JP6029050B2

JP6029050B2 - 血管透過性亢進評価剤、血管透過性亢進評価方法、および血管透過性亢進評価装置

Info

Publication number: JP6029050B2
Application number: JP2012141322A
Authority: JP
Inventors: 寺西　克倫; 克倫寺西
Original assignee: Mie University NUC
Current assignee: Mie University NUC
Priority date: 2012-06-22
Filing date: 2012-06-22
Publication date: 2016-11-24
Anticipated expiration: 2032-06-22
Also published as: JP2014005227A

Description

本発明は、近赤外蛍光化合物を含んでなる血管透過性亢進の評価剤、近赤外蛍光法による血管透過性亢進の評価方法、および血管透過性亢進の評価装置に関する。

炎症の初期に血管内皮細胞がヒスタミン等のメディエータによって収縮し、細胞間隙が広くなり、血管から血漿成分が血管外の組織に漏れ出る。これが続くと次には白血球が浸潤し細菌や異物の解毒を行う。この状態が必要以上に続くと炎症の状態になる。この時の血管からの血漿成分の漏れ、すなわち血管透過性亢進を評価することにより炎症程度の評価や抗炎症化合物などの投与する被検化合物の抗炎症の評価を行うことができる。血管透過性亢進の既存の評価方法として、色素（非特許文献１）、放射性物質¹²⁵Ｉを標識したアルブミン（非特許文献２）あるいはフルオレセイン蛍光物質を標識したアルブミン（非特許文献３、４）を用いる方法があり、薬理試験施設では色素法が主に用いられている。

これらの既存の方法の操作手順は以下である。１）炎症を発症させたラットやマウス等の被検動物に色素、放射性物質¹²⁵Ｉを標識したアルブミンあるいはフルオレセイン蛍光物質を標識したアルブミンを静脈投与する。２）一定時間後に被検動物を安楽死させる。３）炎症部位の皮膚をはぎとる。４）はぎ取った皮膚から色素や標識したアルブミンを抽出する。５）色素や標識されたアルブミンの量を機器計測する、６）測定された色素量あるいは標識アルブミン量から血管透過性亢進を評価する。このような評価法は、動物の安楽死、作業に時間がかかる、作業工程が多い、等の課題があり、簡便性の向上や使用動物の軽減が望まれていた。

一方、本発明者は、インドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を合成し、この化合物をスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬の有効成分として用いることにより、スーパーオキシドアニオンを近赤外光として検出する方法を開示している（特許文献１、２）。しかし、これら特許文献においては、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物が血管透過性亢進の評価剤の有効成分となり得ること、またこの化合物を用いた血管透過性亢進評価方法は開示されていなかった。

特開２００９−２１５１７４特開２０１１−０５１９６１

Katayama S., Shionoya H., Ohtake S., Microbiologyand immunology, 1978, 22(2), 89-101. Taherzadeh M., Das A. K., WarrenJ.B., American Journal of Physiology, 1998, 275, H1388-1394. Watanabe K., Nakagawa H.,Tsurufuji S., Journal of Pharmacological Methods, 1986, 15, 255-261. Yamaki K., Takano-Ishikawa Y., Goto M., Kobori M., Tsushida T.,Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 2002, 48, 81-86.

本発明が解決しようとする課題は、被検動物を、短時間に、簡便に、安全に、精度よく、また被検動物が試験用・実験用動物の場合にあっては安楽死させずに、血管透過性亢進を評価するための評価剤、測定・解析方法、および測定・解析装置を提供することである。

上記のような背景の下、本発明者は鋭意研究した結果、課題を解決する血管透過性亢進の評価剤および血管透過性亢進の評価法として、以下を発明した。本発明は、炎症が発症している被検動物に、生体での光透過性に優れる近赤外蛍光を発する近赤外蛍光化合物を含んでなる評価剤を血管内投与し、炎症部位表面に近赤外光を照射し、照射した光を投与した近赤外化合物に吸収させ、近赤外化合物から放出される別の波長の光、すなわち蛍光を機器を用いて画像として検出し、検出された蛍光の輝度および発光面積から算出される総蛍光量を解析し血管透過性亢進を評価するものである。

したがって、本発明は、
＜１＞下記化学式１（化１）または化学式２（化２）から選択される１種類または２種類以上の近赤外蛍光化合物を含んでなることを特徴とする血管透過性亢進評価剤である。
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｋ、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ１以上１０以下の整数である。）
（式中のＲは、アルキル基、アリール基であり、Ｍは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｍ、ｎ、ｐは、それぞれ１以上７以下の整数である。）
＜２＞近赤外蛍光化合物が、下記化学式３（化３）または化学式４（化４）から選択される１種類または２種類以上であることを特徴とする上記＜１＞に記載の血管透過性亢進評価剤である。
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
＜３＞近赤外蛍光化合物の濃度が、0.001 mg/被検動物体重(kg)から1 mg/被検動物体重(kg)であることを特徴とする上記＜１＞または＜２＞に記載の血管透過性亢進評価剤である。

