CN104039977A - 一种特异性地标记活细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在含有细菌的样品中特异性地标记给定分类的细菌的活细菌的方法，方法包括步骤：a)所述样品的所述细菌与至少一种单糖化合物类似物孵育，所述单糖是这些给定分类的细菌的外膜聚糖的内源单糖残基，所述内源单糖残基包含糖酸或糖酸盐残基，所述单糖化合物类似物是修饰的单糖，其在给定位置被能够与标记分子的第二反应基团反应的第一反应化学基团取代，所述给定位置优选是在并入所述细菌外膜聚糖的所述内源单糖残基中包含游离基团的位置，b)所述细菌和包含所述第二反应基团的所述标记分子接触，来产生并入到所述活细菌外膜的所述聚糖的所述类似物残基的所述第一反应基团和所述标记分子的所述第二反应基团的反应。

Description

一种特异性地标记活细菌的方法
技术领域
本发明涉及在含有细菌的样品中特异性地标记以及更尤其是特异性地检测活细菌的方法。
背景技术
检测活细菌的传统方法涉及在固态介质上培养细菌，并通过观察菌落进行计数。因培养需要很长时间，所以这样的方法并不快。另外，这些方法必须仅限于检测可培养的细菌，而非活细菌。的确，它的定量是不可靠的，因为已经有人指出在固态介质上一些细菌由于培养压力而被杀死。实际上，使用平板计数，微生物学家已经提出重要的假设，在某种意义上他们假设这种方法对细菌无有害作用。然而，从1950年代已经报道，当厌氧呼吸期间天然产生的活性氧类的清道夫(丙酮酸盐、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶…)被加入到琼脂板时，死细胞显然可以被再激活[40-48]。例如，各种压力，如饥饿、HOCl、热击和干燥，可能使细胞处于一个脆弱的生理状态，其中在恢复期间，大气中的氧气增强主要压力源(stressor)的毒性作用。
为了克服这些局限，已经提出一些间接的不基于培养的方法来评价细菌的生存能力，所有这些也都有优点和缺点。因此，尚没有被一致认同是适于所有情况的方法。这些方法通过两个标准之一评价生存能力、代谢活性的说明或细胞结构的维持。
在荧光技术使用之前，用于指示细胞代谢活性的方法包括使用微-放射自显影[25]，以及可诱导的酶活性[26]作为蛋白从头合成的指示剂，直接活力计数方法(DVC)[27]基于添加营养时的细胞扩大，和四唑盐的降低作为活性电子运输链的指示[28]。然而，这些方法有使用相关的缺点。DVC和四唑盐降低分析需要营养添加[28,29]，并因此依赖于有机体对所提供的营养的反应能力。呼吸测量也有其缺点。已经指出一些因素影响来自四唑盐还原的甲瓒沉积物的形成[29]，并且一个报道指出四唑盐5-氰基-2,3-二甲苯基四唑鎓氯化物，阻止细菌代谢[30]。
基于荧光染料的细胞染色的细胞生存能力分析也已经开发。这些方法通过稳定细胞结构的维持来评价生存能力。吖啶橙直接计数[31]和4P,6-二脒基-2-苯基吲哚染色[32]已经用作完整核酸维持的指示。罗丹明123已经广泛用于膜电位的指示剂，并随着流式细胞术的发展，已经有大量描述细胞生理状态特征的方法[33]。在有些有机体中这些染料的渗透性可能是一个问题。最近，一些新的分析已经用于评价细菌生存能力，这些描述代谢活性(如酯酶活性，其后是ChemChrome V6荧光探针)[34]、细胞完整性(如膜的完整性-BacLight Kit)、膜电位、细胞内pH[35]和最终的ATP[36]的一些方面。最后，自2002年以来涉及有活力的细菌病原体的基于信使RNA的检测和病原体的实时PCR定量的新方法已经开发出来[37]。
使用允许在单细胞水平检测有活力的细胞的方法，微生物学家已经提出一个重要的假设，在某种意义上他们假设这些细胞随时间将能够再次生长。然而，一些作者已经提出这个观察是细胞恶化的结果，并且有活力但是不能培养的细胞正在其死亡的过程中[40,49]。
结果，可以预期明显有活力的细胞数目高估了真正活细胞的数目(可培养，即能够随时间分裂/繁殖)。
然而很多这些方法具有以上所述的缺点，更明显的是非活的细菌保持着这些方法所涉及的有活力的细胞的某些特征，如酶活性。因此，这些方法涉及大量的假阳性检测和定量，并且检测到的和定量的细菌数目不够可靠。
本发明的目标是提供一种新的改进的间接的基于非培养的用于特异性地检测活细菌的方法，尤其是克服以上所述的缺点并提供更可靠的检测和可培养细菌精确数目的定量。
代谢的聚糖(glycan)标记[1]最近已经出现作为研究细菌表面聚糖的一种非常强大的工具，应用范围从活的多细胞有机体(如斑马鱼或小鼠)成像到细胞表面唾液酸糖蛋白相关的新陈代谢的鉴定[2]。这个策略依赖于携带生物正交化学报告分子(reporter)的修饰单糖被细胞生物合成机器的同化。这种报告分子代谢并入到聚糖可以通过与标记(如荧光探针)的化学连接而进一步被观察到。有些惊奇的是，研究主要集中于用常见的单糖衍生物标记脊椎动物聚糖[3]，如N-乙酰神经氨酸或其N-乙酰甘露糖胺前体、N-乙酰葡萄糖胺、乙酰半乳糖胺和海藻糖。
尽管单糖基本成分(building block)更高程度的多样性以及细菌-宿主相互作用和细菌毒力的必要作用，细菌多糖的体内结构修饰未得到良好的探索。细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。然而，革兰氏阳性菌被肽聚糖细胞壁所包裹，革兰氏阴性菌被嵌入其外膜的致密脂多糖(LPS)层所覆盖，其参与细胞的结构完整性，并常常被认为是致病因素。
包含于LPS中重复的聚糖聚合物被称为细菌的O抗原、O多糖、或O侧链。O抗原附着于核心寡聚糖，并包含LPS分子的最外面的结构域。O链的组合物存在株与株间的差异。例如，不同的大肠杆菌株产生超过160种不同的O抗原结构。O抗原暴露于细菌细胞最外面。核心结构域总是包含直接连接于脂质A的寡聚糖成分，并通常含有糖(如庚糖)和3-脱氧-D-甘露醇辛糖酸(也被称为KDO，酮基脱氧辛糖酸)。
脂多糖(LPS)是最重要的细胞表面多糖之一，因它在外膜的完整性中发挥关键的结构作用，也是宿主-病原体相互作用的重要媒介。
细菌外膜的其它细菌聚糖包含荚膜多糖(CPS)和糖蛋白，所述荚膜多糖为线性并由单糖重复亚单位组成。
糖蛋白已被指出对细菌感染期间的粘附和入侵是重要的。
尽管LPS在革兰氏阴性菌中出现作为特异和定义明确的聚糖代谢标记的兴趣靶，尝试依然限于将修饰的L-海藻糖衍生物引入到有目的的遗传改造的大肠杆菌株中[4]。然而，最近的方法呈现一些局限，因为：
(a)L-海藻糖一般不出现在所有革兰氏阴性菌的LPS中，但是发现于特异性株的O-抗原中[5]，
(b)游离的L-海藻糖不是正常大肠杆菌“从头合成”途径的中间体，因此不通过选择性途径的遗传工程引入(被称为“补救途径”)到兴趣有机体(代谢途径工程)，应该不被直接激活为核苷-糖供体[6]，以及
(c)一旦以GDP-Fuc的形式激活，随着反向从头合成途径，修饰的L-海藻糖类似物可能被转化为GDP-Man，并可能被进一步代谢为各种其它化合物，化学报告分子此时易于通过其它糖代谢(或之外)途径传播。
因而，如上所述细菌上的LPS标记需要细菌的遗传修饰，根据本发明它不能用在待测试的样品中检测任何活细菌的方法。
发明内容
根据本发明，已经研究了是否其它糖可用作至少一个给定分类的细菌的聚糖代谢修饰的靶，无需对所述细菌进行遗传修饰，利用代谢修饰是细菌生存能力的证据这一事实。
因此，本发明的方法主要包括，经由它们的膜聚糖(尤其是脂多糖)代谢修饰标记它们的细菌膜，对有活力的细菌进行检测，在图2B中所示意性显示的整体快速过程中，所述方法通过将携带生物正交化学报告分子的修饰糖组分并入到它们的膜聚糖(尤其是其LPS)中，从而对细胞表面进行修饰，并且使得能够利用化学反应(尤其是点击化学反应)对其进行检测，进一步允许检测化学报告分子。
根据本发明，已经发现包含糖酸或糖酸盐残基的修饰糖是尤其有利的，因为这样的残基可见于细菌膜的聚糖中，尤其是所有革兰氏阴性菌LPS中，并且它们能够以这样的形式被直接同化，即它们被并入所述聚糖(尤其是革兰氏阴性菌的LPS)中，然而大多LPS的其它糖来自不同的单糖前体。
糖酸(也称为酮醛糖酸，或aldulosonic(无对应中译文)酸)是酮糖家族的单糖，其在C-2上呈现酮的的功能，并在C-1上呈现羧酸的功能。辛糖酸和非糖酸见于多种天然聚糖中，包括不同形式的细菌聚糖(尤其是LPS、CPS、糖蛋白)。导致这些聚糖细化(elaboration)的生物合成途径通常涉及以游离的糖酸作为中间体，其然后以CMP-糖供体的形式被直接激活。这与很多其它单糖相反，其它单糖通常从一小部分简单单糖主要激活供体，以核苷二磷酸糖供体的形式直接被生物合成。
本发明提供一种用于在含有细菌的样品中特异性地标记给定分类的细菌的活细菌的方法，并入结合到所述活细菌外膜聚糖的第一反应化学基团。
更准确的，本发明提供一种用于在含有细菌的样品中特异性地标记给定分类的细菌的活细菌的方法，方法包括步骤：
a)所述样品的所述细菌和至少一种单糖化合物的类似物孵育，所述单糖是这种给定分类的细菌外膜聚糖的内源单糖残基，所述内源单糖残基包含糖酸或糖酸盐残基，所述单糖化合物的类似物是在给定位置被第一反应化学基团所取代的修饰单糖，所述第一反应化学基团能够与标记分子的第二反应基团反应，所述给定位置优选是在并入所述细菌外膜聚糖的所述内源单糖残基中包含游离基团的位置，
b)所述细菌与含有所述第二反应基团的所述标记分子接触，以产生并入到所述活细菌外膜的所述聚糖的所述类似物残基的所述第一反应基团和所述标记分子的所述第二反应基团的反应。
活细菌包含能够繁殖的细菌和不能繁殖的有活力的细菌。多数卫生法规涉及能够繁殖(尤其是能够在固态生长介质上繁殖)的细菌的数目，有利的是，更特别地，本发明提供一种用于特异性地标记能够繁殖的细菌的方法，其中所述细菌孵育在培养基中，在所述培养基之中(液态介质)或之上(固态介质)所述细菌能够繁殖。
优选，本发明的方法包括其它的步骤：
c)检测活细菌在检测中是否所述细菌包含结合到它们外膜聚糖的标记分子，和/或将携带所述标记分子的活细菌固定到固态基质上。
所述检测步骤c)可以在液态介质中或固态基质上进行。
更特别的是，所述标记分子是包含可检测物质的可检测分子，或所述标记分子能够与可检测物质反应或结合，或所述标记分子是携带所述第二反应基团的第一分子，所述第一分子能够与第二分子和/或固态基质反应或结合，优选所述第二分子包含可检测物质和/或所述第二分子结合到所述固态基质。
在第一实施方式中，所述标记分子可以是可检测分子，即存在于(consisting in)或携带可检测物质的分子，即能够被检测的物质(如荧光染料或发光底物)或酶(如过氧化物酶)，所述酶更加尤其在和共反应物反应之后被检测。
在其它具体的实施方式中，为了便于分离活细菌，当实施步骤b)时，所述标记分子可以结合到固态基质。
在其它具体实施方式中，所述标记分子是这样的分子，其是携带所述第二反应基团的第一配体或第一结合蛋白，以及在步骤c)中偶联到所述第一配体或第一结合蛋白的所述活细菌，通过所述第一配体或第一结合蛋白与第二分子接触、通过与所述第一配体或第一结合蛋白特异性地反应或结合，而被检测和/或被固定，其中所述第二分子是第二配体或第二结合蛋白。
然后，有利的是，所述第一或第二配体或结合蛋白可以和携带所述可检测物质(如荧光染料或发光底物或酶比如过氧化物酶)的第三结合蛋白反应或结合，所述第三结合蛋白特异性地结合到所述第一和/或第二配体或结合蛋白。通过所述第二配体或第二结合蛋白或第三结合蛋白检测所述可检测物质，使得能够放大所述可检测物质的信号。
