JP6014865B2 - Liquid dividing method and liquid dividing kit - Google Patents

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Description

本発明は、液体分割方法及び液体分割用キットに関する。   The present invention relates to a liquid dividing method and a liquid dividing kit.

スクリーニングの分野では、多種多様で微量な液体試料を並列的に取り扱う技術が求められている。液体試料の定量的分取は中心的技術の一つである。現在、ウェル容量が大きく、並列性も低いマイクロプレートが多用されており、分取操作は手動多連ピペットや自動ロボットによって行われている。しかし、操作の煩雑性、効率性、経済性などの観点から新しいデバイスおよび操作技術の開発が期待されている。   In the field of screening, a technique for handling a wide variety of minute liquid samples in parallel is required. Quantitative fractionation of liquid samples is one of the central techniques. Currently, microplates with large well capacity and low parallelism are frequently used, and sorting operations are performed by manual multiple pipettes or automatic robots. However, new devices and operation techniques are expected to be developed from the viewpoints of operational complexity, efficiency, and economy.

本発明者らは、多数の微量液体試料を多段階に取り扱うデバイスとしてMMV(Multi Micro Vessel、多重並列微小容器)チップを開発した(図１、特許文献1参照)。このチップは、例えば、1インチ角に1024個のウェル(典型的にはウェル直径約0.6mm、深さ約2mm、容積約0.5マイクロリットル)をマトリクス状に有している。そして、このチップを2つ、互いが有するガイドピンを利用して各チップのウェルの開口面を合わせると、双方の全ウェルの開口部が互いに向き合って重なるように設計することができる(図２参照)。 The present inventors, MMV multiple trace liquid sample as a device for handling the multi-stage (M ulti M icro V essel, multiple parallel microvessel) has developed a chip (see FIG. 1, Patent Document 1). This chip has, for example, 1024 wells (typically, a well diameter of about 0.6 mm, a depth of about 2 mm, and a volume of about 0.5 microliters) in a matrix. Then, when the opening surfaces of the wells of the two chips are aligned using the guide pins of the two chips, the openings of all the wells can be designed to face each other and overlap each other (FIG. 2). reference).

WO2006/088162 A1WO2006 / 088162 A1

MMVに充填された液体試料の一部を分取する必要があるときは、一方のMMVのウェル容積を他方のMMVのウェル容積より小さいMMVを準備し、ウェル容積の大きいMMVからウェル容積の小さいMMVに遠心により液体試料を部分的に移送することができる。   When it is necessary to sort a part of the liquid sample filled in the MMV, prepare an MMV with a well volume of one MMV smaller than the well volume of the other MMV, and from an MMV with a large well volume to a well with a small well volume The liquid sample can be partially transferred to the MMV by centrifugation.

しかし、上記方法では、ウェル容積の異なる二種類のMMVチップを準備する必要がある。さらに、上記方法では、ウェル容積の小さいMMVからウェル容積の大きいMMVへ液体試料の一部を分取することはできない。   However, in the above method, it is necessary to prepare two types of MMV chips having different well volumes. Furthermore, in the above method, a part of the liquid sample cannot be separated from an MMV with a small well volume to an MMV with a large well volume.

そこで本発明の第１の目的は、上記MMVチップのような微量液体試料を格納できる多数のウェルを有するマルチウェルプレートを二つ用いて、液体試料を分割するに際して、二つのマルチウェルプレートが有するウェル容積による制限があるという課題を解決できる、新たな液体分割方法及びこの方法に用いられる液体分割用キットを提供することにある。   Accordingly, a first object of the present invention is to use two multiwell plates when dividing a liquid sample using two multiwell plates having a large number of wells capable of storing a small amount of liquid sample such as the MMV chip. It is an object of the present invention to provide a new liquid dividing method and a liquid dividing kit used in this method, which can solve the problem of the limitation due to the well volume.

さらに、上記特許文献１に記載の方法では、二つのMMV同士を分離する際に、液滴の飛散や毛細管現象などにより、ウェル中の試料が相互に行き来して、試料の相互汚染が発生することも、その後の本発明者らの検討で明らかになった。   Furthermore, in the method described in Patent Document 1, when two MMVs are separated from each other, the samples in the wells come and go from each other due to the scattering of the droplets, capillary action, etc., and the samples are contaminated with each other. This has also been clarified by the subsequent studies by the present inventors.

