JP6019535B2 - 蛍光プローブ及びその製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、近赤外光の照射により、照射光の波長と異なる近赤外光を発する蛍光プローブ及びその製造方法に関する。
蛍光法による生体イメージングは、放射線を用いることなく低侵襲的に構造変化や対象物の動態変化を捉えることができるイメージング手法の一つである。蛍光法では、蛍光プローブが広く用いられ、発光した蛍光をもとに、目的対象物（標的分子）の構造変化や動態変化等が可視化観察されるので、蛍光プローブは、有用である。このような蛍光プローブとして、例えば、特許文献１には、ＧＦＰやＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質やＣｙ２などのＣｙシリーズやＡｌｅｘａ４８８などのＡｌｅｘａシリーズといった有機化合物からなる蛍光色素（有機蛍光色素）が記載されている。また、特許文献２には、その他の有機化合物からなる蛍光プローブが多数記載されている。
これらの有機化合物からなる蛍光プローブの多くは、４８０ｎｍ付近の短波長の光で励起するため、励起光が生体深部に到達できず、生体の外表面のイメージングしか行うことができない。また、上記有機化合物は、可視光域で発光するため、生体を構成する物質のさまざまな蛍光と重なり、目的対象物の蛍光とそれ以外の蛍光とが混在したイメージとして得られる。そのため、スペクトル分析を用いて分光するなど、目的対象物を明確に捉えるための工夫が必要となる。更に、有機蛍光色素は、蛍光発生の原理上、退色する傾向にあるので、励起光の照射時間が長いと、目的物質の蛍光シグナルが消失してしまう欠点がある。
これらの問題点を解消するには、生体の外表面から２０ｍｍ程度の深部まで透過する近赤外光域の光を励起光として用い、それに対応した蛍光プローブを用いることが一つの糸口になると考えられる。
可視光域と比べ、波長８００ｎｍを超える近赤外光域では、生体に対して、単に光の透過性が高いだけではなく、水やヘモグロビンの光吸収が極めて低いことから、血液成分などが発する自家蛍光がほとんど見られない。そのため、近赤外光域の光を用いると、目的対象物の蛍光とそれ以外の物質の蛍光とを区別して明確に捉えることが容易であると考えられる。したがって、近赤外光域蛍光プローブを用いることで、これまでにない良好なイメージングが可能になると考えられる。
近年、特許文献３に記載されているように、蛍光プローブとして、半導体量子ドットが用いられ始めている。この手法では、量子ドットの粒子径を変化させることにより、さまざまな波長に対応した蛍光プローブを作製することができる。また、有機蛍光色素などと異なり、近赤外光域の蛍光プローブを作製することもできる。
しかしながら、近赤外光域の蛍光を発する量子ドットは、粒子径が大きく、生体で使用しにくい欠点を有する。更に、量子ドットは、カドミウムなどの生体有害物質を含むため、毒性を軽減する必要性が生じる。
特許文献４には、希土類元素のイオンを含有したシリコンジオキサイドナノ粒子が開示されており、特許文献５には、希土類元素のイオンを含有したＹＡＧナノ結晶が開示されている。これらの技術によると、量子ドットとは異なるので、粒径に依存せず、広い範囲の波長の光で発光する蛍光プローブを作製することができる。
特許文献４又は５に記載された発明は、特許文献１〜３に記載された発明と比べて、その発光波長、退色に対する安定性、粒径の制御等において有用であると考えられる。ところが、ＹＡＧナノ結晶やシリコンジオキサイドナノ結晶へ希土類元素のイオンを導入する場合には、希土類元素のイオンが高効率の発光を示すように、結晶中の特定の位置に取り込まれるように結晶成長条件をコントロールしなければならず、製造工程において高度なテクニックが要求される。また、ナノ結晶のサイズコントロールも高度なテクニックが必要である。更に、ナノ結晶の凝集防止も必要であり、製造管理コストは多大なものとなる。特許文献４のシリコンジオキサイドナノ粒子は、溶液からの合成方法によるため、この問題は重要である。尚、特許文献５には、結晶材料ではなく非晶質材料を用いることも示唆されているが、その具体的な原料や製造方法は記載されておらず、ＹＡＧナノ結晶等と同様の方法によって、溶液から非晶質ナノ粒子が作製されるものと推測される。
国際公開ＷＯ２００９／０２０１９７号公報 特開２００８−１４９１５４号公報 国際公開ＷＯ２００８／１２３２９１号公報 特表２００３−５２２１４９号公報 特開２００７−２３０８７７号公報
