JP6029688B2 - 生菌を特異的に標識する方法 - Google Patents
生菌を特異的に標識する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6029688B2 JP6029688B2 JP2014552604A JP2014552604A JP6029688B2 JP 6029688 B2 JP6029688 B2 JP 6029688B2 JP 2014552604 A JP2014552604 A JP 2014552604A JP 2014552604 A JP2014552604 A JP 2014552604A JP 6029688 B2 JP6029688 B2 JP 6029688B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacteria
- group
- acid
- substituted
- monosaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/245—Escherichia (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/255—Salmonella (G)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
a)単糖化合物の類似体の少なくとも1つと共に上記試料の上記細菌をインキュベートするステップであって、
上記単糖は上記所定のカテゴリーの細菌の外膜のグリカンの内在性単糖残基であり、
上記内在性単糖残基はウロソン酸又はウロソン酸塩残基を含み、
上記単糖化合物の類似体は、標識化分子の第2の反応性基と反応できる第1の反応性化学基によって所定の位置が置換された修飾単糖であり、
上記所定の位置は、好ましくは、上記細菌の外膜のグリカン内に取り込まれた上記内在性単糖残基中の遊離型の基を有する位置である、ステップと、
b)上記第2の反応性基を有する上記標識化分子と上記細菌を接触させて、上記生菌の外膜のグリカン内に取り込まれた上記類似体残基の上記第1の反応性基を上記標識化分子の上記第2の反応性基と反応させるステップと
を含む方法を提供する。
c)上記細菌がその外膜のグリカンに結合した上記標識化分子を含むか否かを検出すること、及び/又は、上記標識化分子を含んでいる上記生菌を固体基材に固定化することにより、生菌を検出するステップ
を含む。
上記標識化分子は上記第2の反応性基を有する第1の分子であり、
該第1の分子は第2の分子及び/又は固体基材と反応又は結合でき、
好ましくは上記第2の分子は検出可能な物質を含んでいるか、及び/又は、上記固体基材に結合している。
ステップc)において、上記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に結合した上記生菌は、上記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質を、上記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質と特異的に反応又は結合する第2のリガンド又は第2の結合タンパク質である第2の分子と接触させることにより検出及び/又は固定化される。
・ビオチン(この場合、上記第2及び第3の結合タンパク質はそれぞれアビジン又はストレプトアビジン(ビオチンに対する抗体)である)、あるいは、
・アビジン又はストレプトアビジン(この場合、上記第2のリガンド及び上記第3の結合タンパク質はそれぞれビオチン(アビジン又はストレプトアビジンに対する抗体)である)、あるいは、
・第1の抗体(この場合、上記第2及び第3の結合タンパク質はそれぞれ上記第1の抗体に特異的な第2及び第3の抗体である)。
ステップc)において、上記第1のリガンドに結合した上記生菌は、上記第1のリガンドに特異的な抗体と上記細菌との反応によって検出され、上記抗体は検出可能な物質、好ましくは蛍光色素分子又は発光分子又は酵素を含む。
上記標識化分子は、検出可能な物質を含む検出可能な分子であり、
上記方法は、c)上記細菌がその外膜のグリカンに結合した上記検出可能な分子を含むか否かを検出することにより、生菌を検出するステップを含む、方法を提供する。
A、B及びCは、独立に、保護基で置換されているか又は置換されていないH、OH、NH2、OH及びNH2、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されているOH及びNH2であってもよく、
Dは、炭素数2〜4のアルキル鎖であって、その各炭素はOH又はNH2で置換されているか又は置換されておらず、該OH及びNH2は保護基で置換されているか又は置換されておらず、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されており、
A、B、C又はD基のうち少なくとも1つは上記第1の反応性基で置換されている)