そこで本発明の第２の目的は、上記MMVチップのような微量液体試料を格納できる多数のウェルを有するマルチウェルプレートを二つ用いて、液体試料を分割するに際して、二つのマルチウェルプレートが有するウェル容積による制限があるという課題及びウェル間の試料の相互汚染という課題を解決できる、新たな液体分割方法及びこの方法に用いられる液体分割用キットを提供することにある。   Therefore, a second object of the present invention is to use two multiwell plates when dividing a liquid sample by using two multiwell plates having a large number of wells capable of storing a small amount of liquid sample such as the MMV chip. An object of the present invention is to provide a new liquid dividing method and a liquid dividing kit used in this method, which can solve the problem that there is a limitation due to the well volume and the problem of cross-contamination of samples between wells.

上記第１の目的は、下記本発明の態様１Ａ(液体分割方法)および１Ｂ(液体分割用キット)により達成された。
本発明の態様１Ａ
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(1)の少なくとも一部のウェルから、このウェル内に格納された液体の一部を、少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(2)のウェル内に移行させて、前記液体を分割する方法であって、
(A)前記マルチウェルプレート(1)と前記マルチウェルプレート(2)とを、膜の厚み方向に貫通する複数の貫通孔を有する隔離シートを介在させて、前記マルチウェルプレート(1)および(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように、かつ前記貫通孔が前記対向するウェル同士の各開口に対して少なくとも２つ存在するように固定する工程、及び
(B)前記隔離シートを介在させて固定した前記マルチウェルプレート(1)および(2)に対して、前記ウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力を与える工程、を含み、
工程(B)において、前記マルチウェルプレート(1)および(2)に対して与えられる遠心力の向きは、隔離シートを平面視した状態において、ウェルの各開口に対して少なくとも２つ存在する貫通孔のうちの２つの貫通孔Ａ及びＢの開口縁に対して遠心力に直交する接線を想定し、
貫通孔Ａにおける、遠心力を付与する回転軸に近い側の接線をＡ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＡ２とし、
貫通孔Ｂにおける、前記回転軸に近い側の接線をＢ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＢ２とし、
前記接線Ａ１は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も近い側の接線であり、
前記接線Ｂ２は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も遠い側の接線であり、
前記接線Ａ１は前記接線Ｂ１より前記回転軸に近い側に位置し、かつ
前記接線Ａ２は前記接線Ｂ２より前記回転軸に近い側に位置するように設定され、
それにより、前記マルチウェルプレート(1)の前記ウェル内に格納された液体の一部が前記マルチウェルプレート(2)の前記ウェル内に前記少なくとも２つの貫通孔の少なくとも１つを通過して移行する、前記方法。 The first object has been achieved by the following aspects 1A (liquid dividing method) and 1B (liquid dividing kit) of the present invention.
Aspect 1A of the present invention
A portion of the liquid stored in at least one of the wells of the multi-well plate (1) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface, and a plurality of wells on at least one main surface A multi-well plate (2) made of a substrate having
(A) The multi-well plate (1) and the multi-well plate (2) are interposed with an isolation sheet having a plurality of through holes penetrating in the thickness direction of the film, the multi-well plate (1) and ( A step of fixing so that at least some of the wells included in 2) face each other and at least two through-holes exist in each opening of the facing wells; and
(B) applying a centrifugal force to the multi-well plate (1) and (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween in a direction perpendicular to the bottom direction from the opening of the well,
In the step (B), the direction of the centrifugal force applied to the multi-well plates (1) and (2) is at least two penetrations for each opening of the well in a state where the isolation sheet is viewed in plan view. Assuming a tangent line perpendicular to the centrifugal force with respect to the opening edges of two through holes A and B of the holes,
In the through-hole A, the tangent on the side close to the rotation axis that applies the centrifugal force is A1, and the tangent on the side far from the rotation axis is A2.
In the through-hole B, the tangent on the side close to the rotation axis is B1, and the tangent on the side far from the rotation axis is B2.
The tangent line A1 is a tangent line closest to the rotation axis among tangent lines orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent B2 is a tangent farthest from the rotation axis among tangents orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent line A1 is positioned closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is set closer to the rotation axis than the tangent line B2.
Thereby, a part of the liquid stored in the well of the multi-well plate (1) passes through at least one of the at least two through holes into the well of the multi-well plate (2). Said method.

