JP6055317B2 - Glycated protein and method for measuring protein - Google Patents
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Description
本発明は、一つの反応容器で生体試料などに含まれる糖化タンパク質及びタンパク質を一度に測定する方法に関するものである。糖化タンパク質及びタンパク質を測定することにより、試料中の糖化タンパク質のタンパク質に対する割合を求めることができる。 The present invention relates to a method for measuring glycated protein and protein contained in a biological sample or the like in one reaction vessel at a time. By measuring glycated protein and protein, the ratio of glycated protein to protein in the sample can be determined.
血液や尿などの生体試料に含まれる様々な物質を測定する目的で、検査センターや病院の検査室等では、多数試料、多項目の同時、連続測定が可能な自動分析装置が広く利用されている。一方、このような自動分析装置を持たない医療施設では、診療上迅速な検査結果が必要な場合に備えて、簡易分析装置や小型分析装置が利用されている。これらの装置の例として、自動分析装置をそのまま小型化したような装置や、測定用試薬が予めパッケージ化された反応カセットを専用装置にセットして簡単に測定できるようにしたものがある。これらには一回の操作で一項目しか測定できないものもあり、複数項目を測定しようとすると、それぞれに応じた反応容器、試薬類を準備し、複数回操作を繰り返す必要があり、結果が出るまでに長時間を要すため、一度の操作で迅速かつ簡便に複数項目の測定ができる方法の開発が望まれている。 For the purpose of measuring various substances contained in biological samples such as blood and urine, automatic analyzers that can measure multiple samples and multiple items simultaneously and continuously are widely used in laboratory centers and hospital laboratories. Yes. On the other hand, in a medical facility that does not have such an automatic analyzer, a simple analyzer or a small analyzer is used in preparation for a case in which a quick examination result is necessary in clinical practice. Examples of these apparatuses include an apparatus in which an automatic analyzer is miniaturized as it is, and an apparatus in which a reaction cassette preliminarily packaged with a measuring reagent is set in a dedicated apparatus so that measurement can be easily performed. Some of these items can only be measured in a single operation, and if multiple items are to be measured, it is necessary to prepare reaction vessels and reagents for each item and repeat the operation multiple times, resulting in results. Therefore, it is desired to develop a method capable of measuring a plurality of items quickly and easily with a single operation.
糖化タンパク質には、ヘモグロビンＡ１ｃ、糖化アルブミンなどがあり、糖化と非糖化の割合を求めることにより糖尿病の診断に用いられている。これらの糖化タンパク質は、免疫法や酵素法などで測定されているが、ヘモグロビンＡ１ｃ以外の糖化タンパク質は測定原理上、糖化タンパク質と非糖化タンパク質２項目の測定が必要であり、一度の操作で迅速かつ簡便に複数項目の測定ができる方法の開発が望まれている。 Examples of glycated proteins include hemoglobin A1c and glycated albumin, which are used for diagnosis of diabetes by determining the ratio of glycation and non-glycation. These glycated proteins are measured by an immunization method or an enzyme method. However, glycated proteins other than hemoglobin A1c require measurement of glycated protein and non-glycated protein on the principle of measurement. Development of a method that can easily measure a plurality of items is desired.
その方法の一つとして、一つの反応容器でタンパク質と糖化タンパク質を一度に測定する方法が提案されている。例えば、第一工程でタンパク質を比色法により測定し、第二工程でプロテアーゼを作用させることにより発色体を退色させ、第三工程で糖化アミノ酸を比色法により測定する方法が報告されている（特許文献１）。しかし、この方法は、第三工程の測定を行う際に、第一工程で用いるタンパク定量色素、即ちブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーンなどが中性以上で着色し、ベースラインが安定しないという課題や、検体に含まれている内因性の糖化アミノ酸の影響を受けるという課題がある。 As one of the methods, a method for measuring protein and glycated protein at one time in one reaction vessel has been proposed. For example, a method has been reported in which a protein is measured by a colorimetric method in the first step, a chromophore is faded by acting a protease in the second step, and a glycated amino acid is measured by a colorimetric method in the third step. (Patent Document 1). However, in this method, when performing the measurement in the third step, the protein quantitative dye used in the first step, that is, bromocresol purple, bromocresol green, etc. is colored neutral or more, and the baseline is not stable. There is a problem of being influenced by endogenous glycated amino acids contained in the specimen.
また、一つの反応容器で測定する別の方法として、アルブミンと糖化アルブミンを含む測定サンプルにプロテアーゼを作用させ、生じた糖化リジンを比色法により測定してから、更に、リジンを比色法により測定する方法が報告されている（特許文献２）。この方法においては、最初の糖化リジンの測定における発色体が、後のリジンの測定に影響を及ぼすことが問題である。 As another method for measuring in one reaction vessel, a protease is allowed to act on a measurement sample containing albumin and glycated albumin, and the resulting glycated lysine is measured by a colorimetric method. A measuring method has been reported (Patent Document 2). The problem with this method is that the chromophore in the first measurement of glycated lysine affects the subsequent measurement of lysine.
一方、２項目を一度に測定する方法としては、測定対象は限定されるが、ＬＤＬコレステロールと総コレステロールを一度に測定する方法（特許文献３）、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを一度に測定する方法（特許文献４、非特許文献１）が報告されている。また、第一反応を経て第二反応開始初期に一つめの物質から生成する発色体を測定し、その後第二反応が進行するに従ってもう一つの物質から徐々に生成してくる発色体を最初に生成した発色体と合わせて測定する方法が報告されている（特許文献５）。さらに、アルブミンを免疫凝集法により測定した後、強アルカリ性に液性を変化させることにより凝集塊を溶解すると同時に、クレアチニンをJaffe反応により比色測定する、クレアチニンとアルブミンを一度に測定する方法が提示されている（特許文献６）。しかし、いずれも特定の物質を測定するために開発された方法であり、汎用性のある方法として、タンパク質及び糖化タンパク質の両者の測定に適用することはできない。 On the other hand, the methods for measuring two items at a time are limited, but the method for measuring LDL cholesterol and total cholesterol at a time (Patent Document 3), the method for measuring hemoglobin and glycated hemoglobin at a time (patent) Document 4 and Non-Patent Document 1) have been reported. In addition, the color former produced from the first substance is measured at the beginning of the second reaction through the first reaction, and then the color former gradually produced from the other substance as the second reaction progresses first. A method of measuring together with the formed color former has been reported (Patent Document 5). Furthermore, after measuring albumin by immunoaggregation method, a method of measuring creatinine and albumin at the same time by dissolving the aggregate by changing the liquidity to strongly alkaline and simultaneously measuring creatinine by Jaffe reaction is presented. (Patent Document 6). However, both are methods developed for measuring a specific substance, and cannot be applied to the measurement of both proteins and glycated proteins as a versatile method.
一つの反応容器で生体試料などに含まれる糖化タンパク質及びタンパク質を、一度に精度よく測定する方法を提供することを課題とする。糖化タンパク質及びタンパク質を測定することにより、試料中の糖化タンパク質のタンパク質に対する割合を求めることができる。 It is an object of the present invention to provide a method for accurately measuring glycated protein and protein contained in a biological sample or the like in one reaction container at a time. By measuring glycated protein and protein, the ratio of glycated protein to protein in the sample can be determined.
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、試料中のタンパク質にプロテアーゼを作用させることによって生成する糖化アミノ酸を糖化アミノ酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ存在下で比色測定を行う第一工程で糖化タンパク質を測定した後、残存しているタンパク質に着目し、その残存しているタンパク質を第二工程で測定する方法を考案した。第一工程の測定後、生成した発色体を退色させる反応を開始及び持続させると同時に、残存しているタンパク質を、色素結合法により比色測定を行う第二工程で測定することにより、一つの反応容器で試料中の糖化タンパク質及びタンパク質を一度に測定する方法を完成させた。すなわち本発明は、次のようである。 As a result of earnest research, the present inventor measured glycated protein in the first step of performing colorimetric measurement of glycated amino acid produced by acting protease on protein in the sample in the presence of glycated amino acid oxidase and peroxidase. Then, paying attention to the remaining protein, a method for measuring the remaining protein in the second step was devised. After the measurement in the first step, the reaction for fading the generated chromophore is started and sustained, and at the same time, the remaining protein is measured in the second step in which the colorimetric measurement is performed by the dye-binding method. A method for measuring glycated protein and protein in a sample at once in a reaction vessel was completed. That is, the present invention is as follows.