Francisella tularensis type A)、オリエンティア・ツツガムシ(Orientia tsutsugamushi(リケッチア・ツツガムシ(Rickettsia tsutsugamushi))、リケッチア・アカリ(Rickettsia akari)、リケッチア・カナデンシス(Rickettsia canadensis corrig.)、リケッチア・コノリイ(Rickettsia conorii)、リケッチア・モンタネンシス(Rickettsia montanensis corrig.)、リケッチア・プロワゼキイ(Rickettsia prowazekii)、リケッチア・リケッチィ(Rickettsia rickettsii)、発疹熱リケッチア(リケッチア・チフィ(Rickettsia typhi))、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清型チフィ(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi(サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、シゲラ・ディゼンテリエタイプ1(Shigella dysenteriae type 1)及びペスト菌(エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis))から選択することができる。
上記細菌の所定のカテゴリーは上記レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)菌のカテゴリーであり、
上記細菌の外膜のLPS層の上記内在性単糖残基は、4−エピレジオナミン酸(5,7−ジアミノ−3,5,7,9−テトラデオキシ−D−グリセロ−D−タロ−ノヌ−2−ウロソン酸)若しくは4−エピレジオナミン酸塩残基、又は、レジオナミン酸(5,7−ジアミノ−3,5,7,9−テトラデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−ノヌ−2−ウロソン酸)若しくはレジオナミン酸塩残基であり、
上記単糖化合物の類似体は、それぞれ、置換4−エピレジオナミン酸若しくは4−エピレジオナミン酸塩化合物、又は、置換レジオナミン酸若しくはレジオナミン酸塩化合物であり、好ましくはその単糖環の3位、4位、5位、7位、8位及び9位、好ましくは5位、7位及び9位から選択される1つの位置が置換されている。上記内在性単糖の2位はLPSとの共有結合に関与している。
上記細菌の所定のカテゴリーは上記緑膿菌(シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))のカテゴリーであり、
上記細菌の外膜のLPS層の上記内在性単糖残基は、8−エピレジオナミン酸(5,7−ジアミノ−3,5,7,9−テトラデオキシ−L−グリセロ−D−ガラクト−ノヌ−2−ウロソン酸)若しくは8−エピレジオナミン酸塩残基、又は、プソイダミン酸(5,7−ジアミノ−3,5,7,9−テトラデオキシ−L−グリセロ−L−マンノ−ノヌ−2−ウロソン酸)若しくはプソイダミン酸塩残基であり、
上記単糖化合物の類似体は、それぞれ、置換8−エピレジオナミン酸若しくは8−エピレジオナミン酸塩化合物、又は、置換プソイダミン酸若しくはプソイダミン酸塩化合物であり、好ましくはその単糖環の3位、4位、5位、7位、8位及び9位、好ましくは5位、7位及び9位から選択される1つの位置が置換されている。上記内在性単糖の2位はLPSとの共有結合に関与している。
上記第2の反応性基R2は、アルキン基(−C≡C−)そのもの又はアルキン基を有する基、及び、アジド基(−N3)そのもの又はアジド基を有する基から選択され、
上記アジド反応性基を上記アルキン基(−C≡CH)と反応させてアジドアルキン付加環化を行うことが好ましい。
上記第1の反応性化学基によって所定の位置が置換されたウロソン酸又はウロソン酸塩化合物を含む上記単糖化合物の類似体と、
上記第1の反応性基と反応できる上記第2の反応性基を有する上記標識化分子と、
上記細菌の外膜のグリカン内に取り込まれた上記類似体残基の上記第1の反応性基を上記標識化分子の上記第2の反応性基と反応させるための反応体と、
上記所定のカテゴリーの細菌を増殖させることができ、好ましくは上記所定のカテゴリーの細菌の増殖に特異的である培養培地又はインキュベーション培地と
を備えるキットも提供する。
検出可能な物質、好ましくは蛍光色素分子又は発光分子又は酵素を含む上記検出可能な分子又は第2の分子、及び/又は、
上記標識化分子と特異的に反応若しくは結合できる上記第2の分子を含む固体基材
を備える。
上記第1の反応性基と反応できる上記第2の反応性基を有する上記検出可能な分子と、
・上記細菌を、上記単糖化合物の類似体、上記反応体及び上記検出可能な分子と共にインキュベートした後に可視化することができる固体媒体と
を備える。
アジド基又はアルキン基を含む上記第1の反応性基で置換されたデオキシオクツロソン酸又はデオキシオクツロソン酸塩化合物である上記単糖化合物の類似体と、
それぞれアルキン基又はアジド基を有する検出可能な分子の上記第2の反応性基と、
銅触媒及びトリス−トリアゾリルリガンドを含む上記反応体と
を備える。
5−アジド−5−デオキシ−D−アラビノフラノース前駆体6は、非常に直接的かつ簡潔で時間を節約できるストラテジーにより得ることができ、嵩高いトリチル基による一時的な保護を代わりに用いる必要がなかった。市販のD−アラビノースは、そのフラノース型の1位で直接的にトシル化され、さらにアセチル化され、アジドアニオンによって求核置換されたが、中間体を精製する必要はなかった。このステップにおいて、生成物はフラッシュクロマトグラフィーによって他の副生成物から容易に分離することができた。最終的な脱アシル化によって、全収率15%で6が得られた。
