JP4045322B2 - Measuring method using redox reaction - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、例えば、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することは、広く実施されている。例えば、生化学分析や臨床検査等における糖化タンパク質の測定にも適用されている。
【０００３】
例えば、血液中の糖化タンパク質、特に赤血球中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）は、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。例えば、赤血球中の糖化タンパク質は、酸化還元反応を用いて、以下に示すようにして測定されている。
【０００４】
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料を適当なプロテアーゼ等で処理した後、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤという）で処理し、過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、赤血球中の糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤという）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応を起こす。この時、前記還元剤として、酸化されることにより発色する還元剤を用いれば、その発色を測定することにより前記過酸化水素量を測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
【０００５】
しかし、血液中には、通常、アスコルビン酸（ＡｓＡ）、ビリルビン等の各種還元物質が存在し、さらに、赤血球中には、グルタチオン（ＧＳＨ）等の各種還元物質が存在する。これらの還元物質により、前記過酸化水素が還元されたり、前記酸化還元反応が阻害されたり、前記還元剤が発色した後に還元され退色するおそれがある。このため、赤血球中の糖化タンパク質量を正確に測定することが困難であるという問題があった。
【０００６】
また、試料ごとによって、含まれる還元物質の濃度も一定ではないため、測定精度が劣るという問題もあった。
【０００７】
このような問題を回避するために、例えば、種々の酸化剤を前記試料に添加するという方法がある。例えば、特開昭５６−１５１３５８号公報には、酸化剤としてヨウ素酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物を用いる方法が開示されており、特開昭５７−１３３５７号公報、特開昭５７−１６１６５０号公報、特開昭５９−１９３３５４号公報、特開昭６２−１６９０５３号公報、特開平３−３０６９７号公報には、酸化剤としてコバルト、鉄、セリウム等の金属錯体を用いる方法が開示されている。
【０００８】
しかしながら、これらの酸化剤を用いた場合でも、前述のような測定に対する影響を充分に回避できず、特に、測定対象物が赤血球内成分である場合に、前述のような酸化剤による効果が低かった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値を得ることができる測定方法の提供である。
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、前記試料が溶血試料であり、前記酸化還元反応に先立ち、試料にテトラゾリウム化合物を添加して前記試料中に含まれる還元物質の影響を排除し、その後、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質を発生させ、この量を前記テトラゾリウム化合物以外の発色性基質の存在下、酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定し、前記テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも二箇所に環構造置換基を有し、少なくとも一つの前記環構造置換基が電子吸引性官能基を有し、前記電子吸引性官能基が、ニトロ基およびスルホ基からなる群から選択された少なくとも一つの官能基であり、前記環構造置換基が、ベンゼン環であり、前記試料中の還元物質の分子量が、１０，０００以上であることを特徴とする。前記テトラゾリウム化合物とは、テトラゾール環構造を有する化合物である。
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究を行なった結果、従来の方法によると、例えば、前記ＧＳＨやＡｓＡのような低分子量還元物質の影響が排除されていないのではなく、タンパク質等のような高分子量還元物質による影響が排除されていないことを突き止めた。そして、本発明者らは、前記テトラゾリウム化合物によれば、例えば、前記低分子量還元物質だけでなく、その他の還元物質の影響をも排除できるということを見出し、本発明の測定方法に到達した。本発明の測定方法によれば、より信頼性に優れた測定対象物の量を求めることが可能であるため、例えば、臨床医療等における各種検査に有用である。
【００１２】
本発明の測定方法において、前記テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも二箇所に環構造置換基を有し、好ましくは、３箇所に環構造置換基を有する構造である。なお、前記少なくとも二箇所に有する環構造置換基は、ベンゼン環である。
【００１３】
前記テトラゾリウム化合物が、前述のように、前記テトラゾール環の少なくとも二箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位および３位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が三箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位および５位に有することが好ましい。
【００１４】
本発明の測定方法において、前記少なくとも二箇所に有する環構造置換基の環構造はベンゼン環である。
【００１５】
本発明の測定方法において、前記テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも三箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
【００１６】
本発明の測定方法において、少なくとも一つの環構造置換基が官能基を有する。前記官能基の数は多いことが好ましい。
【００１７】
前記官能基としては、電子吸引性の官能基であり、ニトロ基およびスルホ基からなる群から選択された少なくとも一つである。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。
【００１８】
本発明の測定方法において、前記テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも一つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ortho-、meta-、pra-）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。
【００１９】
本発明の測定方法において、前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウム塩、3,3'-(1,1'-ビフェニル-4,4'-ジル)-ビス(2,5-ジフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、3,3'-[3,3'-ジメトキシ-(1,1'-ビフェニル)-4,4'-ジル]-ビス[2-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウム塩]、2,3-ジフェニル-5-(4-クロロフェニル)テトラゾリウム塩、2,5-ジフェニル-3-(p-ジフェニル)テトラゾリウム塩、2,3-ジフェニル-5-(p-ジフェニル)テトラゾリウム塩、2,5-ジフェニル-3-(4-スチリルフェニル)テトラゾリウム塩、2,5-ジフェニル-3-(m-トリル)テトラゾリウム塩および2,5-ジフェニル-3-(p-トリル)テトラゾリウム塩等があげられる。
【００２０】
また、前記テトラゾリウム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、2,3-ジフェニル-5-(2-チエニル)テトラゾリウム塩、2-ベンゾチアゾイル-3-(4-カルボキシ-2-メトキシフェニル)-5-[4-(2-スルホエチル カルバモイル)フェニル]-2H-テトラゾリウム塩、2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル]-3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩および3-(4,5-ジメチル-2-チアゾイル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム塩等があげられる。
【００２１】
また、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、2,3-ジフェニル-5-シアノテトラゾリウム塩、2,3-ジフェニル-5-カルボキシテトラゾリウム塩、2,3-ジフェニル-5-メチルテトラゾリウム塩、2,3-ジフェニル-5-エチルテトラゾリウム塩等があげられる。
【００２２】
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を３つ有し、前記少なくとも二箇所に有する環構造がベンゼン環であり、かつ電子吸引性官能基を多く有するものが好ましく、特に好ましくは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。なお、このようなテトラゾリウム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。
【００２３】
本発明の測定方法において、前記テトラゾリウム化合物の添加量は、特に制限されず、試料の種類や前記還元物質の量により適宜決定できる。具体的には、例えば、試料１μｌ当たり、前記テトラゾリウム化合物を、０．００１〜１００μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜１０μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０１〜１μｍｏｌの範囲である。
【００２４】
本発明の測定方法において、前記試料が全血の場合、前記テトラゾリウム化合物を、全血１μｌ当たり、０．００１〜１０μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜５μｍｏｌの範囲、特に好ましくは０．０１〜１μｍｏｌの範囲である。具体的には、前記テトラゾリウム化合物が2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩の場合は、全血１μｌ当たり、０．００１〜０．４μｍｏｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．１μｍｏｌの範囲、特に好ましくは０．０１〜０．０７μｍｏｌの範囲である。
【００２５】
本発明の測定方法において、前記測定対象物由来の酸化物質が過酸化水素であり、酸化還元反応の測定が、前記過酸化水素量の測定であることが好ましい。
【００２６】
前記過酸化水素量の測定は、酸化酵素と酸化により発色する基質（以下、発色性基質という）とを用いた測定であることが好ましい。
【００２７】
前記発色性基質としては、特に制限されないが、高感度に検出可能であることから、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムが好ましい。また、前記酸化酵素はペルオキシダーゼであることが好ましい。
【００２８】
本発明の測定方法において、前記試料の種類は、特に制限されず、全血、血漿、血清、血球等の他に、例えば、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。
【００２９】
本発明の測定方法において、測定対象物としては、例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、好ましくは赤血球内成分である。前記赤血球内成分としては、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられ、より好ましくは糖化タンパク質である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。
【００３０】
本発明の測定方法において、前記糖化タンパク質の糖部分をＦＡＯＤで酸化分解することにより過酸化水素を生成させることが好ましい。また、前記糖化ペプチド、糖化アミンも、同様にＦＡＯＤを作用させることが好ましい。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。
【００３１】
前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
【００３２】
【化１】