更特别的是，第一配体或第一结合蛋白可以是：
-生物素，那么所述第二和第三结合蛋白分别是亲和素或链霉亲和素，和抗生物素的抗体，或
-亲和素或链霉亲和素，那么所述第二配体和所述第三结合蛋白分别是生物素，和抗亲和素的抗体或抗链霉亲和素的抗体，或
-第一抗体，那么所述第二和第三结合蛋白是特异于所述第一抗体的第二和第三抗体。
更特别的是，所述标记分子是第一配体，优选生物素，所述第一配体携带所述第二反应基团，以及在步骤c)中偶联到所述第一配体的所述活细菌通过所述细菌与特异于所述第一配体的抗体的反应得以检测，所述抗体携带可检测物质，优选荧光染料或发光分子或酶。
另一更特别的是，所述标记分子是第一配体，优选生物素，所述第一配体携带所述第二反应基团，以及在通过细菌DNA酶扩增、或通过所述细菌与第三结合蛋白的反应、与所述第一配体或第二结合蛋白特异性地反应或结合而进行所述活细菌的检测之前，在步骤c)中偶联到所述第一结合蛋白的所述活细菌通过所述第一配体与偶联至所述第二结合蛋白(优选亲和素或链霉亲和素)的固态基质(优选磁珠)的反应而得以固定，其中所述第三结合蛋白携带可检测物质，优选荧光染料或发光分子或酶，所述第三结合蛋白优选是特异于所述第一配体或第一结合蛋白的抗体。
这样的实施方式，其中所述活细菌被固定在所述固态基质上，使得能够将样品集中到所述细菌中，以及使得能够通过任何已知的方法定量所述活细菌，所述任何已知的方法包括DNA酶扩增如PCR，尤其是实时PCR或涉及采用标记抗体的免疫反应的方法，如ELISA测试。
更特别的是，本发明提供一种在含有细菌的样品中特异性地检测给定分类的细菌的活细菌的方法，所述标记分子是包含可检测物质的可检测分子，方法包括检测活细菌在检测中是否所述细菌包含结合至其外膜聚糖的所述可检测分子的步骤c)。
通过将所述单糖化合物的类似物的残基并入聚糖(尤其是活细菌外膜的脂多糖层)，步骤a)实现对所述分类的所有活细菌的特异性标记。
在合适的条件下以及存在合适的适当反应物时，通过所述聚糖(尤其是所述培养细菌的LPS)内的所述修饰单糖的所述第一反应基团与包含所述第二反应基团的所述标记分子进行反应，步骤b)将所述标记分子结合到并入活细菌所述聚糖(尤其是LPS)的类似物残基上。
在步骤a)中，优选所述内源单糖的所述给定位置是在并入细菌外膜所述聚糖内的所述内源单糖残基中含有游离基团的位置。“游离基团”的意思是所述聚糖(尤其是LPS)内未参与共价键的位置。
被代谢同化的修饰的糖酸或糖酸盐使得这种方法用于代谢活性/有活力的革兰氏阴性菌的快速检测-总体过程花费少于一天。取决于细菌株检测有活力的细菌正常需要2天到一个月以上，鉴于这个事实这种方法是非常强大的。
严重的病原体隐藏于革兰氏阴性菌中，快速鉴定有活力的细胞代表主要的卫生挑战。本发明因此提供一种简单的策略，通过将修饰的糖酸或糖酸盐残基代谢并入到它们的脂多糖中，然后用点击化学进行进一步的缀合，来标记代谢活性的革兰氏阴性细菌的细胞表面。
细菌细胞中外源糖酸类似物(如KDO类似物)的同化，以及其与内源对应物(如KDO)竞争并入到LPS，根本不是显而易见的，因这些分子是高度极化的并且不易于跨膜。尝试使用KDO类似物作为抗细菌物已经失败，由于这些类似物难于达到足够的细胞内浓度[10]。
更特别的是，步骤a)的孵育时间是从1hr到24hr，优选从2hr到12hr，以及单糖类似物化合物浓度是从10-8M到1M，更特别的是10-5M到1M，用于检测不多于1011细胞/ml的细菌浓度，更尤其是不多于109细胞/ml。
尤其是，所述单糖类似物是具有下式(I)或(II)之一的取代糖酸，或其糖酸盐：
其中，
-A、B和C可以独立地是被保护基团所取代或未取代的H、OH、NH2、OH和NH2，优选被烷基、羟烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基基团取代的OH和NH2，和
-D是C2至C4的烷基链，每个碳被或未被OH或NH2取代，被或未被其保护基团取代的OH和NH2，优选被烷基、羟烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基基团取代的OH和NH2，和
-A、B、C或D基团中的至少一个被所述第一反应基团取代。
这两个式，一个具有pyranosic(无对应中译文)环(I)，另一个具有furanosic(无对应中译文)环(II)，实际上相应于天然平衡的两类，然而一般来说主要是式(I)。
更特别的是，对于OH，保护基团可以优选烷基、羟烷基、酰基、或甲酰基基团。
更特别的是，对于NH2，保护基团可选自烷基、羟烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基基团。
NH2可以被一种或两种保护基团所保护，尤其是一个CH3基团和一个烷基、羟烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基基团，尤其是乙酰基(Ac)、亚氨代乙酰基(Am)、N-甲基-亚氨代乙酰基、N，N-二甲基-亚氨代乙酰基、甲酰基(Fo)、或羟丁酰基基团。
更特别的是，所述单糖化合物的类似物是取代的辛糖酸或辛糖酸盐化合物。
式(I)的辛糖酸或辛糖酸盐化合物包含作为D基团的C2烷基链。
式(II)的辛糖酸或辛糖酸盐化合物包含作为D基团的C3烷基链。
所述单糖化合物的类似物也可以是取代的非辛糖酸或非辛糖酸盐化合物。
式(I)的非糖酸或非糖酸盐化合物包含作为D基团的C3烷基链。
式(II)的非糖酸或非糖酸盐化合物包含作为D基团的C4烷基链。
内源的糖酸或糖酸盐残基中，尤其经常是如下的这些，其特异性地呈现在以下细菌分类中：
1-下式(I)的辛糖酸或辛糖酸盐残基，其中D是-CHOH-CH2OH(Ia-1，Ia-2)或-CHOH-CH2NH2(Ia-3)：
1.1)
·(Ia-1)Kdo(3-脱氧-D-甘露-辛-2-糖酸，或酮脱氧辛酸)，其特异于以下分类的细菌：所有革兰氏阴性菌。它可见于除了一些希瓦氏菌属(Shewenella)细菌以外的所有革兰氏阴性菌的LPS内核中，以及普罗维登斯菌属(Providencia)、阪崎肠杆菌属(Cronobacter)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)细菌的LPS O-抗原和也见于大肠杆菌(E.coli)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、根瘤菌(rhizobia)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、莫拉克斯氏菌(Moraxellanonliquefaciens)、类鼻疽杆菌(Burkholderia pseudomallei)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、卡瑞苯西思伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacaribensis)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)的一些荚膜多糖(CPS)。
1.2)
·(Ia-2)Ko(D-甘油-D-talo-辛-2-糖酸，或酮辛酸)，(Ia-2)可见于以下分类的细菌中：耶尔森氏菌属(Yersinia)、不动细菌属(Acinetobacter)、伯克氏菌(Burkholderias)。
1.3)
·(Ia-3)Kdo8N(8-氨基-3,8-双脱氧-D-甘露辛-2-糖酸)，(Ia-3)可见于希瓦氏菌：
2-下式的非糖酸或非糖酸盐残基，其中D是-CHNH2-CHOH-CH3(Ib-1、Ib-2、Ib-5、Ib-6)，-CHOH-CHOH-CH2OH(Ib-3，Ib-4)，-CHNH2-CHNH2-CH3(Ib-7)：
2.1)
·(Ib-1)(5,7-双氨基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2-糖酸)，(Ib-1)可见于嗜肺军团菌和Schewanella japonica(无对应中译文)的LPS中。
2.2)
·(Ib-2)(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-L-甘油-D-半乳糖-非-2-糖酸)，(Ib-2)可见于大肠杆菌株、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)、亚利桑那沙门菌(Salmonella arizonae)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)。
2.3)
·(Ib-3)Kdn(3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖-非-2-糖酸),(Ib-3)可见于臭鼻克雷白氏杆菌(Klebsiella ozaenae)和快生型中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)(以5-O-甲基Kdn的形式)的CPS中。包含多糖或寡糖的Kdn已见于革兰氏阳性菌的细胞壁中(放线菌目)。
2.4)
·(Ib-4)Neu(5-氨基-3,5-双脱氧-D-甘油-D-半乳糖-非-2-糖酸)，(Ib-4)可见于大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、非液化莫拉菌(Moraxella nonliquefaciens)和溶血曼海姆菌(巴氏杆菌)(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、无乳链球菌(Gram+)(Streptococcus agalactiae)、猪链球菌(Gram+)(Streptococcus suis)的CPS，以及细菌的LPS O-抗原，细菌包括蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、Escherichia albertii(无对应中译文)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌、枸橼酸杆菌(Citro-bacter)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)，以及几种病原体的LPS核心，病原体包括脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
2.5)
·(Ib-5)Pse(5,7二氨基-3,5,7,9-四脱氧-L-甘油-L-甘露-非-2-糖酸)(Ib-5)可见于绿脓杆菌、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、大肠杆菌、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)、识别假交替单胞菌(Pseudoalteromonasdistincta)、大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)和霍乱弧菌、大西洋假交替单胞菌的O-抗原(LPS)，以及Kribella spp.5(无对应中译文)(Gram+)和Actinoplanesutahensis(无对应中译文)(Gram+)的细胞壁，以及副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的LPS核心，以及革兰氏阳性空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)、幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)和肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)的鞭毛蛋白中，以及中华根瘤菌(Sinorhizobium bacteria)的CPS中。
