９２及び貫通穴１９１を通して排出口Ｄに落ちていく。排液の場合は、本実施例１では、２箇所に貫通穴１９１及び１９３を設けているので、一軸（図１、図４の例では切断線Ａ−Ａに平行な軸）周りの傾斜では２箇所から廃液できる。さらに、もう一軸周りに（例えば、図４（ｃ）のように傾斜させた上で、さらに貫通穴１９１が貫通穴１９３より低くなるように）培養システムを傾斜させ、２次元に傾斜姿勢をとることによって、残留する排液の量をごくわずかにすることができる。

一方、気相の流れについて説明する。注液する場合には、液体の注入口は蓋Ｃ０００の貫通穴Ｃ００１の１箇所のみであるが、気相については、注液側の複数の貫通穴Ｃ００１、Ｃ００２等のそれぞれが直接各層の非貫通穴に通じている。例えば、図２Ｂ及び図３等に示すように、非貫通穴３０２は、貫通穴２０５、流路２０４、非貫通穴２０２等を介して貫通穴Ｃ００１にも通じているが、貫通穴２０５及び１０６を介して貫通穴Ｃ００３にも通じている。したがって、各層の培養面に直接通じる同じ面積の開口部があることになり、数週間にわたる培養時間から見れば、ゆっくりとした気相供給では各層間で供給される気相の量に差はないと考えられる。各層にいたる気相の流路の長さが異なるが、流路自体は真直ぐであるから、長さの相違が気相の流量に与える影響は小さいと考えられる。このため、本実施例１では、気相についても各層の差はなく、培養環境を維持できる。

培養層の層数（すなわち培養システムに含まれる培養容器の数）は、一枚の培養容器の培養面積と要求される最大培養面積から求められる。例えば、要求最大培養面積を２５０００平方センチメートルとし、各層の培養容器の培養面を３２センチメートル×３８センチメートルとすると、２１層の培養容器を積層することによって、要求された最大培養面積を有する培養システムを実現できる。

また、一層の培養容器に厚さは、培地の水深、気相領域の高さだけでなく、素材表面の撥水性も考慮して設計する。さらに、非貫通穴から隣の貫通穴に通じる流路の底面の高さ及び排出時の流路の底面の高さなどを考慮する必要がある。例えば、培地水深２ミリメートル、気相高さ４ミリメートルで、培養面を形成する部材の厚みを２ミリメートルとすると、それらの合計は８ミリメートルであるが、最終的には細胞種により培養可能な培養面の親水性の度合いにより、培地水深を最適化してよい。また、培地に細胞を播種したときの攪拌動作で流路からもれる培地が想定されるため、これを少なくするためには、流路の底面にある程度の高さが必要となる。先の例で、８ミリメートル厚さに液が動くときの余裕をとって、各層の培養容器の厚みを１０ミリメートルとすると、２１層の培養容器に蓋を加えることによって、培養システム全体の高さは２２０ミリメートル程度になる。この程度であれば、培養システム全体を傾斜させたときの水平移動の影響も大きくない。

本実施例２は、気相の通気性には実施例１に比べ低下するものの、培養容器製作にあたり例えば、射出成型などの手法において、金型パターンを最小限度の数にして製作できる培養容器を示している。実施例２の構成要素のうち、実施例１と同じ参照符号が付されたものは、以下に特記しない限り、当該参照符号が付された実施例１の構成要素と同じであるため、説明を省略する。

図５は、本発明の実施例２の最上層の培養容器１００の説明図である。実施例２の培養容器１００は、貫通穴１０５以外の貫通穴が設けられていないことを除いて、実施例１の培養容器１００と同じである。

図６は、蓋Ｃ０００と第５層までの積層状態にある培養容器１００〜５００の上面図及びＢ−Ｂ断面図を示している。図７は、蓋Ｃ０００と第３層までの培養容器１００〜３００の積層状態を平面図で示している。図７には、分かりやすくするために、各層をずらして示しているが、実際は蓋Ｃ０００の端面に揃えて培養容器１００〜３００が積層されている。