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−[ＣＨ（ＯＨ）]n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００３４】
前記式（１）において、Ｒ2は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
【００３５】
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
【００３６】
【化２】
−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4 ．．．（２）
【００３７】
前記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
【００３８】
【化３】
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ ．．．（３）
【００３９】
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（４）で示すことができる。
【００４０】
【化４】
前記式（４）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。
【００４２】
また、前記式（４）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
【００４３】
【化５】
−（ＣＯ−ＣＨＲ3−ＮＨ）n−Ｈ ．．．（５）
【００４４】
また、前記式（４）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
【００４５】
【化６】
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ ．．．（６）
【００４６】
本発明の測定方法において、試料中の前記還元物質は、その分子量が、１０，０００以上であり、好ましくは１０，０００〜３，０００，０００の範囲であり、より好ましくは１０，０００〜３００，０００の範囲であり、特に好ましくは３０，０００〜１００，０００の範囲である。
【００４７】
また、試料中の前記還元物質はタンパク質であることが好ましい。前記タンパク質の分子量は、好ましくは１０，０００〜３００，０００の範囲、特に好ましくは３０，０００〜１００，０００の範囲である。このような還元物質としては、例えば、ヘモグロビン、グロビン、グロブリン、アルブミン等があげられ、好ましくは、ヘモグロビンである。
【００４８】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明の測定方法について、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。
【００４９】
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００５０】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン-p-t-オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
【００５１】
つぎに、前記溶血試料に対し、前記テトラゾール環構造を有するテトラゾリウム化合物を添加し、試料の前処理を行なう。
【００５２】
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、濃度０．０２〜２０００ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．１〜１０００ｍｍｏｌ／リットルの範囲、特に好ましくは０．４〜２００ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。具体的に、前記テトラゾリウム化合物が 2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩の場合は、濃度０．０２〜８０ｍｍｏｌ／リットルの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．１〜２０ｍｍｏｌ／リットルの範囲、特に好ましくは０．２〜１５ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。
【００５３】
前記前処理は、通常、緩衝液中で行われる。前記緩衝液は、例えば、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が使用できる。そのｐＨは、例えば、６〜１３の範囲であり、好ましくは８〜１２の範囲、より好ましくは９〜１１の範囲である。また、前記前処理溶液中における前記緩衝液の最終濃度は、例えば、１〜４００ｍｍｏｌ／リットルの範囲であり、好ましくは１０〜２００ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。
【００５４】
この前処理の条件は、特に制限されないが、通常、温度１０〜３７℃の範囲であり、処理時間１０秒〜６０分の範囲である。
【００５５】
前記テトラゾリウム化合物は、そのまま使用してもよいが、操作の簡便性や処理効率等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液として使用することが好ましい。前記溶液の濃度は、テトラゾリウム化合物の種類（例えば、分子量等）等により適宜決定でき、例えば、０．０１〜１２０ｍｍｏｌ／リットルの範囲であり、好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／リットルの範囲、より好ましくは０．２〜２０ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。前記溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が使用でき、前記緩衝液としては、例えば、前述と同様の緩衝液が使用できる。なお、前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００５６】
つぎに、この前処理済み溶血試料に対し、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを測定対象物に作用し易くするためである。
【００５７】
前記プロテアーゼの種類は、特に制限されず、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ等が使用できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５８】
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜３０，０００ｍｇ／リットル、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
【００５９】
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
【００６０】
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００６１】
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／リットル、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００６２】
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色性基質を用いて酸化還元反応により測定する。
【００６３】
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等が挙げられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が挙げられる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、前述のように、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
【００６４】
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ＩＵ／リットル、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
【００６５】
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
【００６６】
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００６７】
この測定方法において、テトラゾリウム化合物による前処理工程は、前述のように、酸化還元反応が実質的に生じる前であれば、特に制限されないが、前記ＦＡＯＤ処理後に過酸化水素が発生することから、前記ＦＡＯＤ処理前に行なうことが好ましい。また、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合わせで同時に行ってもよい処理工程がある。
【００６８】
１：溶血処理＋前処理
２：溶血処理＋前処理＋プロテアーゼ処理
３：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
４：ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理
５：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理
【００６９】
また、前記ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび発色性基質の添加順序も、特に制限されない。
【００７０】
このように、試料にテトラゾリウム化合物を接触させることにより、ＧＳＨ、ＡｓＡ、ジチオスレイトール、システイン、Ｎ−アセチル−システイン等の低分子量還元物質による影響だけでなく、例えば、タンパク質や前述のような分子量の範囲である還元物質による影響も回避することができる。
【００７１】
また、本発明の測定方法の前記テトラゾリウム化合物による前処理工程において、例えば、前記テトラゾリウム化合物以外の酸化剤を、さらに併用してもよい。前記酸化剤としては、例えば、ヨード酢酸ナトリウム、ヨーソ酸、過ヨウ素酸等のハロゲン酸化物、ＥＤＴＡ−Ｆｅ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等が使用できる。このような酸化剤の添加量は、例えば、試料１μｌ当たり０．００１〜０．１ｍｇの範囲である。
【００７２】
本発明の測定方法において、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、例えば、前述のように、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。
【００７３】
例えば、過酸化水素を発生させて、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行なうことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる。
【００７７】
このように、前記テトラゾリウム化合物を用いて試料を処理すれば、前記低分子量還元物質だけでなく、例えば、前述のようなタンパク質等の高分子量還元物質の影響も回避できる。このため、分子量１万以上の還元物質や、タンパク質である還元物質が影響する場合は、前記全血試料だけには限定されず、前述のような各種試料に対しても適用できる。全血試料以外の試料を用いる場合は、前記試料が異なる以外は同様の試薬を用いて、同様にして測定することができる。
【００７８】
【実施例】
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
【００７９】
（実施例１、比較例１）
この実施例は、試料をテトラゾリウム化合物で前処理し、前記試料中の還元物質の影響を排除した例である。以下に、使用した試薬および方法を示す。
【００８０】
（界面活性剤溶液）
ポリオキシエチレン（10）-p-t-オクチルフェニル エーテル（以下、Triton X-100という)を、濃度０．１体積％になるように精製水と混合して調製した。
【００８１】
（ＷＳＴ−３溶液）
濃度が１ｍｍｏｌ／リットルになるように、精製水に 2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３、同仁化学研究所社製）を溶解して調製した。
【００８２】
（フルクトシルバリン溶液）
フルクトシルバリン（以下、ＦＶという）は、特開平２−６９６４４号公報にしたがって製造した（以下、同じ）。前記ＦＶを、濃度５０μｍｏｌ／リットルになるように０．５ｍｏｌ／リットルＴｒｉｓ−HＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に添加して調製した。
【００８３】
（酸化還元反応溶液Ａ）
ＦＡＯＤ（旭化成工業社製：以下同じ） ２８．６ＫＵ／リットル
ＰＯＤ（東洋紡社製：以下、同じ） １４．３ＫＵ／リットル
ＤＡ−６４（和光純薬工業社製：以下、同じ） ２８．６μｍｏｌ／リットル
蒸留水 残分
【００８４】
健常者の全血を遠心分離（１６３０Ｇ、１０分間）して血球を回収した。そして、前記血球を前記Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で、２０倍（体積）希釈し、溶血させたものを溶血試料とした。
【００８５】