（１）一つの反応容器で試料中の糖化タンパク質及びタンパク質を一度に測定する方法であって、 反応容器内で試料中のタンパク質にプロテアーゼを作用させ、生成した糖化アミノ酸に糖化アミノ酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ、及び発色剤を作用させて過酸化水素の生成に基づく発色反応を行い、生成した発色体の測定をレート法で行うことにより、糖化アミノ酸を測定する第一工程、及び、 第一工程の測定後、前記発色体を退色させる還元反応を前記反応容器内で開始及び持続させるとともに、前記還元反応の開始と同時に又は前記還元反応の開始後に、残存している試料中のタンパク質にタンパク結合色素を結合させ、生成した発色体の測定をレート法で行うことにより、タンパク質の測定を行う第二工程 からなる測定方法。
（２）前記試料中のタンパク質がアルブミンであり、前記プロテアーゼが、サーモリシン、ズブチリシン、及びプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（商品名）から選択される、（１）に記載の測定方法。
（３）前記タンパク結合色素がブロモクレゾールパープルである、（１）又は（２）に記載の測定方法。
(1) A method for measuring glycated protein and protein in a sample at a time in one reaction container, wherein a protease is allowed to act on the protein in the sample in the reaction container, and the glycated amino acid oxidase and peroxidase are generated on the generated glycated amino acid. The first step of measuring a glycated amino acid by performing a color reaction based on the production of hydrogen peroxide by the action of a color former and measuring the generated color product by the rate method, and the measurement of the first step Thereafter, a reduction reaction for fading the color former is started and sustained in the reaction vessel, and a protein-binding dye is added to the protein in the remaining sample simultaneously with the start of the reduction reaction or after the start of the reduction reaction. A measuring method comprising a second step of measuring a protein by measuring the produced chromophore after binding by the rate method.
(2) The measurement method according to (1), wherein the protein in the sample is albumin, and the protease is selected from thermolysin, subtilisin, and protease P “Amano” 3SD (trade name).
(3) The measurement method according to (1) or (2), wherein the protein-binding dye is bromocresol purple.
（４）前記還元反応が、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体とジアホラーゼとによる反応であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法。
（５）前記ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体が、基質と、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はそれらの誘導体とにデヒドロゲナーゼを作用させて生成されることを特徴とする、（４）に記載の測定方法。
（６）前記還元反応が、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体と電子伝達体とによる反応であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法。
(4) The measurement method according to any one of (1) to (3), wherein the reduction reaction is a reaction between NADH, NADPH, or a derivative thereof and diaphorase.
(5) The measurement method according to (4), wherein the NADH, NADPH, or a derivative thereof is produced by allowing a dehydrogenase to act on a substrate and NAD, NADP, or a derivative thereof.
(6) The measurement method according to any one of (1) to (3), wherein the reduction reaction is a reaction between NADH, NADPH, or a derivative thereof and an electron carrier.
（７）前記電子伝達体が１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェートである、（６）に記載の測定方法。
（８）前記ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体が、基質と、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はそれらの誘導体とにデヒドロゲナーゼを作用させて生成されることを特徴とする、（６）に記載の測定方法。
（９）前記還元反応が、ＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ酵素、その基質、及び電子伝達体による反応であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法。
(7) The measuring method according to (6), wherein the electron carrier is 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.
(8) The measurement method according to (6), wherein the NADH, NADPH, or a derivative thereof is produced by allowing a dehydrogenase to act on a substrate and NAD, NADP, or a derivative thereof.
(9) The measurement method according to any one of (1) to (3), wherein the reduction reaction is a reaction with an NAD (P) -independent dehydrogenase enzyme, its substrate, and an electron carrier. .
（１０）前記還元反応が、アスコルビン酸又はエリソルビン酸による反応であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法。
（１１）前記アスコルビン酸又はエリソルビン酸が、アスコルビン酸誘導体又はエリソルビン酸誘導体に酵素を作用させて生成されることを特徴とする、（１０）に記載の測定方法。
（１２）前記第一工程の測定及び前記第二工程の測定を同一波長で行うことを特徴とする、（１）〜（１１）のいずれかに記載の測定方法。
(10) The measuring method according to any one of (1) to (3), wherein the reduction reaction is a reaction with ascorbic acid or erythorbic acid.
(11) The measurement method according to (10), wherein the ascorbic acid or erythorbic acid is generated by causing an enzyme to act on the ascorbic acid derivative or erythorbic acid derivative.
(12) The measurement method according to any one of (1) to (11), wherein the measurement in the first step and the measurement in the second step are performed at the same wavelength.
本発明の測定方法は、一つの反応容器で生体試料などに含まれる糖化タンパク質及びタンパク質を、測定対象が限定されることなく、一度に精度よく測定することができる。特に、簡易分析装置や小型分析装置などにおいて利用価値が高い。 The measurement method of the present invention can accurately measure glycated protein and protein contained in a biological sample or the like in one reaction vessel at a time without limiting the measurement target. In particular, the utility value is high in a simple analyzer and a small analyzer.
以下、本発明を詳細に説明する。本発明において、測定対象物は、糖化タンパク質及びタンパク質である。本明細書においては、タンパク質という用語は、糖化タンパク質及び非糖化タンパク質の両者を含むものとして使用されている。また、本発明においては、特定の種類のタンパク質についての測定を行うことができるだけでなく、種々のタンパク質の総量としての測定を行うこともできる。このようなタンパク質を含む生体試料としては、ヒト又は動物の体液、例えば血漿、血清、尿、唾液、滲出液等が挙げられる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the present invention, the measurement objects are glycated protein and protein. In this specification, the term protein is used to include both glycated and non-glycated proteins. In the present invention, not only can a specific type of protein be measured, but also the total amount of various proteins can be measured. Examples of biological samples containing such proteins include human or animal body fluids such as plasma, serum, urine, saliva, and exudates.
本発明は、一つの反応容器に、試料、第一工程の測定試薬、第二工程の測定試薬を順次添加し、反応させて糖化タンパク質及びタンパク質を一連の操作で一度に測定する方法である。具体的には、第一工程として、まず反応容器内で試料中のタンパク質にプロテアーゼを作用させ、生成した糖化アミノ酸に糖化アミノ酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ、及び発色剤を作用させて過酸化水素の生成に基づく発色反応を行い、生成した発色体をレート法で測定することにより糖化アミノ酸を測定する。次に、第二工程として、第一工程の測定後、前記発色体を退色させる還元反応を前記反応容器内で開始及び持続させるとともに、前記還元反応の開始と同時に又は前記還元反応の開始後に、残存している試料中のタンパク質にタンパク結合色素を結合させ、生成した発色体の測定をレート法で行うことによりタンパク質を測定する。第一工程では、糖化タンパク質の濃度に依存して生成した発色体を測定することにより、糖化タンパク質を定量することができる。タンパク質は、第一工程でプロテアーゼによって分解されるが、第一工程終了時点ではプロテアーゼにより分解されていないタンパク質が残存しており、試料中のタンパク質の量は残存しているタンパク質の量と比例関係にある。第二工程では、この残存するタンパク質を色素結合法によって着色して測定するが、この着色したタンパク質に対して第一工程で使用したプロテアーゼが作用し退色させるため、その退色の割合から試料中のタンパク質を定量することができる。第二工程では、プロテアーゼを追加することにより退色反応を加速させることもできる。 The present invention is a method in which a sample, a measurement reagent in the first step, and a measurement reagent in the second step are sequentially added to one reaction vessel and reacted to measure glycated protein and protein at once by a series of operations. Specifically, as the first step, first, protease is allowed to act on the protein in the sample in the reaction vessel, and glycated amino acid oxidase, peroxidase, and color former are allowed to act on the produced glycated amino acid to produce hydrogen peroxide. The glycated amino acid is measured by performing a color development reaction based on this and measuring the produced color product by the rate method. Next, as the second step, after the measurement in the first step, the reduction reaction for fading the color former is started and sustained in the reaction vessel, and simultaneously with the start of the reduction reaction or after the start of the reduction reaction, The protein is measured by binding a protein-binding dye to the protein in the remaining sample and measuring the generated chromogen by the rate method. In the first step, the glycated protein can be quantified by measuring the chromophore produced depending on the concentration of the glycated protein. Protein is degraded by protease in the first step, but protein that is not degraded by protease remains at the end of the first step, and the amount of protein in the sample is proportional to the amount of remaining protein. It is in. In the second step, the remaining protein is colored and measured by the dye-binding method. However, since the protease used in the first step acts on the colored protein and fades, Protein can be quantified. In the second step, the fading reaction can be accelerated by adding protease.