2.6)
·(Ib-6)Leg(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-半乳糖-非-2-糖酸)，(Ib-6)可见于嗜肺军团菌、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、和杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)。
2.7)
·(Ib-7)：5,7,8-三氨基-3,5,7,8,9-五脱氧非-2-糖酸(C-8处的构型未知)可见于海洋屈挠杆菌(Tenacibaculum maritimum)(之前称为海岸屈挠杆菌(Flexibactermaritimus))。
在以上的式Ib-i中，其中i＝1到7，NH2基团可以是N-乙酰基(NHAc)的形式，或可以是N-亚胺代乙酰基(NHAm)、N-(N-甲基亚胺代乙酰基)、N-(N,N-二甲基亚胺代乙酰基)、N-甲酰(NHFo)、NH-羟丁酰基(NH-Hb)的形式，以及也可以是或不是N-甲基化。
优选地，所述给定分类的细菌包括革兰氏阴性菌，以及细菌外膜的所述LPS层的所述内源单糖残基是脱氧辛糖酸盐残基，以及所述单糖化合物的类似物是取代的脱氧辛糖酸或脱氧辛糖酸盐化合物(也称为酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate)，所谓的KDO)。
“革兰氏阴性菌”，它是指用所述KDO的方法不能标记革兰氏阳性菌和其它不携带相同内源单糖的革兰氏阴性菌。的确，所有革兰氏阴性菌LPS包含所述脱氧辛糖酸盐残基，然而它不包含在革兰氏阳性菌的聚糖中。
“脱氧辛糖酸盐(deoxyoctulosonate)”也被称为Kdo，是指式(Ia-1)的3-脱氧-D-甘露辛糖酸盐残基。
更特别的是，所述脱氧辛糖酸盐残基在选自单糖环的位置3、4、5、7或8优选3、7或8的位置上被所述反应基团取代。这个内源单糖的位置2参与和LPS的共价键。
所有革兰氏阴性菌包含所述脱氧辛糖酸盐残基，所述脱氧辛糖酸盐残基包含在至少一个残基的3、4、5、7或8这些位置中的一个上可被所述第一反应基团所取代的游离基团，以及除了一些希瓦氏菌以外，所有革兰氏阴性菌在至少一个残基的位置8上包含游离基团。
为了特异性地检测革兰氏阴性菌，其可以更有利的是在步骤a)和b)中使用特异于革兰氏阴性菌的培养基，因此不允许革兰氏阳性菌的培养。
更特别的是，所述脱氧辛糖酸盐残基是式(I)或(II)的化合物，更特别的是式(Ia-1)，所述化合物在位置8上被所述反应基团R1取代，其中式(I)中D＝-CHOH-CH2-R1、A＝H、B＝OH、C＝OH，或在式(II)中D＝-CHOH-CHOH-CH2-R1、A＝H、B＝OH。
更特别的是，具有内源并入的KDO的所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、嗜肺军团菌和绿脓杆菌。这些细菌在位置8上呈现游离的内源KDO。
具有至少一个游离糖酸或糖酸盐残基位置的其它革兰氏阴性病原菌可选自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、杆状巴尔通氏体(Bartonella bacilliformis)、五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana)(五日热罗卡利马体(Rochalimaea quintana))、巴尔通氏体属(Bartonella spp.)(罗卡利马体(Rochalimaea spp.))、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、副百日咳博德氏杆菌(Bordetella parapertussis)、百日咳博德氏杆菌(Bordetella pertussis)、短塔螺属(Brachyspira spp)、胎儿曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp)、人类心杆菌(Cardiobacterium hominis)、流产衣原体(Chlamydophila abortus)、豚鼠气衣原体(Chlamydophila caviae)、猫披衣菌(Chlamydophila felis)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)(肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae))、迟缓爱德华菌(Edwardsielia tarda)、埃立克体属(Ehrlichia spp)、侵蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)(脑膜炎败血黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)、脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium eningosepticum))、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(＝活动克雷伯氏菌(Klebsiella mobilis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、肠杆菌属(Enterobacter spp)、肠球菌属(Enterococcus spp)、土拉热弗朗西丝氏菌全北区亚种(Francisella tularensis subsp.holarctica)(“土拉热弗朗西丝氏菌古北变种”(“Francisella tularensis var.palaearctica”))、土拉弗朗西斯菌B型(Francisella tularensis type B)、坏死细梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、幽门弯曲菌(Campylobacter pylori)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella spp)、Legionellabozemanae corrig.(无对应中译文)(博兹曼英冠杆菌(Fluoribacter bozemanae))、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、军团菌属(Legionella spp)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、Leptospira interrogans sensu lato inclut Leptospiraalexanderi(无对应中译文)、博氏钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii)、Leptospirafainei(无对应中译文)、良吉氏钩端螺旋体(Leptospira inadai)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、科氏钩端螺旋体(Leptospira kirschneri)、野口氏钩端螺旋体(Leptospira noguchii)、圣地罗斯钩端螺旋体(Leptospira santarosai)、韦氏钩端螺旋体(Leptospira weilii)、摩氏摩根菌(Morganella morganii(摩干氏变形杆菌(Proteusmorganii))、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、Neorickettsia sennetsu(无对应中译文)(腺热埃里希氏体(Ehrlichiasennetsu)、腺热立克次体(Rickettsia sennetsu))、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、巴斯德菌属(Pasteurella spp)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas spp)、普氏菌属(Prevotella spp)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、彭氏变形杆菌(Proteus penneri)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)(雷特格氏变形杆菌(Proteus rettgeri))、普罗威登斯菌属(Providencia spp)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次体属(Rickettsia spp)、除了Orientia(Rickettsia)tsutsugamushi(无对应中译文)之外，痘立克次体(Rickettsia akari)、加拿大痘立克次体(Rickettsia canadensis)、斑疹热立克次体(Rickettsia conorii)、Rickettsia montanensis(无对应中译文)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)和斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、肠炎沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella enterica subsp.Arizonae)(亚利桑那沙门菌(Salmonella arizonae)、猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella choleraesuis subsp.arizonae))、肠炎沙门氏菌血清肠炎变种(Salmonellaenterica subsp.enterica sérovar Enteritidis)(肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis))、肠炎沙门氏菌血清甲型副伤寒变种(Salmonella enterica subsp.enterica sérovar ParatyphiA)(副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi))、乙型副伤寒变种(Paratyphi