態様１Ｂ
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(1)、
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(2)、及び
膜の厚み方向に貫通する複数の貫通孔を有する隔離シートを含む液体分割用キットであって、
前記貫通孔は、前記マルチウェルプレート(1)と前記マルチウェルプレート(2)とを、前記隔離シートを介在させて、前記マルチウェルプレート(1)および(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように固定したときに、前記マルチウェルプレート(1)及び(2)の少なくとも一方のマルチウェルプレートの少なくとも一部のウェルの開口に対して少なくとも２つ存在するように設けられ、
前記隔離シートを介在させて固定したマルチウェルプレート(1)および(2)は、前記ウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力を与えるように用いられる、
前記キット。 Aspect 1B
A multiwell plate (1) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface;
A multi-well plate (2) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface, and a liquid dividing kit comprising a separation sheet having a plurality of through holes penetrating in the thickness direction of the film,
The through hole is formed by interposing the multi-well plate (1) and the multi-well plate (2) with the isolation sheet interposed therebetween, so that at least some of the wells included in the multi-well plates (1) and (2) Are fixed so as to face each other, at least two of the wells of at least one of the multiwell plates (1) and (2) are provided so as to exist at least two wells,
The multi-well plates (1) and (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween are used so as to apply a centrifugal force in a direction perpendicular to the direction of the bottom from the opening of the well.
Said kit.

さらに上記第２の目的は、下記本発明の態様２Ａ(液体分割方法)および２Ｂ(液体分割用キット)により達成された。
本発明の態様２Ａ
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(1)の少なくとも一部のウェルから、このウェル内に格納された液体の一部を、少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(2)のウェル内に移行させて、前記液体を分割する方法であって、
(A)前記マルチウェルプレート(1)と前記マルチウェルプレート(2)とを、膜の厚み方向に貫通する複数の貫通孔を有する隔離シートを介在させて、前記マルチウェルプレート(1)および(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように、かつ前記貫通孔が前記対向するウェル同士の各開口に対して少なくとも２つ存在するように固定する工程、
但し、前記隔離シートは少なくとも２層の膜からなり、かつ各膜の前記貫通孔は互いに連通している、
及び
(B)前記隔離シートを介在させて固定した前記マルチウェルプレート(1)および(2)に対して、前記ウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力を与える工程、
但し、工程(B)において、前記マルチウェルプレート(1)および(2)に対して与えられる遠心力の向きは、隔離シートを平面視した状態において、ウェルの各開口に対して少なくとも２つ存在する貫通孔のうちの２つの貫通孔Ａ及びＢの開口縁に対して遠心力に直交する接線を想定し、
貫通孔Ａにおける、遠心力を付与する回転軸に近い側の接線をＡ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＡ２とし、
貫通孔Ｂにおける、前記回転軸に近い側の接線をＢ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＢ２とし、
前記接線Ａ１は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も近い側の接線であり、
前記接線Ｂ２は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も遠い側の接線であり、
前記接線Ａ１は前記接線Ｂ１より前記回転軸に近い側に位置し、かつ
前記接線Ａ２は前記接線Ｂ２より前記回転軸に近い側に位置するように設定され、
それにより、前記マルチウェルプレート(1)の前記ウェル内に格納された液体の一部が前記マルチウェルプレート(2)の前記ウェル内に前記少なくとも２つの貫通孔の少なくとも１つを通過して移行し、
前記工程(B)の後に、(C)前記隔離シートを構成する一方の膜は前記マルチウェルプレート(2)の主表面に配置した状態、前記隔離シートを構成する他方の膜は前記マルチウェルプレート(1)の主表面に配置した状態となるように、前記マルチウェルプレート(2)と前記マルチウェルプレート(1)とを分離する工程、
前記工程(C)の後に、 (D)前記膜を主表面に配置した少なくとも一方のマルチウェルプレートを、各ウェルの開口から底の方向に遠心力を与える工程、及び
(E)工程(D)で遠心力を与えたマルチウェルプレートから前記膜を分離して、ウェル中に分割後の液体を含むマルチウェルプレートを得る工程を含む、前記方法。 Furthermore, the second object has been achieved by the following aspects 2A (liquid dividing method) and 2B (liquid dividing kit) of the present invention.
Aspect 2A of the present invention
A portion of the liquid stored in at least one of the wells of the multi-well plate (1) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface, and a plurality of wells on at least one main surface A multi-well plate (2) made of a substrate having
(A) The multi-well plate (1) and the multi-well plate (2) are interposed with an isolation sheet having a plurality of through holes penetrating in the thickness direction of the film, the multi-well plate (1) and ( 2) the step of fixing so that at least some of the wells possessed by 2) face each other and at least two of the through holes exist with respect to each opening of the facing wells;
However, the separator sheet comprises at least two layers of membranes, and the through holes of each membrane communicate with each other.
as well as
(B) A step of applying a centrifugal force to the multi-well plate (1) and (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween in a direction perpendicular to the bottom direction from the opening of the well,
However, in step (B), there are at least two directions of centrifugal force applied to the multi-well plates (1) and (2) with respect to each opening of the well in a state where the isolation sheet is viewed in plan view. Assuming tangents perpendicular to the centrifugal force with respect to the opening edges of two through holes A and B of the through holes
In the through-hole A, the tangent on the side close to the rotation axis that applies the centrifugal force is A1, and the tangent on the side far from the rotation axis is A2.
In the through-hole B, the tangent on the side close to the rotation axis is B1, and the tangent on the side far from the rotation axis is B2.
The tangent line A1 is a tangent line closest to the rotation axis among tangent lines orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent B2 is a tangent farthest from the rotation axis among tangents orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent line A1 is positioned closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is set closer to the rotation axis than the tangent line B2.
Thereby, a part of the liquid stored in the well of the multi-well plate (1) passes through at least one of the at least two through holes into the well of the multi-well plate (2). And
After the step (B), (C) the one film constituting the isolation sheet is disposed on the main surface of the multiwell plate (2), the other film constituting the isolation sheet is the multiwell plate A step of separating the multiwell plate (2) and the multiwell plate (1) so as to be placed on the main surface of (1),
After the step (C), (D) applying at least one multi-well plate having the membrane disposed on the main surface to a centrifugal force from the opening of each well toward the bottom; and
(E) The method comprising the step of separating the membrane from the multiwell plate applied with centrifugal force in step (D) to obtain a multiwell plate containing the divided liquid in the well.