図６の断面図では、蓋Ｃ０００の貫通穴Ｃ００１から注入した培地は、最上層の培養容器１００の流路１０３によって受け止められ、第１層の培養面１０１に広がる。非貫通穴１０２の隣の貫通穴１０５への流路１０４の位置の高さにまで液面が上がってくると、培地は、流路１０４を伝って貫通穴１０５に入り、第２層の流路２０３によって受け止められ、培養面２０１に広がっていく。第２層の非貫通穴２０２の隣の貫通穴２０５は、図１とは異なり、反対側、すなわち、上層の培養容器１００の非貫通穴１０２の直下に設けてある。このため、培地は、液面が上がってくると、流路２０４を通って貫通穴２０５を伝って、第３層の培養面３０１への流路３０３に入り、第３層の培養面３０１に広がっていく。以下同様にして、下層に培地が入っていく。

この実施例２では、最上位層の１００とその下層にある第３層の培養容器３００、第５層の培養容器５００など奇数層目の培養容器は全て同じものになっている。また、第２層の培養容器２００は、第４層目の培養容器４００等、偶数層目の培養容器と同じものになっている。このため、二種類の培養容器があれば、必要な層数の培養容器の積層化が可能である。図７の平面図においても、そのことが確認できる。

本実施例２では、気相に関しては、培地の流路と同じ経路を経て各層に供給されることになる。このため、図１の実施例１に比べると、各層の気相については、単位時間当たりの供給量に差が生じる可能性がある。しかし、蓋Ｃ０００及び各培養容器は廃液用の貫通穴（例えば貫通穴Ｃ１９１、Ｃ１９３等）も有しているため、こちらを気相用に流用すれば、供給量の差は小さくできる。例えば、貫通穴Ｃ１９３を気相の供給に併用することで気相の各層間の差を低減できる。

以上、複数の培養容器が積層された培養システムの２種類の構成を実施例１及び実施例２で説明したが、これらにおいて、液体の培地を各層の培養面に供給し、排出する原理は同じである。

次に、これらの積層された培養容器からなる培養システムの実装について説明する。

実施例１及び実施例２に示した積層培養容器は、密閉容器に収容される。図８は、密閉容器に収容された積層培養容器からなる培養システムの一例を示す斜視図である。図９は、密閉容器を含む培養システムの一例を示す三面図である。なお、図８及び図９は、培養システムの例として、実施例１の積層された培養容器が密閉容器１０に収容された状態を示すが、実施例２の積層された培養容器も同様に密閉容器１０に収容される。後述する図１０〜図１２に示す例についても同様である。

図８（ａ）は積層された培養容器を収容した状態の密閉容器１０の外観を、図８（ｂ）は密閉容器の密閉蓋１１、図８（ｃ）は積層された培養容器、図８（ｄ）は密閉容器の本体である収容容器１２の例を示している。この構成では、密閉容器１０の蓋１１と積層された培養容器の最上部の蓋Ｃ０００とで、積層された培養容器を、密閉容器本体の収容容器１２内に圧着する形で密閉する。

密閉容器１０には、培地注入口Ｐ０１、培地排出口Ｐ０２、気相供給口Ｐ０３及び気相排気口Ｐ０４が設けられる。これらは、あらかじめ部分ごとに滅菌処理をされ、清浄環境にて組み立てられる。各培養容器の形態は皿状であるため、容易に培養面などは表面処理して培養に最適な表面としておくことができる。

気相供給口Ｐ０３は、密閉容器の蓋１１の下面側に設けられた窪みに連結される。この窪みによって蓋１１と蓋Ｃ０００の間に形成された空間１３は、蓋Ｃ０００の全ての貫通穴につながり、気相供給口Ｐ０３から気相供給したときに、調圧空間の役目を果たす。すなわち、気相供給口Ｐ０３から注入された気体は、空間１３及び蓋Ｃ０００の各貫通穴を通って、最上層の培養容器１００の非貫通穴１０２及び全ての貫通穴１０５等に流入する。