前記試料５０μｌに、０．５ｍｏｌ／リットル ＣＨＥＳ緩衝液（ＰＨ９．０）５０μｌを添加してから、前記ＷＳＴ−３溶液１００μｌを添加し、攪拌後、３７℃で１０分間処理した。前記処理後、前記処理済み試料に、前記ＦＶ溶液４００μｌを添加してから、前記酸化還元反応溶液Ａ １４００μｌを添加し、反応を開始した。そして、反応溶液の７２６ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８６】
コントロールとしては、前記溶血試料の代り蒸留水を用いた以外は、前述と同様にして測定を行なった。比較例１としては、前記ＷＳＴ−３溶液の代りに蒸留水を用いた以外は、前記実施例１と同様にして測定を行なった。
【００８７】
そして、これらの測定値を下記式（数１）に代入し、コントロールの吸光度を１００％とした時の相対値（％）を求めた。これらの結果を下記表１に示す。
【００８８】
【数１】
相対値（％）＝（Ｘ1−Ｘ0／Ｙ1−Ｙ0）×１００
Ｘ1：５分後の吸光度
Ｘ0：反応開始時の吸光度
Ｙ1：コントロールの５分後の吸光度
Ｙ0：コントロールの反応開始時の吸光度
【００８９】
【表１】
このように、血球の溶血試料をテトラゾリウム化合物で処理することにより、前記試料中の還元物質の影響を排除でき、測定の信頼性が向上した。
【００９１】
（比較例２および比較例３）
実施例１と同様にして血球を回収し、これを１．０体積％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で、５倍（体積）希釈し、溶血させたものを溶血試料とした。この溶血試料５０μｌに、１．０ｍｏｌ／リットル ヨード酢酸ナトリウム（Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製：以下、同じ）溶液１５０μｌを添加し、攪拌後、３７℃で１０分間処理した。前記処理後、前記処理済み試料に、前記ＦＶ溶液４００μｌを添加し、続いて、前記酸化還元反応溶液Ａ １４００μｌを添加して反応を開始した。そして、前記実施例１と同様にして吸光度を測定し、コントロールに対する相対値（％）を求めた。これを比較例２とした。なお、コントロールとしては、前記溶血試料の代りに蒸留水を用いた以外は、前述と同様にして測定を行なった。
【００９２】
比較例３は、前記ヨード酢酸ナトリウム溶液の代りに蒸留水を添加した以外は、前記実施例１と同様にして測定を行なった。これらの結果を下記表２に示す。
【００９３】
【表２】
前記表２に示すように、従来から使用されている酸化剤であるヨード酢酸ナトリウムでは、溶血試料中の還元物質の影響を回避できないことが確認できた。
【００９５】
（比較例４）
この比較例は、赤血球の溶血試料を分子量分画してから、ヨード酢酸ナトリウムで処理した例である
【００９６】
ヘパリンを添加した健常者血液１０ｍｌを遠心分離（１６３０Ｇ、１０分間）し、血漿層および白血球層をピペットで除去した。得られた赤血球層に、生理食塩水加え、前記赤血球が溶血しないように、ゆっくり混和してから、前述と同様に遠心分離を行ない、上清を除去した。この一連の洗浄操作は、３回繰り返し行なった。つぎに、得られた赤血球に、同量（体積）の蒸留水を加えて完全に溶血させた後、再度、遠心分離（４５３０Ｇ、１０分間）を行ない、膜成分を除去した溶液を試料１とした。
【００９７】
つぎに、試料１を、ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ ３０（ミリポア社製）を用いて、遠心分離（１６３０Ｇ、４時間）することにより限外濾過した。前記ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ ３０に残った分子量３万以上の画分を、試料２とし、濾液を試料３とした。
【００９８】
つぎに、前記試料３を、さらに、ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ １０（ミリポア社製）を用いて、遠心分離（１６３０Ｇ、２時間）することにより限外濾過した。前記ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ １０に残った分子量１万以上３万未満の画分を試料４とし、濾液を試料５とした。
【００９９】
そして、前記各試料を蒸留水で希釈した希釈溶液２００μｌに、前記ＦＶ溶液４００μｌを添加し、続いて、前記酸化還元反応溶液Ａ １４００μｌを添加して反応を開始した。そして、前記実施例１と同様にして吸光度を測定し、コントロールに対する相対値（％）を求めた。なお、前記試料１〜２は、蒸留水により８０倍に希釈し、試料３〜試料５は、１０倍に希釈した。コントロールとしては、前記溶血試料の代り蒸留水を用いた以外は、前述と同様にして測定を行なった。
【０１００】
また、前記各試料の希釈溶液５０μｌに対し、前記ヨード酢酸ナトリウム溶液１５０μｌを添加し、攪拌後、３７℃で１０分間処理した。そして、前記処理済み希釈試料に、前記ＦＶ溶液４００μｌを添加し、続いて、前記酸化還元反応溶液Ａ １４００μｌを添加して反応を開始した。前記実施例１と同様にして吸光度を測定し、コントロールに対する相対値（％）を求めた。これらの結果を下記表３に示す。
【０１０１】
【表３】
前記表３に示すように、試料１（未分画）および試料２（分子量３万以上の画分）については、ほとんど測定することができなかった。また、前記試料１および試料２をヨード酢酸ナトリウムで処理しても、同様に、ほとんど測定できなかった。このことから、ヨード酢酸ナトリウムでは、１万以上、特に３万以上の還元物質についての影響を、ほとんど回避できないことがわかった。
【０１０３】
（実施例２、比較例５）
この実施例は、各種テトラゾリウム化合物を用いて、血液試料を処理して、前記試料中の還元物質の影響を排除した例である。以下に、使用したテトラゾリウム化合物の化合物名とその構造を示す。
【０１０４】
（１）テトラゾール環の３箇所にベンゼン環構造置換基を有するテトラゾリウム化合物
（１−１）ＷＳＴ−１
【化７】
（１−２）ＷＳＴ−３
【化８】
（１−３）ＷＳＴ−８
【化９】
（１−４）ＩＮＴ
【化１０】
（１−５）Ｎｅｏ−ＴＢ
【化１１】
クロライド
（１−６）ＮＴＢ
【化１２】
（１−７）Ｂ３２９
【化１３】
（１−８）Ｄ０８８３
【化１４】
（１−９）Ｄ０８８４
【化１５】
（１−１０）Ｄ０９１５
【化１６】
（１−１１）Ｔ３２４
【化１７】
（１−１２）Ｔ３２６
【化１８】
【０１０５】
（２）テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基を有し、１箇所にその他の環構造置換基を有するテトラゾリウム化合物
（２−１）Ｂ０３２５
【化１９】
（２−２）ＷＳＴ−４
【化２０】
（２−３）ＷＳＴ−５
【化２１】
（２−４）ＭＴＴ
【化２２】
【０１０６】
（３）テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基を有し、１箇所に環構造以外の置換基を有するテトラゾリウム化合物
（３−１）Ｂ０２９３
【化２３】
（３−２）Ｂ２９５
【化２４】
（３−３）Ｂ３１３
【化２５】
（３−４）Ｂ３１９
【化２６】
【０１０７】
なお、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−８、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＩＮＴ、ＭＴＴ、ＮＴＢ、Ｎｅｏ−ＴＢは、同仁化学研究所製、その他は、東京化成社製である。
【０１０８】
（ＦＶ溶液）
前記ＦＶを、濃度１０μｍｏｌ／リットルになるように０．１４５ｍｏｌ／リットルＫＰＢ（ｐＨ７．０）に添加して調製した。
【０１０９】
（酸化還元反応溶液Ｂ）
ＦＡＯＤ ７３ＫＵ／リットル
ＰＯＤ ２１９ＫＵ／リットル
ＤＡ−６４ １４６μｍｏｌ／リットル
蒸留水 残分
【０１１０】
１．０ｍｏｌ／リットル ＣＡＰＳＯ緩衝液（ｐＨ１０．０）２５μｌに、前記１０体積％ Triton X-100溶液４１．３μｌおよび健常者の全血１．６５μｌを添加し、蒸留水で２５０μｌに定量した。そして、これを精製水で３倍（体積）希釈したものを溶血試料とした。
【０１１１】
前記溶血試料２５０μｌに、各種テトラゾリウム化合物溶液１５０μｌを添加し、攪拌後、３７℃で６０分間処理した。そして、前記処理済み試料２５μｌに、前記ＦＶ溶液５５μｌを添加してから、前記酸化還元反応溶液Ｂ １５μｌを添加し、反応を開始した。そして、前記実施例１と同様にして吸光度を測定し、コントロールに対する相対値（％）を求めた。なお、前記テトラゾリウム化合物溶液の濃度は、ＷＳＴ−５については０．５ｍｍｏｌ／リットルとし、それ以外の溶液は濃度５ｍｍｏｌ／リットルとした。
【０１１２】
コントロールとしては、前記溶血試料の代り蒸留水を用いた以外は、前述と同様にして測定を行なった。比較例５としては、前記テトラゾリウム化合物溶液の代りに蒸留水を用いた以外は、前記実施例２と同様にして測定を行なった。これらの結果を下記表４に示す。
【０１１３】
【表４】
前記表４に示すように、溶血試料を前記各種テトラゾリウム化合物で処理することにより、測定値の信頼性が向上した。特に、テトラゾール環の３箇所にベンゼン環構造置換基を有するテトラゾリウム化合物（１−１）〜（１−１２）によれば、さらに信頼性に優れた測定値を得ることができた。
【０１１５】
（実施例３）
この実施例は、テトラゾリウム化合物としてＷＳＴ−３、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８およびＩＮＴを用い、処理時のｐＨを変化させた例である。以下に、使用した緩衝液を示す。
【０１１６】
（緩衝液）
１．０ｍｏｌ／リットル ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）
１．０ｍｏｌ／リットル ＣＡＰＳＯ緩衝液（ｐＨ１０．０）
１．０ｍｏｌ／リットル ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１．０）
【０１１７】
前記各緩衝液をそれぞれ用いた以外は、前記実施例２と同様にして、前記各テトラゾリウム化合物を用いた処理を行い、吸光度の測定を行なった。なお、相対値は、ＷＳＴ−３のｐＨ１０．０における吸光度を１００％として求めた。その結果、前記各テトラゾリウム化合物について、前記各緩衝液（ｐＨ９、１０、１１）を用いても、これらの相対値は１００％であり、ｐＨによる影響は見られなかった。
【０１１８】
（実施例４、比較例６）
この実施例は、反応溶液における全血試料の最終希釈倍率が約１００倍になるように設定して、ＷＳＴ−３により処理を行なった例である。
【０１１９】
健常者の全血３３μｌおよび１．０ｍｏｌ／リットル ＣＡＰＳＯ緩衝液（ｐＨ１０）５０μｌを用いた以外は、前記実施例２と同様にして溶血を行ない、蒸留水１２５．７μｌを添加することにより、２５０μｌに定量した。そして、これを精製水で３倍（体積）希釈したものを溶血試料とした。
【０１２０】
前記溶血試料２５μｌに、５ｍｍｏｌ／リットルＷＳＴ−３溶液１５μｌを添加し、攪拌後、３７℃で５分間処理した。そして、前記処理済み試料に、６μｍｏｌ／リットルＦＶ溶液５５μｌを添加してから、前記酸化還元反応溶液Ｂ １５μｌを添加し、反応を開始した。そして、前記実施例１と同様にして吸光度を測定し、コントロールに対する相対値（％）を求めた。コントロールとしては、前記溶血試料の代りに蒸留水を用いた以外は、前述と同様にして測定を行なった。比較例６としては、前記ＷＳＴ−３溶液の代りに蒸留水を用いた以外は、前述と同様にして測定を行なった。これらの結果を下記表５に示す。
【０１２１】
【表５】
実施例４では、全血試料の最終希釈倍率を低くすることによって、反応溶液中の還元物質濃度が高くなっても、前記表５に示すように還元物質の影響を排除でき、優れた信頼性の測定値を得ることができた。これに対し、ＷＳＴ−３で処理しない比較例６では、反応開始直後、わずかに発色が見られたが、すぐに退色がおこり、５分経過後には完全に退色した。このため、吸光度を測定できず、前記表５に示すように相対値は０％であった。
【０１２３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の測定方法は、前記テトラゾリウム化合物を試料に添加することにより、試料中の還元物質の影響を排除できるため、信頼性に優れた測定を行なうことができる。このため、本発明の測定方法は、例えば、臨床医療における各種分析に適用でき、特に、糖尿病診断において重要である、赤血球中の糖化ヘモグロビン等の糖化タンパク質の測定に有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring an object to be measured in a sample using an oxidation-reduction reaction.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, for example, measuring the amount of a measurement object in a sample using an oxidation-reduction reaction has been widely performed. For example, it is applied to the measurement of glycated protein in biochemical analysis and clinical examination.
[0003]