B)和丙型副伤寒变种(Paratyphi C)、Salmonella enterica subsp.enterica sérovar Typhimurium(无对应中译文)(鼠伤寒沙氏杆菌(Salmonella typhimurium))、鲍氏志贺菌(Shigellaboydii)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、除了1型、副痢疾杆菌(Shigella flexneri)、宋氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、“斑点病密螺旋体(Treponema carateum)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)”、“细弱密螺旋体(Treponema pertenue)”(“苍白密螺旋体细长亚种(Treponema pallidum subsp.pertenue)”)、密螺旋体属(Treponema spp)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血霍乱弧菌(vibrio parahaemolyticus)(＝Beneckea parahaemolytica(无对应中译文))、弧菌属(Vibrio spp)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、地中海热布氏杆菌(Brucella melitensis)(sensu stricto(无对应中译文))、流产地中海热布氏杆菌生化变种(Brucella melitensis biovarAbortus)(流产布氏杆菌(Brucella abortus))、犬属地中海热布氏杆菌生化变种(Brucella melitensis biovar Canis)(犬属布氏杆菌(Brucella canis)、猪属地中海热布氏杆菌生化变种(Brucella melitensis biovar Suis)(猪属布氏杆菌(Brucella suis))、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei))、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)(类鼻疽无色杆菌(Pseudomonaspseudomallei))、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)(鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci))、伯纳特氏立克次体(Coxiella burnetii)、土拉热弗朗西丝氏菌土拉热亚种(Francisella tularensis subsp.Tularensis)(“土拉热弗朗西丝氏菌欧亚变种”(“Francisella tularensis subsp.Nearctica”))、土拉热弗朗西丝氏菌美洲变种(Francisella tularensis biovar Tularensis)、A型土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis type A)、Orientia tsutsugamushi(无对应中译文)(恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi))、痘立克次体(Rickettsia akari.)、Rickettsia canadensiscorrig(无对应中译文)、康氏立克次体(Rickettsia conorii)、Rickettsia montanensiscorrig(无对应中译文)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、Salmonella enterica subsp.enterica sérovar Typhi(无对应中译文)(伤寒杆菌(Salmonella typhi)、1型痢疾志贺杆菌(Shigella dysenteriae type1)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)。
在另一个优选实施方式中，根据本发明的方法用于特异性地标记，优选检测，活嗜肺军团菌，以及所述给定分类的细菌是嗜肺军团菌的分类，以及细菌外膜所述LPS层所述内源单糖残基是4-epilegionaminic(无对应中英文)酸(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2-糖酸)或4-epilegionaminate(无对应中英文)残基或legionaminic(无对应中英文)酸(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-半乳糖-非-2-糖酸)或legionaminate残基，以及所述单糖化合物的类似物分别是取代的4-epilegionaminic酸或4-epilegionaminate化合物，或取代的legionaminic酸或legionaminate化合物，优选在选自单糖环位置3、4、5、7、8和9，优选5、7和9的一个位置上被取代。这个内源单糖的位置2参与和LPS的共价键。
优选，所述单糖化合物的类似物是式(I)的取代的4-epilegionaminic酸或4-epilegionaminate化合物，更特别的是(Ib-1)，或式(I)的取代的legionaminic酸或legionaminate化合物，更特别的是(Ib-6)，在位置9被所述反应基团R1取代，其中D＝-CHNH2-CHOH-CH2R1,A＝H,B＝OH和C＝NH2。
所述单糖化合物类似物的另一优选结构是式(I)的取代的4-epilegionaminic酸或4-epilegionaminate化合物，更特别的是(Ib-1)，或式(I)的取代的legionaminic酸或legionaminate化合物，更特别的是(Ib-6)，在位置5和7中的至少一个上被所述反应基团R1所取代，其中D＝-CHNHR2-CHOH-CH3、A＝H、B＝OH和C＝NHR3，其中R2和R3各自独立地是H或R1。
在另一个优选的实施方式中，根据本发明的方法用于特异性地标记，优选检测，活铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，以及所述给定分类的细菌是铜绿假单胞菌的分类，以及细菌外膜所述LPS层所述内源单糖残基是8-epilegionaminic(无对应中译文)酸(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-L-甘油-D-半乳糖-非-2-糖酸)或8-epilegionaminate(无对应中译文)残基，或pseudaminic(无对应中译文)酸(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-L-甘油-L-甘露-非-2-糖酸)或pseudaminate(无对应中译文)残基，以及所述单糖化合物的类似物分别是取代的8-epilegionaminic酸或8-epilegionaminate(无对应中译文)化合物，或取代的pseudaminic酸或pseudaminate化合物，优选在选自单糖环的位置3、4、5、7、8和9，优选5、7和9的一个位置上被取代。这个内源单糖的位置2参与和LPS的共价键。
优选，所述单糖化合物的类似物是式(I)的取代的8-epilegionaminic酸或8-epilegionaminate化合物，更特别的是(Ib-2)、或式(I)的取代的pseudaminic酸或pseudaminate化合物，更特别的是(Ib-5)，在位置9被所述反应基团R1所取代，其中D＝-CHNH2-CHOH-CH2R1，A＝H，B＝OH和C＝NH2。
所述单糖化合物类似物的另一个优选结构是式(I)的取代的8-epilegionaminic酸或8-epilegionaminate化合物，更特别的是(Ib-2)，或式(I)的取代的pseudaminic酸或pseudaminate化合物，更特别的是(Ib-5)，在位置5和7中的至少一个上被所述反应基团R1所取代，其中D＝-CHNHR2-CHOH-CH3、A＝H、B＝OH和C＝NHR3，其中R2和R3各自独立地是H或R1。
更特别的是，所述可检测物质是可通过荧光或发光被检测到的荧光染料或发光分子。
优选，所述第一反应基团R1选自存在于或携带叠氮基(-N3)的基团和存在于或携带炔基(-C≡C-)的基团，以及所述第二反应基团R2选自分别存在于或携带炔基(-C≡C-)和叠氮基(-N3)的基团，以及所述叠氮反应基团和所述炔基(-C≡CH)的反应是通过进行叠氮炔环化加成而实施的。
在催化剂铜存在时，叠氮炔环化加成是众所周知的所谓点击化学反应，其中所述叠氮基团与炔基基团反应得到三唑。
更特别的是，三–三唑配体优选TGTA存在时，反应是在铜催化的条件下实施的。
更特别的是，可检测分子是携带末端炔基的荧光团。
更特别的是，置换并入到细菌外膜LPS层的内源3脱氧-D-甘露辛糖酸的Kdo类似物，是Kdo-N3(8-叠氮-3,8-双脱氧-D-甘露-辛糖酸)类似物，其在三–三唑配体和携带末端炔基的Alexa标记荧光团分子存在下，与催化剂发生反应，从而进行所述荧光团和所述Kdo-N3的叠氮炔环化加成，其中三–三唑配体如TGTA(三((l-β-D-吡喃葡萄糖基)-lH-[l,2,3]-三唑-4-基)甲基)胺)或TBTA(三-[(l-苄基-lH-l,2,3-三唑-4-基)甲基]胺)。
其它合适的常用配体是：三(3-羟丙基三唑甲基)胺(THPTA)、2-(4-((双((l-叔丁基-lH-l,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-lH-l,2,3-三唑-l-基)乙磺酸(BTTES)、Tris((l-((O-乙基)羧甲基)-(l,2,3-三唑-4-基))甲基)胺、红菲绕啉二磺酸盐、或Tris(2-苯并咪唑基甲基)胺(53)。
其它反应基团和其它反应可能是，如：施陶丁格连接(第一反应基团＝叠氮，以及第二反应基团＝膦)、无铜点击化学(第一反应基团＝叠氮，以及第二反应基团＝受到限制的炔(环内炔))、羰基缩合(第一反应基团＝醛或酮，以及第二个反应基团＝酰肼或羟基胺)、His-标签(第一反应基团＝寡-组氨酸，以及第二反应基团＝镍-复合物或镍配体)、硫醇烯点击化学(第一反应基团＝硫醇，以及第二反应基团＝烯烃)、腈-氧化物-烯点击化学(第一反应基团＝腈氧化物或醛、肟、或氯化hydroxymoyl(无对应中译文)或氯肟，以及第二反应基团＝烯烃或炔烃)、腈亚胺-烯点击化学(第一反应基团＝腈亚胺或醛、腙、或腙酰氯或氯腙，以及第二反应基团＝烯烃或炔烃)、反电子需求的Diels-Alder连接(inverse electron demand Diels-Alder ligation)(第一反应基团＝烯烃，以及第二反应基团＝四嗪)，铃木－宫浦(Suzuki-Miyaura)偶联(第一反应基团＝芳基卤，以及第二反应基团＝芳基硼酸酯)。