本発明は、近赤外光を利用する蛍光プローブ及びその効率良い製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、希土類元素のイオンがガラスの中に分散したガラス組成物を作製した。そして、このガラス組成物に近赤外光を照射すると、照射光の波長と異なる近赤外光を発することを見い出した。また、ガラス組成物を、破砕して微粒化した場合、この粉体が近赤外光域の光を励起光とする生体イメージングに好適な蛍光プローブであることを見い出した。即ち、本発明は以下に示される。
１．近赤外光域の波長の光で励起されて該波長以外の近赤外光域の波長の光を発するＹｂイオン、Ｎｄイオン、Ｓｍイオン及びＰｒイオンから選ばれた少なくとも１種の希土類元素のイオンを含む蛍光プローブであって、該イオンを含むＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスのガラス粉体からなることを特徴とする蛍光プローブ。
２．上記近赤外光域が、８００〜１２００ｎｍの範囲にある波長である上記１に記載の蛍光プローブ。
３．上記希土類元素の含有割合が上記蛍光プローブを構成する原子の合計量に対して０．４〜２．０ａｔ％である上記１又は２に記載の蛍光プローブ。
４．上記粉体の最大長さを測定した際の下限値が０．１μｍであり、上限値が１．０μｍである上記１〜３のいずれか一項に記載の蛍光プローブ。
５．上記１〜４のいずれか一項に記載の蛍光プローブを製造する方法であって、
Ｙｂ、Ｎｄ、Ｓｍ及びＰｒから選ばれた少なくとも１種の希土類元素を含む化合物と、ＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスのガラス原料とを溶融する溶融工程と、上記溶融工程により得られた溶融物を冷却し、上記希土類元素のイオンを含むガラス組成物を作製する冷却工程と、上記ガラス組成物を破砕し、粉体を得る破砕工程と、を備えることを特徴とする蛍光プローブの製造方法。
６．上記希土類元素を含む化合物が、酸化物である上記５に記載の蛍光プローブの製造方法。
７．上記溶融工程における温度が９００℃〜１３５０℃である上記５又は６に記載の蛍光プローブの製造方法。
８．上記破砕工程において、乳棒及び乳鉢による破砕、並びに／又は、ボールミルによる破砕が行われる上記５〜７のいずれか一項に記載の蛍光プローブの製造方法。
本発明の蛍光プローブは、希土類元素のイオンが、ガラスの中に分散しているガラス粉体からなることから、近赤外光を照射すると、照射光の波長と異なる近赤外光を発する。この性質を利用して、近赤外光域の光を励起光とする生体イメージングに好適に用いることができる。また、本発明の蛍光プローブは、有機色素と異なり退色することなく化学的に安定であり、量子ドットのように粒子径にも制限がないので、市販の励起用光源を用いた多彩な生体イメージング法における蛍光プローブとして好適である。特に、上記の励起光は、ヒトを含む動物の体表面から内部への透過性に優れるので、表面から２０ｍｍ程度の深さまでの範囲における所望の部位をより詳しく観察することができる。
本発明における希土類元素のイオンが、Ｙｂイオン、Ｎｄイオン、Ｓｍイオン及びＰｒイオンから選ばれた少なくとも１種であるので、近赤外光域の波長の光であって、励起光と異なる波長の発光（蛍光）を容易に得ることができる。
例えば、希土類元素のイオンとして、Ｙｂイオン及びＮｄイオンの両方を含む場合は、波長８０８ｎｍの光の照射で、生体透過性の高い１０００ｎｍ帯（９５０〜１０５０ｎｍを含む）の発光が得られる。そして、希土類元素のイオンとして、Ｎｄイオンを単独で用いた場合は、波長８０８ｎｍの光の照射で、安価なＳｉ系検出器を用いることができる９００ｎｍ帯（８６０〜９３０ｎｍを含む）の発光が得られる。また、希土類元素のイオンとして、Ｙｂイオンを単独で用いた場合は、波長８０８ｎｍの光の照射で、１０００ｎｍ帯（９５０〜１０５０ｎｍを含む）の発光が得られる。
本発明におけるガラスが、ＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスであるので、励起光及び蛍光の波長の透過性に優れ、高い発光強度が得られる。
また、粉体を構成する希土類元素の含有割合が、蛍光プローブを構成する原子の合計量に対して０．４〜２．０ａｔ％である場合には、より高い蛍光強度を得ることができる。