市販のD−アラビノース5(6.00g、40mmol)をピリジン(40ml)中で100℃で2時間加熱した。溶液を自然冷却させ、さらに塩化トシル(8.38g、44mmol;1.1当量)で処理し、16時間室温で撹拌した。次に無水酢酸(20ml)を添加した。アセチル化が完全に終わったことをTLCで確認した後、溶媒を留去し、残った痕跡量をトルエンと共に数回共留去した。残渣をDMF(100ml)に溶解させ、NaN3(5.20g、80mmol、2当量)を添加し、懸濁液を80℃で20時間加熱した。酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル=7:3)で精製した。最初の溶出物が所望の5−アジド−1,2,3−トリ−O−アセチル−D−アラビノフラノース(1.83g、15%、α/β=約2:1)であることが確認された。LRMS(ESI+)324.0[M+Na]+;HRMS(ESI+)[C11H15N3NaO7]+に対する計算値:324.0802,実測値:324.0802;1H NMR(CDCl3,360MHz)δ(ppm):6.41(d,0.33H,J1,2 3.5Hz,H−1β);6.23(d,0.67H,H−1α);5.40−5.37(m,1,34H,H−2β,H−3β);5.23(d,0.67H,J1,2 約1Hz,H−2α);5.06(d,0.67H,J3,4 4.6Hz,H−3α);4.30(ddd,0.67H,H−4β);4.16−4.10(m,0.33H,H−4β);3.69(dd,0.67H,J4,5a 3.1Hz,J5a,5b 13.5Hz,H−5aα);3.61(dd,0.33H,J4,5a 3.6,J5a,5b 13.1Hz,H−5aα);3.51−3.43(m,1H,H−5bα,H−5bβ);2.15,2.13,2.12,2.11,2.11,2.09(6s,18H,6CH3CO);13C NMR(CDCl3,62.5MHz)δ(ppm):170.3,170.0,169.1(OC(O)CH3),99.2(C−1α),93.5(C−1β),84.1(C−4α),80.8(C−4β),80.6(C−3α),77.4(C−2α),75.1(C−2β),74.8(C−3β),53.0(C−5β),51.3(C−5α),20.9,20.6,20.3(OC(O)CH3)。
5−アジド−5−デオキシ−D−アラビフラノース6(437mg、2.5mmol)の冷(4℃)水(2.1mL)溶液をオキサロ酢酸(528mg、4.0mmol)の水(2.5mL)溶液に添加し、溶液のpHをNaOH(10M)水溶液を添加して約11に調整した。2時間室温で撹拌した後、溶液を中和し(Dowex 50(H+))、濾過し、80℃で20分間加熱した。
一晩培養した培養物を、KDO−N3(4mM)を含有する新鮮培地で1000倍に希釈し(最終体積100μl)、細菌を37℃で12時間インキュベートした後、リン酸緩衝液(0.05M、pH7.5)を用いて遠心分離を室温下、13000×gで1分間行うことにより3回洗浄を行った。
細菌をカバーガラス上に接種した後、希釈したLB(1/10、リン酸緩衝液中)で作製した薄い(厚さ1mm)半固形状1%寒天パッドで覆った。CoolSNAP HQ 2カメラ(Roper Scientific、Roper Scientific SARL、フランス)と100×/1.4DLL対物レンズを備えたエピ蛍光自動顕微鏡(Nikon TE2000−E−PFS、Nikon、フランス)を用いて画像を記録した。励起光を120Wメタルハライドライトから放射し、適切なフィルターを用いてシグナルをモニターした。上述の方法[50,51]に従って、カスタム自動化スクリプト(Visual Basic)により、Metamorph 7.5(Molecular Devices、Molecular Devices France、フランス)の下でデジタル分析及び画像処理を行った。
細菌を含有する試料を、0.45mmの細孔径を有する25mm黒色ポリエステルメンブランフィルターを通して濾過した。ペトリ皿中、0.5%ピルビン酸塩又はカタラーゼ(酸素毒性作用から保護したもの)及びKDO−N3(4mM)を添加した650μlの栄養培地(nutritive broth)(対象とする細菌に応じて、異なる栄養培地を用いることができる)に浸したセルロースパッド(25mm)上に個々のメンブランを置いた。試料の入ったペトリ皿を37℃である一定時間(対象とする細菌によって異なる)インキュベートした。
本化合物9−アジド−5,7−ジアセトアミド−3,5,7,9−テトラデオキシ−D−グリセロ−D−タロ−ノヌ−2−ウロソン酸又はその塩(9−アジド−5,7−ジアセトアミド−3,5,7,9−テトラデオキシ−D−グリセロ−D−タロ−ノヌ−2−ウロソン酸塩)(化合物(Ib−1)の類似体)は以下のプロセスによって調製することができる[52]。
培養培地の種類は限定されないが、M9及びLBの大腸菌培養培地を用いると両方ともに首尾よく試験できた。
1.1)細菌株及び増殖条件
M9培地(カザミノ酸0.2%、グルコース0.2%、CaCl21mM、MgSO45mMを共に含む)又はルリア−ベルターニ(LB)培地で増殖させた大腸菌K12野生株[54]。細胞は、回転式振盪機(200rpm)内で37℃で増殖させた。
一晩培養した培養物をKDO−N3(1mM)を含有する新鮮培地で100倍に希釈し(最終体積200μl)、細菌を37℃で12時間インキュベートした後、リン酸緩衝液(0.05M、pH7.5)を用いて遠心分離を室温下、14000×gで2分間行うことにより3回洗浄を行った。