在上述参与反应的基团的列表中，第一反应基团和第二反应基团可以被转置(permute)。
其它和更高的检测特异性可以在细菌样品与两种所述不同单糖类似物化合物和两种不同可检测分子的孵育中获得。
在本发明方法另一具体实施方式中，步骤a)的所述孵育和步骤b)的反应在膜过滤器上实施，从而源自经繁殖的相同起始细菌的培养细菌，被集合到一起并可以用显微镜观察，以及所述可检测分子可通过所述显微镜观察检测因此，可以由此定量可培养的细菌的数目。
在同化所述修饰单糖之前，这个实施方式使得能够过滤所述膜过滤器(如聚酯膜)上的受试样品，以避免由于同化期间的潜在生长而高估了有活力的细菌。事实上，当固定在这样膜顶部的细胞开始生长时，它们聚在一起并形成微菌落，因来自于相同单细胞菌落可以很容易地被检测到。因此，这使得能够通过数可培养的细菌来进行计数。
本发明还提供用于实施本发明方法的试剂盒，其包含：
-所述单糖化合物的类似物，其包含糖酸或糖酸盐化合物，糖酸或糖酸盐化合物在给定位置被所述第一反应化学基团所取代，和
-所述标记分子，其包含能够与所述第一反应基团反应的所述第二反应基团，和
-反应物，其用于产生并入到所述细菌外膜的所述聚糖的所述类似物残基的所述第一反应基团和所述标记分子的所述第二反应基团的反应，和
-允许所述给定分类的细菌生长的培养或孵育介质，优选特异于所述给定分类的细菌生长，和
优选，所述培养或孵育介质也包含增强和/或加速所述给定分类的细菌的生长速度和/或形成菌落的能力的试剂。更特别的是，孵育介质包含至少一种抗氧化剂如丙酮酸盐或过氧化氢酶。
更特别的是，在一个实施方式中，试剂盒也包含：
-所述可检测分子或携带可检测物质的所述第二分子，可检测物质优选荧光染料或发光分子或酶，和/或
-携带所述第二分子的固态基质，所述第二分子能够特异性地与所述标记分子反应或结合。
更特别的是，在一个实施方式中，本发明的试剂盒也包含：
-所述可检测分子，其包含能够与所述第一反应基团反应的所述第二反应基团，和
-固态介质，其允许在与所述单糖化合物的类似物、所述反应物和所述可检测分子孵育后，进行细菌的观察。
又一更特别的是，试剂盒包含：
-所述单糖化合物的类似物，其是被包含叠氮基或炔基的所述第一反应基团取代的脱氧辛糖酸或脱氧辛糖酸盐化合物，和
-可检测分子的所述第二反应基团，其分别携带炔基或叠氮基，和
-所述反应物，其包含铜催化剂和三-三唑配体。
附图说明
根据参照下面附图的以下详细描述，本发明的其它特征和优点将变得更加明显，其中：
-图1A显示大肠杆菌K12脂多糖主要成分的结构，其中KDO糖残基并入到IC中、OC(外核)和LA(脂质A)之间的革兰氏阴性菌的LPS内核中，显示O-抗原的锚定位置A和在位置8上KDO修饰B的可能位点；
Glc：D-葡萄糖；GlcN:2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖；KDO:3-脱氧-D-甘露-辛糖酸；Hep:L-甘油-D-甘露-庚糖；Gal:D-半乳糖；
-图1B显示KDO生物合成途径(KDO途径)；
-图2A显示用于这个实施例的分子(1＝KDO-N3，2＝TGTA，3＝A488-yne)；
-图2B显示大肠杆菌代谢LPS标记的示意性图示，其中1＝KDO-N3；
-图3A代表有代谢并入的KDO-N3(+KDO-N3)和无代谢并入的KDO(-KDO-N3)的大肠杆菌K12的照片，通过进行5min A488-yne-Cu(I)催化的点击化学后，显示前(灰色)和显示后(黑色)；
-图3B表示在有(灰色条)或没有(黑色条)KDO-N3加入时所产生并绘制的细菌荧光值的频率分布图，荧光任意单位(“a.u.f”)在横坐标的范围是从0到1300，以及相对频率(“r.f.”)的范围是从0到1；
-图3C是显示集中在大肠杆菌细胞表面的荧光照片，大肠杆菌通过进行5minA488-yne-Cu(I)催化的点击化学而得以标记，使用带有实验点扩散融合的理查德森-露西算法对图像进行去卷积；
-图4表示由各种细菌株所代谢并入的KDO-N3的检测照片，由各种细菌所代谢并入的KDO-N3通过进行60min的A488-yne-Cu(I)催化点击化学后得以显示。未添加KDO-N3的相差和荧光图像(左侧图板)；添加KDO-N3的相差和荧光图像(右侧图板)。图3A中比例尺为1μM(添加有KDO-N3(+KDO-N3)和未添加有KDO(-KDO-N3)的细菌)，通过进行5min A488-yne-Cu(I)催化的点击化学后，显示前(灰色)和显示后(黑色)；和
-图5表示各种细菌株代谢并入的KDO-N3的检测结果(照片和图)。通过60minA488-yne-Cu(I)催化的点击化学，对各种细菌株所代谢地并入的KDO-N3进行显示。添加有(灰色条)或未添加有(黑色条)KDO-N3所产生并绘制的细菌荧光值频率分布。
具体实施方式
以下描述是通过用修饰的KDO代谢修饰LPS内核来点击标记革兰氏阴性菌的细菌膜的说明性实施例的描述。
有活力的革兰氏阴性菌可以将修饰的KDO特异性地并入到它们的脂多糖，用生物正交化学报告分子装饰细胞表面。如图1所示意性显示的，在整体快速过程中，点击化学允许进一步标记有活力的细胞。
实施例1：8-叠氮基-3,8-双脱氧-D-甘露-辛糖酸(KDO-N3)的同化和革兰氏阴性菌的特异性检测
1)所有潜在靶中，3-脱氧-D-甘露-辛糖酸(KDO)好像是非常有吸引力的候选。事实上，KDO是LPS内核的特异性的和主要的成分，[7,8]并且长期以来被认为存在于几乎所有革兰氏阴性物种(及高等植物和藻类)的LPS中，其中至少一个残基直接连接到脂质A(图1A)。[9]由于它非常重要，KDO已经被认为是革兰氏阴性菌特征的决定因素，并且KDO途径被视为新抗菌剂开发的潜在靶。[10]这个途径中(图1B)，阿拉伯糖-5-P与PEP缩合形成KDO-8-P，然后其转化为游离的KDO，并在LPS细化之前进一步以CMP-KDO供体的形式被激活。
因为所有这些原因，已经寻找这种KDO途径作为LPS-特异性的途径是否能够足以容忍将修饰的KDO(如8-叠氮基-8-脱氧-KDO(1，图2A)并入到大肠杆菌LPS核心和潜在的其它革兰氏阴性菌。假设在途径中存在游离的KDO作为中间体，我们推测如果KDO的这种类似物的细胞渗透可以是足够的，[11]其之后能够潜在地被直接激活，部分置换内源KDO至LPS中，并通过叠氮-炔点击化学在细胞表面被得以检测(图2B)。[12]另外，通过生物正交叠氮基团对KDO的C-8位置的修饰应该通过KDO-8-P磷酸酶(3.1.3.45)阻止反向代谢，限制化学报告分子潜在扩散到其它的糖和代谢物中。
很多潜在的可以得到8-叠氮基-3,8-双脱氧-D-甘露-辛糖酸的多步合成策略中1,[13]这个化合物已经以直接的方式进行制备(方案1)[14]，所述方案改造自Ghalambor和Heath在1963年描述的直接KDO合成的方法。[15]即5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖[16](6)与草酰乙酸钠(7)缩合，在微酸的条件中脱羧后产生KDO-N3(1)，其作为其铵盐的形式被分离，产率为57％(86％，基于回收的6)。如此后所描述的，5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖前体6能够以非常直接、简单和省时的策略获自市售D-阿拉伯糖。
1a)5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖铵6的合成。
5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖前体6能够以非常直接、简单和省时的策略而获得，避免了替代使用大体积的临时三苯甲基保护：市售的D-阿拉伯糖在其呋喃糖形式主要位置上被直接甲苯磺酸酯化，进一步被乙酰化，并且无需纯化中间体而被叠氮阴离子进行亲核置换。在这步，通过快速层析能够很容易地将产物与任何其它副产物分离。最后的去乙酰化以15％的总产率得到6。
方案1.5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖铵6的合成。
5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖(6)
市售D-阿拉伯糖5(6.00g，40mmol)在吡啶(40ml)中100℃加热两小时。让溶液冷却，进一步用对甲苯磺酰氯(8.38g，44mmol；1.1当量)处理，并在室温搅拌16小时。然后加入乙酸酐(20ml)。如通过TLC所确定的，完全乙酰化后，蒸发溶剂，痕量残留用甲苯共蒸发几次。残留溶解在DMF(100ml)中，加入NaN3(5.20g，80mmol，2当量)，并且混悬液在80℃加热20小时。用乙酸乙酯稀释和用水洗后，有机层用无水硫酸镁干燥和浓缩。用快速层析纯化(石油醚/乙酸乙酯7:3)残留。第一洗脱产物被确定为预期的5-叠氮基-1,2,3-三-O-乙酰-D-阿拉伯糖呋喃(1.83g，15％，α/β～2:1)。LRMS(ESI+)324.0[M+Na]+；针对[C11H15N3NaO7]+计算的HRMS(ESI+)324.0802，发现：324.0802；1H NMR(CDCl3,360MHz)δ(ppm)：6.41(d,0.33H,J1,23.5Hz,Η-1β)；6.23(d,0.67H,H-1α)；5.40-5.37(m,1,34H,Η-2β,Η-3β)；5.23(d,0.67H,J1,2～1Hz,H-2α)；5.06(d,0.67H,J3,44.6Hz,H-3α)；4.30(ddd,0.67H,H-4α)；4.16-4.10(m,0.33H,Η-4β)；3.69(dd,0.67H,J4,5a3.1Hz,J5a,5b13.5Hz,H-5aα)；3.61(dd,0.33H,J4,5a3.6,J5a,5b13.1Hz,Η-5aβ)；3.51-3.43(m,1H,H-5bα,Η-5β)；2.15、2.13、2.12、2.11、2.11、2.09(6s,18H,6CH3CO)；13C NMR(CDCl3,62.5MHz)δ(ppm)：170.3,170.0,169.1(OC(O)CH3),99.2(C-1α),93.5(C-1β),84.1(C-4α),80.8(C-4β),80.6(C-3α),77.4(C-2α),75.1(C-2β),74.8(C-3β),53.0(C-5β),51.3(C-5α),20.9,20.6,20.3(OC(O)CH3)。
1b)被保护的5-叠氮基-1,2,3-三-O-乙酰-D-阿拉伯糖之后溶解在无水甲醇(30ml)中，用MeONa的甲醇溶液(0.2mol.l-1，3ml)处理并在室温下在氩保护气中搅拌3h。中和(Dowex50(H+))过滤、和浓缩后，获得产率为99％的5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯糖呋喃6(1.03g)。LRMS(ESI+)198.0[M+Na]+,40％，230[M+MeOH+Na]+,100％；针对[C5H9N3NaO4]+所计算的HRMS(ESI+)198.0485，发现：198.0485；1H NMR(D2O,300MHz)δ(ppm)：5.20(d,0.45H,J1,23Hz,H-1β)；5.16(d,0.55H,J1,23Hz,H-1α)；4.12-4.05(m,0.55H,H-4α)；4.02-3.85(m,2H,H-2α,Η-2β,H-3α,Η-3β)；3.84-3.76(m0.45H,Η-4β)；3.56(dd,0.55H,J5a,5b13.5,J4,5a3.0Hz,H-5aα)；3.51(dd,0.45H,J5a,5b13.0Hz,J4,5a3.5Hz,Η-5aβ)；3.35(dd,0.55H,J4,5b6.5Hz,H-5bα)；3.33(dd,0.45H,J4,5b6.5Hz,H-5bβ)；13C NMR(D2O,75MHz)δ(ppm)：101.1C-1α；95.3C-1β；81.4,81.3,79.7,76.4,75.9,和74.8C-2α,2β,3α,3β,4α,4β；52.7C-5β；51.6,C-5α。