本発明の方法によれば、被検動物を、短時間に、簡便に、安全に、精度よく、また被検動物が試験用・実験用動物の場合にあっては安楽死の処理をすることなく、生きた状態で、短時間に簡便に血管透過性亢進の評価を行うことができる。

ヒスタミン投与による血管透過性亢進誘起ラットの近赤外蛍光画像を示す。ヒスタミン投与による血管透過性亢進誘起ラットの近赤外蛍光画像から解析された総蛍光量の時間変化を示す。抗炎症剤であるピリラミンを経口投与した後のヒスタミン投与による血管透過性亢進誘起ラットの近赤外蛍光画像から解析されたピリラミン投与量に対する総蛍光量値を示す。抗炎症剤であるジクロフェナックナトリウムを経口投与した後のヒスタミン投与による血管透過性亢進誘起ラットの近赤外蛍光画像から解析された総蛍光量の時間変化を示す。

本発明の血管透過性亢進評価剤において用いる近赤外蛍光化合物としては、血管透過性亢進は発症している血管内皮細胞間隙を通過し、血管透過性亢進が発症していない正常な血管からは漏れないあるいは漏れにくい性質であればよい。すなわち血管透過性亢進部位と正常部位の蛍光のコントラスト比が高い蛍光化合物であればよい。
特に、化学式１または化学式２で示されるインドシアニンイミダゾピラジン化合物またはその塩が好適であり、化学式３または化学式４で示されるインドシアニンイミダゾピラジン化合物またはその塩がより好適である。これら化合物は、１種類または２種類以上の混合物として使用できる。
なお、化学式１乃至化学式４において、これら化合物を注射投与時に水に溶解することができ、また生体に影響を及ぼさないために、これら式中のＭは、Ｈあるいはアルカリ金属あるいはアルカリ土類金属であることが好ましい。さらに、水への溶解性を妨げないために、化学式１中のｋ、ｌ、ｍ、ｎは、１以上１０以下の整数、また化学式２中のｍ、ｎ、ｐは、１以上７以下の整数であることが好ましい。

本発明の血管透過性亢進評価剤において用いる近赤外蛍光化合物の濃度は、対象とする動物および使用する蛍光検出器にもよるが、一般に0.001 mg/被検動物体重(kg)から1 mg/被検動物体重(kg)が好ましく、それぞれの様態により調整することができ、限定されることはない。また、該評価剤には、近赤外蛍光化合物以外に、生体に影響を与えず、また、蛍光に著しい影響を与えないものであれば含まれてもよい。

本発明の血管透過性亢進評価剤、血管透過性亢進評価方法、および血管透過性亢進評価装置において対象とする動物は、ヒトの他、例えば、マウス、ラット、ブタ、イヌ、サル等の一般に実験動物として用いられる生体が挙げられる。
動物に発症した血管透過性亢進は、自然発症のもの、あるいは実験動物においては人為的に発症させたものでもよい。人為的に発症させる場合は、例えばヒスタミン、ブラジキニン、サブスタンＰなどをあげることができるが、これら以外の血管透過性亢進を誘起する物質あるいは外科的方法を用いてもよく限定されることはない。

本発明の血管透過性亢進評価剤の動物への投与法では、該評価剤を例えば水、生理食塩水、緩衝液に溶解した溶液を血管内投与する方法が挙げられ、生体に影響を与えない方法であれば限定されることはない。

蛍光検出時間は、蛍光化合物投与後0秒から3時間であり、対象とする動物、投与する血管透過性亢進評価剤量および血管透過性亢進の発症状態により適宜選択され、限定されることはない。
照射する光は、約600 nmから約800 nmの近赤外光であり、その強度は血管透過性亢進評価剤の量および動物の種類により適宜選択できる。また、光照射装置は、血管透過性亢進部位よりも広い範囲を光照射できるものであり、さらには十分な光強度を有する能力のものであれば、特に制限されない。
使用する蛍光検出装置は、約750 nmから約1000 nmの蛍光を画像として取得できる装置であればよく、特に制限されることはない。
蛍光解析装置は、取得した蛍光画像の蛍光輝度および蛍光面積から総蛍光量を算出できるものであればよく、特に制限されることはない。
血管透過性亢進の評価は、正常部位の総蛍光量と血管透過性亢進発症部位の総蛍光量の比較で行うことができる。

以下に本発明の好適な一実施の形態を実施例によって具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態によって限定されるものでなく、本発明の範囲で様々に改変して実施することができる。

＜実施例１：ラット皮膚の血管透過性亢進の測定＞
ラット（13週齢、300 g、雄）をペントバルビタールナトリウム麻酔下で背中を除毛し、背部に血管透過性亢進誘起剤であるヒスタミンを25 mg/site、 2.5 mg/site、 0.25 mg/site、生理食塩水をそれぞれ皮内投与し、化式４で示される近赤外蛍光化合物4-(2-((E)-2-((E)-2-methoxy-3-((E)-2-(1-(3-(2-(3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamido)ethylamino)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの1 mM水溶液0.075 mLを尾静脈投与した。その60分後の背部を赤外観察システム（浜松ホトニクス社製）で撮像した。その撮像結果を図１に示す。図１に示されるように、投与したヒスタミン量によって、すなわち血管透過性亢進の程度に対し、血管透過性亢進部位の総蛍光量が対応している。