すなわち本発明によれば、第一工程でパーオキシダーゼ存在下生成した発色体は、第二工程開始と共に還元反応により退色化され、さらにその還元反応を持続させることにより、第一工程の反応継続の有無に関係なく第二工程測定時のベースラインを安定化することができ、正確な測定が可能となる。例えば、第一工程の反応をレート法で測定し、その反応の途中から第二工程を開始する場合、従来の技術では、第二工程中も酵素反応が継続することにより発色体が生成しベースラインの変動をもたらすが、本発明の測定方法では、発色体を退色させる還元反応を第二工程中持続させることにより、ベースラインを継続して安定化することができるので、正確な測定が可能となり、その結果として、一つの反応容器で糖化タンパク質とタンパク質を一度に正確に測定することができるようになる。 That is, according to the present invention, the chromophore produced in the presence of peroxidase in the first step is faded by the reduction reaction at the start of the second step, and further, the reduction reaction is continued, thereby continuing the reaction in the first step. Regardless of the presence or absence, the baseline at the time of the second process measurement can be stabilized, and an accurate measurement becomes possible. For example, when the reaction in the first step is measured by the rate method and the second step is started in the middle of the reaction, the conventional technology produces a chromophore by the enzymatic reaction continuing during the second step. The measurement method according to the present invention can stabilize the baseline by continuing the reduction reaction that fades the chromophore during the second step, so that accurate measurement is possible. As a result, the glycated protein and protein can be accurately measured at once in one reaction vessel.
また、本発明によれば、第一工程で生成した発色体の影響を受けずに、第二工程の発色体の測定が可能なため、第一工程及び第二工程を同一波長で測定することができる。このことは、小型装置のように測定波長を複数選択できない場合でも、一つの反応容器で２種類の物質を一度に測定することができる利点を有している。 Further, according to the present invention, since the color development body in the second step can be measured without being influenced by the color development body produced in the first step, the first step and the second step can be measured at the same wavelength. Can do. This has the advantage that two kinds of substances can be measured at one time in one reaction vessel even when a plurality of measurement wavelengths cannot be selected as in a small apparatus.
以下、さらに本発明を具体的に説明する。
本発明で述べる一つの反応容器とは、試料、第一工程の測定試薬、及び第二工程の測定試薬を順次添加して混合させるための容器で、光学的に検出可能な部位を１箇所以上有する容器のことである。例えば、臨床検査で使用されている大型自動分析装置や小型分析装置においては、一つの反応セルが挙げられる。また、デバイス自体に試料、試薬の計量、移動、混合、光学的検出などの機能を持たせたマイクロチップやバイオチップのようなデバイスも挙げられる。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically.
One reaction container described in the present invention is a container for sequentially adding and mixing a sample, a measurement reagent in the first step, and a measurement reagent in the second step, and has one or more sites that can be detected optically. It is a container you have. For example, in a large automatic analyzer or a small analyzer used in a clinical test, one reaction cell can be mentioned. Moreover, devices such as microchips and biochips in which the devices themselves have functions such as sample, reagent weighing, movement, mixing, and optical detection are also included.
本発明の第一工程により測定される糖化タンパク質は、プロテアーゼを作用させることにより生成する糖化アミノ酸に、糖化アミノ酸オキシダーゼ及びパーオキシダーゼを作用させることにより過酸化水素を生成させることができ、パーオキシダーゼ−発色法により測定できる糖化タンパク質であれば特に限定されない。 The glycated protein measured by the first step of the present invention can generate hydrogen peroxide by allowing glycated amino acid oxidase and peroxidase to act on the glycated amino acid produced by the action of protease. There is no particular limitation as long as it is a glycated protein that can be measured by a color development method.
本発明の第一工程の測定試薬は、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ、及び発色剤を含み、場合によっては、更に、発色体を退色させるための構成試薬の一部を含む。プロテアーゼは、測定対象であるタンパク質に依存して選択されるが、特定のタンパク質及びその糖化タンパク質を測定する場合は、測定対象であるタンパク質に特異的なプロテアーゼを使用する。タンパク質がアルブミンの場合に、作用させるプロテアーゼとして、例えば、バチルス属、ストレプトマイセス属、又はアスペルギルス属等の微生物由来プロテアーゼが挙げられる。その中でも、バチルス属の微生物由来プロテアーゼであるサーモリシン若しくはズブチリシン、又はアスペルギルス属の微生物由来プロテアーゼであるプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（天野エンザイム社製）が好ましい。尚、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤは商品名であるが、適当な一般名が存在しないため、本明細書及び請求項において、そのまま商品名を使用する。特定のタンパク質ではなく、タンパク質総量及び糖化タンパク質の総量を測定したい場合は、特異性の低いプロテアーゼであるトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、又はパパイン等を使用する。糖化アミノ酸オキシダーゼは、例えば、アスペルギルス属由来のものを、パーオキシダーゼは、例えば、ホースラディッシュ由来のものを用いることができ、発色剤としては、公知の発色剤、例えばフェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体と４−アミノアンチピリンとの組み合わせ、ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、及びトリアリルイミダゾール誘導体等が挙げられる。 The measurement reagent of the first step of the present invention contains a protease, a glycated amino acid oxidase, a peroxidase, and a color former, and in some cases further contains a part of a constituent reagent for fading the color former. The protease is selected depending on the protein to be measured. When measuring a specific protein and its glycated protein, a protease specific to the protein to be measured is used. Examples of proteases that act when the protein is albumin include microorganism-derived proteases such as Bacillus, Streptomyces, or Aspergillus. Among them, thermolysin or subtilisin which is a protease derived from Bacillus genus, or protease P “Amano” 3SD (manufactured by Amano Enzyme) which is a protease derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus is preferable. Protease P “Amano” 3SD is a trade name, but since there is no appropriate general name, the trade name is used as it is in the present specification and claims. When it is desired to measure not the specific protein but the total amount of protein and the total amount of glycated protein, trypsin, chymotrypsin, pepsin, elastase, papain or the like, which is a low-specificity protease, is used. As the glycated amino acid oxidase, for example, those derived from the genus Aspergillus can be used, and as the peroxidase, for example, those derived from horseradish can be used. As the color former, a known color former, for example, phenol or its derivative or aniline derivative can be used. Examples include combinations with 4-aminoantipyrine, leuco dyes, diphenylamine derivatives, triallylimidazole derivatives, and the like.
前記フェノールの誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、及び２，４，６−トリクロロフェノール等を挙げることができる。
また、前記アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）等を挙げることができる。
Examples of the phenol derivative include 4-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, and 2,4,6-trichlorophenol.
Examples of the aniline derivative include N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (HDAPS), N- Ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (ADOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (ADPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline (ALOS), N-ethyl-N- (3 -Sulfopropyl) aniline (ALPS), N- (3-sulfopropyl) aniline (HALPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy) -3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAPS), and N-ethyl-N- (2- And hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (TOOS).
前記ロイコ色素としては、例えば、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェノール）−２−スルホニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメタン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、及び１０−［３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノカルボニル］−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられる。 Examples of the leuco dye include bis (p-diethylaminophenol) -2-sulfonylmethane, bis (p-diethylaminophenyl) -3,4-disulfopropoxyphenylmethane, 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3, Examples include 7-bis (dimethylamino) phenothiazine and 10- [3- (methoxycarbonylaminomethyl) phenylmethylaminocarbonyl] -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine.
前記ジフェニルアミン誘導体としては、例えば、ビス［４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２−メチルフェニル］アミン及びＮ，Ｎ−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニル尿酸等が挙げられる。
また、前記トリアリルイミダゾール誘導体としては、例えば、２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール及び２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール等が挙げられる。
Examples of the diphenylamine derivative include bis [4-di (2-butoxyethyl) amino-2-methylphenyl] amine and N, N-bis (4-diethylamino-2-methylphenyl) -N′-p-toluene. And sulfonyluric acid.