本発明の態様２Ｂ
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(1)、
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(2)、及び
膜の厚み方向に貫通する複数の貫通孔を有する隔離シートを含む液体分割用キットであって、
前記隔離シートは、少なくとも２層の膜からなり、かつ各膜の貫通孔は、互いに連通しており、
前記貫通孔は、前記マルチウェルプレート(1)と前記マルチウェルプレート(2)とを、前記隔離シートを介在させて、前記マルチウェルプレート(1)および(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように固定したときに、前記マルチウェルプレート(1)及び(2)の少なくとも一方のマルチウェルプレートの少なくとも一部のウェルの開口に対して少なくとも２つ存在するように設けられ、
前記隔離シートを介在させて固定したマルチウェルプレート(1)および(2)は、前記ウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力を与えるように用いられる、前記キット。 Aspect 2B of the present invention
A multiwell plate (1) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface;
A multi-well plate (2) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface, and a liquid dividing kit comprising a separation sheet having a plurality of through holes penetrating in the thickness direction of the film,
The separator sheet is composed of at least two layers of membranes, and the through holes of each membrane communicate with each other,
The through hole is formed by interposing the multi-well plate (1) and the multi-well plate (2) with the isolation sheet interposed therebetween, so that at least some of the wells included in the multi-well plates (1) and (2) Are fixed so as to face each other, at least two of the wells of at least one of the multiwell plates (1) and (2) are provided so as to exist at least two wells,
The kit, wherein the multi-well plates (1) and (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween are used so as to apply a centrifugal force in a direction perpendicular to the bottom direction from the well opening.

本発明の態様１Ａおよび１Ｂによれば、二つのマルチウェルプレートを用いて、二つのマルチウェルプレートが有するウェル容積による制限なしに、液体試料を分割することができる。さらに本発明の態様２Ａおよび２Ｂによれば、二つのマルチウェルプレートを用いて、二つのマルチウェルプレートが有するウェル容積による制限なしに、かつウェル間の試料の相互汚染を抑制して、液体試料を分割することができる。   According to aspects 1A and 1B of the present invention, it is possible to divide a liquid sample using two multiwell plates without being limited by the well volume of the two multiwell plates. Furthermore, according to the aspects 2A and 2B of the present invention, a liquid sample is obtained by using two multi-well plates, without limiting by the well volume of the two multi-well plates, and suppressing cross-contamination of the samples between the wells. Can be divided.

本発明はさらに以下の効果を奏する。
(1)多数の液体試料を一斉に分離処理することができる。
(2)ウェル形状を選択することで、ウェル形状に応じて液体試料を任意の割合に分割することができる。
(3) ウェル寸法を選択することで、サブマイクロリットルからサブミリリットルスケールの液体試料の分離に有効である。
(4)懸濁液やエマルジョンの分割にも利用できる。 The present invention further provides the following effects.
(1) A large number of liquid samples can be separated simultaneously.
(2) By selecting the well shape, the liquid sample can be divided into arbitrary proportions according to the well shape.
(3) By selecting the well size, it is effective for the separation of submicroliter to submilliliter scale liquid samples.
(4) It can also be used to divide suspensions and emulsions.