1c)8-叠氮基-3,8-双脱氧-D-甘露-辛糖酸铵(1·ΝΗ3)的合成。
5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖6(437mg,2.5mmol)冷的(4℃)水溶液(2.1mL)加入到草酰乙酸(528mg,4.0mmol)水溶液中(2.5mL)，其pH值通过添加NaOH水溶液(10M)已经调至～11。在室温搅拌两小时后，溶液进行中和(Dowex50(H+))、过滤并在80℃加热20分钟。
其pH值用AcOH(0.5M)调到～7后，用阴离子交换层析纯化(Dowex1×8(HCO2 -))混合物。起始洗脱物用水得到未反应的6(150mg,34％)。进一步用甲酸浓度梯度(0.5mol.l-1→2mol.l-1)洗脱，冻干，用Dowex50(H+)树脂处理，并且用氨水(0.2mol.l-1)中和，浓缩后得到8-叠氮基-3,8-双脱氧-D-甘露-辛糖酸铵(1·NH3,400mg，57％)。
Rf0.38(异丙醇/水9:1)。LRMS(ESI-)262.1[M-H]-，100％；525.1[2M-H]-，5％；547.1[2M-2H+Na]-，10％；针对[C8H12N3O7]-计算所得的HRMS(ESI-)262.0681,发现：262.0667。IR v(cm-1)＝3210,2111(N3),1604,1401,1077.1的NMR，像游离的KDO和衍生物，是复杂的，因为存在多种形式(例如α-吡喃糖(αp,58％),β-吡喃糖(βp,4％),α-呋喃糖(αf,24％),β-呋喃糖(βf,14％))。选择的NMR数据：1HNMR(D2O,400MHz)δ(ppm):3.56(dd,J8a,8b13.2,J7,8a2.4Hz,H-8aαp)；3.39(dd,J7,8b6.0Hz,H-8bαp)；2.55(dd,J3a,3b14.3Hz,J3a,47.2Hz,H-3aαf)；2.33(dd,J3a,3b13.1,J3a,46.6Hz,H-3aβf)；2.26(dd,J3b,47.3Hz,H-3bβf)；2.03(dd,J3b,43.6,H-3bαf)；1.94(dd,J3a,3b＝12.7,J3a,412,7Hz,H-3aαp)；1.84(dd,J3b,4＝4.9Hz,H-3bαp)；1.71(dd,J3a,3b～J3b,412.0Hz,H-3bβp)；13C NMR(D2O,100MHz)δ(ppm)：176.4(C-1αp),104.1(C-2αf),96.2(C-2αp),85.3(C-5αf),71.5,68.0,66.3和66.0(C-4αp,5αp,6αp,7αp),53.8(C-8αp),44.6(C-3αf),33.5(C-3αp)。
方案2、8-叠氮基-3,8-双脱氧-D-甘露-辛糖酸铵的合成。
2)如以下段落3)所描述的，将缺少O-抗原的非致病性大肠杆菌K12[17]在KDO-N3(1)存在下培养过夜，并使用优化的铜催化点击条件[18]按照以下段落2a)中所描述的，在葡萄糖衍生的三-三唑配体(2)[19]和携带末端炔基(3)的Alexa Fluor488荧光团存在下，进一步处理一段试验时间。孵育5min后，观察到细菌的非常明亮的标记，然而对照试验(没有KDO-N3类似物存在)未显示任何信号(图3A、B)。荧光按以下段落2b)所描述的实施。荧光多数在细胞外周是显著的，这提示正如预期的膜被优先标记(图3C)。
2a)铜催化的点击化学。
过夜培养物用含有KDO-N3(4mM)的新鲜介质稀释1000倍(终体积100μl)。细菌在37℃孵育12小时，然后用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.5)洗3次，在室温13000x g离心1分钟。
终浓度分别为2mM和4mM的CuSO4和TGTA，在磷酸缓冲液(0.05M，pH7.5)中混合过夜，在37℃剧烈摇动。下一步，终浓度分别为4mM，5mM和0.13mM的氨基胍、抗坏血酸钠和A488-yne加入到CuSO4/TGTA过夜混合物中。最后，细菌在此溶液中重悬。5、30、60或180分钟后，通过在室温13000x g离心1min用磷酸缓冲液将细胞洗3次，并用显微镜分析。
2b)荧光显微镜。
细菌孵育在玻璃盖玻片上，然后用稀释的LB(1/10在磷酸缓冲液中)制成的薄(厚度为1mm)半固态1％琼脂垫覆盖。用配有CoolSNAP HQ2照相机(RoperScientific，Roper Scientific SARL，法国)和l00x/1.4DLL物镜的落射荧光自动显微镜(Nikon TE2000-E-PFS，Nikon，法国)记录图像。激发光由120W金属卤化物灯发射，使用合适的滤光片监测信号。如前所述，数字分析和图像处理用自定义自动化脚本(Visual Basic)在Metamorph7.5(Molecular Devices，Molecular Devices法国，法国)下进行[50，51]。
3)为了进一步加强这个方法，它的效率和特异性已经在利用KDO的三种其它革兰氏阴性菌(O86大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、嗜肺军团菌巴黎株)和三种负对照(包括奥奈达希瓦氏菌)以及两种不产生KDO的革兰氏阳性菌(枯草杆菌、金黄色葡萄球菌)[22]上进行了测试，最近已经显示奥奈达希瓦氏菌利用8-氨基-8-脱氧-KDO但不利用KDO[21]。
细菌株和生长条件如下。大肠杆菌K12、大肠杆菌O86和鼠伤寒沙门氏菌12023生长在M9介质中(还含有：酪蛋白氨基酸0.2％，葡萄糖0.2％，CaCl21mM，MgSO45mM)，奥奈达希瓦氏菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌生长在Luria-Bertani(LB)介质上以及嗜肺军团菌巴黎株生长在补充有L-半胱氨酸、焦磷酸铁和a-酮戊二酸的酵母提取介质(YEC)中。除奥奈达希瓦氏菌生长在28℃以外，所有株生长在37℃旋转摇床(160rpm)中。
正如所预期，当两种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌和嗜肺军团菌巴黎株显示有效和明确的细胞表面标记时，奥奈达希瓦氏菌或革兰氏阳性菌中没有观察到标记，因为这些细菌没有在它们细胞表面上呈现KDO(图4和图5)。
4)在膜过滤器上孵育和反应。
含有细菌的样品用25-mm，0.45-mm-孔径的黑色聚酯膜过滤器过滤。各自的膜置于纤维素垫(25mm)上，所述纤维素垫浸泡在皮氏皿中补充有0.5％丙酮酸盐或过氧化氢酶(防止氧的毒性作用)和KDO-N3(4mM)的650μl营养肉汤(取决于兴趣细菌，可用不同的营养肉汤)中。含有样品的皮氏皿在37℃孵育一定时间(取决于兴趣细菌)。
下一步，终浓度分别为2mM和4mM的CuSO4和TGTA在磷酸缓冲液(0.05M,pH7.5)中在37℃下剧烈摇荡混合过夜。下一步，终浓度分别为4mM、5mM和0.13mM的氨基胍、抗坏血酸钠和A488-yne加入到CuSO4/TGTA过夜混合物中。
最后，各膜放在纤维素垫上，所述纤维素垫浸泡在皮氏皿中650μl这种溶液中并在室温孵育30分钟。
用配有CoolSNAP HQ2照相机(Roper Scientific，Roper Scientific SARL，法国)和l00x/1.4DLL物镜的落射荧光自动显微镜(Nikon TE2000-E-PFS，Nikon，法国)记录图像。激发光由120W金属卤化物灯发射，使用合适的滤光片监测信号。如前所述，数字分析和图像处理用自定义自动化脚本(Visual Basic)在Metamorph7.5(Molecular Devices，Molecular Devices法国，法国)下进行[50，51]。
5、总之，其已经说明KDO类似物能被代谢同化和并入LPS，而无需使用遗传修饰的细菌。更有趣的是，修饰的KDO首先需要被代谢同化的事实导致使用这种方法用于对代谢活性/有活力的革兰氏阴性菌进行快速检测(整体过程花费不到一天)。鉴于检测有活力的细菌正常地需要2天到多于一个月(取决于细菌株)的事实，这种最后的应用是非常强大的。
严重的病原体隐藏于革兰氏阴性菌中，快速鉴定有活力的细胞代表主要的卫生挑战。本发明因此提供一种简单的策略，通过将修饰的糖酸或糖酸盐残基(如KDO)代谢并入到它们的脂多糖中，然后用点击化学进行进一步的缀合，来标记代谢活性的革兰氏阴性细菌的细胞表面。
当然，KDO-N3同化能够随后偶联到荧光原位杂交(FISH)[24]或任何其它众所周知的允许特异性地检测有活力的兴趣细菌的过程。
核糖体-RNA(rRNA)方法对微生物进化和生态学已经变为环境微生物学不可分割的一部分。基于rRNA散落的(patchy)保守性，寡核苷酸探针可以被设计成具有特异性，范围从种的水平到门的水平或甚至界的水平。当用例如荧光染料或辣根过氧化物酶标记这些探针时，通过荧光原位杂交(FISH)其直接可用于鉴定单一微生物细胞[38]。已经提出特异性地使用噬菌体的一种新方法[39]。
实施例2：8-O-(4-乙基苄基)-3-脱氧-D-甘露-辛糖酸(KDO-CCH)的同化
这种化合物8-O-(4-乙基苄基)-3-脱氧-D-甘露-辛糖酸或其盐(8-O-(4-乙基苄基)-3-脱氧-D-甘露-辛糖酸盐)，化合物的类似物(Ia-1)可通过以下过程制备：
冷的5-O-(4-乙基苄基)-D-阿拉伯糖呋喃糖水溶液可加入到草酰乙酸的水溶液中，其pH用NaOH水溶液调节至～10.5-11。在室温搅拌后，溶液可以被中和，并在80℃短时间加热。
用AcOH将其pH值调节至～7后，可以在甲酸盐树脂上通过阴离子交换层析纯化混合物。用水起始洗脱后，进一步用甲酸浓度梯度洗脱、冻干、用酸性树脂处理、氨水中和、并浓缩，能够产生8-O-(4-乙基苄基)-3-脱氧-D-甘露-辛糖酸铵。
之后可以用叠氮基衍生标记分子，用和KDO-N3(实施例1)相同的试剂和方法，来实施化合物并入细菌LPS和标记。
KDO-CCH(被氨水中和之前)：
实施例3：9-叠氮基-5,7-二乙酰胺基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2糖酸的同化和军团杆菌属细菌的特异性检测。
这个化合物9-叠氮基-5,7-二乙酰胺基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2糖酸或其盐(9-叠氮基-5,7-二乙酰胺基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2-糖酸盐)，化合物(Ib-1)的类似物可以通过以下过程制备[52]：