Examples of the triallylimidazole derivative include 2- (4-carboxyphenyl) -3-N-methylcarbamoyl-4,5-bis (4-diethylaminophenyl) imidazole and 2- (3-methoxy-4-). And diethylaminophenyl) -3-N-methylcarbamoyl-4,5-bis (2-methyl-4-diethylaminophenyl) imidazole.
上記第一工程の測定試薬は、緩衝液成分を含む構成とすることが好ましい。緩衝液の種類、濃度、ｐＨは、酵素、発色剤、発色体を退色させるための構成試薬の一部等の各成分の安定性、酵素の特性等を考慮して選択される。緩衝液の種類としては、リン酸塩、トリス、グリシン、グッド緩衝液等が用いられ、緩衝液の濃度は１〜５００ｍＭ程度、ｐＨは通常５〜９が好ましい。 The measurement reagent in the first step preferably includes a buffer component. The type, concentration, and pH of the buffer solution are selected in consideration of the stability of each component such as the enzyme, the color former, and a part of the constituent reagent for fading the color former, the characteristics of the enzyme, and the like. As the type of the buffer solution, phosphate, Tris, glycine, Good buffer solution and the like are used. The concentration of the buffer solution is preferably about 1 to 500 mM, and the pH is usually preferably 5 to 9.
第一工程の測定試薬は、すべての成分を一つの試薬として調製して添加しても、または二つ以上の試薬として分割して調製して添加してもどちらでも構わない。また、これらの試薬には必要に応じて防腐剤、界面活性剤、アスコルビン酸オキシダーゼ等を加えてもよい。 The measurement reagent in the first step may be prepared by adding all components as one reagent, or may be prepared by adding two or more reagents separately. Moreover, you may add antiseptic | preservative, surfactant, ascorbic acid oxidase etc. to these reagents as needed.
第一工程の反応の吸光度測定は、プロテアーゼによるタンパク質の分解反応が持続している状態で行うため、任意の二点間の吸光度差又は吸光度変化率を求めることによるレート法によって測定する。糖化タンパク質の量は、前記吸光度測定により求められる糖化アミノ酸の量と平均糖結合数を用いて計算することにより求めることができる。平均糖結合数とはタンパク質の種類毎によって実験で確かめられている糖化タンパク質1分子中に含まれる糖結合数の平均値である。実用的にはキャリブレータ（標準品）の値を対照として、糖化タンパク質の濃度を測定する。 Since the absorbance measurement of the reaction in the first step is performed in a state where the degradation reaction of the protein by the protease is continued, the absorbance is measured by a rate method by obtaining an absorbance difference between two arbitrary points or an absorbance change rate. The amount of glycated protein can be determined by calculating using the amount of glycated amino acid determined by the absorbance measurement and the average number of sugar bonds. The average number of sugar bonds is the average value of the number of sugar bonds contained in one molecule of glycated protein, which has been confirmed by experiments for each type of protein. Practically, the concentration of glycated protein is measured using the value of a calibrator (standard product) as a control.
本発明で用いる第一工程で生成した発色体を退色させる方法は、発色体を還元することにより行われる。この還元反応は、第一工程の終了直後から、又は第二工程の反応開始と同時に効力を発揮することが好ましい。具体的には、還元作用を有する試薬を第二工程の測定試薬に添加するか、又は、還元作用を有する試薬が複数の成分から構成される場合は、あらかじめ第一工程の測定試薬と第二工程の測定試薬に分割して添加しておき、第一工程と第二工程の測定試薬が混合されることにより還元反応が始まるように設定することができる。 The method for fading the color former produced in the first step used in the present invention is carried out by reducing the color former. This reduction reaction is preferably effective immediately after the end of the first step or simultaneously with the start of the reaction in the second step. Specifically, a reagent having a reducing action is added to the measuring reagent in the second step, or when the reagent having a reducing action is composed of a plurality of components, the measuring reagent in the first step and the second reagent are previously prepared. It can be set so that the reduction reaction starts when the measurement reagent in the step is added in portions and the measurement reagent in the first step and the second step are mixed.
さらにこの還元反応には、第二工程の反応開始と同時に発色体を瞬時に退色させ、第二工程の測定が終了するまで持続することが求められる。具体的には数分間以上、好ましくは５分以上である。また、この還元反応又はそれに必要な試薬は、本発明による第一工程の測定試薬及び／又は第二工程の測定試薬中に長期間安定に存在できること、第二工程の色素結合反応に影響を与えないこと、他の成分、酵素等の安定性、活性に影響を与えないことなどがその性能として必要とされる。 Further, this reduction reaction is required to cause the color former to fade instantaneously simultaneously with the start of the reaction in the second step and to continue until the measurement in the second step is completed. Specifically, it is several minutes or more, preferably 5 minutes or more. In addition, the reduction reaction or a reagent necessary for the reduction reaction can be stably present for a long time in the measurement reagent of the first step and / or the measurement reagent of the second step according to the present invention, and it affects the dye-binding reaction of the second step. It is necessary as performance to have no effect, stability of other components, enzymes, etc., and no influence on activity.
発色体を退色させるための具体的方法としては、（１）ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体とジアホラーゼとを同時に作用させる方法、（２）ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体と電子伝達体とを同時に作用させる方法、（３）ＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ酵素、その基質、及び電子伝達体を同時に作用させる方法、（４）アスコルビン酸又はエリソルビン酸を作用させる方法等を利用することができる。その他に、システイン、システアミン塩酸塩、ジチオトレイトール等の還元性チオアルコール類等を使用することもできるが、これらは溶解後の安定性が良くないことが知られており、本発明の還元反応には適さない。また、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体は、単独でも還元作用を示し発色体の生成を抑制することが知られているが、第一工程で生成した発色体を速やかに退色することができないので、単独での使用は本発明の還元反応には適さない。 Specific methods for fading the color former include (1) a method in which NADH, NADPH, or a derivative thereof and diaphorase are allowed to act simultaneously, and (2) NADH, NADPH, or a derivative thereof, and an electron carrier. A method of simultaneously acting, (3) a method of simultaneously acting on a NAD (P) -independent dehydrogenase enzyme, its substrate, and an electron carrier, (4) a method of acting ascorbic acid or erythorbic acid, etc. can be used. . In addition, reducing thioalcohols such as cysteine, cysteamine hydrochloride and dithiothreitol can also be used, but these are known to have poor stability after dissolution, and the reduction reaction of the present invention. Not suitable for. In addition, NADH, NADPH, or their derivatives are known to exhibit a reducing action alone and suppress the formation of a color former, but cannot rapidly discolor the color former produced in the first step. , Use alone is not suitable for the reduction reaction of the present invention.
還元反応に用いる試薬については、反応液中に含まれる糖化タンパク質の測定上限の１〜１０００倍、好ましくは５〜１００倍程度の量から生成する発色体を退色できるように、用いる還元方法に応じて、基質、酵素、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体、電子伝達体等の使用量を設定すれば良い。また、第二工程の吸光度測定を開始する前に第一工程で生成した発色体をすべて還元反応により退色させ、さらに第二工程中も持続的に生成する、第一工程の反応により生成する発色体を退色させ続けるために、第二工程の開始から測定が終了するまで還元反応を持続させる必要がある。還元反応を持続させる方法としては、（a）第二工程の試薬に過剰量の還元作用を有する物質を添加して、第二工程の測定が終了するまで反応液中に存在させる方法、（b）第二工程の開始直後に必要な量の還元作用を有する物質を一度に過剰量生成させて、第二工程の測定が終了するまで反応液中に存在させる方法、（c）持続的に酵素反応を行わせることにより、第二工程の測定が終了するまで還元作用を持続させる方法、等がある。これらの方法は必要に応じて組み合わせて使用しても構わない。 About the reagent used for the reduction reaction, it depends on the reduction method used so that the chromophore produced from an amount of about 1 to 1000 times, preferably about 5 to 100 times the upper limit of measurement of the glycated protein contained in the reaction solution can be faded. The amount of substrate, enzyme, NADH, NADPH, or a derivative thereof, an electron carrier, etc. may be set. In addition, color development generated by the reaction of the first step that fades all the chromophore generated in the first step by the reduction reaction before starting the absorbance measurement in the second step, and also generates continuously during the second step. In order to keep the body fading, it is necessary to continue the reduction reaction from the start of the second step until the measurement is completed. As a method for sustaining the reduction reaction, (a) a method in which an excessive amount of a substance having a reducing action is added to the reagent in the second step, and the reaction is allowed to exist in the reaction solution until the measurement in the second step is completed, (b ) A method in which an excessive amount of a substance having a reducing action required immediately after the start of the second step is generated at a time and present in the reaction solution until the measurement in the second step is completed, (c) a continuous enzyme There is a method in which the reduction action is continued until the measurement in the second step is completed by performing the reaction. These methods may be used in combination as necessary.