本発明の蛍光プローブの製造方法によれば、蛍光プローブを効率良く製造することができる。溶融工程によりガラス原料等を溶融した後、冷却工程及び破砕工程を経て、蛍光プローブを作製するため、自由度の大きい製造方法とすることができる。また、上記のように、ガラス組成を広く選択することができるので、破砕特性及び発光特性に合わせて、一般的なガラス原料を自由に扱うことができる。ガラス原料として、ＺｎＯ−Ｂ２Ｏ３系ガラスを形成する原料を用いると、溶融工程における溶融温度を、低下させることができ、ガラス組成物を円滑に形成することが可能となる。尚、引用文献に示された方法のように、溶液からのナノ結晶成長を利用する方法では、結晶母体組成によって成長条件が異なるため、自由度が小さい。更に、ガラス組成物は、一般的な破砕によって微粒化が容易であることから、本発明の蛍光プローブの製造方法は、非常に簡便である。また、凝集防止に関してもガラス組成物を製造後、破砕する際に、一般的な凝集防止剤を使用すればよい。以上より、本発明の蛍光プローブの製造方法によって、製造コスト及び管理コストの低減化を図ることができる。
他の蛍光プローブの製造方法で作製したガラス組成物（破砕前）の外観画像である。 他の蛍光プローブの製造方法で作製した蛍光プローブの粒径分布を示すグラフである。 参考例１で得られた蛍光プローブ粉体に可視光を照射して撮影した画像である。 参考例１で得られた蛍光プローブ（粉体）に近赤外光を照射して撮影した画像である。 参考例１で得られた蛍光プローブ（粉体）に近赤外光を照射して得られた蛍光スペクトルである。 参考例１で得られた蛍光プローブをマウスの尾静脈に注入した後、自然光下にて撮影した画像である。 参考例１で得られた蛍光プローブをマウスの尾静脈に注入した後、近赤外光を照射して撮影した画像である。 参考例１で得られた蛍光プローブをマウスの肺に集積させた後、自然光下にて撮影した画像である。 参考例１で得られた蛍光プローブをマウスの肺に集積させた後、近赤外光を照射して撮影した画像である。 参考例１で得られた蛍光プローブをマウスの皮膚下に注入する前に、近赤外光を照射して撮影した画像である。 参考例１で得られた蛍光プローブをマウスの皮膚下に注入した後、近赤外光を照射して撮影した画像である。 実施例１で得られた蛍光プローブ粉体に近赤外光を照射して得られた蛍光スペクトルである。 参考例４で得られた蛍光プローブ粉体に近赤外光を照射して得られた蛍光スペクトルである。 実施例２で得られた蛍光プローブ粉体に近赤外光を照射して得られた蛍光スペクトルである。 実施例３で得られた蛍光プローブ粉体に近赤外光を照射して得られた蛍光スペクトルである。
１．蛍光プローブ
本発明の蛍光プローブは、近赤外光域の波長の光で励起されて該波長以外の近赤外光域の波長の光を発するＹｂイオン、Ｎｄイオン、Ｓｍイオン及びＰｒイオンから選ばれた少なくとも１種の希土類元素のイオンを含む蛍光プローブであって、該イオンを含むＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスのガラス粉体からなることを特徴とする。本発明における近赤外光域の波長とは、７５０ｎｍから２５００ｎｍ程度の波長範囲を意味し、好ましくは８００ｎｍから１２００ｎｍの波長範囲である。
尚、本明細書において、Ｙｂ、Ｎｄ、Ｔｍ、Ｓｍ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｄｙ及びＰｒは、希土類元素のイッテルビウム（Ｙｂ）、ネオジム（Ｎｄ）、ツリウム（Ｔｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）及びプラセオジム（Ｐｒ）を示す。
本発明の蛍光プローブを構成するガラス粉体は、Ｙｂイオン、Ｎｄイオン、Ｓｍイオン及びＰｒイオンから選ばれた少なくとも１種の希土類元素のイオンが、ＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスの中に分散された粉体である。これは、ガラスの中に希土類元素のイオンが散らばって含まれている状態を意味し、希土類元素のイオンによる特定の化学構造体を形成している状態ではない。尚、本発明の蛍光プローブでは、希土類元素のイオンは、三価のイオンとして存在している。
本発明の蛍光プローブに含まれる希土類元素のイオンは、その励起帯に相当する波長の光により励起され、励起状態から基底状態へ緩和する際に発光する。本発明の蛍光プローブにおいて、希土類元素のイオンの励起帯に相当する波長の光が近赤外光域にあり、発光する光の波長が、近赤外光域にあり、且つ、励起光と異なる波長であることから、励起光以外の波長の光を利用している蛍光プローブであるといえる。また、希土類元素のイオンが、励起光及び蛍光の透過性に優れたガラスの中に含まれることから、希土類元素のイオンの発光強度を低減させることなく、蛍光プローブにおける十分な発光強度を得ることができる。