6-叠氮基-2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-D-甘露吡喃糖可以加入到草酰乙酸的水溶液，通过加入NaOH的水溶液调节pH值到～10.5-11，并且在存在或无四硼酸钠下在室温下搅拌混合物。为了保证良好的转化可能需要进一步加入草酰乙酸。用酸性树脂中和后，过滤和浓缩到小体积，溶液能够施加到甲酸盐/甲酯(formate)树脂，用水洗，和用甲酸洗脱。进一步纯化，例如用反相HPLC可能是需要。
之后可以用和KDO(实施例1)相同的反应基团、相同试剂和方法来实施将化合物并入细菌LPS中和标记。
实施例4：5,7-二叠氮乙酰胺基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2-糖酸的同化和军团杆菌属细菌的特异性检测。
这个化合物5,7-二叠氮乙酰胺基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2-糖酸或其盐(5,7-二叠氮乙酰胺基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2-糖酸盐)、化合物(Ib-1)的类似物，可以象在前面的实施例2中那样，通过2,4-二叠氮乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-D-甘露吡喃糖和草酰乙酸的反应而制备。
Az＝叠氮乙酰基
在细菌LPS中并入化合物及其标记，然后可以按照针对KDO的那样进行实施。
实施例5：各种培养基的使用。
培养基的种类不限于已经测试成功的M9和LB大肠杆菌培养基。
1)材料和方法
1.1)细菌株和生长条件
大肠杆菌K12野生型株生长在M9介质(还含有酪蛋白氨基酸0.2％、葡萄糖0.2％、CaCl21mM、MgSO45mM)或在Luria-Bertani(LB)介质中[54]。细胞生长于旋转摇床(200rpm)在37℃。
1.2)铜催化的点击化学
过夜培养物在含有KDO-N3(1mM)的新鲜介质中稀释100倍(终体积200μl)。细菌在37℃孵育12小时，然后用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.5)通过在室温14000xg离心2min洗3次。
点击预混合物包括终浓度分别为2mM和4mM的CuSO4和TGTA，点击预混合物在磷酸缓冲液(0.05M，pH7.5)中在37℃剧烈震荡下孵育过夜。下一步，终浓度分别为4mM,、5mM和0.13mM的氨基胍、抗坏血酸钠和A488-yne加入到过夜的点击预混合物中。细菌然后重悬在这个溶液中，并在37℃震荡孵育30分钟。最后，细胞用磷酸缓冲液在室温通过14000x g离心2min洗三次。
1.3)荧光显微镜
铜点击化学后，在细菌接种物上进行显微分析，其中细菌接种物置于玻璃盖玻片上，并覆盖有采用稀释的LB(1/10在磷酸缓冲液中)制成的薄(厚度为1mm)半固态1％琼脂垫。用配有Cool SNAP HQ2照相机(Roper Scientific，Roper ScientificSARL，法国)和l00x/1.4DLL物镜的落射荧光自动显微镜(Nikon TE2000-E-PFS，Nikon，法国)记录图像。激发光由120W金属卤化物灯发射，使用合适的滤光片监测信号。数字分析和图像处理用自定义自动化脚本(Visual Basic)在Metamorph7.5(Molecular Devices，Molecular Devices法国，法国)下进行。
2)结果
无论使用什么培养基，都发生KDO同化。
来自LB介质的616大肠杆菌和来自基本介质(M9)的598大肠杆菌已经进行了分析。
相较于M9介质，当细胞生长在LB介质时，获得更高的KDO同化。然而，两种介质对检测和定量可培养细菌是方便和足够的。
实施例6：可培养的/活的和死的大肠杆菌细胞的检测和计数。
数目已知的两种能够繁殖的可培养大肠杆菌和死的大肠杆菌已经和KDO-N3接触。KDO-N3只并入活的大肠杆菌中。KDO-N3并入所有活的大肠杆菌中。
1)材料与方法
1.1)细菌株和生长条件
在旋转摇床(200rpm)中在37℃下，大肠杆菌K12生长在Luria-Bertani(LB)介质中。在120℃加热15分钟后获得死的大肠杆菌K12。
1.2)铜催化的点击化学(如实施例5中所公开的)
1.3)细菌计数和荧光显微镜
1.3.1)对全部细菌得分，细胞在对多聚甲醛3％-DAPI2μg/ml的溶液中固定和染色，并在isopore聚碳酸酯膜(Milipore)上过滤。
1.3.2)铜点击化学之前，通过平板稀释监测菌落形成单位(CFU)。
1.3.3)铜点击化学后，在细菌接种物上进行显微分析，其中细菌接种物置于玻璃盖玻片上，并覆盖有采用稀释的LB(1/10在磷酸缓冲液中)制成的薄(厚度为1mm)半固态1％琼脂垫。用配有Cool SNAP HQ2照相机(Roper Scientific，Roper ScientificSARL，法国)和l00x/1.4DLL物镜的落射荧光自动显微镜(Nikon TE2000-E-PFS，Nikon，法国)记录图像。激发光由120W金属卤化物灯发射，使用合适的滤光片监测信号。数字分析和图像处理用自定义自动化脚本(Visual Basic)在Metamorph7.5(Molecular Devices，Molecular Devices法国，法国)下进行。
2)结果
2.1)通过1.3.1)中公开的总得分所计算的总细胞浓度是9109+/-0.1109细胞/ml，然而通过1.3.2)中公开的菌落计数所计数的可培养细胞浓度是4109+/-0.15109cfu/ml。这些结果表明存在于这个样品中所有细胞的44.5％(+/-4％)是可培养的。
2.2)如段落1.2/1.3.3)公开的点击化学后，通过荧光计数提供以下结果。一个样品在没有KDO-N3时进行孵育，一个样品与KDO-N3孵育。荧光分析已经在1878个有KDO-N3的大肠杆菌细胞和3039个无KDO-N3的大肠杆菌细胞上实施。它使得能够确定任意荧光单位的阈值为30，在其以下为死细胞和在其以上是可培养的细胞。下一步，应用这种阈值(30)，有可能在已经通过如1.3.3)中的点击化学进行反应的细菌上，对鉴定为死的(30以下)和鉴定为可培养的(30以上)的细胞进行计数。做这个评价，发现1587个死细胞(KDO-N3-)和1452个可培养的细胞(KDO-N3+)导致47.7％的可培养细胞。此数值统计学上看上去和使用死的和可培养的细胞获得的值一致，44.5％说明只有可培养的细胞被本发明的方法检测。
实施例7：仅革兰氏-可培养细胞的检测
革兰氏+菌(枯草杆菌)和革兰氏-菌(大肠杆菌)的混合物已经与KDO-N3接触。仅可培养的革兰氏-菌被KDO-N3所标记和被检测。
1)材料和方法
1.1)细菌株和生长条件
通过m-cherry[55]释放(rendered)荧光的大肠杆菌K12野生型株、大肠杆菌K12sodA-mCherry[55]和枯草杆菌，在旋转摇床中(200rpm)在37℃下生长于Luria-Bertani(LB)介质中。
1.2)铜催化的点击化学(如在实施例6中所公开的)
1.3)细菌计数和荧光显微镜(如在实施例5中所公开的)。
2)结果
枯草杆菌和大肠杆菌在LB介质中生长12小时。此后，大肠杆菌(1.66109cfu/ml)和枯草杆菌(5.9108cfu/ml)可培养的细胞浓度已经通过段落1.32)中公开的计数得以鉴定，提示26％的可培养细胞是枯草杆菌，以及74％是大肠杆菌。
另外，由于使用了大肠杆菌sodA-mCherry株，在点击化学之前使用如上公开的荧光，可以区分大肠杆菌和枯草杆菌。696个被分析的细胞中，170个是mCherry阴性(24.4％)代表枯草杆菌的结果，和526个mCherry阳性(75.6％)代表大肠杆菌的结果。这些结果用获得自cfu值的百分比验证。
然后，相同样品的所有细菌已经进行了以上点击化学反应，通过荧光计数的结果在下表1中给出。
KDO-N3阴性细胞中，评价了代表枯草杆菌结果的mCherry阴性细胞的数目(166)和代表大肠杆菌细胞数目结果的mCherry阳性细胞数目(9)。在KDO-N3阳性细胞中，评价了代表枯草杆菌数目结果的mCherry阴性细胞的数目(4)和代表大肠杆菌数目结果的mCherry阳性细胞的数目(517)。
使用这些数值，可以鉴定4个枯草杆菌为假阳性(大约2％)。相反，9个大肠杆菌KDO阴性(大约2％)可以是假阳性或是假阴性，因为标准方法误差范围是大约10％。
因此，以上这些结果说明KDO-N3基本上仅在可培养的大肠杆菌细胞而非可培养的枯草杆菌细胞中被很好地同化。
实施例8：通过生物素-炔烃的检测
Kdo-N3同化后，使用生物素化-炔烃进行点击化学，使用偶联到荧光染料AlexaFluor A494的抗生物素抗体检测有活力的大肠杆菌细胞。通过比较可培养的计数和Kdo阳性细胞计数所观察的，通过以下实验步骤检测所有有活力的大肠杆菌。
1)细菌株和生长条件。
大肠杆菌K12野生型株在旋转摇床(200rpm)在37℃下生长在Luria-Bertani(LB)介质中。
2)铜催化的点击化学：
过夜培养物在含有KDO-N3(1mM)的新鲜介质中稀释100倍(终体积200μl)。细菌在37℃孵育12小时，然后用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.5)通过在室温14000x g离心2min洗3次。点击预混合物包括终浓度分别为2mM和4mM的CuSO4和TGTA，点击预混合物在磷酸缓冲液中在37℃剧烈震荡下孵育过夜。下一步，终浓度分别为4mM,和5mM的氨基胍、抗坏血酸钠加入到过夜的点击预混合物中。这个“点击混合物”被加入到被清洗的培养物中，并补充或不补充生物素-炔烃(Carbosynth)(1到100μg)，并在37℃震荡下孵育1到60分钟。
3)细菌计数和荧光显微镜
对铜点击化学之前和之后的总细菌得分，在多聚甲醛3％-DAPI2μg/ml的溶液中对细胞进行固定和染色，并在isopore聚碳酸酯膜上(Milipore)过滤。
偶联到Alexa Fluor A594(Jackson Immuno Researsh)的抗生物素抗体稀释10到1000倍用于标记细菌。在铜点击化学之前，也通过平板稀释法监测菌落形成单位(CFU)。
铜点击化学后，在细菌接种物上进行显微分析，其中细菌接种物置于玻璃盖玻片上，并覆盖有采用稀释的LB(1/10在磷酸缓冲液中)制成的薄(厚度为1mm)半固态1％琼脂垫。用配有CoolSNAP HQ2照相机(Roper Scientific，Roper ScientificSARL，法国)和l00x/1.4DLL物镜的落射荧光自动显微镜(Nikon TE2000-E-PFS，Nikon，法国)记录图像。激发光由120W金属卤化物灯发射，使用合适的滤光片监测信号。数字分析和图像处理用自定义自动化脚本(Visual Basic)在Metamorph7.5(Molecular Devices，Molecular Devices法国，法国)下进行。
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[13]综述，参见:A.Banaszek,J.Mlynarski in Studies in NaturalProducts Chemistry,Vol.30(Ed.:Atta-ur-Rahman),Elsevier,Amsterdam,2005,pp.419-482.