カバーガラス上に接種し、希釈したLB(1/10、リン酸緩衝液中)で作製した薄い(厚さ1mm)半固形状1%寒天パッドで覆った状態の細菌に対して銅クリックケミストリーを行った後、顕微鏡分析を行った。CoolSNAP HQ 2カメラ(Roper Scientific、Roper Scientific SARL、フランス)と100×/1.4DLL対物レンズを備えたエピ蛍光自動顕微鏡(Nikon TE2000−E−PFS、Nikon、フランス)を用いて画像を記録した。励起光を120Wメタルハライドライトから放射し、適切なフィルターを用いてシグナルをモニターした。カスタム自動化スクリプト(Visual Basic)により、Metamorph 7.5(Molecular Devices、Molecular Devices France、フランス)の下でデジタル分析及び画像処理を行った。
どの培養培地を用いてもKDOの同化は起こる。
両方ともに数が既知の、増殖することができる培養可能な大腸菌と死菌の大腸菌をKDO−N3に接触させた。KDO−N3は、大腸菌の生菌にのみ取り込まれていた。KDO−N3は大腸菌の全ての生菌に取り込まれていた。
1.1)細菌株及び増殖条件
大腸菌K12株は、回転式振盪機(200rpm)内でルリア−ベルターニ(LB)培地において37℃で増殖させた。120℃で15分間加熱した後に大腸菌K12株の死菌を得た。
1.3.1)全細菌スコアを付けるために、細胞を固定化し、パラホルムアルデヒド3%−DAPI2μg/mlの溶液で染色し、アイソポアポリカーボネートメンブラン(Milipore)上でろ過した。
2.1)1.3.1)に開示した全スコア付けによって算出した全細胞濃度は9×109 +/− 0.1×109cell/mlであり、1.3.2)に開示したコロニーの計数によって計数した培養可能な細胞の濃度は、4×109 +/− 0.15×109cfu/mlであった。これらの結果は、この試料に含まれる全細胞のうち44.5%(+/−4%)が培養可能な細胞であることを示している。
グラム陽性菌(枯草菌)及びグラム陰性菌(大腸菌)の混合物をKDO−N3に接触させた。培養可能なグラム陰性菌のみがKDO−N3で標識され、検出された。
1.1)細菌株及び増殖条件
大腸菌K12野生株をm−cherryを用いて蛍光性とし[55]、大腸菌K12 sodA−mCherry株[55]と枯草菌を回転式振盪機(200rpm)内でルリア−ベルターニ(LB)培地において37℃で増殖させた。
枯草菌及び大腸菌をLB培地で12時間増殖させた。その後、大腸菌(1.66×109cfu/ml)及び枯草菌(5.9×108cfu/ml)の培養可能な細胞の濃度を段落1.32)に開示した計数法により特定した。それによると、枯草菌では26%が培養可能な細胞、大腸菌では74%が培養可能な細胞であった。
Kdo−N3の同化の後、ビオチン−アルキンを用いてクリックケミストリーを行い、生存している大腸菌細胞を、蛍光色素であるAlexa Fluor A494と結合した抗ビオチン抗体を用いて検出した。培養可能な細胞の計数及びKdo陽性細胞の計数と比較することでわかるように、生存している大腸菌全てを以下の実験手順によって検出した。
大腸菌K12野生株を回転式振盪機(200rpm)内でルリア−ベルターニ(LB)培地において37℃で増殖させる。
一晩培養した培養物をKDO−N3(1mM)を含有する新鮮培地(最終体積200μl)で100倍に希釈した。細菌を37℃で12時間インキュベートし、リン酸緩衝液(0.05M、pH7.5)を用いて遠心分離を室温下、14000×gで2分間行うことにより3回洗浄を行った。CuSO4とTGTAをそれぞれ最終濃度2mM、4mMで含有するクリック用予混合物をリン酸緩衝液中で37℃において激しく振盪させながら一晩インキュベートした。次に、一晩インキュベートしたクリック用予混合物に、最終濃度がそれぞれ4mM、5mMのアミノグアニジン、アスコルビン酸ナトリウムを添加した。この「クリック用混合物」を洗浄後の培養物に添加し、ビオチン−アルキン(Carbosynth)(1〜100μg)を補充し、あるいは補充せずに、振盪下、37℃で1〜60分間インキュベートした。
銅クリックケミストリーの前後でいずれも全細菌スコアを付けるために、細胞を固定化し、パラホルムアルデヒド3%−DAPI2μg/mlの溶液で染色し、アイソポアポリカーボネートメンブラン(Milipore)上でろ過した。
[1]E.Sletten,C.R.Bertozzi,Acc.Chem.Res.2011,in press,DOI:10.1021/ar200148z;M.Boyce,C.R.Bertozzi,Nature methods 2011,8,638−642;D.H.Dube,K.Champasa,B.Wang,Chem.Commun.2011,47,87−101;S.T.Laughlin,C.R.Bertozzi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009,106,12−17;J.Du,M.A.Meledeo,Z.Wang,H.S.Khanna,V.D.P.Paruchuri,K.J.Yarema,Glycobiology 2009,19,1382−1401;S.R.Hanson,W.A.Greensberg,C.−H.Wong,QSAR Comb.Sci.2007,26,1243−1253.