以下に、前記発色体を退色させるための具体的方法について、個々に説明する。
前述の、（１）ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体とジアホラーゼとを同時に作用させる方法においては、第一工程の測定試薬にジアホラーゼを含み、第二工程の測定試薬にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体を含むように振り分けるのが好ましい。還元作用の持続は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体の十分量存在下、ジアホラーゼ量を増減させて酵素反応速度を調節することにより行うことが出来る。
Hereinafter, specific methods for fading the color former will be described individually.
In the above-mentioned (1) method in which NADH, NADPH or a derivative thereof and diaphorase are allowed to act simultaneously, diaphorase is included in the measurement reagent in the first step, and NADH, NADPH, or their It is preferable to sort such that a derivative is included. The reduction action can be continued by adjusting the enzyme reaction rate by increasing or decreasing the amount of diaphorase in the presence of a sufficient amount of NADH, NADPH, or a derivative thereof.
ここで、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体については、基質と、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はそれらの誘導体とに酵素を作用させることによって生成させることもできる。この場合は、使用する酵素に対する基質と、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はそれらの誘導体の十分量存在下、その酵素量を調節することによって還元作用を持続させることができる。具体的な基質と酵素の組み合わせとしては、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸とグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、３ーヒドロキシ酪酸と３ーヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールとグリセロールデヒドロゲナーゼなどが挙げられるが、糖化タンパク質の測定に影響を及ぼさない組み合わせが好ましいのは言うまでもない。これらは、第二工程開始と同時に、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体が生成するように構成するのが好ましい。そのためには、例えば、第一工程の測定試薬に、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はそれらの誘導体、及び基質を含め、第二工程の測定試薬に、酵素及びジアホラーゼを含む構成とすることができる。具体的には、基質と酵素の組み合わせがグルコース−６−リン酸とグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの場合は、第一工程の測定試薬にＮＡＤとグルコース−６−リン酸とを含め、第二工程の測定試薬にグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとジアホラーゼとを含める構成とすることができる。 Here, NADH, NADPH, or a derivative thereof can also be generated by allowing an enzyme to act on a substrate and NAD, NADP, or a derivative thereof. In this case, the reducing action can be continued by adjusting the amount of the enzyme in the presence of a sufficient amount of a substrate for the enzyme to be used and NAD, NADP, or a derivative thereof. Specific substrate and enzyme combinations include glucose and glucose dehydrogenase, glucose-6-phosphate and glucose-6-phosphate dehydrogenase, 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, glycerol and glycerol dehydrogenase, etc. Needless to say, a combination that does not affect the measurement of glycated protein is preferable. These are preferably configured so that NADH, NADPH, or derivatives thereof are formed simultaneously with the start of the second step. For this purpose, for example, the measurement reagent in the first step may include NAD, NADP, or a derivative thereof, and a substrate, and the measurement reagent in the second step may include an enzyme and diaphorase. Specifically, when the combination of the substrate and the enzyme is glucose-6-phosphate and glucose-6-phosphate dehydrogenase, NAD and glucose-6-phosphate are included in the measurement reagent in the first step, and the second It can be set as the structure which contains glucose-6-phosphate dehydrogenase and diaphorase in the measuring reagent of a process.
前述の、（２）ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体と電子伝達体とを同時に作用させる方法においては、電子伝達体には、フェナジンメトスルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート、又は９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライド等が用いられ、中でも、安定性にすぐれた１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（以下、ｍＰＭＳと称す）が好適に用いられる。この場合は、第一工程の測定試薬にｍＰＭＳを含み、第二工程の測定試薬にＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体を含むように振り分けるのが好ましい。この方法においては、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体と電子伝達体との反応により、電子伝達体は速やかに還元型の電子伝達体に変換される。従って、その還元作用を持続させるためには、前述のように、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はそれらの誘導体を、基質と、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はそれらの誘導体とに酵素を作用させることによって生成させる方法で生成し、基質と、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はそれらの誘導体の十分量存在下、酵素量を調節する方法を採用することが好ましい。測定試薬の構成としては、第一工程の測定試薬に、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はそれらの誘導体、及び、基質を含め、第二工程の測定試薬に、酵素及びｍＰＭＳ等の電子伝達体を含める構成が例示される。 In the above-described method (2) where NADH, NADPH or a derivative thereof and an electron carrier are allowed to act simultaneously, the electron carrier includes phenazine methosulfate, 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate. 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (hereinafter referred to as mPMS), which is excellent in stability, is preferable, such as fete or 9-dimethylaminobenzo-α-phenazoxonium chloride. Used for. In this case, it is preferable to distribute mPMS in the measurement reagent in the first step and NADH, NADPH, or a derivative thereof in the measurement reagent in the second step. In this method, the electron carrier is quickly converted into a reduced electron carrier by the reaction of NADH, NADPH, or a derivative thereof and the electron carrier. Therefore, in order to maintain the reduction action, as described above, NADH, NADPH, or a derivative thereof is generated by causing an enzyme to act on a substrate and NAD, NADP, or a derivative thereof. It is preferable to adopt a method of producing and adjusting the amount of enzyme in the presence of a substrate and a sufficient amount of NAD, NADP, or a derivative thereof. As a configuration of the measurement reagent, there is a configuration in which NAD, NADP or a derivative thereof and a substrate are included in the measurement reagent in the first step, and an electron carrier such as an enzyme and mPMS is included in the measurement reagent in the second step. Illustrated.
前述の、（３）ＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ酵素、その基質、及び電子伝達体を同時に作用させる方法においては、ＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ酵素としてＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、及びＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。ＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ酵素とは、その酵素反応にＮＡＤ又はＮＡＤＰ類の補酵素を電子伝達体として使用せず、フラビンやキノン等の酸化還元部位を分子内に有しており、フェナジンメトスルフェート、ｍＰＭＳ、９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロライド、ピロロキノリンキノン、ユビキノン類、又は２, ６−ジクロロフェノールインドフェノール等を電子伝達体として使用する酵素である。測定試薬の構成としては、第一工程の測定試薬に基質及びｍＰＭＳを含み、第二工程の測定試薬にＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ酵素を含む構成が例示され、還元作用の持続は、ＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ酵素の量を増減させて酵素反応速度を調節することにより行うことが出来る。さらに、ＮＡＤ（Ｐ）非依存性デヒドロゲナーゼ酵素の種類によっては、第一工程で生成した発色体をそのまま電子伝達体として使用することもでき、その例としてピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが挙げられる。より速く持続的に退色させたい場合は、適切な酵素量下でｍＰＭＳ又はピロロキノリンキノン等の電子伝達体をどちらかの測定試薬に添加して使用するか、或いは使用する酵素量を増やすとさらに効果的である。 In the above-described (3) NAD (P) -independent dehydrogenase enzyme, its substrate, and electron carrier, the FAD-dependent glucose dehydrogenase, pyrroloquinoline quinone are used as NAD (P) -independent dehydrogenase enzymes. Dependent glucose dehydrogenase, fructose dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, methanol dehydrogenase, and PQQ-dependent glycerol dehydrogenase. NAD (P) -independent dehydrogenase enzyme does not use a coenzyme of NAD or NADP as an electron carrier for the enzyme reaction, and has a redox site such as flavin or quinone in the molecule, and phenazine It is an enzyme that uses methosulfate, mPMS, 9-dimethylaminobenzo-α-phenazoxonium chloride, pyrroloquinoline quinone, ubiquinones, or 2,6-dichlorophenolindophenol as an electron carrier. As the configuration of the measurement reagent, a configuration in which the measurement reagent in the first step contains a substrate and mPMS, and the measurement reagent in the second step contains a NAD (P) -independent dehydrogenase enzyme is exemplified. (P) It can be carried out by adjusting the enzyme reaction rate by increasing or decreasing the amount of the independent dehydrogenase enzyme. Furthermore, depending on the type of NAD (P) -independent dehydrogenase enzyme, the chromogen produced in the first step can be used as an electron carrier as it is, and examples thereof include pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase. If you want to discolor faster and more continuously, add an electron carrier such as mPMS or pyrroloquinoline quinone to either measurement reagent under an appropriate amount of enzyme, or increase the amount of enzyme used. It is effective.