[14]在本工作的过程中，发表了一个非常相似的8-叠氮-8-脱氧-KDO的研究:R.Winzar,J.Philips,M.J.Kiefel,Synlett2010,583-586.
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Claims (22)

1.一种用于在包含细菌的样品中特异性地标记给定分类的细菌的活细菌的方法，所述方法包含步骤：
a)所述样品的所述细菌与至少一种单糖化合物类似物孵育，所述单糖是这些给定分类的细菌外膜聚糖的内源单糖残基，所述内源单糖残基包含糖酸或糖酸盐残基，所述单糖化合物的类似物是在给定位置被能够与标记分子的第二反应基团反应的第一反应化学基团取代的修饰单糖，所述给定位置优选是在并入到细菌外膜所述聚糖的所述内源单糖残基中包含游离基团的位置，
b)所述细菌和包含所述第二反应基团的所述标记分子接触，以产生并入所述活细菌外膜的所述聚糖的所述类似物残基的所述第一反应基团和所述标记分子的所述第二反应基团的反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其用于特异性地标记能够繁殖的细菌，其中所述细菌孵育在培养基中，所述细菌在培养基之中或之上能够繁殖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括另一步骤：
c)检测活细菌在检测中是否所述细菌包含结合到它们外膜聚糖的所述标记分子和/或将携带所述标记分子的所述活细菌固定在固态基质上。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述标记分子是包含可检测物质的可检测分子，或所述标记分子能够与可检测物质反应或结合，或所述标记分子是携带所述第二反应基团的第一分子，所述第一分子能够与第二分子和/或固态基质反应或结合，优选所述第二分子包含可检测物质和/或所述第二分子被结合到所述固态基质。
5.根据权利要求4所述的方法，其用于在包含细菌的样品中特异性地检测给定分类的细菌的活细菌，其中所述标记分子是包含可检测物质的可检测分子，方法包括检测活细菌在检测中是否所述细菌包含结合到它们外膜聚糖的所述可检测分子的步骤c)。
6.根据权利要求4所述方法，其中所述标记分子是携带所述第二反应基团的第一配体或第一结合蛋白，以及步骤c)中偶联到所述第一配体或第一结合蛋白的所述活细菌，通过所述第一配体或第一结合蛋白与第二配体或第二结合蛋白接触、通过与所述第一配体或第一结合蛋白特异性地反应或结合，而被检测和/或被固定。
7.根据权利要求6所述方法，其中所述标记分子是第一配体，优选生物素，所述第一配体携带所述第二反应基团，以及在步骤c)中偶联到所述第一配体的所述活细菌通过所述细菌与特异于所述第一配体的抗体进行反应而得以检测，所述抗体携带可检测物质，优选荧光染料或发光分子或酶。
8.根据权利要求4至7任一项所述的方法，其中所述可检测物质是通过荧光或发光可检测的荧光染料或发光分子。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述单糖化合物的类似物是具有下式(I)或(II)之一的糖酸、或其糖酸盐：
或
其中
-A、B和C可以独立地是被保护基团所取代或未取代的H、OH、NH2、OH和NH2，优选被烷基、羟烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基基团取代，和
-D是C2至C4的烷基链，每个碳被或未被OH或NH2取代，被或未被其保护基团取代，优选被烷基、羟烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基基团取代，和
-A、B、C或D基团中的至少一个被所述第一反应基团取代。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述单糖类似物是取代的辛糖酸或辛糖酸盐化合物或取代的非糖酸或非糖酸盐化合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其用于特异性地检测活的革兰氏阴性菌，其中所述给定分类的细菌是革兰氏阴性菌的分类，以及细菌外膜的所述LPS层的所述内源单糖残基是脱氧辛糖酸或脱氧辛糖酸盐残基，以及所述单糖化合物的类似物是取代的脱氧辛糖酸或脱氧辛糖酸盐化合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述脱氧辛糖酸或脱氧辛糖酸盐化合物的类似物在选自单糖位置3、4、5、7和8，优选3、7和8的一个位置上，被所述反应基团取代。
13.根据权利要求9至12任一项所述的方法，其中式(I)或(II)的所述脱氧辛糖酸的类似物或脱氧辛糖酸盐化合物的类似物被所述第一反应基团R1在位置8取代，其中式(I)中D＝-CHOH-CH2-R1、A＝H、B＝OH、C＝OH，或式(II)中D＝-CHOH-CHOH-CH2-R1、A＝H、B＝OH。
14.根据权利要求11至13任一项所述的方法，其中所述革兰氏阴性菌包含大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
15.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其用于特异性地标记活嗜肺军团菌，以及所述给定分类的细菌是嗜肺军团菌的分类，以及细菌外膜所述LPS层的所述内源单糖残基是4-epilegionaminic(无对应中译文)酸(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-talo-非-2-糖酸)或4-epilegionaminate(无对应中译文)残基或legionaminic(无对应中译文)酸(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-D-甘油-D-半乳糖-非-2-糖酸)或legionaminate(无对应中译文)残基，以及所述单糖化合物的类似物分别是取代的4-epilegionaminic酸或4-epilegionaminate化合物，或取代的legionaminic酸或legionaminate化合物，优选在选自单糖环位置3、4、5、7、8和9，优选5、7和9的一个位置上被取代。
16.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其用于特异性地标记，优选检测活的铜绿假单胞菌，以及所述给定分类的细菌是铜绿假单胞菌的分类，以及细菌外膜的所述LPS层的所述内源单糖残基是8-epilegionaminic(无对应中译文)酸(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-L-甘油-D-半乳糖-非-2-糖酸)或8-epilegionaminate(无对应中译文)残基、或pseudaminic(无对应中译文)酸(5,7-二氨基-3,5,7,9-四脱氧-L-甘油-L-甘露-非-2-糖酸)或pseudaminate(无对应中译文)残基，以及所述单糖化合物的类似物分别是取代的8-epilegionaminic酸或8-epilegionaminate化合物、或取代的pseudaminic酸或pseudaminate化合物，优选在选自单糖环的位置3、4、5、7、8和9，优选5、7和9的一个位置上被取代。
17.根据权利要求1至16任一项所述的方法，其中所述第一反应基团选自存在于或携带叠氮基的基团和存在于或携带炔基的基团，以及所述第二反应基团是选自分别存在于或携带炔基和叠氮基的基团，以及所述叠氮基反应基团和所述炔基反应基团的反应通过叠氮炔的环化加成作用而实施。
18.根据权利要求17所述的方法，其中反应是在铜催化的条件下，三-三唑配体优选TGTA存在时实施的。
19.根据权利要求2至4和权利要求8至18任一项所述的方法，其用于计数活细菌，其中步骤a)的所述孵育和步骤b)的反应在固态基质优选膜过滤器上实施，从而源自经繁殖的相同起始细菌的培养细菌，被集合到一起并可以用显微镜观察，以及所述可检测分子可通过所述显微镜观察检测。
20.一种用于实施权利要求1至19任一项所述方法的试剂盒，其包含：
-所述单糖化合物的类似物，其包含糖酸或糖酸盐化合物，糖酸或糖酸盐化合物在给定位置被所述第一反应化学基团取代，和
-所述标记分子，其包含能够与所述第一反应基团反应的所述第二反应基团，和
-反应物，其用于产生并入到所述细菌外膜的所述聚糖的所述类似物残基的所述第一反应基团和所述标记分子的所述第二反应基团的反应，和
-允许所述给定分类的细菌生长的培养或孵育介质，优选特异于所述给定分类的细菌生长。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其用于实施权利要求19所述的方法，所述试剂盒还包括：
-所述可检测分子，其包含能够与所述第一反应基团反应的所述第二反应基团，和
-固态介质，其允许在与所述单糖化合物的类似物、所述反应物和所述可检测分子孵育后，进行细菌的观察。
22.根据权利要求20或21任一项所述的试剂盒，其包含：
-所述单糖化合物的类似物，其是被包含叠氮基或炔基的所述第一反应基团取代的脱氧辛糖酸或脱氧辛糖酸盐化合物，和
-可检测分子的所述第二反应基团，其分别携带炔基或叠氮基，和
-所述反应物，其包含铜催化剂和三-三唑配体。
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