本発明の蛍光プローブに用いる希土類元素のイオンは、Ｙｂイオン、Ｎｄイオン、Ｓｍイオン及びＰｒイオンから選ばれた少なくとも１種である。
例えば、発光中心としてＹｂイオン及びＮｄイオンを含有する蛍光プローブは、８０８ｎｍ付近を含む光の受光により、２つのイオンが励起され、８５０ｎｍ〜１１００ｎｍの近赤外光域で発光する。このように、励起光と異なる波長で発光し、生体の観察に適した蛍光プローブとすることができる。
本発明の蛍光プローブを構成する粉体中の希土類元素の含有割合の下限値は、発光強度の観点から、蛍光プローブを構成する原子の合計量に対して、好ましくは０．０５ａｔ％であり、より好ましくは０．４ａｔ％、更に好ましくは０．７ａｔ％である。また、上限値は、通常、１０ａｔ％、好ましくは７ａｔ％、より好ましくは３．４ａｔ％、更に好ましくは２．０ａｔ％である。希土類元素のイオンの含有割合が多過ぎると、濃度消光が生じることがある。そのため、含有割合は、濃度消光が生じない範囲で、希土類元素のイオンの種類等に応じて、適宜、設定すればよい。
本発明におけるガラス粉末を構成するＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスは、ガラス転移現象を示す無機化合物からなる非晶質固体である。この非晶質固体は、公知の方法により粉砕される結晶と同程度の剛性を持つ。
本発明の蛍光プローブの形態は、粉体であり、形状は、球体、楕円球体、多面体（立方体、直方体、八面体等）等の塊状；断面が、円形、楕円形又は多角形の線状（直線体、曲線体）等とすることができる。この蛍光プローブの大きさは、具体的には、電子顕微鏡、レーザー散乱計等で測定される最大長さの上限値が、好ましくは１０μｍ、より好ましくは５μｍ、更に好ましくは１μｍ以下である。但し、下限値は、通常、０．１μｍである。蛍光プローブの発光強度は、粉体の体積に依存するので、最大長さの下限値が０．１μｍであれば、十分な発光強度を得ることができる。尚、蛍光プローブが小さければ、ヒトを含む動物の毛細血管内を移動させることが容易となり好ましい。生体イメージングに好ましい形状は、尖った部位ができるだけ少ない形状であり、多面体や球体に近い形状がより好ましい。
２．蛍光プローブの製造方法
本発明の蛍光プローブの製造方法は、Ｙｂ、Ｎｄ、Ｓｍ及びＰｒから選ばれた少なくとも１種の希土類元素を含む化合物（以下、単に「希土類化合物」ともいう）と、ＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスのガラス原料とを溶融する溶融工程と、上記溶融工程により得られた溶融物を冷却し、上記希土類元素のイオンを含むガラス組成物を作製する冷却工程と、上記ガラス組成物を破砕し、粉体を得る破砕工程と、を備えることを特徴とする。
本発明の製造方法では、希土類元素を結晶中の特定の位置に取り込ませなければならない技術と異なり、単純に、溶融工程及び冷却工程により、ガラス組成物の中に希土類元素のイオンが取り込まれるため、製造上のテクニックを必要としない。
上記溶融工程は、希土類化合物と、ガラス原料とを含有する混合物を溶融する工程である。この溶融工程により、希土類化合物とガラス原料の両方が溶融して混ざり合った溶融物が生成する。
上記希土類化合物は、溶融工程でガラス原料とともに溶融混合物を形成し、冷却工程の後、ガラス組成物の中に希土類元素のイオンを生じさせる化合物である。このような化合物としては、希土類元素を含む酸化物、水酸化物、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩及びハロゲン化物等が挙げられる。このような希土類化合物は、１種のみでもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのうち、生体に対する光透過性の高い蛍光が得られることから、Ｙｂ、Ｎｄ、Ｓｍ及びＰｒから選ばれた希土類元素の酸化物が特に好ましい。具体的には、ガラスの中に、Ｙｂイオン又はＮｄイオンを分散させた蛍光プローブを製造する場合、希土類化合物として、Ｙｂ２Ｏ３又はＮｄ２Ｏ３が好ましく用いられる。
上記ガラス原料は、ＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスの原料であり、加熱により溶融物とされた後に冷却されて、ガラスを形成することができる材料である。一般的なガラス原料としては、よく知られたガラス形成化合物を用いることができ、ＳｉＯ２、ＧｅＯ２、Ｐ２Ｏ５、Ｂ２Ｏ３等が挙げられ、ガラスの諸物性を制御するために、Ｂｉ２Ｏ３、ＺｎＯ、ＣａＯ等の修飾酸化物等を併用する。例えば、ガラス粉末を構成するガラスをＢｉ２Ｏ３−Ｂ２Ｏ３系ガラスとする場合、Ｂｉ２Ｏ３及びＨ３ＢＯ３が用いられる。