特許文献1に記載のMMVチップの写真。A photograph of the MMV chip described in Patent Document 1. 特許文献１に記載のMMVチップにおける液体試料分配の説明図。FIG. 6 is an explanatory diagram of liquid sample distribution in the MMV chip described in Patent Document 1. ウェルと貫通孔と遠心力方向との関係を示す説明図。Explanatory drawing which shows the relationship between a well, a through-hole, and a centrifugal force direction. ウェルと貫通孔と遠心力方向との関係を示す説明図。Explanatory drawing which shows the relationship between a well, a through-hole, and a centrifugal force direction. ウェルと貫通孔と遠心力方向との関係を示す説明図。Explanatory drawing which shows the relationship between a well, a through-hole, and a centrifugal force direction. 本発明の方法による液体試料分割の説明図。Explanatory drawing of the liquid sample division | segmentation by the method of this invention. 本発明における液体試料分割の説明図。Explanatory drawing of the liquid sample division | segmentation in this invention. バケット式遠心分離機を用いる場合の説明図。Explanatory drawing in the case of using a bucket-type centrifuge. ウェルの貫通孔と遠心力方向との関係を途中で変えた例の説明図。Explanatory drawing of the example which changed the relationship between the through-hole of a well and a centrifugal force direction on the way. 実施例１における固形物と液体試料あるいは密度の異なる液体試料の分割の説明図。Explanatory drawing of the division | segmentation of the solid sample in Example 1, and a liquid sample or a liquid sample from which a density differs. MMVのウェルの寸法と隔離シートの二つの貫通孔の寸法、及びそれらの位置関係並びに遠心力ｇの向きを示す。The size of the MMV well and the size of the two through holes of the separator sheet, their positional relationship, and the direction of the centrifugal force g are shown.

＜液体分割用キット＞
本発明の液体分割用キットは、
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(1)、
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなるマルチウェルプレート(2)、及び
膜の厚み方向に複数の貫通孔を有する、少なくとも２層の膜からなる隔離シートを含む。 <Liquid splitting kit>
The liquid splitting kit of the present invention is
A multiwell plate (1) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface;
A multi-well plate (2) made of a substrate having a plurality of wells on at least one main surface, and an isolation sheet made of at least two layers of films having a plurality of through holes in the thickness direction of the film.

マルチウェルプレート(1)及び(2)は、少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなる。複数のウェルは、マルチウェルプレートの表裏両主表面に設けられても良いし、いずれか一方の主表面だけに設けられても良い。マルチウェルプレートの一方の主表面に設けられるウェルの数には特に制限はないが、例えば、平方インチ(2.5×2.5cm2)当たり1000個以上であり、1000〜100，000の範囲とすることができる。ウェルの数は、マルチウェルプレートを用いる目的に応じて適宜決定できる。 The multiwell plates (1) and (2) are made of a substrate having a plurality of wells on at least one main surface. The plurality of wells may be provided on both main surfaces of the multi-well plate, or may be provided only on one of the main surfaces. The number of wells provided on one main surface of the multi-well plate is not particularly limited. For example, it should be 1000 or more per square inch (2.5 × 2.5 cm 2 ), and be in the range of 1000 to 100,000. Can do. The number of wells can be appropriately determined according to the purpose of using the multiwell plate.

ウェルの内容量には特に制限はなく、基板の大きさ、ウェルの数、反応(液体の容量)等を考慮して、適宜決定される。ウェルの内容量は、例えば、10μL以下であることができ、1μL以下であることもできる。基板の材質には特に制限はなく、例えば、プラスチック、シリコン、ゲル等からなることができる。   The internal volume of the well is not particularly limited, and is appropriately determined in consideration of the size of the substrate, the number of wells, reaction (liquid volume), and the like. The internal volume of the well can be, for example, 10 μL or less, and can be 1 μL or less. There is no restriction | limiting in particular in the material of a board | substrate, For example, it can consist of a plastics, a silicon | silicone, a gel, etc.