Claims (22)
- 細菌を含有する試料中の所定のカテゴリーの細菌の生菌を特異的に標識する方法であって、
a)単糖化合物の類似体の少なくとも1つと共に前記試料の前記細菌をインキュベートするステップであって、
前記単糖は前記所定のカテゴリーの細菌の外膜のグリカンの内在性単糖残基であり、
前記内在性単糖残基はウロソン酸又はウロソン酸塩残基を含み、
前記単糖化合物の類似体は、標識化分子の第2の反応性基と反応できる第1の反応性化学基によって所定の位置が置換された修飾単糖であり、
前記所定の位置は、好ましくは、前記細菌の外膜のグリカン内に取り込まれた前記内在性単糖残基中の遊離型の基を有する位置である、ステップと、
b)前記第2の反応性基を有する前記標識化分子と前記細菌を接触させて、前記生菌の外膜のグリカン内に取り込まれた前記類似体残基の前記第1の反応性基を前記標識化分子の前記第2の反応性基と反応させるステップと
を含む方法。 - 増殖可能な細菌を特異的に標識するための請求項1に記載の方法であって、
前記細菌は培養培地でインキュベートされ、その培地中又は培地上で前記細菌は増殖可能である、方法。 - さらに、
c)前記細菌がその外膜のグリカンに結合した前記標識化分子を含むか否かを検出すること、及び/又は、前記標識化分子を含んでいる前記生菌を固体基材に固定化することにより、生菌を検出するステップ
を含む請求項1又は2に記載の方法。 - 前記標識化分子は、検出可能な物質を含む検出可能な分子、又は、検出可能な物質と反応若しくは結合できる検出可能な分子であるか、又は、
前記標識化分子は前記第2の反応性基を有する第1の分子であり、
該第1の分子は第2の分子及び/又は固体基材と反応又は結合でき、
好ましくは前記第2の分子は検出可能な物質を含んでいるか、及び/又は、前記固体基材に結合している、
請求項3に記載の方法。 - 細菌を含有する試料中の所定のカテゴリーの細菌の生菌を特異的に検出するための請求項4に記載の方法であって、
前記標識化分子は、検出可能な物質を含む検出可能な分子であり、
前記方法は、c)前記細菌がその外膜のグリカンに結合した前記検出可能な分子を含むか否かを検出することにより、生菌を検出するステップを含む、方法。 - 前記標識化分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド又は第1の結合タンパク質であり、
ステップc)において、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に結合した前記生菌は、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質を、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質と特異的に反応又は結合する第2のリガンド又は第2の結合タンパク質と接触させることにより検出及び/又は固定化される、
請求項4に記載の方法。 - 前記標識化分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド、好ましくはビオチンであり、
ステップc)において、前記第1のリガンドに結合した前記生菌は、前記第1のリガンドに特異的な抗体と前記細菌との反応によって検出され、前記抗体は検出可能な物質、好ましくは蛍光色素分子又は発光分子又は酵素を含む、
請求項6に記載の方法。 - 前記検出可能な物質は、蛍光又は発光によって検出可能な蛍光色素分子又は発光分子である、
請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記単糖化合物の類似体は、以下の式(I)又は(II)の1つで表されるウロソン酸又はウロソン酸塩である、
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
A、B及びCは、独立に、保護基で置換されているか又は置換されていないH、OH、NH2、OH及びNH2、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されているH、OH、NH2、OH及びNH2であってもよく、
Dは、炭素数2〜4のアルキル鎖であって、その各炭素はOH及びNH2で置換されているか又は置換されておらず、該OH及びNH2は保護基、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されているか又は置換されておらず、
A、B、C又はD基のうち少なくとも1つは前記第1の反応性基で置換されている) - 前記単糖の類似体は、置換オクツロソン酸若しくはオクツロソン酸塩化合物、又は、置換ノヌロソン酸若しくはノヌロソン酸塩化合物である、
請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - グラム陰性菌の生菌を特異的に検出するための請求項10に記載の方法であって、
前記細菌の所定のカテゴリーは前記グラム陰性菌のカテゴリーであり、
前記細菌の外膜のLPS層の前記内在性単糖残基は、デオキシオクツロソン酸又はデオキシオクツロソン酸塩残基であり、
前記単糖化合物の類似体は、置換デオキシオクツロソン酸又はデオキシオクツロソン酸塩化合物である、
方法。 - 前記デオキシオクツロソン酸又はデオキシオクツロソン酸塩化合物の類似体は、その単糖の3位、4位、5位、7位及び8位、好ましくは3位、7位及び8位から選択される1つの位置が前記反応性基によって置換されている、
請求項11に記載の方法。 - 前記式(I)又は(II)のデオキシオクツロソン酸又はデオキシオクツロソン酸塩化合物の類似体は、8位が前記第1の反応性基R1によって置換されており、前記式(I)中、D=−CHOH−CH2−R1、A=H、B=OH、C=OH、又は、前記式(II)中、D=−CHOH−CHOH−CH2−R1、A=H、B=OHである、
請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記グラム陰性菌は、大腸菌、ネズミチフス菌(サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium))、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)及び緑膿菌(シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))を含む、
請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。 - レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)菌の生菌を特異的に標識するための請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法であって、
前記細菌の所定のカテゴリーは前記レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)菌のカテゴリーであり、
前記細菌の外膜のLPS層の前記内在性単糖残基は、4−エピレジオナミン酸(5,7−ジアミノ−3,5,7,9−テトラデオキシ−D−グリセロ−D−タロ−ノヌ−2−ウロソン酸)若しくは4−エピレジオナミン酸塩残基、又は、レジオナミン酸(5,7−ジアミノ−3,5,7,9−テトラデオキシ−D−グリセロ−D−ガラクト−ノヌ−2−ウロソン酸)若しくはレジオナミン酸塩残基であり、
前記単糖化合物の類似体は、それぞれ、置換4−エピレジオナミン酸若しくは4−エピレジオナミン酸塩化合物、又は、置換レジオナミン酸若しくはレジオナミン酸塩化合物であり、好ましくはその単糖環の3位、4位、5位、7位、8位及び9位、好ましくは5位、7位及び9位から選択される1つの位置が置換されている、方法。 - 緑膿菌(シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))の生菌を特異的に標識する、好ましくは検出するための請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法であって、