前述の、（４）アスコルビン酸又はエリソルビン酸を作用させる方法においては、アスコルビン酸又はエリソルビン酸は、その誘導体であるアスコルビン酸誘導体又はエリソルビン酸誘導体から酵素反応により生成させることができる。アスコルビン酸又はエリソルビン酸は一般に溶液中での安定性が良くないことが知られており、反応液中でアスコルビン酸又はエリソルビン酸をその誘導体から酵素反応により生成させる方法が好適である。アスコルビン酸誘導体又はエリソルビン酸誘導体としては、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩、アスコルビン酸２−グルコシドなどが挙げられる。酵素として、前者の場合はアルカリフォスファターゼ、後者の場合はαグルコシダーゼを作用させることにより、アスコルビン酸又はエリソルビン酸を生成させることができる。測定試薬の構成としては、第一工程の測定試薬にＬ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩を含め、第二工程の測定試薬にアルカリフォスファターゼを含める構成が例示される。還元作用の持続は、アスコルビン酸誘導体又はエリソルビン酸誘導体の十分量存在下、これら誘導体を基質とする酵素の使用量を調節することにより行うことができる。 In the above-described method (4) in which ascorbic acid or erythorbic acid is allowed to act, ascorbic acid or erythorbic acid can be produced by enzymatic reaction from an ascorbic acid derivative or erythorbic acid derivative that is a derivative thereof. Ascorbic acid or erythorbic acid is generally known to have poor stability in solution, and a method of generating ascorbic acid or erythorbic acid from its derivative in the reaction solution by an enzymatic reaction is preferable. Examples of the ascorbic acid derivative or erythorbic acid derivative include L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium salt, ascorbic acid 2-glucoside and the like. As the enzyme, ascorbic acid or erythorbic acid can be produced by acting alkaline phosphatase in the former case and α-glucosidase in the latter case. Examples of the configuration of the measurement reagent include a configuration in which L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium salt is included in the measurement reagent in the first step and alkaline phosphatase is included in the measurement reagent in the second step. The reduction action can be continued by adjusting the amount of the enzyme using the derivative as a substrate in the presence of a sufficient amount of the ascorbic acid derivative or erythorbic acid derivative.
本発明の第二工程の測定試薬はタンパク結合色素を含む。タンパク結合色素としては、クマシーブリリアントブルー、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）等が挙げられる。タンパク質がアルブミンの場合には、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）が好ましい。 The measurement reagent in the second step of the present invention contains a protein-binding dye. Examples of protein-binding dyes include Coomassie brilliant blue and bromocresol purple (BCP). Bromocresol purple (BCP) is preferred when the protein is albumin.
本発明の第二工程で行われる色素結合法は、プロテアーゼによって分解されずに残存している正電荷タンパク質に解離して陰イオンとなるタンパク結合色素を結合させて、残存しているタンパク質の濃度に応じた量の発色体を形成させる方法を用いることができる。ここでもやはり、プロテアーゼによるタンパク質の分解反応が進行していることから、第二工程の反応の吸光度測定は、任意の二点間の吸光度差又は吸光度変化率を求めることによるレート法によって測定する。タンパク質の分解反応を早く進行させたい場合は、プロテアーゼを追加しても良い。 The dye-binding method performed in the second step of the present invention is the concentration of the remaining protein by binding the protein-binding dye that becomes an anion by dissociating into the positively charged protein that remains without being decomposed by the protease. A method of forming a colored body in an amount corresponding to the above can be used. Again, since the protein degradation reaction by the protease is proceeding, the absorbance measurement of the reaction in the second step is performed by the rate method by determining the absorbance difference or absorbance change rate between any two points. Protease may be added to accelerate the protein degradation reaction.
第二工程の測定試薬は緩衝液成分を含ませることが好ましい。緩衝液の種類、濃度、ｐＨは、酵素、タンパク質に結合する色素、発色体を退色させるための構成試薬の一部等の各成分の安定性、酵素の特性等を考慮して選択される。緩衝液の種類としては、リン酸塩、トリス、グリシン、又はグッド緩衝液等が用いられ、緩衝液の濃度は１〜５００ｍＭ程度、ｐＨは通常４．５〜７．５が好ましい。さらに、安定化剤、防腐剤、界面活性剤などを添加しても良い。 The measurement reagent in the second step preferably contains a buffer component. The kind, concentration, and pH of the buffer solution are selected in consideration of the stability of each component such as a part of a constituent reagent for fading the enzyme, the dye that binds to the protein, and the color former, the characteristics of the enzyme, and the like. As the type of buffer solution, phosphate, Tris, glycine, Good buffer solution, or the like is used. The concentration of the buffer solution is preferably about 1 to 500 mM, and the pH is usually preferably 4.5 to 7.5. Further, stabilizers, preservatives, surfactants and the like may be added.
タンパク質の糖化割合、即ち試料中の糖化タンパク質のタンパク質に対する割合は、本発明の第一工程の測定から求められる糖化タンパク質の量を第二工程の測定から求められるタンパク質の量で除することによって求めることができる。 The glycation ratio of the protein, that is, the ratio of the glycated protein in the sample to the protein is obtained by dividing the amount of glycated protein obtained from the measurement in the first step of the present invention by the amount of protein obtained from the measurement in the second step. be able to.
本発明の測定方法において、測定波長は使用する発色剤の吸収スペクトル、試料中に含まれる測定対象の濃度などにより適宜設定されるが、一般に５５０〜６３０ｎｍの範囲で、好ましくは６００ｎｍ付近である。第一工程の測定と第二工程の測定は異なる波長を設定しても、或いは同一波長を設定してもどちらでも構わない。特に、同一波長で２成分が一度に測定できることは、単一波長しか搭載していない分析装置であっても２成分が一度に測定可能になることであり、利便性の向上、装置コストの低下などの優れた点をもたらす効果がある。 In the measurement method of the present invention, the measurement wavelength is appropriately set depending on the absorption spectrum of the color former to be used, the concentration of the measurement target contained in the sample, etc., but is generally in the range of 550 to 630 nm, preferably around 600 nm. The measurement in the first step and the measurement in the second step may be performed by setting different wavelengths or setting the same wavelength. In particular, the fact that two components can be measured at the same wavelength at a time means that even an analyzer equipped with only a single wavelength can measure two components at a time, improving convenience and reducing device costs. There is an effect to bring such excellent points.
以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行うが、本発明の技術的範囲は、これにより限定されるものではない。
[試験例１]
還元反応による第二工程測定時のベースラインの安定化効果
<Ｒ−１>
糖化アミノ酸オキシダーゼ（５０ｕ／ｍｌ キッコーマン社製）、パーオキシダーゼ（３０ｕ／ｍｌ シグマ社製）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（０．５ｍｇ／ｍｌ 同人化学研究所製）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解してＲ−１とした。
<Ｒ−２>
４−アミノアンチピリン（１ｍｇ／ｍｌ 和光純薬社製）、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ(５０００ＰＵ／ｍｌ 天野エンザイム社製）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した液を調製し、さらに、この溶液に表１に示した成分を添加してＲ−２とした。
<Ｒ−３>
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、表２に示したＲ−２の添加物に応じた成分を添加してＲ−３とした。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited thereto.
[Test Example 1]
Baseline stabilization effect during the second process measurement by reduction reaction
<R-1>
Saccharified amino acid oxidase (50 u / ml manufactured by Kikkoman), peroxidase (30 u / ml manufactured by Sigma), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (0.5 mg) / Ml manufactured by Dojin Chemical Laboratory) was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) to give R-1.
<R-2>
A solution prepared by dissolving 4-aminoantipyrine (1 mg / ml Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and protease P “Amano” 3SD (5000 PU / ml Amano Enzyme) in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) was further prepared. The components shown in Table 1 were added to this solution to give R-2.
<R-3>
Components corresponding to the R-2 additive shown in Table 2 were added to 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) to obtain R-3.
<試料>
ヒトアルブミン（ＨＳＡ）基質溶液；８ｇ／ｄｌ（表示値）、糖化アルブミン率１５．８％〔シグマ社製；基質溶液中の糖化アルブミン率は、グリコアルブミン測定キット（ルシカ ＧＡ−Ｌ；旭化成ファーマ社製）を用いて測定した。〕
<操作>
上記Ｒ−１（糖化アルブミン定量試薬[1]）１００μl及び試料５μlをセルにとり、３７℃にインキュベートし反応を開始した。反応開始８５秒後に、上記Ｒ−２（糖化アルブミン定量試薬[2]）を１００μl添加、撹拌し、引き続き３７℃にて糖化アルブミン定量反応を継続した。反応開始２８０秒後に、上記Ｒ−３を８０μl添加、撹拌し、反応を９０３秒まで継続した。測定波長は、主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍに設定した。
<測定装置>
測定は、７１８０型自動分析装置（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いて実施した。
<Sample>
Human albumin (HSA) substrate solution: 8 g / dl (indicated value), glycated albumin ratio 15.8% [manufactured by Sigma; glycated albumin ratio in the substrate solution is a glycoalbumin measurement kit (Lucica GA-L; Asahi Kasei Pharma Corporation) ). ]
<Operation>
100 μl of the above R-1 (glycated albumin quantification reagent [1]) and 5 μl of sample were placed in a cell and incubated at 37 ° C. to initiate the reaction. 85 seconds after the start of the reaction, 100 μl of the above R-2 (glycated albumin quantification reagent [2]) was added and stirred, and the glycated albumin quantitative reaction was continued at 37 ° C. 280 seconds after the start of the reaction, 80 μl of the above R-3 was added and stirred, and the reaction was continued until 903 seconds. The measurement wavelength was set to a main wavelength of 600 nm and a sub wavelength of 800 nm.
<Measurement device>
The measurement was carried out using a 7180 type automatic analyzer (manufactured by HITACHI).
<結果>
図１に各処方で測定を行った結果得られた反応タイムコースを、表３に反応開始３４１秒後の吸光度及び反応開始３４１秒後と９０３秒後の吸光度差を示した。
本試験例では、試液Ｒ−１及びＲ−２による反応が第一工程に、試液Ｒ−３添加後の反応が第二工程の還元反応に相当し、第二工程における色素結合反応時のベースラインの変動を示している。この第一工程に相当する反応では、糖化アルブミン測定の発色反応により吸光度が上昇する。試液Ｒ−３添加後の反応では、比較例は試液Ｒ−３添加により希釈されて吸光度が一旦下がり、その後持続的に吸光度が上昇しているのに対し、処方Ａ〜Ｆは、第一工程で生成した発色体による吸光度が反応開始２８７秒後〜３４１秒後の間に消失し、さらに、反応開始３４１秒後〜９０３秒後の間で吸光度上昇が認められなかった。このことから、反応終了時まで還元反応が維持されていることが確認できた。尚、反応開始３４１秒後以降は、処方Ａ〜Ｆの吸光度がほぼゼロを示したため、図１の処方Ａ〜Ｆのプロットは重複して示されている。この結果から、本発明では、第一工程の反応開始以降に生成した発色体が、還元反応により持続的に退色されることにより、第二工程のベースラインが安定化されることが判明した。
<Result>
FIG. 1 shows the reaction time course obtained as a result of the measurement performed for each formulation. Table 3 shows the absorbance after 341 seconds after the start of the reaction and the difference in absorbance between 341 seconds and 903 seconds after the start of the reaction.
In this test example, the reaction by the test solutions R-1 and R-2 corresponds to the first step, the reaction after the addition of the test solution R-3 corresponds to the reduction reaction of the second step, and the base during the dye binding reaction in the second step The line fluctuation is shown. In the reaction corresponding to this first step, the absorbance increases due to the color development reaction of glycated albumin measurement. In the reaction after the addition of the test solution R-3, the comparative example was diluted by the addition of the test solution R-3 and the absorbance decreased temporarily, and then the absorbance increased continuously. The absorbance due to the chromophore produced in (3) disappeared between 287 seconds and 341 seconds after the start of the reaction, and no increase in absorbance was observed between 341 seconds and 903 seconds after the start of the reaction. From this, it was confirmed that the reduction reaction was maintained until the end of the reaction. After 341 seconds after the start of the reaction, the absorbances of the formulations A to F showed almost zero, so the plots of the formulations A to F in FIG. From this result, it was found that in the present invention, the base color of the second step is stabilized by the continuous color fading of the colored body produced after the start of the reaction of the first step.
[試験例２]
アルブミンの糖化割合の測定
<Ｒ−１>
糖化アミノ酸オキシダーゼ（５０ｕ／ｍｌ キッコーマン社製）、パーオキシダーゼ（３０ｕ／ｍｌ シグマ社製）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（０．５ｍｇ／ｍｌ 同人化学研究所製）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解してＲ−１とした。
<Ｒ−２>
４−アミノアンチピリン（１ｍｇ／ｍｌ 和光純薬社製）、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（５０００ＰＵ／ｍｌ 天野エンザイム社製）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解してＲ−２とした。
<Ｒ−３>
０．００２％ブロモクレゾールパープル(和光純薬社製）、１％ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５ 和光純薬社製）、アスコルビン酸（２ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解してＲ−３とした。
<試料>
試験例１記載のＨＳＡ基質溶液（ＨＳＡ濃度：８ｇ／ｄｌ、表示値）を水で希釈して調製した、ＨＳＡ濃度７、６、５、４、３ｇ／ｄｌ及び水（ブランク）を試料とした。
[Test Example 2]
Measurement of albumin saccharification rate
<R-1>
Saccharified amino acid oxidase (50 u / ml manufactured by Kikkoman), peroxidase (30 u / ml manufactured by Sigma), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (0.5 mg) / Ml manufactured by Dojin Chemical Laboratory) was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) to give R-1.
<R-2>
4-aminoantipyrine (1 mg / ml Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and protease P “Amano” 3SD (5000 PU / ml Amano Enzyme) were dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) to give R-2. .
<R-3>
0.002% bromocresol purple (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1% polyoxyethylene (23) lauryl ether (Brij35 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), ascorbic acid (2 mg / ml) in 50 mM phosphate buffer (pH 7. 0-3) was dissolved in R-3.
<Sample>
The HSA substrate solution described in Test Example 1 (HSA concentration: 8 g / dl, indicated value) was prepared by diluting with water, and HSA concentrations of 7, 6, 5, 4, 3 g / dl and water (blank) were used as samples. .
<操作>
上記Ｒ−１（糖化アルブミン定量試薬[1]）１００μl及び試料５μlをセルにとり、３７℃にインキュベートし反応を開始した。反応開始８５秒後に上記Ｒ−２（糖化アルブミン定量試薬[2]）を１００μl添加、撹拌し、反応開始１１１秒後に吸光度（Ａ１）を測定し、引き続き３７℃にて糖化アルブミン定量反応を継続した。反応開始２３６秒後に吸光度（Ａ２）を測定し、反応開始２８０秒後に上記Ｒ−３（アルブミン定量試薬）を８０μl添加、撹拌し、アルブミン定量反応を継続した。反応開始４６３秒後と５８７秒後に吸光度（Ａ３及びＡ４）を測定した。同様にブランク試料の吸光度測定を行い、Ａ１ブランク、Ａ２ブランク、Ａ３ブランク及びＡ４ブランクを測定した。測定波長は、主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍに設定した。糖化アルブミン定量の吸光度変化（ΔＡ（ＧＡ））は、（Ａ２−Ａ１）−（Ａ２ブランク−Ａ１ブランク）、アルブミン定量の吸光度変化（ΔＡ（Ａｌｂ））は、（Ａ３−Ａ４）−（Ａ３ブランク−Ａ４ブランク）により計算した。
<測定装置>
測定は、７１８０型自動分析装置（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いて実施した。
<Operation>
100 μl of the above R-1 (glycated albumin quantification reagent [1]) and 5 μl of sample were placed in a cell and incubated at 37 ° C. to initiate the reaction. 85 seconds after the start of the reaction, 100 μl of the above R-2 (glycated albumin quantification reagent [2]) was added and stirred, and the absorbance (A1) was measured 111 seconds after the start of the reaction. Subsequently, the glycated albumin quantitative reaction was continued at 37 ° C. . Absorbance (A2) was measured 236 seconds after the start of the reaction, 80 μl of the above R-3 (albumin quantitative reagent) was added and stirred 280 seconds after the start of the reaction, and the albumin quantitative reaction was continued. Absorbance (A3 and A4) was measured 463 seconds and 587 seconds after the start of the reaction. Similarly, the absorbance of the blank sample was measured, and A1 blank, A2 blank, A3 blank, and A4 blank were measured. The measurement wavelength was set to a main wavelength of 600 nm and a sub wavelength of 800 nm. The absorbance change (ΔA (GA)) of glycated albumin quantification is (A2-A1)-(A2 blank-A1 blank), and the absorbance change (ΔA (Alb)) of albumin quantification is (A3-A4)-(A3 blank). -A4 blank).