前記ウェルは、ウェルの開口が上向きの状態で、マルチウェルプレートを静置したときには、ウェルの開口がウェルに充填されるべき液体で覆われても、ウェル内に液体は注入されない、寸法、形状および表面状態を有することができる。ウェルの開口がある程度の大きさを有する場合、ウェルを設けた主表面に一定量以上の液体を置けば、液体は自然とウェル内に流れ込み、充填される。しかるに、ウェルの開口の寸法が一定以下になると、表面張力により、液体は自然とはウェル内に流れ込まず、マイクロシリンジ等を使用して、注入する必要がある。このような現象は、ウェルの開口の寸法のみならず、ウェルの開口の形状およびウェルの開口およびウェル内の親液性、濡れ性などの表面状態(特に、開口に近い部分の表面状態)によっても生じる。さらには、ウェル内に注入しようとする液体(液体)の物性よっても、このような現象は生じる。本発明の方法は、このように、ウェルを設けた主表面に一定量以上の液体を置いても、液体が自然とはウェル内に流れ込まない、マルチウェルプレートを用いても、ウェル内の液体を分割することできる。   The well has a size and shape that does not inject liquid into the well even when the well opening is covered with the liquid to be filled into the well when the multiwell plate is left standing with the well opening facing upward. And can have a surface state. When the opening of the well has a certain size, if a certain amount or more of liquid is placed on the main surface provided with the well, the liquid naturally flows into the well and is filled. However, when the size of the opening of the well becomes below a certain level, the liquid does not naturally flow into the well due to surface tension, but must be injected using a microsyringe or the like. This phenomenon depends not only on the size of the well opening, but also on the shape of the well opening and the surface state of the well and the lyophilicity and wettability in the well (particularly the surface state of the portion close to the opening). Also occurs. Furthermore, such a phenomenon occurs depending on the physical properties of the liquid (liquid) to be injected into the well. As described above, the method of the present invention can be applied to the liquid in the well even if a multi-well plate is used in which the liquid does not naturally flow into the well even when a certain amount of liquid is placed on the main surface provided with the well. Can be divided.

ウェルを設けた主表面に一定量以上の液体を置いても、液体が自然とはウェル内に流れ込まないウェルは、ウェルの寸法、形状および表面状態により決まるが、例えば、ウェルの開口の最大内径が、5mm以下である場合、ほとんどの場合、液体は自然とはウェル内に流れ込まない。さらに、3mm以下である場合、通常、液体は自然とはウェル内に流れ込まない。ウェルの開口の最大内径が、1mm以下である場合、液体が自然とウェル内に流れ込むことはない。ウェルの開口の最大内径が、1mm以下である場合、ウェルの開口の最大内径は、例えば、0.1〜0.9mm、好ましくは0.4〜0.8mmの範囲であることができる。   Even if a certain amount or more of liquid is placed on the main surface where the well is provided, the well does not naturally flow into the well.The well is determined by the size, shape and surface condition of the well. However, if it is 5 mm or less, in most cases the liquid will not naturally flow into the well. Furthermore, if it is 3 mm or less, normally the liquid does not flow naturally into the well. When the maximum inner diameter of the well opening is 1 mm or less, the liquid does not naturally flow into the well. When the maximum inner diameter of the well opening is 1 mm or less, the maximum inner diameter of the well opening can be, for example, in the range of 0.1 to 0.9 mm, preferably 0.4 to 0.8 mm.

ウェルの開口の形状には特に制限はないが、例えば、円形、方形（正方形、長方形）、菱形、多角形（例えば、六角形、八角形等）等であることができる。さらに、ウェルの開口は、突出した端(リップ)のあるものや、逆に端を面取りしたものであることもできる。   The shape of the well opening is not particularly limited, and may be, for example, a circle, a rectangle (square, rectangle), a rhombus, a polygon (eg, a hexagon, an octagon, etc.). Further, the well opening may have a protruding end (lip) or a chamfered end.

ウェルの深さ(開口から底までの長さ)は、ウェルの開口の寸法とウェル内に充填する液体の容量等を考慮して、適宜決定される。ウェルの開口寸法やウェル内壁の親液性にもよるが、一般に、ウェルの開口の寸法に対するウェルの深さの割合が大きいほど、液体はウェル内に充填されにくい。ウェルの開口の寸法に対するウェルの深さの比率は、例えば、１〜１０の範囲であることができ、２〜８の範囲であることが好ましく、２．５〜５の範囲であることがより好ましい。但し、ウェルの深さは、あくまでもウェル内に充填されるべき液体の容量とウェルの開口の寸法を考慮して適宜決定されるものであり、ウェルの開口の寸法に対するウェルの深さの比率が、１０を超えても、液体の分割は可能である。   The depth of the well (length from the opening to the bottom) is appropriately determined in consideration of the size of the opening of the well and the volume of the liquid filled in the well. Although depending on the size of the well opening and the lyophilicity of the inner wall of the well, generally, the larger the ratio of the depth of the well to the size of the well opening, the more difficult the liquid is filled into the well. The ratio of the well depth to the size of the well opening can be, for example, in the range of 1-10, preferably in the range of 2-8, more preferably in the range of 2.5-5. preferable. However, the depth of the well is determined appropriately in consideration of the volume of the liquid to be filled in the well and the size of the well opening, and the ratio of the well depth to the size of the well opening is Even if it exceeds 10, the liquid can be divided.