一方、培地注入口Ｐ０１は、最上層の培養容器１００の非貫通穴１０２に連結した蓋Ｃ０００の貫通穴Ｃ００１の直上に設けられる。このため、培地注入口Ｐ０１から注入された液体の培地は、貫通穴Ｃ００１を通って非貫通穴１０２のみに流入する。

また、培地排出口Ｐ０２及び気相排気口Ｐ０４は、それぞれ、最下層の培養容器の貫通穴１９１及び１９３に連結する。培地注入口Ｐ０１からの培地の注入が終了し、培養システムが水平に静置された状態では、培地排出口Ｐ０２及び気相排気口Ｐ０４のいずれからも培地は排出されない。その状態で、気相供給口Ｐ０３から気体が供給された場合、培地排出口Ｐ０２及び気相排気口Ｐ０４の両方から気体が排出される。

上記のように、各培養容器の培養空間に通じる流体の経路が、培地注入口Ｐ０１、培地排出口Ｐ０２、気相供給口Ｐ０３及び気相排気口Ｐ０４以外に存在しないように、積層された培養容器が密閉容器１０によって密閉される。

図９は、２１層の積層された培養容器とそれらを収容する密閉容器１０を示しており、最下層の第２１層の培養容器２１００については断面図を示している。この例では、培地排出口Ｐ０２の反対側に、培地排出口Ｐ０２と同様の気相排気口Ｐ０４を設けている。スペーサＳ０１、Ｓ０２、Ｓ０３は、培養システムを台（図示省略）の上に置くときに台と収容容器１２との間に設けられ、収容容器１２を支持するスペーサを示している。

図１０は、積層された培養容器を収容した密閉容器１０の別の例を示している。図１０では、密閉容器１０から排出された培地及び細胞懸濁液を一時蓄える中間容器１４が密閉容器１０の下部に設けられる。この中間容器１４の底部に液体排出口Ｐ０５が、側面に気相排気口Ｐ０６がそれぞれ設けられる。

また、図１０（ａ）及び図１０（ｄ）に示しているように細胞観察用のカメラシステム９０を密閉容器１０の下部に設置することで、透明樹脂で製作された密閉容器１０及び培養容器を通して、培養容器で培養されている細胞を観察することができる。カメラシステム９０は、カメラ本体９１、レンズ系９２、照明９３からなっている。

さらにまた、図１０では、この密閉容器１０を用いる自動培養装置への取り付けが容易になるような支持部材Ｈ０１、Ｈ０２、Ｈ０３が密閉容器本体の収容容器１２に設けてある。

図１１は、積層された培養容器を収容した密閉容器１０の構成のさらに別の例を三面図で示している。大量培養装置の場合、始めは小さい面積で培養し、細胞が充満状態、コンフルエント状態になると、それを継代して大きな面積の培養容器に播種しなおして、細胞数を増大させる。図１１は、このためのはじめの培養用と継代後の培養用に培地注入口を分けた設けたもので、最上部の第１層は、この培養容器一枚でのみ培養でき、下層につながる流路１０４を設けていない。第２層以下には、これまでに説明したような下層につながる流路２０４等を設けた培養容器が積層されている。このため、第２層の培養容器２００の非貫通穴２０２に培地を仲秋するための液体注入口Ｐ１０が、培地注入口Ｐ０１とは別に設けられている。これによって注入口が１つ増えるが、継代の前と後で容器を完全に分けることができ、操作が一部簡略化できる。