製造コストを考慮すると、形成されるガラスの融点が低くなるガラス原料を用いることが好ましい。また、適切な破砕特性が得られるガラスが得られるように、ガラス中の各酸化物の割合を調整することが好ましい。
溶融工程における、希土類化合物及びガラス原料の混合比は、蛍光プローブの使用目的に応じて、適宜、選択される。上記のように、本発明の蛍光プローブを構成する原子の合計量に対して、希土類元素の好ましい含有割合が０．０５〜１０ａｔ％であるので、希土類化合物の使用量は、希土類化合物及びガラス原料の合計量に対して、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ％であり、より好ましくは１〜５ｍｏｌ％である。希土類化合物の使用量が、上記範囲内であると、濃度消光が抑制され、発光特性に優れる蛍光プローブが得られる。
上記溶融工程において、溶融物を調製する方法及び溶融条件は、特に限定されない。
溶融工程における溶融温度は、希土類化合物及びガラス原料の種類により、適宜、選択されるが、好ましくは８００℃〜１５００℃であり、より好ましくは９００℃〜１３５０℃、更に好ましくは１０００℃〜１２５０℃である。
また、溶融工程における溶融時間は、好ましくは５〜６０分であり、より好ましくは１０〜１５分である。
上記冷却工程は、溶融工程で得られた溶融物を冷却し、希土類元素のイオンを含むガラス組成物を得る工程である。溶融物の冷却方法及び冷却条件は、特に限定されない。例えば、大気雰囲気下での放置による空冷等が挙げられる。冷却速度は、例えば、毎秒数ケルビンとすることができる。
上記破砕工程は、冷却工程で得られたガラス組成物を破砕して、粉体を得る工程である。この破砕工程で得られた粉体を蛍光プローブとして用いることができる。ガラス組成物の粉砕方法は、特に限定されず、ガラス等の塊状物を粉砕し、微粒化する、公知の方法を適用することができる。例えば、乳棒及び乳鉢による破砕、ボールミルによる破砕等が挙げられる。これらの粉砕方法は、組み合わせて行うこともできる。
以下、Ｙｂイオン及びＮｄイオンを含有するＢｉ ２ Ｏ ３ −Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスの粉体からなる蛍光プローブの製造方法の１例を示す。
Ｙｂイオン及びＮｄイオンを含有するＢｉ２Ｏ３−Ｂ２Ｏ３系ガラスの粉体からなる蛍光プローブは、Ｙｂ２Ｏ３粉末、Ｎｄ２Ｏ３粉末、Ｂｉ２Ｏ３粉末及びＨ３ＢＯ３粉末を、所定の割合で混合し、加熱して混合物を溶融した後、溶融物を冷却し、更に、冷却物（ガラス組成物）を粉砕することにより作製される。混合物を溶融する場合には、アルミナ坩堝等が用いられ、溶融温度は、例えば、１０００℃〜１２５０℃に設定される。また、冷却は、ステンレス製又はカーボン製の鋳型に融液（溶融物）を流し出し、空冷すればよい。尚、１０００℃を超える温度で溶融を行うと、Ｂｉイオンが還元されるため、この場合は、Ｓｂ２Ｏ３粉末を使用すると、Ｂｉイオンの還元を抑制することができる。希土類化合物とガラス原料との合計を１００ｍｏｌ％としたときに、Ｙｂ２Ｏ３の使用量が５．０ｍｏｌ％以下、かつ、Ｎｄ２Ｏ３の使用量が６．０ｍｏｌ％以下であれば、１０００℃での溶融物を冷却することにより、ガラス組成物を作製することができる。蛍光プローブの原料として、Ｙｂ２Ｏ３を１．０ｍｏｌ％、Ｎｄ２Ｏ３を１．０ｍｏｌ％、Ｂｉ２Ｏ３を４８．５ｍｏｌ％、Ｂ２Ｏ３を４８．５ｍｏｌ％、Ｓｂ２Ｏ３を１．０ｍｏｌ％として作製したガラス組成物（破砕前）の外観画像を図１に示す。
次いで、得られたガラス組成物を、上記例示した方法により破砕することにより、蛍光プローブを作製できる。尚、破砕条件を変えることによって、最終的に得られる蛍光プローブの粒径分布を、例えば、図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すように制御できる。
希土類元素のイオン源として、Ｙｂ２Ｏ３及びＮｄ２Ｏ３を用いる場合、Ｙｂ２Ｏ３及びＮｄ２Ｏ３の使用量並びにガラス原料の組成は、所望の発光特性が得られるように、適宜、変更してもよい。例えば、希土類化合物とガラス原料との合計を１００ｍｏｌ％としたときに、Ｙｂ２Ｏ３を５．０ｍｏｌ％、Ｎｄ２Ｏ３を２．９ｍｏｌ％、Ｂｉ２Ｏ３を４３．９ｍｏｌ％、Ｂ２Ｏ３を４８．１ｍｏｌ％として作製した蛍光プローブは、十分な発光特性を与える。また、Ｙｂ２Ｏ３及びＮｄ２Ｏ３の使用量を、それぞれ、５．０ｍｏｌ％及び３．０ｍｏｌ％に固定して、Ｂｉ２Ｏ３及びＢ２Ｏ３の使用量をそれぞれ、９１．９ｍｏｌ％及び０ｍｏｌ％、８２．４ｍｏｌ％及び９．５ｍｏｌ％、７３．２ｍｏｌ％及び１８．８ｍｏｌ％、６４．５ｍｏｌ％及び２７．３ｍｏｌ％、５５．２ｍｏｌ％及び３３．７ｍｏｌ％、又は、３６．６ｍｏｌ％及び５５．４ｍｏｌ％と変化させることもできる。