前記細菌の所定のカテゴリーは前記緑膿菌(シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))のカテゴリーであり、
前記細菌の外膜のLPS層の前記内在性単糖残基は、8−エピレジオナミン酸(5,7−ジアミノ−3,5,7,9−テトラデオキシ−L−グリセロ−D−ガラクト−ノヌ−2−ウロソン酸)若しくは8−エピレジオナミン酸塩残基、又は、プソイダミン酸(5,7−ジアミノ−3,5,7,9−テトラデオキシ−L−グリセロ−L−マンノ−ノヌ−2−ウロソン酸)若しくはプソイダミン酸塩残基であり、
前記単糖化合物の類似体は、それぞれ、置換8−エピレジオナミン酸若しくは8−エピレジオナミン酸塩化合物、又は、置換プソイダミン酸若しくはプソイダミン酸塩化合物であり、好ましくはその単糖環の3位、4位、5位、7位、8位及び9位、好ましくは5位、7位及び9位から選択される1つの位置が置換されている、方法。 - 前記第1の反応性基は、アジド基そのもの又はアジド基を有する基、及び、アルキン基そのもの又はアルキン基を有する基から選択され、
前記第2の反応性基は、アルキン基そのもの又はアルキン基を有する基、及び、アジド基そのもの又はアジド基を有する基から選択され、
前記アジド反応性基を前記アルキン反応性基と反応させてアジドアルキン付加環化を行う、
請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。 - 前記反応は、トリス−トリアゾリルリガンド、好ましくはTGTAの存在下、銅触媒条件で行われる、
請求項17に記載の方法。 - 生菌の数を数えるための請求項2及び4及び8〜18のいずれか1項に記載の方法であって、
前記ステップa)のインキュベーション及び前記ステップb)の反応は固体基材、好ましくはメンブランフィルター上で行われ、それにより、もともと同じ細菌から増殖した培養細菌を1つの群にして、顕微鏡を用いて可視化することができ、前記検出可能な分子は前記顕微鏡を用いて可視化することにより検出することができる、方法。 - 請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法を行うためのキットであって、
前記第1の反応性化学基によって所定の位置が置換されたウロソン酸又はウロソン酸塩化合物を含む前記単糖化合物の類似体と、
前記第1の反応性基と反応できる前記第2の反応性基を有する前記標識化分子と、
前記細菌の外膜のグリカン内に取り込まれた前記類似体残基の前記第1の反応性基を前記標識化分子の前記第2の反応性基と反応させるための反応体と、
前記所定のカテゴリーの細菌を増殖させることができ、好ましくは前記所定のカテゴリーの細菌の増殖に特異的である培養培地又はインキュベーション培地と
を備えるキット。 - 請求項19に記載の方法を行うための請求項20に記載のキットであって、さらに、
前記第1の反応性基と反応できる前記第2の反応性基を有する前記検出可能な分子と、
前記細菌を、前記単糖化合物の類似体、前記反応体及び前記検出可能な分子と共にインキュベートした後に可視化することができる固体媒体と
を備えるキット。 - アジド基又はアルキン基を含む前記第1の反応性基で置換されたデオキシオクツロソン酸又はデオキシオクツロソン酸塩化合物である前記単糖化合物の類似体と、
それぞれアルキン基又はアジド基を有する検出可能な分子の前記第2の反応性基と、
銅触媒及びトリス−トリアゾリルリガンドを含む前記反応体と
を備える請求項20又は21に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12151622.3A EP2617833A1 (en) | 2012-01-18 | 2012-01-18 | A method for specifically detecting living bacteria |
EP12151622.3 | 2012-01-18 | ||
PCT/EP2013/050712 WO2013107759A1 (en) | 2012-01-18 | 2013-01-16 | A method for specifically labeling living bacteria |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015505248A JP2015505248A (ja) | 2015-02-19 |
JP6029688B2 true JP6029688B2 (ja) | 2016-11-24 |
Family
ID=47594722
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014552604A Active JP6029688B2 (ja) | 2012-01-18 | 2013-01-16 | 生菌を特異的に標識する方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9493809B2 (ja) |
EP (2) | EP2617833A1 (ja) |
JP (1) | JP6029688B2 (ja) |
CN (1) | CN104039977B (ja) |
CA (1) | CA2861134C (ja) |
ES (1) | ES2556996T3 (ja) |
HK (1) | HK1200501A1 (ja) |
PL (1) | PL2804953T3 (ja) |
PT (1) | PT2804953E (ja) |
WO (1) | WO2013107759A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2617833A1 (en) * | 2012-01-18 | 2013-07-24 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | A method for specifically detecting living bacteria |
EP2868750A1 (en) * | 2013-10-30 | 2015-05-06 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | A method for labeling specifically living bacteria comprising the use of modified monosaccharide compounds |
US10745735B2 (en) * | 2013-11-22 | 2020-08-18 | National Research Council Of Canada | Detection, isolation and identification of microorganisms |
CN104215620A (zh) * | 2014-09-30 | 2014-12-17 | 南京大学 | 一种检测活性污泥中革兰氏阴性菌相对含量的方法 |
EP3091082A1 (en) * | 2015-05-04 | 2016-11-09 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | A method for labeling specifically living bacteria comprising the use of modified non endogenous monosaccharide compounds |
EP3091081A1 (en) * | 2015-05-04 | 2016-11-09 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | A method for labeling specifically living microorganisms comprising the use of modified monosaccharide compounds |