For example, glycated proteins in blood, in particular glycated hemoglobin (HbA1c) in erythrocytes, reflect the past history of biological blood glucose levels, and are therefore important indicators in diabetes diagnosis and treatment. For example, glycated protein in erythrocytes is measured as shown below using an oxidation-reduction reaction.
[0004]
First, a sample in which red blood cells are hemolyzed is prepared, and this hemolyzed sample is treated with an appropriate protease or the like, and then treated with fructosyl amino acid oxidase (hereinafter referred to as FAOD) to generate hydrogen peroxide. This amount of hydrogen peroxide corresponds to the amount of glycated protein in red blood cells. A peroxidase (hereinafter referred to as POD) and a reducing agent are added to the sample, and an oxidation-reduction reaction is caused between the hydrogen peroxide and the reducing agent using the POD as a catalyst. At this time, if a reducing agent that develops color when oxidized is used as the reducing agent, the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the color development. As a result, the amount of glycated protein in erythrocytes can be known. it can.
[0005]
However, various reducing substances such as ascorbic acid (AsA) and bilirubin usually exist in blood, and various reducing substances such as glutathione (GSH) exist in red blood cells. These reducing substances may reduce the hydrogen peroxide, inhibit the oxidation-reduction reaction, or reduce the color after the reducing agent develops color. Therefore, there is a problem that it is difficult to accurately measure the amount of glycated protein in erythrocytes.
[0006]
Moreover, since the concentration of the reducing substance contained in each sample is not constant, there is a problem that the measurement accuracy is poor.
[0007]
In order to avoid such a problem, for example, there is a method of adding various oxidizing agents to the sample. For example, Japanese Patent Laid-Open No. 56-151358 discloses a method using halogen oxides such as iodic acid and periodic acid as an oxidizing agent. Japanese Patent Laid-Open Nos. 57-13357 and 57- No. 161650, JP-A-59-193354, JP-A-62-169053, and JP-A-3-30697 disclose a method using a metal complex such as cobalt, iron, cerium as an oxidizing agent. ing.
[0008]
However, even when these oxidants are used, the above-described influence on the measurement cannot be sufficiently avoided. In particular, when the measurement object is an erythrocyte component, the effect of the oxidant as described above is low. It was.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a method for measuring a measurement object in a sample using an oxidation-reduction reaction, and to provide a measurement method that can obtain a measurement value with excellent reliability.
[0010]
In order to achieve the object, the measurement method of the present invention is a method for measuring an object to be measured in a sample using an oxidation-reduction reaction, wherein the sample is a hemolyzed sample, and prior to the oxidation-reduction reaction, A tetrazolium compound is added to the sample to eliminate the influence of the reducing substance contained in the sample, and then a reducing substance or an oxidizing substance derived from the measurement object is generated, and this amount is used as a chromogenic substrate other than the tetrazolium compound. The amount of the measurement object is determined from the measured value, and the tetrazolium compound has a ring structure substituent in at least two positions of the tetrazole ring, and includes at least one ring. The structural substituent has an electron-withdrawing functional group, and the electron-withdrawing functional group is at least one functional group selected from the group consisting of a nitro group and a sulfo group.The ring structure substituent is a benzene ring;The molecular weight of the reducing substance in the sample is 10,000 or more. The tetrazolium compound is a compound having a tetrazole ring structure.
[0011]
As a result of intensive studies, the present inventors have found that, according to conventional methods, for example, the influence of low molecular weight reducing substances such as GSH and AsA is not excluded, but high molecular weights such as proteins are not excluded. I found out that the effects of reducing substances were not excluded. Then, the present inventors have found that according to the tetrazolium compound, for example, the influence of not only the low molecular weight reducing substance but also other reducing substances can be eliminated, and the measurement method of the present invention has been reached. According to the measurement method of the present invention, it is possible to determine the amount of the measurement object with higher reliability, and thus it is useful for various examinations in clinical medicine, for example.
[0012]
In the measurement method of the present invention, the tetrazolium compound has a ring structure substituent at at least two positions of the tetrazole ring, and preferably has a structure having a ring structure substituent at three positions.In addition, the ring structure substituent which has the said at least two places is a benzene ring.
[0013]
As described above, when the tetrazolium compound has a ring structure substituent in at least two positions of the tetrazole ring, it is preferable to have the substituent at the 2-position and the 3-position of the tetrazole ring. Moreover, when a tetrazolium compound has a ring structure substituent in three places, it is preferable to have the said substituent in 2nd-position, 3rd-position, and 5th-position of the said tetrazole ring.
[0014]
In the measurement method of the present invention,Have at least two placesRing structure of ring structure substituentIsBenzene ringIs.
[0015]
In the measurement method of the present invention, the tetrazolium compound has a ring structure substituent in at least three positions of the tetrazole ring, and the ring structure of at least two of the ring structure substituents is a benzene ring. Is preferred.