本発明の蛍光プローブは、生体イメージングに好適であり、蛍光プローブを生体内に導入する方法は、以下に例示される。
（１）蛍光プローブを、シリンジにより、直接、注射する方法
（２）蛍光プローブと、液体とを含む分散液を、シリンジにより、直接、注射する方法
（３）蛍光プローブをエンドサイトーシスやファゴサイトーシスによって取り込んだ細胞を、シリンジにより注射する方法
（４）蛍光プローブを細胞膜に標識した細胞を、シリンジにより注射する方法
（５）蛍光プローブを標識した抗体や化学物質をシリンジにより注射する方法
そして、生体外部から励起光を照射し、蛍光プローブからの発光を観察する。その際、励起光の波長と発光の波長とが異なるため、励起光を除去する光学フィルターを用いるとよい。励起光の光源としては、市販の光源を用いればよく、発光ダイオードやレーザダイオードのような半導体発光デバイスが好ましい。希土類イオン分散ガラス蛍光プローブの発光は、Ｓｉ系ＣＣＤカメラ、ＩｎＧａＡｓカメラ等の既存の２次元検出器を用いればよい。
本発明の蛍光プローブは、化学的に安定であるので、生体内における所望の部位に導入しても、変質又は分解を引き起こすことがないので、近赤外光を照射することにより、十分な発光強度を得ることができる。
以下、実施例を挙げて、本発明の実施の形態を、更に具体的に説明する。但し、本発明は、これらの実施例に何ら制約されるものではない。
参考例１
（１）蛍光プローブの調製
希土類元素化合物として、１ｍｏｌ％のＹｂ２Ｏ３粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）及び４ｍｏｌ％のＮｄ２Ｏ３粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）と、ガラス原料として、４７ｍｏｌ％のＢｉ２Ｏ３粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）、Ｂ２Ｏ３換算で４７ｍｏｌ％となる量のＨ３ＢＯ３粉末（ナカライテスク社製 特級試薬）、及び、１ｍｏｌ％のＳｂ２Ｏ３粉末（和光純薬工業株式会社製 試薬）と（希土類元素化合物及びガラス原料を合わせて１００ｍｏｌ％とする）を、チャック袋（ｚｉｐｐｅｒ ｂａｇ）中で混合し、蛍光プローブの原料である混合粉末を調製した。次いで、混合粉末をアルミナ坩堝に投入し、大気雰囲気下、１２５０℃で１０分間加熱をして、溶融させた。続いて、ステンレス鋳型に溶融物（融液）を流し出して、室温（２０℃程度）で空冷させて、希土類イオンが分散したガラス組成物を得た。その後、得られたガラス組成物を、乳棒、乳鉢及びボールミルにより破砕し、レーザー散乱計により測定される最大長さが０．１μｍ以上１μｍ以下の粉体混合物（蛍光プローブ）を作製した。希土類元素（Ｙｂ及びＮｄの含有量の合計）の含有割合は、蛍光プローブを構成する全原子の合計に対して、２．０ａｔ％であった。
上記により得られた蛍光プローブに対して、可視光を照射したとき、及び、波長８０８ｎｍを含む近赤外光を照射したときの蛍光プローブの画像を、それぞれ、図３及び図４に示す。波長８０８ｎｍを含む近赤外光を照射した場合、励起されて蛍光を発して、蛍光プローブの粉末形状を反映していることが確認された。また、蛍光スペクトル測定により、蛍光の波長は８５０〜１１００ｎｍであることを確認した（図５参照）。
（２）生体イメージング評価
蛍光プローブ０．１ｇを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）１ｍｌに投入し、撹拌して、蛍光プローブが懸濁した分散液を得た。得られた分散液を、２６ゲージ針の付いた１ｍｌシリンジに充填し、マウスの尾静脈から２００μｌ注入した。図６及び図７に、自然光の下でマウス尾部を撮影した画像、及び、８０８ｎｍを含む近赤外光を照射して励起させ、マウス尾部に含まれる蛍光プローブから発せられた蛍光（波長８５０〜１１００ｎｍの光）を撮影した画像を示す。