さらに、図１１に示す培養システムには、密閉容器１０を支持する脚Ｌ０１、Ｌ０２、Ｌ０３が設けられる。例えば、脚Ｌ０２と、脚Ｌ０１、Ｌ０３とを図１１の線Ｅで示すような脚長に調節できれば、培養システム全体を脚Ｌ０２側に傾けることができる。これは、図４（ｂ）に示した培地注入時の姿勢に相当する。逆に、線Ｗのように脚長を調節すると、図４（ｃ）に示した培地廃棄時の姿勢になるように、培養システム全体を脚Ｌ０１、Ｌ０３側に傾けることができる。

最後に、上記の培養容器を用いた自動培養装置の構成の例について、図１２を用いて説明する。図１２は、本発明の培養システムを用いた自動培養装置１の構成の例を示している。積層された培養容器を収容した密閉容器１０は、恒温装置２の中に収容される。恒温装置２はヒータ２８を備え、その温度を測定し、制御することによって、恒温装置２内の温度を一定に保つことができる。

恒温装置２の中で、密閉容器１０は、これを支持し固定する支持部材２１に取り付けられる。支持部材２１は、密閉容器１０を傾斜させることのできる搖動機構、ここでは３組の上下方向の駆動機構２５、２６、２７に、それぞれ姿勢変化を伝え受動する接続部材２２、２４で姿勢を変えられるように取り付けられている。接続部材２２等は、一軸の平行移動、その軸周りとそれに直行する軸周りのそれぞれ回転の３自由度を受動する機構でよい。密閉容器１０には、密閉容器１０の（すなわちそれに収容された培養容器の）傾斜を計測する傾斜センサ２９が取り付けられる。

このほかに、装置内部には、送液ポンプ３０、電磁弁などでチューブを切り替え、液又は気相を密閉容器１０に送ったり、回収したりする弁機構３１、細胞をモニタするカメラシステム９０、などが設置されており、チューブで密閉容器１０に接続されている。これらチューブ系は密閉容器とともに清浄環境において組み立てられ、密閉環境の清浄性を維持している。恒温装置２の外部には、気相調整器４０、培地などを格納しておく冷蔵部５０、排液などを保管する排液部５１がある。必要なチューブで弁機構３１等と冷蔵部５０内の培地バッグ及び排液部５１内の排液バッグ等が接続されている。

さらに、そのほか、全体を制御し、上位装置との通信を行う制御システム６０が培養装置１に接続される。制御システム６０は、いわゆるＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）のような一般的な計算機であってよい。例えば、制御システム６０は、傾斜センサ２９が計測した密閉容器１０の傾斜の値を取得し、その値に基づいて、密閉容器１０の傾斜の量が所望の値になるように駆動機構２５、２６、２７を制御する。例えば、制御システム６０は、各培養容器に注入したい培地の量を示す値を入力されると、培養容器の寸法に基づいて、その量の培地を注入するために必要な傾斜量を計算し、傾斜センサ２９の計測値が上記の計算された傾斜量となるように駆動機構２５、２６、２７を制御してもよい。

播種を行う場合には、密閉容器１０を所定量に傾けて、第１層に播種する。この場合は、第１層のみに入れるだけなので、傾けなくても良いかもしれない。その状態で、密閉容器に所定量細胞懸濁液と培地を入れる。

培地交換を行う場合は、密閉容器１０を播種の場合と逆に傾けて培地を排出し、さらに逆に傾けて培地を供給する。その後、回収時期になれば、ｐｂｓを入れて洗浄し、トリプシンを入れて細胞懸濁液とし、回収する。次に、回収したものに培地を追加し、細胞懸濁液とし、密閉容器１０を傾けて今度は全層に播種する。その場合も、１つの注入口から注入し続けることで全層に播種することができる。

このように、密閉容器１０に接続されるチューブ系は、培地注入口Ｐ０１、培地排出口Ｐ０２、気相供給口Ｐ０３及び気相排気口Ｐ０４に接続される４本のみで十分であり、密閉容器１０の傾斜を制御することで密閉容器に収容された複数の培養容器内での培養処理を実現できる。