マルチウェルプレートのウェルパターン、ウェル形状、ウェルサイズは、具体的には、例えば、ウェルの配置:正方形パターン(N個×N個)、1インチ平方当たりのウェル数:64から4096個、ウェルの直径(mmφ):0.1〜2、ウェルの深さ(mm):0.2〜2、ウェルの形状:円筒(但し、四角柱等の多角柱であることもできる)であることができる。但し、これらはあくまでも例示であり、これらに限定する意図ではない。   Specifically, the well pattern, well shape, and well size of the multi-well plate are, for example, well arrangement: square pattern (N × N), number of wells per inch square: 64 to 4096, Diameter (mmφ): 0.1 to 2, Well depth (mm): 0.2 to 2, Well shape: Cylindrical (however, it may be a polygonal column such as a square column). However, these are merely examples, and are not intended to be limited to these.

マルチウェルプレートを構成する基板の厚みは、上記ウェルの深さと、マルチウェルプレートに要求される強度、特に、ウェルの底に要求される強度を考慮して、適宜決定される。通常、基板の厚みは、上記ウェルの深さと同程度以上であることが適当である。   The thickness of the substrate constituting the multi-well plate is appropriately determined in consideration of the depth of the well and the strength required for the multi-well plate, particularly the strength required for the bottom of the well. Usually, it is appropriate that the thickness of the substrate is equal to or more than the depth of the well.

隔離シート
隔離シートは、膜の厚み方向に貫通する複数の貫通孔を有するシート状の物である。さらに、各膜の貫通孔は、2つのマルチウェルプレート(1)とマルチウェルプレート(2)とを、隔離シートを介在させて、マルチウェルプレート(1)および(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように固定したときに、マルチウェルプレート(1)及び(2)の少なくとも一方のマルチウェルプレートの少なくとも一部のウェルの開口に対して少なくとも２つ存在するように設けられる。 Isolation sheet An isolation sheet is a sheet-like thing which has a some through-hole penetrated in the thickness direction of a film | membrane. Furthermore, the through-holes of each membrane include at least a part of the multi-well plates (1) and (2) with two multi-well plates (1) and multi-well plates (2) interposed between the separators. When the wells are fixed so as to oppose each other, at least two of the wells of at least one of the multiwell plates (1) and (2) are provided so as to exist in the wells.

さらに、隔離シートは、好ましくは少なくとも２層の膜からなるものである(態様2B)。少なくとも２層の膜からなる隔離シートにおいては、各膜の貫通孔は、互いに連通するように上記膜は重ねられる。   Further, the separator sheet is preferably composed of at least two layers of membranes (Aspect 2B). In an isolation sheet comprising at least two layers of membranes, the membranes are stacked so that the through holes of each membrane communicate with each other.