[0016]
In the measurement method of the present invention, at least one ring structure substituent has a functional group.Have.Number of functional groupsIs preferable.
[0017]
As the functional group, an electron withdrawing propertyIt is a functional group and is at least one selected from the group consisting of a nitro group and a sulfo group.The functional group may be ionized by dissociation.
[0018]
In the measurement method of the present invention, the tetrazolium compound has a benzene ring at the 2-position and 3-position of the tetrazole ring, and at least one of the benzene rings is a halogen group, a carboxy group, a nitro group, a hydroxy group, or a sulfo group. It preferably has at least one functional group selected from the group consisting of a methoxy group and an ethoxy group. Both the benzene rings may have the functional group. The benzene ring may have the functional group at any position (ortho-, meta-, pra-). The number of functional groups is not particularly limited, and may have the same functional group or different functional groups.
[0019]
In the measurement method of the present invention, the tetrazolium compound is, for example, a compound having a benzene ring structure substituent at the 2-position, 3-position and 5-position of the tetrazole ring, such as 2- (4-iodophenyl) -3- (4-Nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, 2- (4-iodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4 -Disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, 2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, 2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium salt, 3,3 '-(1,1'-biphenyl-4,4'-diyl) -bis ( 2,5-diphenyl) -2H-tetrazolium salt, 3,3 '-[3,3'-dimethoxy- (1,1'-biphenyl) -4,4'-zyl] -bis [2- (4-nitro Phenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium salt], 2,3-diphenyl-5- (4-chlorophenyl) Trazolium salt, 2,5-diphenyl-3- (p-diphenyl) tetrazolium salt, 2,3-diphenyl-5- (p-diphenyl) tetrazolium salt, 2,5-diphenyl-3- (4-styrylphenyl) tetrazolium Salts, 2,5-diphenyl-3- (m-tolyl) tetrazolium salt, 2,5-diphenyl-3- (p-tolyl) tetrazolium salt, and the like.
[0020]
Further, the tetrazolium compound is not limited to the above-mentioned compounds, and in addition, a compound having a benzene ring structure substituent at two positions of the tetrazole ring and another ring structure substituent at one position can be used. For example, 2,3-diphenyl-5- (2-thienyl) tetrazolium salt, 2-benzothiazoyl-3- (4-carboxy-2-methoxyphenyl) -5- [4- (2-sulfoethylcarbamoyl) phenyl ] -2H-tetrazolium salt, 2,2'-dibenzothiazoyl-5,5'-bis [4-di (2-sulfoethyl) carbamoylphenyl] -3,3 '-(3,3'-dimethoxy-4, 4'-biphenylene) ditetrazolium salt and 3- (4,5-dimethyl-2-thiazoyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium salt.
[0021]
Further, tetrazolium compounds having a benzene ring structure substituent at two positions of the tetrazole ring and a substituent not having a ring structure at one position can also be used, for example, 2,3-diphenyl-5-cyanotetrazolium salt, 2,3-diphenyl -5-carboxytetrazolium salt, 2,3-diphenyl-5-methyltetrazolium salt, 2,3-diphenyl-5-ethyltetrazolium salt and the like.
[0022]
Among the aforementioned tetrazolium compounds, as described above, there are three ring structure substituents.And at least in two placesThe ring structure is a benzene ringRAnd having many electron-withdrawing functional groupsPreferablyParticularly preferred is 2- (4-iodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt. Such a tetrazolium compound may be, for example, a salt or an ionized state.
[0023]
In the measurement method of the present invention, the amount of the tetrazolium compound added is not particularly limited, and can be appropriately determined depending on the type of sample and the amount of the reducing substance. Specifically, for example, the tetrazolium compound is preferably added so as to be in the range of 0.001 to 100 μmol, more preferably in the range of 0.005 to 10 μmol, and particularly preferably 0.001 per 1 μl of sample. The range is 01 to 1 μmol.
[0024]
In the measurement method of the present invention, when the sample is whole blood, the tetrazolium compound is preferably added in a range of 0.001 to 10 μmol per 1 μl of whole blood, more preferably 0.005 to 5 μmol. The range is particularly preferably 0.01 to 1 μmol. Specifically, when the tetrazolium compound is 2- (4-iodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, It is preferable to add so as to be in the range of 0.001 to 0.4 μmol per 1 μl of blood, more preferably in the range of 0.005 to 0.1 μmol, particularly preferably in the range of 0.01 to 0.07 μmol. .
[0025]
In the measurement method of the present invention, it is preferable that the oxidation substance derived from the measurement object is hydrogen peroxide, and the measurement of the oxidation-reduction reaction is measurement of the amount of hydrogen peroxide.
[0026]
The measurement of the amount of hydrogen peroxide is preferably a measurement using an oxidase and a substrate that develops color by oxidation (hereinafter referred to as a chromogenic substrate).
[0027]
The chromogenic substrate is not particularly limited, but for example, N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium is preferable because it can be detected with high sensitivity. The oxidase is preferably peroxidase.
[0028]
In the measurement method of the present invention, the type of the sample is not particularly limited, and in addition to whole blood, plasma, serum, blood cells, and the like, for example, biological samples such as urine and cerebrospinal fluid, drinking water such as juice, and soy sauce It can also be applied to samples of foods such as sauces.
[0029]
In the measurement method of the present invention, examples of the measurement target include whole blood components, erythrocyte components, plasma components, serum components, urine components, and cerebrospinal fluid components, preferably erythrocyte components. is there. Examples of the erythrocyte components include glycated proteins such as glycated hemoglobin and glycated albumin, glycated peptides, glycated amino acids, glucose, uric acid, cholesterol, creatinine, sarcosine, and glycerol, and more preferably glycated proteins. For example, when measuring the red blood cell component, a sample obtained by hemolyzing whole blood as it is may be used as a sample, or a sample obtained by separating red blood cells from whole blood and hemolyzing the red blood cells may be used as a sample.
[0030]
In the measurement method of the present invention, it is preferable to generate hydrogen peroxide by oxidatively decomposing the sugar portion of the glycated protein with FAOD. In addition, the glycated peptide and glycated amine are also preferably allowed to act on FAOD. The glycated protein or glycated peptide is preferably treated with a protease before the FAOD treatment, if necessary.
[0031]
As said FAOD, it is preferable that it is FAOD which catalyzes reaction shown to following formula (1).
[0032]
[Chemical 1]
In the formula (1), R1Means a residue (sugar residue) derived from a hydroxyl group or a sugar before saccharification reaction. The sugar residue (R1) Is an aldose residue when the sugar before the reaction is aldose, and is a ketose residue when the sugar before the reaction is ketose. For example, when the sugar before the reaction is glucose, the structure after the reaction takes a fructose structure due to the Amadori rearrangement. In this case, the sugar residue (R1) Becomes a glucose residue (aldose residue). This sugar residue (R1) For example
-[CH (OH)]n-CH2OH
N is an integer of 0-6.
[0034]
In the formula (1), R2Although there is no particular limitation, for example, in the case of a glycated amino acid, a glycated peptide or a glycated protein, the case where the α-amino group is glycated differs from the case where the other amino group is glycated.
[0035]
In the formula (1), when the α-amino group is saccharified, R2Is an amino acid residue or a peptide residue represented by the following formula (2).
[0036]
[Chemical formula 2]
-CHRThree-CO-RFour . . . (2)
[0037]
In the formula (2), RThreeRepresents an amino acid side chain group. RFourRepresents a hydroxyl group, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented, for example, by the following formula (3). In the following formula (3), n is an integer of 0 or more, and RThreeRepresents an amino acid side chain group as described above.
[0038]
[Chemical Formula 3]
-(NH-CHRThree-CO)n-OH. . . (3)
[0039]
In the formula (1), when an amino group other than the α-amino group is saccharified (the amino acid side chain group is saccharified), R2Can be represented by the following formula (4).
[0040]
[Formula 4]
In the formula (4), RFiveRepresents a portion of the amino acid side chain group other than the glycated amino group. For example, when the glycated amino acid is lysine, RFiveIs
-CH2-CH2-CH2-CH2−
And
For example, when the glycated amino acid is arginine, RFiveIs
-CH2-CH2-CH2-NH-CH (NH2) −
It is.