以上の本発明の実施形態によれば、各培養容器は、その上下の培養容器と直接密着した状態で積層化できるような、皿状に厚みの薄い構造であり、多数枚を積層して培養容器としての密閉容器に構成できるため、単位体積あたりの培養面積を増大させることができる。

密閉容器内で積層している複数の培養容器の貫通穴及び非貫通穴を介して気相、液相が順次流れていくため、液相、気相ともに注入口は密閉容器についてそれぞれ１箇所あればよく、複数の培養容器のそれぞれにチューブを接続する必要がない。同様に、排出口も液相、気相のそれぞれについて密閉容器に１箇所ずつあればよい。このため、複雑なチューブ系を用いた気相及び液相の分配は不要となり、チューブ系を簡素化することができる。

上記の構造のため、密閉容器全体を水平に静置したままで、１箇所の注入口から注液することによって、各層ごとに均等に液体が入っていくため、均等注液、すなわち、各層に等量、均一に液を入れることができる。さらに、密閉容器全体をわずかに傾けることによって、各層に貯留する液量が所望の量になるように調節することもできる。このため、密閉容器全体を９０度回転させるなど、大きく傾ける必要がなくなり、密閉容器全体を支持及び駆動する機構を簡素化することができるとともに、必要最小限の培地を注入することで培地の消費量を削減することができる。

各培養容器は積層し密閉容器内に固定されているため、外部とは４つのポートのみを介して接続され、ここの接続自体、もっともクリーンな環境で行うことで、密閉状態でチューブ系を構成するため、外部とのコンタミネーションの機会を低減できる。

各培養容器に開けられた貫通穴を通して、培地及び気体が入っていくとともに拡散し、ムラが低減できるため、培養環境としての気相、液相を最適に維持できる。特に、穴の数は培養容器に１つ確保されるため、換気能力確保の効果がある。また、気相の入力側は、各培養容器への穴を包括的に含むマニホールドが構成できるため、気相系を簡素化できる。

さらに、培養装置が密閉容器単位で構成されるため、装置の維持及び管理を容易化でき、容器の操作を自動化できる。

さらにまた、培養面に支柱を設けることで、培養容器の積層に伴い、全体の剛性を高めることができ、培養面の水平を維持することができる。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。また、上記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１ 培養装置
１０ 密閉容器
１００、２００、３００、４００、５００ 培養容器
１０１、２０１、３０１ 培養面
１０２、２０２、３０２、４０２、５０２ 非貫通穴
１０３、２０３、３０３、４０３、５０３ 培養面と非貫通穴とを連結する流路
１０４、２０４、３０４、４０４、５０４ 非貫通穴と貫通穴とを連結する流路
１０５、１０６、１０７、２０５、２０６、３０５、４０５、５０５ 注入側の貫通穴
１１５ 支柱
１９１、１９３ 排出側の貫通穴
１９２、１９４ 培養面と排出側の貫通穴とを連結する流路
Ｃ０００ 蓋
Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００６、Ｃ０９１、Ｃ０９３ 蓋の貫通穴

Claims (8)