<Measurement device>
The measurement was carried out using a 7180 type automatic analyzer (manufactured by HITACHI).
<結果>
図２に各試料で測定を行った結果得られた反応タイムコースを示した。測定開始１１１秒後から２３６秒後までが第一工程の糖化アルブミン測定による発色反応のタイムコース、測定開始２８７秒後以降が第二工程のアルブミン測定による発色反応の反応タイムコースである。
図３に糖化アルブミンの濃度と反応開始２３６秒後と１１１秒後の間の吸光度差の関係を示した。この結果から、糖化アルブミンの濃度に比例した吸光度差が得られることが確認できた。
図４にアルブミンの濃度と反応開始４６３秒後と５８７秒後の間の吸光度差の関係を示した。この結果からアルブミンの濃度に比例した吸光度差が得られることが確認できた。
以上の結果は、試料中の糖化アルブミン及びアルブミンを一度に測定できること、すなわち、糖化割合の測定が可能であることを示している。
尚、図３の糖化アルブミン（ＧＡ）濃度及び図４のアルブミン（ＡＬＢ）濃度は、グリコアルブミン測定キット（ルシカ ＧＡ−Ｌ；旭化成ファーマ社製）を使用して求めた実測値を用いた。ＨＳＡ基質溶液（ＨＳＡ濃度：８ｇ／ｄｌ）のアルブミン濃度及び糖化アルブミン濃度の実測値は、６．３及び０．９５ｇ／ｄｌであった。そのＨＳＡ基質溶液を水で希釈して調製したＨＳＡ濃度７、６、５、４、３ｇ／ｄｌのアルブミン濃度（糖化アルブミン濃度）の実測値は、５．５（０．８３）、４．８（０．７１）、４．０（０．６０）、３．２（０．４８）、２．５（０．３７）であった。
<Result>
FIG. 2 shows the reaction time course obtained as a result of measurement with each sample. From 111 seconds to 236 seconds after the start of measurement is the time course of the color reaction by the glycated albumin measurement in the first step, and after 287 seconds from the start of the measurement is the reaction time course of the color reaction by the albumin measurement in the second step.
FIG. 3 shows the relationship between the glycated albumin concentration and the absorbance difference between 236 seconds and 111 seconds after the start of the reaction. From this result, it was confirmed that an absorbance difference proportional to the concentration of glycated albumin was obtained.
FIG. 4 shows the relationship between the albumin concentration and the absorbance difference between 463 seconds and 587 seconds after the start of the reaction. From this result, it was confirmed that an absorbance difference proportional to the albumin concentration was obtained.
The above results show that glycated albumin and albumin in the sample can be measured at one time, that is, the saccharification ratio can be measured.
Note that the glycated albumin (GA) concentration in FIG. 3 and the albumin (ALB) concentration in FIG. 4 were measured values obtained using a glycoalbumin measurement kit (Lucica GA-L; manufactured by Asahi Kasei Pharma). The measured values of albumin concentration and glycated albumin concentration of the HSA substrate solution (HSA concentration: 8 g / dl) were 6.3 and 0.95 g / dl. The measured values of albumin concentration (glycated albumin concentration) of HSA concentrations 7, 6, 5, 4, 3 g / dl prepared by diluting the HSA substrate solution with water were 5.5 (0.83), 4.8. (0.71), 4.0 (0.60), 3.2 (0.48), and 2.5 (0.37).
[試験例３]
アルブミンと糖化アルブミンを別々に測定して糖化アルブミンの割合を求める方法と、アルブミンと糖化アルブミンを一度に測定して糖化アルブミンの割合を求める本発明方法の比較
<Ｒ−１> 試験例２に同じ。
<Ｒ−２> 試験例２に同じ。
<Ｒ−３> 試験例２に同じ。
<試料> 糖尿病患者血清１０検体
健常者血清 ５検体
[Test Example 3]
Comparison of the method for determining the ratio of glycated albumin by separately measuring albumin and glycated albumin and the method of the present invention for determining the ratio of glycated albumin by measuring albumin and glycated albumin at once
<R-1> Same as Test Example 2.
<R-2> Same as Test Example 2.
<R-3> Same as Test Example 2.
<Sample> Diabetes patient serum 10 samples
Healthy specimen 5 samples
<操作>
アルブミンと糖化アルブミンを別々に測定して糖化アルブミンの割合を求める方法（対照法）は、グリコアルブミン測定キット（ルシカ ＧＡ−Ｌ；旭化成ファーマ社製）を用いて行った。アルブミンと糖化アルブミンを一度に測定して糖化アルブミンの割合を求める本発明方法(本法)は、試験例２と同じ方法で行った。各々の測定系で測定される糖化アルブミンの割合（％）は、測定した糖化アルブミン濃度を測定したアルブミン濃度で除することによって求めた。
<Operation>
A method for determining the ratio of glycated albumin by separately measuring albumin and glycated albumin (control method) was performed using a glycoalbumin measurement kit (Lucica GA-L; manufactured by Asahi Kasei Pharma). The method of the present invention (this method) for determining the ratio of glycated albumin by measuring albumin and glycated albumin at the same time was performed in the same manner as in Test Example 2. The ratio (%) of glycated albumin measured in each measurement system was determined by dividing the measured glycated albumin concentration by the measured albumin concentration.
<結果>
対照法と本発明方法で測定した糖化アルブミンの割合（％）の相関結果を図５に示した。本発明方法で求めた糖化アルブミンの割合と、対照法で求めた糖化アルブミンの割合との間に、良好な相関関係が見られた。この結果から、本発明方法によってアルブミンに対する糖化アルブミンの割合を正確に求めることができることが確認できた。
<Result>
The correlation result of the ratio (%) of glycated albumin measured by the control method and the method of the present invention is shown in FIG. A good correlation was found between the ratio of glycated albumin determined by the method of the present invention and the ratio of glycated albumin determined by the control method. From this result, it was confirmed that the ratio of glycated albumin to albumin can be accurately obtained by the method of the present invention.
Claims (12)
反応容器内で試料中のタンパク質にプロテアーゼを作用させ、生成した糖化アミノ酸に糖化アミノ酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ、及び発色剤を作用させて過酸化水素の生成に基づく発色反応を行い、生成した発色体の測定をレート法で行うことにより、糖化アミノ酸を測定する第一工程、及び、
第一工程の測定後、前記発色体を退色させる還元反応を前記反応容器内で開始及び持続させるとともに、前記還元反応の開始と同時に又は前記還元反応の開始後に、残存している試料中のタンパク質にタンパク結合色素を結合させ、生成した発色体の測定をレート法で行うことにより、タンパク質の測定を行う第二工程
を含む測定方法。 A method of measuring glycated protein and protein in a sample at a time in one reaction vessel,
Protease is allowed to act on the protein in the sample in the reaction container, and glycated amino acid oxidase, peroxidase, and color former are allowed to act on the glycated amino acid produced to perform a color reaction based on the production of hydrogen peroxide. A first step of measuring a glycated amino acid by performing the rate measurement, and
After the measurement in the first step, the reduction reaction for fading the chromophore is started and sustained in the reaction container, and the protein in the remaining sample is simultaneously with the start of the reduction reaction or after the start of the reduction reaction. A measurement method comprising a second step of measuring a protein by binding a protein-binding dye to the sample and measuring the generated chromogen by a rate method.
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