＜実施例２：ラット皮膚の血管透過性亢進の測定、解析および評価＞
ラット（13週齢、300 g、雄）をペントバルビタールナトリウム麻酔下で背中を除毛し、背部に血管透過性亢進誘起剤であるヒスタミンを25 mg/site、 2.5 mg/site、 0.25 mg/site、生理食塩水を別々のラットにそれぞれ皮内投与し、化式４で示される近赤外蛍光化合物4-(2-((E)-2-((E)-2-methoxy-3-((E)-2-(1-(3-(2-(3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamido)ethylamino)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの1 mM水溶液0.075 mLを尾静脈投与した。蛍光化合物の投与直後から60分間の背部を赤外観察システム（浜松ホトニクス社製）で撮像し、蛍光解析ソフトを用いて、得られた蛍光画像から血管透過性亢進部位の総蛍光量を算出した。その総蛍光量を図２で示した。総蛍光量は正常部位の蛍光強度を0とするように補正した。図２に示されるように、投与したヒスタミン量によって、すなわち血管透過性亢進の程度に対応し、血管透過性亢進部位の総蛍光量が対応することがわかる。さらに、ラットを生きたまま観察しているので、時間経過による蛍光量をリアルタイムで取得することができた。

＜実施例３：抗炎症剤ピリラミンの経口投与におけるラット皮膚の血管透過性亢進の測定、解析および評価＞
ラット（13週齢、300 g、雄）に各種濃度のピリラミン水溶液を経口投与し、1時間後にペントバルビタールナトリウム麻酔下で背中を除毛し、背部に血管透過性亢進誘起剤であるヒスタミンを25 mg/siteを皮内投与し、化式４で示される近赤外蛍光化合物4-(2-((E)-2-((E)-2-methoxy-3-((E)-2-(1-(3-(2-(3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamido)ethylamino)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの1 mM水溶液0.075 mLを尾静脈投与した。蛍光化合物の投与20分後の背部を赤外観察システム（浜松ホトニクス社製）で撮像し、蛍光解析ソフトを用いて、得られた蛍光画像から血管透過性亢進部位の総蛍光量を算出し、総蛍光量をグラフで示した。総蛍光量は正常部位の蛍光強度を0とするように補正した。その結果を図３に示す。図３に示されるように、投与したピリラミン量によって、血管透過性亢進部位の総蛍光量が対応することがわかる。すなわち、ピリラミン量の増加によって総蛍光量が減少し、血管透過性亢進の減少が判定できた。なお、ピリラミンはＨ１レセプターのアンタゴニストであり、ヒスタミンによる血管透過性亢進を抑制する抗炎症剤であることは既知である。

＜実施例４：抗炎症剤ジクロフェナックナトリウムの経口投与におけるラット皮膚の血管透過性亢進の測定、解析および評価＞
ラット（13週齢、300 g、雄）に15 mg/mLジクロフェナックナトリウム水溶液（1 mL）を経口投与し、1時間後にペントバルビタールナトリウム麻酔下で背中を除毛し、背部に血管透過性亢進誘起剤であるヒスタミンを25 mg/siteを皮内投与し、化式４で示される近赤外蛍光化合物4-(2-((E)-2-((E)-2-methoxy-3-((E)-2-(1-(3-(2-(3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamido)ethylamino)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの1 mM水溶液0.075 mLを尾静脈投与した。蛍光化合物の投与20分後の背部を赤外観察システム（浜松ホトニクス社製）で撮像し、蛍光解析ソフトを用いて、得られた蛍光画像から血管透過性亢進部位の総蛍光量を算出し、総蛍光量をグラフで示した。総蛍光量は正常部位の蛍光強度を0とするように補正した。その結果を図４に示す。図４に示されるように、ジクロフェナックナトリウムの投与に対し、血管透過性亢進部位の総蛍光量が減少しないことがわかる。ジクロフェナックナトリウムはシクロオキシゲナーゼアンタゴニストであり、ヒスタミンによる血管透過性亢進を抑制しないことが既知であり、本発明の血管透過性亢進の評価法においてもそれを示すことができた。

Claims

下記化学式１（化１）または化学式２（化２）から選択される１種類または２種類以上の近赤外蛍光化合物を含んでなることを特徴とする血管透過性亢進評価剤。
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｋ、ｌ、ｍ、ｎは、それぞれ１以上１０以下の整数である。）
（式中のＲは、アルキル基、アリール基であり、Ｍは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｍ、ｎ、ｐは、それぞれ１以上７以下の整数である。）
近赤外蛍光化合物が、下記化学式３（化３）または化学式４（化４）から選択される１種類または２種類以上であることを特徴とする請求項１に記載の血管透過性亢進評価剤。
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
近赤外蛍光化合物の濃度が、0.001 mg/被検動物体重(kg)から1 mg/被検動物体重(kg)であることを特徴とする請求項１または２に記載の血管透過性亢進評価剤。