1. 液体の培地を貯留する、上方が開口した培養空間の底面と、前記培養空間を囲み、前記培養空間の底面より高い辺部と、を有する培養容器であって、
   前記辺部は、上下方向に貫通する複数の貫通穴と、上方が開口した非貫通穴と、前記複数の貫通穴の一つと前記非貫通穴とを連結する第１流路と、前記非貫通穴と前記培養空間とを連結する第２流路と、を有し、
   前記第１流路の底の高さは、前記辺部の上面の高さより低く、かつ、前記培養空間の底面及び前記第２流路の底の高さのいずれより高いことを特徴とする培養容器。
2. 請求項１に記載の培養容器であって、
   前記辺部は、直線状の第１の辺部と、前記培養空間を挟んで前記第１の辺部に対向する直線状の第２の辺部とを含み、
   前記非貫通穴は、前記第１の辺部に設けられ、
   前記複数の貫通穴は、前記第１の辺部に設けられた一つ以上の第１の貫通穴と、前記第２の辺部に設けられた一つ以上の第２の貫通穴と、を含み、
   前記第２の辺部は、前記各第２の貫通穴と前記培養空間とを連結する第３流路を有し、
   前記第３流路の底の高さは、前記辺部の上面の高さより低く、かつ、前記培養空間の底面の高さより高いことを特徴とする培養容器。
3. 上下方向に重ねられた請求項２に記載の複数の培養容器を含む培養システムであって、
   最上部の前記培養容器を除く前記各培養容器の前記各第２の貫通穴は、直上の前記培養容器の前記各第２の貫通穴に連結し、
   最上部の前記培養容器を除く前記各培養容器の前記非貫通穴は、直上の前記培養容器の前記第１流路に連結した前記第１の貫通穴に連結し、
   最上部の前記培養容器を除く前記各培養容器の辺部のうち、前記非貫通穴、前記複数の貫通穴及び前記第１乃至第３流路を除く部分の上面は、直上の前記培養容器の底面に密着し、
   前記重ねられた複数の培養容器を収容する密閉容器をさらに含み、
   前記密閉容器は、
   最上部の前記培養容器の前記非貫通穴及び前記一つ以上の第１の貫通穴の全てに通じる第１の流入口と、最上部の前記培養容器の前記非貫通穴に通じる第２の流入口と、最下部の前記培養容器の前記一つ以上の第２の貫通穴に通じる一つ以上の排出口と、を有し、
   前記第１の流入口、前記第２の流入口及び前記一つ以上の排出口以外に、前記各培養容器の前記培養空間に通じる流体の経路を有しないことを特徴とする培養システム。
4. 請求項３に記載の培養システムであって、
   前記最上部の培養容器及び前記最下部の培養容器を除く前記各培養容器は、直上の前記培養容器より一つ少なく、かつ、直下の前記培養容器より一つ多い数の前記第１の貫通穴を有し、
   前記各貫通穴は、直上の前記培養容器の前記複数の貫通穴のうち、前記第１流路に連結していない前記各貫通穴に連結することを特徴とする培養システム。
5. 請求項３に記載の培養システムであって、
   前記複数の培養容器は、
   前記第１の辺部の第１の位置に設けられた非貫通穴及び前記第１の辺部の第２の位置に設けられた一つの前記第１の貫通穴を有する複数の第１の培養容器と、
   前記第２の位置に設けられた非貫通穴及び前記第１の位置に設けられた一つの前記第１の貫通穴を有する複数の第２の培養容器と、を含み、
   前記第１の培養容器の前記非貫通穴が、直上の前記第２の培養容器の前記第１の貫通穴に通じ、前記第２の培養容器の前記非貫通穴が、直上の前記第１の培養容器の前記第１の貫通穴に通じるように、前記第１の培養容器及び前記第２の培養容器が交互に重ねられることを特徴とする培養システム。
6. 請求項３に記載の培養システムであって、
   前記各培養容器は、前記培養空間の底面の所定の位置に設けられた、前記辺部と同一の高さの支柱をさらに有することを特徴とする培養システム。
7. 請求項３に記載の培養システムと、前記培養システムの傾斜を計測する傾斜センサと、前記培養システムを支持し、傾斜させる駆動機構と、を有することを特徴とする培養装置。
8. 請求項７に記載の培養装置であって、
   前記駆動機構は、前記傾斜センサが計測した値に基づいて、前記第２の流入口から液体が注入されるときに、前記第１の辺部が前記第２の辺部より低くなるように前記培養システムを傾斜させ、前記一つ以上の流出口の少なくとも一つから前記液体が排出されるときに、前記第２の辺部が前記第１の辺部より低くなるように前記培養システムを傾斜させることを特徴とする培養装置。

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