EP3170832A1 (en) | 2015-11-17 | 2017-05-24 | Centre National De La Recherche Scientifique | Method of preparation of 6-azido-2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxy-d-mannose |
EP3170830A1 (en) * | 2015-11-17 | 2017-05-24 | Centre National De La Recherche Scientifique | New 5-azido-5-deoxy-2 :3-isopropylidene-d-arabinose compounds ; their method of manufacture and their use for the synthesis of ara-n3, kdo-n3 and 4ekdo-n3 |
US9834808B2 (en) | 2016-01-21 | 2017-12-05 | SeLux Diagnostics, Inc. | Methods for rapid antibiotic susceptibility testing |
ES2862345T3 (es) | 2016-01-21 | 2021-10-07 | Selux Diagnostics Inc | Métodos rápidos para probar la susceptibilidad antimicrobiana |
US10180689B2 (en) * | 2016-08-19 | 2019-01-15 | Omega Patents, L.L.C. | Vehicle system including security unit providing degradation commands via a vehicle data bus and related methods |
US10428357B2 (en) * | 2017-04-04 | 2019-10-01 | NNB Nutrition USA, LLC | Preparation of (R)-3-hydroxybutyric acid or its salts by one-step fermentation |
CN108865918B (zh) * | 2017-05-09 | 2022-01-07 | 中国科学院微生物研究所 | 一种标记存活的革兰氏阳性细菌及其细胞壁的方法 |
SG11202108422XA (en) * | 2019-02-20 | 2021-09-29 | Diamidex | Methods for labeling eukaryotic cells from a multicellular organism as well as for treating and/or diagnosing a cancer using modified monosaccharide compounds |
JP2022546416A (ja) | 2019-08-27 | 2022-11-04 | セルックス・ダイアグノスティクス・インコーポレイテッド | 抗菌薬感受性試験を実施するためのシステム及び方法 |
US11098377B1 (en) * | 2020-09-15 | 2021-08-24 | Nubiyota Llc | Systems and methods for characterizing compositions comprising bacterial populations |
JP7286070B2 (ja) * | 2021-01-31 | 2023-06-05 | 株式会社バランス・イースト | 検査システム、検査方法、プログラム、およびコンピュータが読み取り可能な記憶媒体 |
EP4198141A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-21 | C4Diagnostics | Method for detecting and optionally quantifying microorganisms |
EP4310192A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-24 | C4Diagnostics | Method of determining the existence and/or degree of resistance of microorganisms to antimicrobial agents |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5179018A (en) * | 1983-10-14 | 1993-01-12 | Centocor, Inc. | Mamalian monoclonal antibodies against endotoxin of gram-negative bacteria |
JP3270722B2 (ja) * | 1996-09-27 | 2002-04-02 | オルガノ株式会社 | 細菌の検出方法及び検出装置 |
CA2355292C (en) * | 1998-12-15 | 2007-02-06 | Exiqon A/S | Coupling of lipopolysaccharide-derived carbohydrates onto solid surfaces |
CN1877327A (zh) * | 2006-07-12 | 2006-12-13 | 南开大学 | 利用核糖体操纵子间区探针检测水生动物病原菌的方法 |
US7960139B2 (en) * | 2007-03-23 | 2011-06-14 | Academia Sinica | Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells |
JP5393771B2 (ja) * | 2008-04-04 | 2014-01-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 微生物の検出および計数 |
KR101042541B1 (ko) * | 2008-07-25 | 2011-06-17 | 한국생명공학연구원 | 외막소체를 생산하는 재조합 g(-) 박테리아 및 이를이용한 다가항원이 실린 외막소체의 제조방법 |
JP5645927B2 (ja) * | 2009-05-28 | 2014-12-24 | イーティーエイチ・チューリッヒ | N−グリカンコアβ−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用 |
FR2953519B1 (fr) * | 2009-12-08 | 2012-02-10 | Commissariat Energie Atomique | Nouveaux composes chimiques aptes a complexer au moins un element metallique et complexe de coordination a base de ces composes |
RS56572B1 (sr) * | 2010-06-03 | 2018-02-28 | Basf Se | Detekcija i brojanje mikroorganizama |
EP2617833A1 (en) * | 2012-01-18 | 2013-07-24 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | A method for specifically detecting living bacteria |
EP2868750A1 (en) * | 2013-10-30 | 2015-05-06 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | A method for labeling specifically living bacteria comprising the use of modified monosaccharide compounds |