[0042]
In the formula (4), R6Is hydrogen, an amino acid residue, or a peptide residue, and can be represented, for example, by the following formula (5). In the following formula (5), n is an integer of 0 or more, and RThreeRepresents an amino acid side chain group as described above.
[0043]
[Chemical formula 5]
-(CO-CHRThree-NH)n-H. . . (5)
[0044]
In the formula (4), R7Is a hydroxyl group, an amino acid residue, or a peptide residue, and can be represented by, for example, the following formula (6). In the following formula (6), n is an integer of 0 or more, and RThreeRepresents an amino acid side chain group as described above.
[0045]
[Chemical 6]
-(NH-CHRThree-CO)n-OH. . . (6)
[0046]
In the measurement method of the present invention, the sample in the sampleReducing substances have a molecular weight of10,000 or more, preferably in the range of 10,000 to 3,000,000, more preferably in the range of 10,000 to 300,000, particularly preferably in the range of 30,000 to 100,000. It is.
[0047]
Moreover, it is preferable that the said reducing substance in a sample is protein. Of the proteinThe molecular weight is preferablyIt is in the range of 10,000 to 300,000, particularly preferably in the range of 30,000 to 100,000. Examples of such a reducing substance include hemoglobin, globin, globulin, and albumin, and hemoglobin is preferable.
[0048]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Next, the measurement method of the present invention will be described with an example of measuring glycated protein in blood cells.
[0049]
First, whole blood is hemolyzed as it is, or a blood cell fraction is separated from whole blood by a conventional method such as centrifugation, and this is hemolyzed to prepare a hemolyzed sample. The hemolysis method is not particularly limited, and for example, a method using a surfactant, a method using ultrasonic waves, a method using a difference in osmotic pressure, and the like can be used. Among these, the method using the surfactant is preferable for reasons such as ease of operation.
[0050]
Examples of the surfactant include polyoxyethylene-pt-octylphenyl ether (Triton surfactant, etc.), polyoxyethylene sorbitan alkyl ester (Tween surfactant, etc.), polyoxyethylene alkyl ether (Brij type). Nonionic surfactants such as surfactants can be used, and specific examples include Triton X-100, Tween-20, Brij35, and the like. The treatment conditions with the surfactant are usually such that when the blood cell concentration in the treatment solution is 1 to 10% by volume, the surfactant is adjusted so that the concentration in the treatment solution is 0.01 to 5% by weight. Add and stir at room temperature for a few seconds (about 5 seconds) to about 10 minutes.
[0051]
Next, the tetrazolium compound having the tetrazole ring structure is added to the hemolyzed sample, and the sample is pretreated.
[0052]
For example, when the blood cell concentration in the pretreatment solution is 1 to 10% by volume, the tetrazolium compound is preferably added so that the concentration is in the range of 0.02 to 2000 mmol / liter, and more preferably 0.1 to 0.1%. It is in the range of ~ 1000 mmol / liter, particularly preferably in the range of 0.4 to 200 mmol / liter. Specifically, when the tetrazolium compound is 2- (4-iodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, the concentration is 0. It is preferable to add in a range of 0.02 to 80 mmol / liter, more preferably in the range of 0.1 to 20 mmol / liter, and particularly preferably in the range of 0.2 to 15 mmol / liter.
[0053]
The pretreatment is usually performed in a buffer solution. Examples of the buffer include CHES buffer, CAPSO buffer, CAPS buffer, phosphate buffer, Tris buffer, EPPS buffer, and HEPES buffer. The pH is, for example, in the range of 6 to 13, preferably in the range of 8 to 12, and more preferably in the range of 9 to 11. Moreover, the final concentration of the buffer solution in the pretreatment solution is, for example, in the range of 1 to 400 mmol / liter, and preferably in the range of 10 to 200 mmol / liter.
[0054]
The conditions for this pretreatment are not particularly limited, but are usually in the range of a temperature of 10 to 37 ° C. and a treatment time of 10 seconds to 60 minutes.
[0055]
The tetrazolium compound may be used as it is, but it is preferably used as a tetrazolium compound solution dissolved in a solvent from the viewpoint of easy operation and processing efficiency. The concentration of the solution can be appropriately determined depending on the type of tetrazolium compound (for example, molecular weight, etc.), and is, for example, in the range of 0.01 to 120 mmol / liter, preferably in the range of 0.1 to 50 mmol / liter. Is in the range of 0.2-20 mmol / liter. As the solvent, for example, distilled water, physiological saline, buffer solution, or the like can be used. As the buffer solution, for example, the same buffer solution as described above can be used. In addition, the said tetrazolium compound may be one type and may use 2 or more types together.
[0056]
Next, a protease treatment is performed on the pretreated hemolyzed sample. This is for facilitating the action of the FAOD used for the subsequent processing on the measurement object.
[0057]
The kind of the protease is not particularly limited, and for example, protease K, subtilisin, trypsin, aminopeptidase and the like can be used. The protease treatment is usually performed in a buffer solution, and the treatment conditions are appropriately determined depending on the type of protease to be used, the type of glycated protein that is a measurement target, the concentration thereof, and the like.
[0058]
Specifically, for example, when the pretreated hemolyzed sample is treated with protease K as the protease, the protease concentration in the reaction solution is usually 10 to 30,000 mg / liter, and the blood cell concentration in the reaction solution is 0. It is the range of 05-15 volume%, reaction temperature 15-37 degreeC, reaction time 1 minute-24 hours, and pH 6-12. Further, the type of the buffer solution is not particularly limited, and for example, Tris-HCl buffer solution, EPPS buffer solution, PIPES buffer solution and the like can be used.
[0059]
Next, the degradation product obtained by the protease treatment is treated with the FAOD. By this FAOD treatment, the reaction represented by the formula (1) is catalyzed.
[0060]
This FAOD treatment is preferably performed in a buffer solution as in the protease treatment. The processing conditions are appropriately determined depending on the type of FAOD to be used, the type of glycated protein that is a measurement target, its concentration, and the like.
[0061]
Specifically, for example, the FAOD concentration in the reaction solution is 50 to 50,000 U / liter, the blood cell concentration in the reaction solution is 0.01 to 1% by volume, the reaction temperature is 15 to 37 ° C., the reaction time is 1 to 60 minutes, and the pH is 6 It is the range of ~ 9. Further, the type of the buffer solution is not particularly limited, and the same buffer solution as in the protease treatment can be used.
[0062]
Next, the hydrogen peroxide generated by the FAOD treatment is measured by a redox reaction using POD and the chromogenic substrate.
[0063]
As the chromogenic substrate, for example, N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium, orthophenylenediamine (OPD), a substrate obtained by combining a Trinder reagent and 4-aminoantipyrine Etc.Be mentioned. Examples of the Trinder reagent include phenol, phenol derivatives, aniline derivatives, naphthol, naphthol derivatives, naphthylamine, naphthylamine derivatives, and the like.Be mentioned. In addition to the aminoantipyrine, aminoantipyrine derivatives, vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH), sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone (SMBTH) and the like can also be used. Among such chromogenic substrates, as described above, N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium is particularly preferable.
[0064]
The oxidation-reduction reaction is usually performed in a buffer solution, and the conditions are appropriately determined depending on the concentration of the generated hydrogen peroxide. Usually, the POD concentration in the reaction solution is 10 to 100,000 IU / liter, the chromogenic substrate concentration is 0.005 to 30 mmol / l, the reaction temperature is 15 to 37 ° C., the reaction time is 0.1 to 30 minutes, and the pH is 5 to 9. The buffer solution is not particularly limited, and for example, the same buffer solution as the protease treatment and FAOD treatment can be used.
[0065]
In the oxidation-reduction reaction, for example, when the chromogenic substrate is used, the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the degree of color development (absorbance) of the reaction solution with a spectrophotometer. For example, the amount of glycated protein in the sample can be determined using the hydrogen peroxide concentration and the calibration curve.
[0066]
The amount of hydrogen peroxide can be measured by, for example, an electrical method in addition to the enzymatic method using the POD or the like.
[0067]
In this measurement method, the pretreatment step with the tetrazolium compound is not particularly limited as long as the oxidation-reduction reaction substantially occurs as described above, but hydrogen peroxide is generated after the FAOD treatment. It is preferably performed before the FAOD treatment. Moreover, although each process process may be performed separately as mentioned above, there exists a process process which may be performed simultaneously by the combination as shown below, for example.
[0068]
1: hemolysis treatment + pretreatment
2: Hemolysis treatment + pretreatment + protease treatment
3: Protease treatment + FAOD treatment
4: FAOD treatment + POD redox treatment
5: Protease treatment + FAOD treatment + POD redox treatment
[0069]
Further, the order of adding the FAOD, POD and chromogenic substrate is not particularly limited.
[0070]
Thus, by contacting the sample with a tetrazolium compound, not only the influence of low molecular weight reducing substances such as GSH, AsA, dithiothreitol, cysteine, N-acetyl-cysteine, but also proteins and molecular weights as described above, for example. It is also possible to avoid the influence of the reducing substance within the range.
[0071]
In the pretreatment step with the tetrazolium compound in the measurement method of the present invention, for example, an oxidizing agent other than the tetrazolium compound may be used in combination. Examples of the oxidizing agent include halogen oxides such as sodium iodoacetate, iodoacid, and periodic acid, EDTA-Fe, ascorbate oxidase, bilirubin oxidase, and the like. The amount of the oxidizing agent added is, for example, in the range of 0.001 to 0.1 mg per 1 μl of sample.
[0072]
In the measurement method of the present invention, the measurement object is not particularly limited as long as it uses an oxidation-reduction reaction. In addition to the glycated protein, for example, as described above, a glycated peptide, a glycated amino acid, glucose, Examples include cholesterol, uric acid, creatinine, sarcosine, glycerol and the like.
[0073]
For example, when hydrogen peroxide is generated to measure the amount of each measurement object, for example, glucose oxidase for glucose, cholesterol oxidase for cholesterol, uricase for uric acid, and creatinine Sarcosine oxidase, sarcosine oxidase on the sarcosine, glycerol oxidase on the glycerol, and hydrogen peroxide may be generated. The method for measuring the amount of hydrogen peroxide can be performed in the same manner as described above. The glycated peptide and glycated amino acid can be measured in the same manner as the measurement of the glycated protein, for example.
[0077]
Thus, if the sample is treated with the tetrazolium compound, the influence of not only the low molecular weight reducing substance but also the high molecular weight reducing substance such as protein as described above can be avoided. For this reason, when a reducing substance having a molecular weight of 10,000 or more or a reducing substance that is a protein is affected, the invention is not limited to the whole blood sample, and can be applied to various samples as described above. When a sample other than the whole blood sample is used, measurement can be performed in the same manner using the same reagent except that the sample is different.
[0078]
【Example】
Next, examples will be described together with comparative examples.
[0079]
(Example 1, Comparative Example 1)
In this example, the sample was pretreated with a tetrazolium compound to eliminate the influence of the reducing substance in the sample. The reagents and methods used are shown below.
[0080]
(Surfactant solution)
Polyoxyethylene (10) -p-t-octylphenyl ether (hereinafter referred to as Triton X-100) was prepared by mixing with purified water to a concentration of 0.1% by volume.
[0081]
(WST-3 solution)
In purified water, add 2- (4-iodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, mono to a concentration of 1 mmol / liter. A sodium salt (WST-3, manufactured by Dojindo Laboratories) was dissolved and prepared.
[0082]
(Fructosylvaline solution)
Fructosylvaline (hereinafter referred to as FV) was produced according to JP-A-2-69644 (hereinafter the same). The FV was prepared by adding to a 0.5 mol / liter Tris-HCl buffer (pH 8.0) to a concentration of 50 μmol / liter.
[0083]
(Redox reaction solution A)
FAOD (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd .: The same shall apply hereinafter) 28.6KU / liter
POD (Toyobo Co., Ltd .: The same applies hereinafter) 14.3 KU / liter
DA-64 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: hereinafter the same) 28.6 μmol / liter
Distilled water residue
[0084]
Whole blood of a healthy person was centrifuged (1630G, 10 minutes) to collect blood cells. The blood cells were diluted 20 times (volume) with the Triton X-100 solution and hemolyzed to obtain hemolyzed samples.
[0085]
After adding 50 μl of 0.5 mol / liter CHES buffer (PH9.0) to 50 μl of the sample, 100 μl of the WST-3 solution was added, and after stirring, treated at 37 ° C. for 10 minutes. After the treatment, 400 μl of the FV solution was added to the treated sample, and then 1400 μl of the oxidation-reduction reaction solution A was added to start the reaction. Then, the absorbance of the reaction solution at 726 nm was measured.
[0086]
As a control, measurement was performed in the same manner as described above except that distilled water was used instead of the hemolyzed sample. As Comparative Example 1, measurement was performed in the same manner as in Example 1 except that distilled water was used instead of the WST-3 solution.
[0087]
Then, these measured values were substituted into the following formula (Equation 1) to obtain a relative value (%) when the absorbance of the control was 100%. These results are shown in Table 1 below.
[0088]
[Expression 1]
Relative value (%) = (X1-X0/ Y1-Y0) × 100
X1: Absorbance after 5 minutes
X0: Absorbance at the start of reaction
Y1: Absorbance after 5 minutes of control
Y0: Absorbance at the start of control reaction
[0089]
[Table 1]
Thus, by treating the hemolyzed sample of blood cells with the tetrazolium compound, the influence of the reducing substance in the sample can be eliminated, and the reliability of the measurement is improved.
[0091]
(Comparative Example 2 and Comparative Example 3)
Blood cells were collected in the same manner as in Example 1, and this was diluted 5 times (volume) with 1.0 volume% Triton X-100 solution, and hemolyzed sample was used as a hemolyzed sample. To 50 μl of this hemolyzed sample, 150 μl of a 1.0 mol / liter sodium iodoacetate (Aldrich: hereinafter the same) solution was added, stirred, and then treated at 37 ° C. for 10 minutes. After the treatment, 400 μl of the FV solution was added to the treated sample, and then 1400 μl of the oxidation-reduction reaction solution A was added to initiate the reaction. Then, the absorbance was measured in the same manner as in Example 1, and the relative value (%) to the control was determined. This was designated as Comparative Example 2. As a control, measurement was performed in the same manner as described above except that distilled water was used instead of the hemolyzed sample.
[0092]
In Comparative Example 3, the measurement was performed in the same manner as in Example 1 except that distilled water was added instead of the sodium iodoacetate solution. These results are shown in Table 2 below.
[0093]
[Table 2]
As shown in Table 2 above, it has been confirmed that sodium iodoacetate, which has been conventionally used as an oxidizing agent, cannot avoid the influence of reducing substances in the hemolyzed sample.
[0095]
(Comparative Example 4)
This comparative example is an example in which a hemolyzed sample of erythrocytes was subjected to molecular weight fractionation and then treated with sodium iodoacetate.
[0096]
Ten milliliters of healthy human blood to which heparin was added was centrifuged (1630 G, 10 minutes), and the plasma layer and leukocyte layer were removed with a pipette. To the obtained erythrocyte layer, physiological saline was added, and the mixture was slowly mixed so that the erythrocytes would not be hemolyzed, followed by centrifugation as described above to remove the supernatant. This series of washing operations was repeated three times. Next, after adding the same amount (volume) of distilled water to the obtained erythrocytes to completely hemolyze them, centrifugation (4530 G, 10 minutes) is performed again, and the solution from which the membrane components have been removed is referred to as Sample 1. did.
[0097]
Next, the sample 1 was ultrafiltered by centrifuging (1630G, 4 hours) using CENTRIPREP 30 (Millipore). The fraction having a molecular weight of 30,000 or more remaining in the CENTRIPREP 30 was designated as sample 2, and the filtrate was designated as sample 3.
[0098]
Next, the sample 3 was further ultrafiltered by centrifugation (1630 G, 2 hours) using CENTRIPREP 10 (manufactured by Millipore). The fraction remaining in the CENTRIPREP 10 with a molecular weight of 10,000 or more and less than 30,000 was designated as sample 4, and the filtrate was designated as sample 5.
[0099]
Then, 400 μl of the FV solution was added to 200 μl of a diluted solution obtained by diluting each sample with distilled water, and then 1400 μl of the oxidation-reduction reaction solution A was added to start the reaction. Then, the absorbance was measured in the same manner as in Example 1, and the relative value (%) to the control was determined. The samples 1 and 2 were diluted 80 times with distilled water, and the samples 3 to 5 were diluted 10 times. As a control, measurement was performed in the same manner as described above except that distilled water was used instead of the hemolyzed sample.
[0100]
Further, 150 μl of the sodium iodoacetate solution was added to 50 μl of the diluted solution of each sample, and after stirring, treated at 37 ° C. for 10 minutes. Then, 400 μl of the FV solution was added to the processed diluted sample, and then 1400 μl of the oxidation-reduction reaction solution A was added to start the reaction. Absorbance was measured in the same manner as in Example 1, and the relative value (%) relative to the control was determined. These results are shown in Table 3 below.
[0101]
[Table 3]
As shown in Table 3, almost no measurement was possible for sample 1 (unfractionated) and sample 2 (fraction with a molecular weight of 30,000 or more). Similarly, even when Sample 1 and Sample 2 were treated with sodium iodoacetate, almost no measurement was possible. From this, it was found that sodium iodoacetate can hardly avoid the influence of 10,000 or more, especially 30,000 or more reducing substances.
[0103]
(Example 2, Comparative Example 5)
In this example, blood samples were treated with various tetrazolium compounds to eliminate the influence of reducing substances in the samples. The compound names and structures of the tetrazolium compounds used are shown below.
[0104]
(1) Tetrazolium compounds having a benzene ring structure substituent at three positions on the tetrazole ring
(1-1) WST-1
[Chemical 7]
(1-2) WST-3
[Chemical 8]
(1-3) WST-8
[Chemical 9]
(1-4) INT
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(1-5) Neo-TB
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Chloride
(1-6) NTB
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(1-7) B329
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(1-8) D0883
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(1-9) D0884
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(1-10) D0915
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(1-11) T324
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(1-12) T326
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[0105]
(2) A tetrazolium compound having a benzene ring structure substituent at two positions on the tetrazole ring and another ring structure substituent at one position.
(2-1) B0325
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(2-2) WST-4
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(2-3) WST-5
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(2-4) MTT
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[0106]
(3) A tetrazolium compound having a benzene ring structure substituent at two positions on the tetrazole ring and a substituent other than the ring structure at one position.
(3-1) B0293
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(3-2) B295
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(3-3) B313
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(3-4) B319
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[0107]
WST-1, WST-3, WST-8, WST-4, WST-5, INT, MTT, NTB and Neo-TB are manufactured by Dojindo Laboratories, and others are manufactured by Tokyo Chemical Industry.
[0108]
(FV solution)
The FV was prepared by adding 0.145 mol / liter KPB (pH 7.0) to a concentration of 10 μmol / liter.
[0109]
(Redox reaction solution B)
FAOD 73KU / liter
POD 219KU / liter
DA-64 146 μmol / liter
Distilled water residue
[0110]
To 25 μl of 1.0 mol / liter CAPSO buffer (pH 10.0), 41.3 μl of the 10 vol% Triton X-100 solution and 1.65 μl of whole blood of a healthy person were added, and quantified to 250 μl with distilled water. And what diluted this 3 times (volume) with purified water was made into the hemolysis sample.
[0111]
150 μl of various tetrazolium compound solutions were added to 250 μl of the hemolyzed sample, stirred, and then treated at 37 ° C. for 60 minutes. Then, 55 μl of the FV solution was added to 25 μl of the processed sample, and then 15 μl of the redox reaction solution B was added to start the reaction. Then, the absorbance was measured in the same manner as in Example 1, and the relative value (%) to the control was determined. The concentration of the tetrazolium compound solution was 0.5 mmol / liter for WST-5, and the concentration of the other solutions was 5 mmol / liter.
[0112]
As a control, measurement was performed in the same manner as described above except that distilled water was used instead of the hemolyzed sample. As Comparative Example 5, measurement was performed in the same manner as in Example 2 except that distilled water was used instead of the tetrazolium compound solution. These results are shown in Table 4 below.
[0113]
[Table 4]
As shown in Table 4, the reliability of the measured values was improved by treating the hemolyzed sample with the various tetrazolium compounds. In particular, according to the tetrazolium compounds (1-1) to (1-12) having a benzene ring structure substituent at three positions of the tetrazole ring, it was possible to obtain a more reliable measurement value.
[0115]
(Example 3)
In this example, WST-3, WST-1, WST-8, and INT were used as tetrazolium compounds, and the pH during the treatment was changed. The buffer solution used is shown below.
[0116]
(Buffer solution)
1.0 mol / liter CHES buffer (pH 9.0)
1.0 mol / liter CAPSO buffer (pH 10.0)
1.0 mol / liter CAPS buffer (pH 11.0)
[0117]
Except for using each buffer solution, the treatment with each tetrazolium compound was performed in the same manner as in Example 2, and the absorbance was measured. In addition, the relative value was calculated | required considering the light absorbency in pH 10.0 of WST-3 as 100%. As a result, even if each said buffer solution (pH 9, 10, 11) was used about each said tetrazolium compound, these relative values were 100% and the influence by pH was not seen.
[0118]
(Example 4, Comparative Example 6)
In this example, the final dilution ratio of the whole blood sample in the reaction solution was set to be about 100 times, and the processing was performed with WST-3.
[0119]
Except for using 33 μl of healthy human blood and 50 μl of 1.0 mol / liter CAPSO buffer (pH 10), hemolysis was performed in the same manner as in Example 2 above, and 125.7 μl of distilled water was added to make 250 μl. Quantified. And what diluted this 3 times (volume) with purified water was made into the hemolysis sample.
[0120]
To 25 μl of the hemolyzed sample, 15 μl of 5 mmol / liter WST-3 solution was added, stirred, and treated at 37 ° C. for 5 minutes. Then, 55 μl of a 6 μmol / liter FV solution was added to the treated sample, and then 15 μl of the oxidation-reduction reaction solution B was added to start the reaction. Then, the absorbance was measured in the same manner as in Example 1, and the relative value (%) to the control was determined. As a control, measurement was performed in the same manner as described above except that distilled water was used instead of the hemolyzed sample. As Comparative Example 6, measurement was performed in the same manner as described above except that distilled water was used instead of the WST-3 solution. These results are shown in Table 5 below.
[0121]
[Table 5]
In Example 4, by reducing the final dilution ratio of the whole blood sample, even if the reducing substance concentration in the reaction solution is increased, the influence of the reducing substance can be eliminated as shown in Table 5 above, and excellent reliability is achieved. The measured value of was able to be obtained. In contrast, in Comparative Example 6 that was not treated with WST-3, a slight color development was observed immediately after the start of the reaction, but the color fading occurred immediately, and after 5 minutes, the color fading was complete. For this reason, the absorbance could not be measured, and the relative value was 0% as shown in Table 5 above.
[0123]
【The invention's effect】
As described above, the measurement method of the present invention can eliminate the influence of the reducing substance in the sample by adding the tetrazolium compound to the sample, so that measurement with excellent reliability can be performed. For this reason, the measuring method of the present invention can be applied to, for example, various analyzes in clinical medicine, and is particularly useful for measuring glycated proteins such as glycated hemoglobin in erythrocytes, which is important in diabetes diagnosis.
Claims (16)
前記テトラゾリウム化合物が、テトラゾール環の少なくとも二箇所に環構造置換基を有し、
少なくとも一つの前記環構造置換基が電子吸引性官能基を有し、
前記電子吸引性官能基が、ニトロ基およびスルホ基からなる群から選択された少なくとも一つの官能基であり、
前記環構造置換基が、ベンゼン環であり、
前記試料中の還元物質の分子量が、１０，０００以上である測定方法。A method for measuring an object to be measured in a sample using a redox reaction, wherein the sample is a hemolytic sample, and prior to the redox reaction, a tetrazolium compound is added to the sample and the reduction contained in the sample After eliminating the influence of the substance, a reducing substance or an oxidizing substance derived from the measurement object is generated, and this amount is measured by a redox reaction in the presence of a chromogenic substrate other than the tetrazolium compound. Determining the amount of the measurement object from
The tetrazolium compound has a ring structure substituent in at least two positions of the tetrazole ring;
At least one of the ring structure substituents has an electron withdrawing functional group;
The electron-withdrawing functional group is at least one functional group selected from the group consisting of a nitro group and a sulfo group;
The ring structure substituent is a benzene ring;
The measurement method wherein the molecular weight of the reducing substance in the sample is 10,000 or more.
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