図７に示す画像によると、マウスの尾静脈中の蛍光プローブの発光が明瞭に観察できた（２つの矢印の間の発光線参照）。波長８０８ｎｍの光は、生体透過性の比較的高い励起極大波長の１つであるため、尾静脈中の蛍光プローブを十分励起することができた。そして、蛍光プローブの蛍光は、波長８５０〜１１００ｎｍの光であるため、蛍光プローブが尾静脈の中にあるにも関わらず、この光が生体を透過しマウスの尾の外から容易に観察できた。更に、マウスの尾静脈の周辺の発光は観察されず、低侵襲で、バックグラウンド発光の無い尾静脈の観察ができた。
参考例２
参考例１と同様の方法で調製した蛍光プローブの分散液を、参考例１と同様の方法により、マウスの体内に注入し、蛍光プローブを肺に集積させた。図８及び図９に、マウスの皮膚のみを切開後、肺を含む部分を撮影した画像を示す。図８は、自然光の下で撮影した画像であり、図９は、８０８ｎｍを含む近赤外光を照射して励起させ、蛍光プローブから発せられた蛍光（波長８５０〜１１００ｎｍの光）を撮影した画像である。
図８に示される画像から、蛍光プローブの集積は明瞭ではないが、図９に示される画像によると、肺へ集積した蛍光プローブの発光が明確に観察された。尚、皮膚を切開せずに、除毛だけした場合でも、近赤外光の照射により、同様の蛍光観察を行うことができた。このように、低侵襲で、バックグラウンド発光の無い肺のイメージングができた。尚、最終的には、開腹によって肺への集積を確認した。
参考例３
参考例１と同様の方法で調製した蛍光プローブの分散液を、参考例１と同様の方法により、マウスの皮膚下に注入した。蛍光プローブを注入する前と、注入した後に、同じ位置を撮影した画像を図１０及び図１１に示す。尚、いずれの場合も８０８ｎｍの励起光を照射した。
図１０に示すように、蛍光プローブをマウスの皮膚下に注入する前の画像では、発光は観察されなかった。一方、図１１に示すように、蛍光プローブをマウスの皮膚下に注入した後では、皮膚下の注入部のみから８５０〜１１００ｎｍの蛍光が明確に観察された。このように、皮膚下に存在する蛍光プローブのみを低侵襲で観察することができた。
参考例１〜３では、微粒化された蛍光プローブを直接用いているが、蛍光プローブの表面を、ポリマー等でコーティングしたり、抗体や薬物などに標識したりすることも可能である。蛍光プローブの標識を行う場合には、抗体等を、蛍光プローブの表面の官能基（例えば、水酸基）に、直接、結合させる方法、蛍光プローブの表面を、シランカップリング剤（例えば、３−アミノプロピルトリメトキシシラン）等でコーティングした後、抗体等を結合させる方法等を適用することができる。
実施例１（蛍光プローブの製造）
希土類元素化合物として、１ｍｏｌ％のＹｂ２Ｏ３粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）、及び、１ｍｏｌ％のＮｄ２Ｏ３粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）と、ガラス原料として、５４ｍｏｌ％のＺｎＯ粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）、及び、Ｂ２Ｏ３換算で４４ｍｏｌ％となる量のＨ３ＢＯ３粉末（ナカライテスク社製 特級試薬）と（希土類元素化合物及びガラス原料を合わせて１００ｍｏｌ％とする）を、混合し、蛍光プローブの原料である混合粉末を調製した。次いで、混合粉末をアルミナ坩堝に投入し、大気雰囲気下、１２５０℃で１０分間加熱をして、溶融させた以外は、参考例１と同様にして、蛍光プローブを作製した。希土類元素（Ｙｂ及びＮｄの含有量の合計）の含有割合は、蛍光プローブを構成する全原子の合計に対して、０．８ａｔ％であった。
上記により得られた蛍光プローブの蛍光スペクトル測定により、蛍光の波長は８７０〜１１００ｎｍであることを確認した（図１２参照）。
参考例４（蛍光プローブの製造）
希土類元素化合物として、１ｍｏｌ％のＥｒ２Ｏ３粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）と、ガラス原料として、４９ｍｏｌ％のＢｉ２Ｏ３粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）、Ｂ２Ｏ３換算で４９ｍｏｌ％となる量のＨ３ＢＯ３粉末（ナカライテスク社製 特級試薬）、及び、１ｍｏｌ％のＳｂ２Ｏ３粉末（和光純薬工業株式会社製 試薬）と（希土類元素化合物及びガラス原料を合わせて１００ｍｏｌ％とする）を、混合し、蛍光プローブの原料である混合粉末を調製した。次いで、混合粉末をアルミナ坩堝に投入し、大気雰囲気下、１２５０℃で１０分間加熱をして、溶融させた以外は、参考例１と同様にして、蛍光プローブを作製した。希土類元素であるＥｒの含有割合は、蛍光プローブを構成する全原子の合計に対して、０．４ａｔ％であった。