US10745735B2 (en) * | 2013-11-22 | 2020-08-18 | National Research Council Of Canada | Detection, isolation and identification of microorganisms |
-
2012
- 2012-01-18 EP EP12151622.3A patent/EP2617833A1/en not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-01-16 EP EP13700708.4A patent/EP2804953B1/en active Active
- 2013-01-16 CN CN201380005270.5A patent/CN104039977B/zh active Active
- 2013-01-16 ES ES13700708.4T patent/ES2556996T3/es active Active
- 2013-01-16 PL PL13700708T patent/PL2804953T3/pl unknown
- 2013-01-16 WO PCT/EP2013/050712 patent/WO2013107759A1/en active Application Filing
- 2013-01-16 JP JP2014552604A patent/JP6029688B2/ja active Active
- 2013-01-16 CA CA2861134A patent/CA2861134C/en active Active
- 2013-01-16 PT PT137007084T patent/PT2804953E/pt unknown
- 2013-01-16 US US14/372,652 patent/US9493809B2/en active Active
-
2015
- 2015-01-28 HK HK15100927.1A patent/HK1200501A1/xx unknown
-
2016
- 2016-10-14 US US15/293,425 patent/US10571469B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-27 US US16/752,991 patent/US20200158727A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2617833A1 (en) | 2013-07-24 |
ES2556996T3 (es) | 2016-01-21 |
HK1200501A1 (en) | 2015-08-07 |
US20170030908A1 (en) | 2017-02-02 |
PL2804953T3 (pl) | 2016-04-29 |
CN104039977B (zh) | 2016-06-08 |
EP2804953A1 (en) | 2014-11-26 |
EP2804953B1 (en) | 2015-10-28 |
US20200158727A1 (en) | 2020-05-21 |
CA2861134C (en) | 2021-05-11 |
WO2013107759A1 (en) | 2013-07-25 |
JP2015505248A (ja) | 2015-02-19 |
CA2861134A1 (en) | 2013-07-25 |
PT2804953E (pt) | 2016-03-01 |
US20140363817A1 (en) | 2014-12-11 |
CN104039977A (zh) | 2014-09-10 |
US10571469B2 (en) | 2020-02-25 |
US9493809B2 (en) | 2016-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6029688B2 (ja) | 生菌を特異的に標識する方法 | |
Siegrist et al. | Illumination of growth, division and secretion by metabolic labeling of the bacterial cell surface | |
Smartt et al. | Pathogen detection using engineered bacteriophages | |
JP6708918B2 (ja) | 修飾単糖化合物の使用を含む生菌を特異的に標識する方法 | |
KR102524696B1 (ko) | 개질된 단당류 화합물의 사용을 포함하는 살아 있는 미생물을 특이적으로 표지하기 위한 방법 | |
AU2014353835B2 (en) | Detection, isolation and identification of microorganisms | |
Gautam et al. | Exterior design: strategies for redecorating the bacterial surface with small molecules | |
US11199542B2 (en) | Method for labeling specifically living bacteria comprising the use of modified non endogenous monosaccharide compounds | |
Liu et al. | Acceptor specificity and inhibition of the bacterial cell‐wall glycosyltransferase MurG | |
JP2008516625A (ja) | 細胞内ヌクレオチドアデニリルに基づく細胞数の検知及び計量のためのatp法、特に無atp菌の決定のための利用及び方法 | |
Zheng et al. | Shedding Light on Bacterial Physiology with Click Chemistry | |
JP5730305B2 (ja) | 新規ニトロレダクターゼ酵素基質 | |
CA2713155A1 (fr) | Procede de detection et/ou de quantification et/ou d'identification in vitro de bacteries dans un materiau biologique | |
Robertson et al. | Fatty Acids and Lipids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20151002 |
|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20151002 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20151002 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160113 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20160916 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160927 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161018 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6029688 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |