JP6046060B2 - エイズの治療のための、ポリアニオン性ポリペプチドと結合しているcd4受容体由来ペプチドを含んでなる新規コンジュゲート分子 - Google Patents
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Description
該CD4受容体由来ペプチドは、次の一般配列(I):
・P1は3〜6個のアミノ酸残基を表し、
・P2は2〜4個のアミノ酸残基を表し、
・P3は6〜10個のアミノ酸残基を表し、
・XaafはN−アセチルシステイン(Ac−Cys)またはチオプロピオン酸(TPA)を表し、
・XaagはAlaまたはGlnを表し、
・XaahはGlyまたは(D)AspまたはSerを表し、
・XaaiはSerまたはHisまたはAsnを表し、
・Xaajはビフェニルアラニン(Bip)、フェニルアラニンまたは[β]−ナフチルアラニンを表し、
・XaakはThrまたはAlaを表し、
・XaalはGly、ValまたはLeuを表し、
・Xaamは−NH2または−OHを表し、
P1、P2およびP3中のアミノ酸残基は天然または非天然の、同一または異なる残基であり、P1、P2およびP3の該残基は総てLys残基とは異なり、P1、P2およびP3は共通または非共通の配列を有する)
を含んでなり、
該有機分子は、
・天然または非天然の、同一または異なる、5〜21個、有利には、5〜17個、好ましくは、13個のアミノ酸残基からなるアニオン性ポリペプチドであって、少なくとも3個、とりわけ、3〜15個、例えば、3〜13個などのアミノ酸が負の電荷を有するアニオン性ポリペプチド、
・分子基A−Z
(式中、
Aは、式−CO(CH2)3NH−CO(CH2)2−、−CO(CH2)p−NH−CO−(CH2)q−、−CO(CH2−CH2)−(O−CH2−CH2)p−NH−CO−(CH2)q−、−CO(CH2)p−NH−CO−(CH2−CH2−O)q−(CH2−CH2)−および−CO(CH2−CH2)−(O−CH2−CH2)p−NH−CO−(CH2−CH2−O)q−(CH2−CH2)−(式中、pは、1〜10の間に含まれる整数を表し、qは、1〜10の間に含まれる整数を表し、1位のカルボニル基はN末端セリンのαNH2と結合している)の群の中から選択される基を含んでなり、有利には、Aは式−CO(CH2)3NH−CO(CH2)2−の基を表し、
Zはハロゲン原子、チオールまたはマレイミド基を表す)、
を含んでなり、
該アニオン性ポリペプチドは、式A−Zの該分子基によってリンカーと結合しており、該リンカーは、その一方の末端で、該CD4受容体由来ペプチドの一般配列(I)中に存在するアミノ酸残基Lysの遊離アミノ基(−NH2)と共有結合し、その他方の末端で、該有機分子のZ基と共有結合している。
の中から選択され、かつ、Zがマレイミド基またはハロゲン原子を表す場合には、
・S−(YSO3−D−YSO3−S)n、例えば、S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S(配列番号4)など(式中、YSO3はスルホチロシンである);
・S−(YSN−D−YSN−S)n、例えば、S−YSN−D−YSN−S−YSN−D−YSN−S−YSN−D−YSN−S(配列番号5)など(式中、YSO3はチロシンスルホネートである);
・S−(pF−D−pF−S)n、例えば、S−pF−D−pF−S−pF−D−pF−S−pF−D−pF−S(配列番号6)など(式中、pFはp−カルボキシメチルフェニルアラニンである);
・S−(Asu−D−Asu−S)n、例えば、S−Asu−D−Asu−S−Asu−D−Asu−S−Asu−D−Asu−S(配列番号7)など(式中、Asuはアミノスベリン酸である);および
・S−(Y−D−Y−S)n、例えば、S−Y−D−Y−S−Y−D−Y−S−Y−D−Y−S(配列番号8)など(式中、Yはチロシンである)
のいずれかを有することができる。
・S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−Y−S−Y−D−Y−S(配列番号20)または
・S−Y−D−Y−S−Y−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S(配列番号21)
を有していてもよい。
・該CD4受容体由来ペプチドは、配列番号1および配列番号2の配列からなる群から選択され、
・該リンカーは、CO−(CH2O)2CH2NHCO(CH2)2−ピロリジニル−2,5−ジオンであり、
・該有機分子は、S−(YSO3−D−YSO3−S)n、S−(YSN−D−YSN−S)n、S−(pF−D−pF−S)n、S−(Asu−D−Asu−S)nおよびS−(Y−D−Y−S)nからなる群から選択される配列、特に、S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S(配列番号4)、S−YSN−D−YSN−S−YSN−D−YSN−S−YSN−D−YSN−S(配列番号5)、S−pF−D−pF−S−pF−D−pF−S−pF−D−pF−S(配列番号6)、S−Asu−D−Asu−S−Asu−D−Asu−S−Asu−D−Asu−S(配列番号7)、S−Y−D−Y−S−Y−D−Y−S−Y−D−Y−S(配列番号8)からなる群から選択される配列を有するアニオン性ポリペプチドを含んでなり、該配列は、式A−Z(式中、Aは−NHCO(CH2)3NH−CO(CH2)2−であり、Zはチオール基である)の分子基によって該リンカーと結合している。
a.前記に定義された一般配列(I)のminiCD4ペプチドを、2つの活性基を有する二官能性化合物と接触させ、その結果、その2つの活性基のうちの一方が、一般配列(I)中に存在するアミノ酸残基Lysの遊離アミノ基(−NH2)と共有結合を形成し、該二官能性基のもう一方の活性基を有する活性化型ペプチドを得る工程、および
b.工程(a)で得られた活性化型ペプチドを、チオール基(SH)が保護チオール基によって保護されているチオール基を有する前記に定義された官能基を有する有機分子と接触させ、その結果、該活性化型ペプチドの活性基が、該有機分子の保護されているまたは保護されていない官能基と共有結合を形成し、コンジュゲート分子を得る工程
を含むことを特徴とする。
のCD4受容体由来ペプチドをN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)と接触させ、一般配列(III)のCD4受容体由来ペプチドのN末端にTPAを組み込むことからなる。
1.1.式H−γ−Abu−SXDXSXDXSXDXS−OH(式中、X=YSO3(P3YSO3)、Y(P3Y)、Asu(P3Asu)またはpF(P3pF));H−γ−Abu−SY SO3 DY SO3 SY SO3 DYSYDYS−OH(Nter3スルフェート);H−γ−Abu−SYDYSYDY SO3 SY SO3 DY SO3 S−OH(Cter3スルフェート);およびH−γ−Abu−(Glu) 13 −OH(E13)(式中、γ−Abu:NH 2 −(CH 2 ) 3 −CO)のペプチドの合成
次の実施例で、式H−γ−Abu−SXDXSXDXSXDXS−OH(式中、X=YSO3(P3YSO3)、Y(P3Y)、Asu(P3Asu)またはpF(P3pF));H−γ−Abu−SYSO3DYSO3SYSO3DYSYDYS−OH(Nter3スルフェート);H−γ−Abu−SYDYSYDYSO3SYSO3DYSO3S−OH(Cter3スルフェート);H−γ−Abu−(Glu)13−OH(E13)(式中、γ−Abu:NH2−(CH2)3−CO)の修飾ペプチドの合成を記載する。この式において、本発明のアニオン性ペプチド(ペプチドE13を除く)はSXDXSXDXSXDXS−OH(配列番号19)(式中、Xは上記の通りである(同一であるかまたは異なる))に相当する。
P3YSO3(配列番号14):NH2−(CH2)3−CO−S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S
P3Y(配列番号15):NH2−(CH2)3−CO−S−Y−D−Y−S−Y−D−Y−S−Y−D−Y−S
P3pF(配列番号16):NH2−(CH2)3−CO−S−pF−D−pF−S−pF−D−pF−S−pF−D−pF−S
P3Asu(配列番号17):NH2−(CH2)3−CO−S−Asu−D−Asu−S−Asu−D−Asu−S−Asu−D−Asu−S
E13(配列番号18):NH2−(CH2)3−CO−EEEEEEEEEEEEE
Nter3スルフェート(配列番号20):NH2−(CH2)3−CO−S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−Y−S−Y−D−Y−S
Cter3スルフェート(配列番号21):NH2−(CH2)3−CO−S−Y−D−Y−S−Y−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−Sである。
樹脂はRAPP Polymere GmbH社から購入した。Fmoc AA、HATU、NMP、DMF、TFAはApplied Biosystems社製、ピペリジンはSigma社製であった。Fmoc−Tyr(SO3.NnBu4)−OHおよびFmoc−γ−アミノブチリック−OH(γ−Abu)はNovabiochem社製、(S)−Fmoc−2−アミノ−オクタン二酸−8−ter−ブチルエステル(Asu)はPolypeptides社製、Fmoc−L−4(O−tブチルカルボキシメチル)−Phe−OH(pF)はAnaspec社製であった。HPLCグレード酢酸トリエチルアミンバッファーはGlenResearch社製であった。N−スクシンイミジル−S−アセチルチオプロピオネート(SATP)はPierce社製であった。
ペプチドは、Applied社製433型ペプチドシンセサイザーにおいて、H−Ser(tBu)−2−ClTrt−PS樹脂(100μmol;0.78mmol/g)上で合成した。E13ペプチドは、Fmoc−Glu(tBu)−PHB−PS樹脂(100μmol;0.61mmol/g)上で合成した。鎖の伸長は10当量のFmocアミノ酸およびHATU/DIEAによる活性化を用いて行った。TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)によって室温で1時間半処理することによりペプチドを樹脂から切り出した(ただし、硫酸化ペプチドは4℃(氷浴)で行った)。冷ジエチルエーテル沈殿により粗ペプチドを単離し、3%NH4OHを加えることによってそれらを水に溶解させた(ただし、硫酸化ペプチドは100mM炭酸水素アンモニウムバッファーにすぐに溶解した)。凍結乾燥後、50mM NEt3−AcOH水溶液(硫酸化ペプチドおよびE13ペプチドの場合には100mM)と、溶出剤としてCH3CNを使用したC18 RP−HPLCによって粗ペプチドを精製した。精製ペプチドは、質量分析(Waters社製ionspray Q−TOF−micro)によって確認し、アミノ酸分析(Hitachi社製L−8800形装置)によって定量した。ペプチド純度は、20分間の50mM NEt3−AcOH水溶液中CH3CNの直線勾配を用いた分析用C18 RP−HPLC(Waters社製Symetry C18−300Å、3.5μm、2.1×100mmカラム、流速0.35ml/分)によって制御した。
ペプチドを100mMリン酸ナトリウムバッファーpH8.2に溶解した(終濃度1mM)。40分間にわたって10当量のSATP(DMSO中で0.26M)を段階的に添加することによってS−アセチルチオプロピオネート基を導入した。1時間半後、20分間の50mM NEt3−AcOH水溶液中CH3CNの直線勾配を用いたC18 RP−HPLC(C18−300Å、5μm、10×250mmカラム、流速6ml/分)によってS−アセチルチオプロピオネートペプチドを精製した。SATP誘導ペプチドの純度は、20分間の50mM NEt3−AcOH水溶液中CH3CNの直線勾配を用いた分析用C18 RP−HPLC(Waters社製Symetry C18−300Å、3.5μm、2.1×100mmカラム、流速0.35ml/分)によって制御した。
本発明のmini−CD4ペプチドは、WO2009/098147およびNature Chemical Biology, 2009, 5(10), 743-748に開示されているように得られる。
Mini−CD4−PEO2−マレイミド=mini−CD4+リンカー
10mgのmCD4(MW:2897;3.4mmol)のH2O(1ml)溶液を1mlのリン酸バッファー0.1M pH8で希釈した。20μlのDMSO中でこの不透明な溶液に、4.5mgのNHS−PEO2−マレイミド(MW:325;13.8mmol;4当量)を撹拌しながら加えた。10分後に、出発材料の85%(HPLC)がマレイミド誘導体に変換された。マレイミド基のpH8での安定性が低いため、TFA0.08%水溶液中10%CH3CNでキャリブレーションを行ったSepaK C18カラムにカップリング反応物を直接注入した。マレイミド誘導体は50%CH3CNで溶出された。凍結乾燥後、その化合物をさらにセミ分取カラムで精製した。
SATPペプチドを100mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.2に溶解した(終濃度1mM)。100mMリン酸ナトリウムバッファー中100当量の0.5M NH2OH,HCl(pHは4N NaOHにより7.2に調整した)を加えた。HPLCによりチオール官能基の脱保護をモニタリングした。30分後、H2O中の0.3当量のmCD4−Mal(1.5mM)を加えた。30分後、20分間の50mM NEt3−AcOH水溶液中CH3CNの直線勾配を用いたC18 RP−HPLC(C18−300Å、5μm、10×250mmカラム、流速6ml/分)によってmCD4−ペプチドコンジュゲートを精製した。mCD4−ペプチドコンジュゲートは、20分間の50mM NEt3−AcOH水溶液中CH3CNの直線勾配を用いた分析用C18 RP−HPLC(Waters社製Symetry C18−300Å、3.5μm、2.1×100mmカラム、流速0.35ml/分)、ネガティブモードでの質量分析によって制御し、アミノ酸分析によって定量した。
2.1.プロトコール
X4型分離株(gp120 MN)およびR5型分離株(gp120 YU2)を由来とする、2つの異なるgp120を使用した。異なる分子の、種々の受容体または共受容体とのgp120相互作用を阻害する能力は、表面プラズモン共鳴(Biacore)によって測定される。
mCD4−P3Y SO3 はgp120/mCD4複合体におけるmAb17b結合を十分に阻害する。
3.1.プロトコール
抗ウイルス実験は、WO/2009/098147およびNature Chemical Biology, 2009, 5(10), 743-748に記載されている通りに行った。
単独で使用した場合、アニオン性ペプチドの中では、試験した最大濃度(500nM)で抗ウイルス活性を示したものはなかった。しかしながら、mCD4とコンジュゲートを形成している場合、それらはLAI株および/またはBa−L株に対して阻害活性を示し、50%阻害をもたらす有効量(ED50)は、mCD4−P3YSO3については0.5nM程度の低値であって、mCD4−HS12についての1.4nMとよい比較対照となる(下表4を参照)。
4.1.プロトコール
抗ウイルスアッセイを、92UG029、SF162、92US723、96USHIPS4、92HT599および98IN017を含む、一連のより臨床上関連のある初代株まで拡大した。
下の表5に示すように、mCD4−P3YSO3は高レベルの抗ウイルス活性を示し、ウイルス5株についてはED50が0.2〜1.2nMの範囲にあり、クレードCウイルスであるHIV−1 98IN017については29nMであるという特徴を示している。LAI株およびBa−L株に関しては、mCD4またはP3YSO3は低い活性しかないかまたは不活性であり、カップリング戦略によって非常に強い相乗作用がもたらされたことがさらに立証されている。それらの分子の中では、1μMまで細胞毒性を示したものはなかった。
5.1.プロトコール
HIV LTRの制御下でルシフェラーゼ(Luceriferase)を発現するTZN−bl細胞を使用した。これらの細胞は高レベルのCD4およびCCR5を発現し、HIV−1/−2およびSIVに感染しやすい。これらの細胞が感染すると、ウイルスのTatによりルシフェラーゼの転写が誘導される。Lucシグナルは感染の量に比例する。試験対象の化合物(mCD4、mCD4−HS12またはmCD4−P3YSO3)の連続希釈物を細胞に加え、続いて、ウイルスを加える。48時間後に、得られたLucシグナルを読み取る。
得られた結果を下の表6に示す。
この研究によって、アニオン性ポリペプチドと結合している3kDaのCD4模倣体を含んでなる比較的小さな合成分子は、CD4と、mAbを認識する共受容体結合部位とを含むいくつかの大きなgp120リガンドを効果的に模倣し得ることが示される。注目すべきことには、本発明に記載したコンジュゲートはR5指向性HIV−1とX4指向性HIV−1の両方を中和するが、CCR5特異的アンタゴニストの効力からの大きな利益は、CXCR4を利用するウイルス株の出現によって危険にさらされる可能性があり、それに対する阻害剤はまだ得られていない。
Fmoc:9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
DMF:ジメチルホルムアミド
HATU:N[(ジメチルアミノ)−1H−1,2,3−トリアゾロ[4,5−b]ピリジン−1−イルメチレン]−N−メチルメタンアミニウムのヘキサフルオロホスフェートN−オキシド
DIEA:ジイソプロピルエチルアミン
SPDP:N−スクシンイミジル−3(2−ピリジルジチオ)プロピオネート
TFA:トリフルオロ酢酸
EDT:エタンジチオール
TIS:トリイソプロピルシラン
DTT:1,4−ジチオトレイトール
MPLC:中圧液体クロマトグラフィー
ES+MS:エレクトロスプレー質量分析、ポジティブモード
GSH:還元型グルタチオン
GSSG:酸化型グルタチオン
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
RP−HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
SMPH:スクシンイミジル−6−[β−マレイミドプロピオンアミド]ヘキサノエート
SATP:N−スクシンイミジル−S−アセチルチオプロピオネート(proprionate)
RT:室温
Rt:保持時間
Cbz:ベンジルオキシカルボニル
pMBn:p−メトキシベンジル
Bn:ベンジル
Ac:アセチル
Me:メチル
Et:エチル
eq:当量
HRMS:高分解能質量スペクトル
ESI:エレクトロスプレーイオン化
LC−ESI−TOF−MS:液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析
LCMS:液体クロマトグラフィー/質量分析
DMSO:ジメチルスルホキシド
Claims (14)
- リンカーによって有機分子と結合しているCD4受容体由来ペプチドを含んでなるコンジュゲート分子であって、
該CD4受容体由来ペプチドは、次の一般配列(I):
・P1は3〜6個のアミノ酸残基を表し、
・P2は2〜4個のアミノ酸残基を表し、
・P3は6〜10個のアミノ酸残基を表し、
・XaafはN−アセチルシステイン(Ac−Cys)またはチオプロピオン酸(TPA)を表し、
・XaagはAlaまたはGlnを表し、
・XaahはGlyまたは(D)AspまたはSerを表し、
・XaaiはSerまたはHisまたはAsnを表し、
・Xaajはビフェニルアラニン(Bip)、フェニルアラニンまたは[β]−ナフチルアラニンを表し、
・XaakはThrまたはAlaを表し、
・XaalはGly、ValまたはLeuを表し、かつ
・Xaamは−NH2または−OHを表し、
P1、P2およびP3中のアミノ酸残基は天然または非天然の、同一または異なる残基であり、P1、P2およびP3の該残基は総てLys残基とは異なり、P1、P2およびP3は共通または非共通の配列を有する)
を含んでなり、かつ、
該有機分子は、
・S−(X−D−X−S) n の配列(式中、nは、1〜5の間に含まれる整数を表し、Sはセリンを表し、かつ、Dはアスパラギン酸を表し、かつ、Xは、チロシン、スルホチロシン、チロシンスルホネート、アミノスベリン酸およびp−カルボキシメチルフェニルアラニンからなる群から選択され、かつ、個々のX基は同一であるかまたは異なっている)を有するアニオン性ポリペプチド、
・分子基A−Z
(式中、
Aは、式−CO(CH2)3NH−CO(CH2)2−、−CO(CH2)p−NH−CO−(CH2)q−、−CO(CH2−CH2)−(O−CH2−CH2)p−NH−CO−(CH2)q−、−CO(CH2)p−NH−CO−(CH2−CH2−O)q−(CH2−CH2)−および−CO(CH2−CH2)−(O−CH2−CH2)p−NH−CO−(CH2−CH2−O)q−(CH2−CH2)−(式中、pは、1〜10の間に含まれる整数を表し、qは、1〜10の間に含まれる整数を表し、1位のカルボニル基はアニオン性ペプチドのN末端と結合している)の群の中から選択される基を含んでなり、
Zはハロゲン原子、チオールまたはマレイミド基を表す)、
を含んでなり、
該アニオン性ポリペプチドは、式A−Zの該分子基によってリンカーと結合しており、該リンカーは、その一方の末端で、該CD4受容体由来ペプチドの一般配列(I)中に存在するアミノ酸残基Lysの遊離アミノ基(−NH2)と共有結合し、その他方の末端で、該有機分子のZ基と共有結合している、コンジュゲート分子。 - Aが式−CO(CH2)3NH−CO(CH2)2−の基を表す、請求項1に記載のコンジュゲート分子。
- 一般配列(I)のCD4受容体由来ペプチドの配列が、配列番号1および配列番号2の配列からなる群から選択される、請求項1または2に記載のコンジュゲート分子。
- 前記アニオン性ポリペプチドが13個のアミノ酸からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
- 前記アニオン性ポリペプチドが、S−X−D−X−S−X−D−X−S−X−D−X−S(配列番号19)の配列を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
- 個々のX基が同一である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
- Xはスルホチロシンである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
- 前記アニオン性ポリペプチドが、S−(Y−D−Y−S)n、S−(YSO3−D−YSO3−S)n、S−(YSN−D−YSN−S)n、S−(pF−D−pF−S)nおよびS−(Asu−D−Asu−S)n(式中、nは、1〜5の間に含まれる整数を表し、Sはセリンを表し、Dはアスパラギン酸を表し、Yはチロシンを表し、YSO3はスルホチロシンを表し、YSNはチロシンスルホネートを表し、pFはp−カルボキシメチルフェニルアラニンを表し、Asuはアミノスベリン酸を表す)からなる群の中で選択される配列を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
- 前記アニオン性ポリペプチドが、S−Y−D−Y−S−Y−D−Y−S−Y−D−Y−S(配列番号8)、S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S(配列番号4)、S−YSN−D−YSN−S−YSN−D−YSN−S−YSN−D−YSN−S(配列番号5)、S−pF−D−pF−S−pF−D−pF−S−pF−D−pF−S(配列番号6)、S−Asu−D−Asu−S−Asu−D−Asu−S−Asu−D−Asu−S(配列番号7)、S−YSO3−D−YSO3−S−YSO3−D−Y−S−Y−D−Y−S(配列番号20)およびS−Y−D−Y−S−Y−D−YSO3−S−YSO3−D−YSO3−S(配列番号21)(式中、Sはセリンを表し、Dはアスパラギン酸を表し、Yはチロシンを表し、YSO3はスルホチロシンを表し、YSNはチロシンスルホネートを表し、pFはp−カルボキシメチルフェニルアラニンを表し、Asuはアミノスベリン酸を表す)からなる群の中で選択される配列を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子と薬学的に許容可能なビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
- エイズの治療に使用するための、請求項12に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子の製造方法であって、以下の工程:
a.請求項1に記載の一般配列(I)のCD4受容体由来ペプチドを、2つの活性基を有する二官能性化合物と接触させ、その結果、その2つの活性基のうちの一方が、一般配列(I)中に存在するアミノ酸残基Lysの遊離アミノ基(−NH2)と共有結合を形成し、該二官能性基のもう一方の活性基を有する活性化型ペプチドを得る工程、および
b.工程(a)で得られた活性化型ペプチドを、請求項1に記載の官能基を有する有機分子と、またはチオール基(SH)が保護チオール基によって保護されている、請求項1に記載のチオール基を有する有機分子に相当する有機分子と接触させ、その結果、該活性化型ペプチドの活性基が、該有機分子の保護されているまたは保護されていない官能基と共有結合を形成し、コンジュゲート分子を得る工程
を含んでなる、方法。
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