上記により得られた蛍光プローブの蛍光スペクトル測定により、蛍光の波長は１４４０〜１６４０ｎｍであることを確認した（図１３参照）。
実施例２（蛍光プローブの製造）
希土類元素化合物として、１ｍｏｌ％のＳｍ２Ｏ３粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）と、ガラス原料として、５４．５ｍｏｌ％のＺｎＯ粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）、及び、Ｂ２Ｏ３換算で４４．５ｍｏｌ％となる量のＨ３ＢＯ３粉末（ナカライテスク社製 特級試薬）と（希土類元素化合物及びガラス原料を合わせて１００ｍｏｌ％とする）を、混合し、蛍光プローブの原料である混合粉末を調製した。次いで、混合粉末をアルミナ坩堝に投入し、大気雰囲気下、１２５０℃で１０分間加熱をして、溶融させた以外は、参考例１と同様にして、蛍光プローブを作製した。希土類元素であるＳｍの含有割合は、蛍光プローブを構成する全原子の合計に対して、０．６ａｔ％であった。
上記により得られた蛍光プローブの蛍光スペクトル測定により、蛍光の波長は７５０〜１０５０ｎｍであることを確認した（図１４参照）。
実施例３（蛍光プローブの製造）
希土類元素化合物として、Ｐｒ２Ｏ３換算で１ｍｏｌ％となる量のＰｒ６Ｏ１１粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）と、ガラス原料として、５４．５ｍｏｌ％のＺｎＯ粉末（関東化学社製 素材研究用試薬）、及び、Ｂ２Ｏ３換算で４４．５ｍｏｌ％となる量のＨ３ＢＯ３粉末（ナカライテスク社製 特級試薬）と（希土類元素化合物及びガラス原料を合わせて１００ｍｏｌ％とする）を、混合し、蛍光プローブの原料である混合粉末を調製した。次いで、混合粉末をアルミナ坩堝に投入し、大気雰囲気下、１２５０℃で１０分間加熱をして、溶融させた以外は、参考例１と同様にして、蛍光プローブを作製した。希土類元素であるＰｒの含有割合は、蛍光プローブを構成する全原子の合計に対して、０．６ａｔ％であった。
上記により得られた蛍光プローブの蛍光スペクトル測定により、蛍光の波長は７６０〜１１００ｎｍであることを確認した（図１５参照）。
本発明の蛍光プローブは、近赤外光を用いた生体イメージングに好適である。

Claims (8)

  1. 近赤外光域の波長の光で励起されて該波長以外の近赤外光域の波長の光を発するＹｂイオン、Ｎｄイオン、Ｓｍイオン及びＰｒイオンから選ばれた少なくとも１種の希土類元素のイオンを含む蛍光プローブであって、該イオンを含むＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスのガラス粉体からなることを特徴とする蛍光プローブ。
  2. 前記近赤外光域が、８００〜１２００ｎｍの範囲にある波長である請求項１に記載の蛍光プローブ。
  3. 前記希土類元素の含有割合が前記蛍光プローブを構成する原子の合計量に対して０．４〜２．０ａｔ％である請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
  4. 前記粉体の最大長さを測定した際の下限値が０．１μｍであり、上限値が１．０μｍである請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光プローブ。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光プローブを製造する方法であって、
    Ｙｂ、Ｎｄ、Ｓｍ及びＰｒから選ばれた少なくとも１種の希土類元素を含む化合物と、ＺｎＯ−Ｂ ２ Ｏ ３ 系ガラスのガラス原料とを溶融する溶融工程と、
    前記溶融工程により得られた溶融物を冷却し、前記希土類元素のイオンを含むガラス組成物を作製する冷却工程と、
    前記ガラス組成物を破砕し、粉体を得る破砕工程と、を備えることを特徴とする蛍光プローブの製造方法。
  6. 前記希土類元素を含む化合物が、酸化物である請求項５に記載の蛍光プローブの製造方法。
  7. 前記溶融工程における温度が９００℃〜１３５０℃である請求項５又は６に記載の蛍光プローブの製造方法。
  8. 前記破砕工程において、乳棒及び乳鉢による破砕、並びに／又は、ボールミルによる破砕が行われる請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛍光プローブの製造方法。
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