隔離シートを構成する膜を形成する材料は、プレート表面との密着性が良好であることを考慮して適宜決定され、例えば、弾性材料からなるものであることができる。また、隔離シートが少なくとも２層の膜からなる場合には、上記プレート表面との密着性に加えて、膜同士の密着性が良好であることが好ましく、その点からも、弾性材料からなるものであることが好ましい。弾性材料としては、例えば、ゴム類を例示出来るがこれらに限定される意図ではない。ゴム類としては、例えば、フッ素ゴム、シリコーンゴム、ニトリルゴム、水素化ニトリルゴム、スチレンブタジエンゴム、エチレンプロピレンゴム、ブチルゴム、アクリルゴム、イソプレンゴム、ウレタンゴム、クロロスルホン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴム、クロロプレンゴム、ブタジエンゴム、ポリイソブチレンゴム、天然ゴムなどを挙げることができる。何れも市販の材料を適宜利用できる。隔離シートを構成する膜の厚みは、特に制限はないが、プレート表面への設置及びプレート表面からの剥離等の操作性及び貫通孔を設ける際の加工性、膜に形成される貫通孔に対する液体の透過性等を考慮すると、単独で使用する場合および2以上を重ねて使用する場合のいずれの場合も、例えば、0.1〜5mmの範囲であることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。上記操作性や加工性等を考慮すると、膜の厚みは、好ましくは0.2〜1mmの範囲であり、より好ましくは0.3〜0.5mmの範囲である。   The material forming the film constituting the isolation sheet is appropriately determined in view of good adhesion to the plate surface, and can be made of, for example, an elastic material. Further, when the separator sheet is composed of at least two layers of film, in addition to the adhesion to the plate surface, it is preferable that the adhesion between the films is good. It is preferable that Examples of the elastic material include rubbers, but are not intended to be limited thereto. Examples of rubbers include fluorine rubber, silicone rubber, nitrile rubber, hydrogenated nitrile rubber, styrene butadiene rubber, ethylene propylene rubber, butyl rubber, acrylic rubber, isoprene rubber, urethane rubber, chlorosulfonated polyethylene rubber, epichlorohydrin rubber, and chloroprene. Examples thereof include rubber, butadiene rubber, polyisobutylene rubber, and natural rubber. In any case, commercially available materials can be used as appropriate. The thickness of the membrane constituting the isolation sheet is not particularly limited, but the operability such as installation on the plate surface and peeling from the plate surface, the workability when providing the through-hole, and the liquid for the through-hole formed in the membrane In consideration of the transparency of the film, it can be in the range of 0.1 to 5 mm, for example, when used alone or when two or more layers are used. However, it is not intended to be limited to this range. Considering the above operability and workability, the thickness of the film is preferably in the range of 0.2 to 1 mm, more preferably in the range of 0.3 to 0.5 mm.

隔離シートを構成する膜は、マルチウェルプレートの少なくとも一部のウェルの各開口に対して貫通孔を有するように、複数の貫通孔を有する。これらの貫通孔は、膜に対して、例えば、レーザー加工による穴開けを行うことで形成することができる。貫通孔の孔径は、ウェルの開口径及び液体の透過性等を考慮して適宜決定でき、例えば、0.01〜2mmの範囲とすることができる。２つの貫通孔の径は同一であっても異なっても良い。また、貫通孔は、ウェルの各開口に対して少なくとも２つあればよく、3つ以上有っても良い。但し、２つあれば液体分割には、支障はなく、好ましくは、1つのウェル開口に対して２つの貫通孔が設けられる。   The film constituting the isolation sheet has a plurality of through-holes so as to have a through-hole with respect to each opening of at least some wells of the multi-well plate. These through holes can be formed, for example, by drilling the film by laser processing. The diameter of the through hole can be appropriately determined in consideration of the opening diameter of the well, the liquid permeability, and the like, and can be, for example, in the range of 0.01 to 2 mm. The diameters of the two through holes may be the same or different. Further, the number of through holes may be at least two for each opening of the well, and may be three or more. However, if there are two, there is no hindrance to the liquid division, and preferably two through holes are provided for one well opening.

さらに、この２つの貫通孔は、2つのマルチウェルプレート(1)とマルチウェルプレート(2)とを、隔離シートを介在させて、マルチウェルプレート(1)および(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように固定したときに、マルチウェルプレート(1)及び(2)の少なくとも一方のマルチウェルプレートの少なくとも一部のウェルの開口に対して少なくとも２つ存在するように設けられる。   Further, the two through holes are provided so that at least a part of the multi-well plates (1) and (2) has two multi-well plates (1) and multi-well plates (2) with an isolation sheet interposed therebetween. When the wells are fixed so as to oppose each other, at least two of the wells of at least one of the multiwell plates (1) and (2) are provided so as to exist in the wells.

さらに後述するように、本発明のキットを、(B)隔離シートを介在させて固定したマルチウェルプレート(1)および(2)に対して、ウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力を与える工程を含む液体を分割する方法に用いた場合に、上記工程(B)において、マルチウェルプレート(1)および(2)に対して与えられる遠心力の向きは、隔離シートを平面視した状態において、ウェルの各開口に対して少なくとも２つ存在する貫通孔のうちの２つの貫通孔Ａ及びＢの開口縁に対して遠心力に直交する接線を想定し、下記のように設定される。
貫通孔Ａにおける、遠心力を付与する回転軸に近い側の接線をＡ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＡ２とし、貫通孔Ｂにおける、前記回転軸に近い側の接線をＢ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＢ２とする。
前記接線Ａ１は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も近い側の接線であり、
前記接線Ｂ２は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も遠い側の接線である。換言すると、上記接線Ａ１を引ける貫通孔が貫通孔Ａであり、上記接線Ｂ２を引ける貫通孔が貫通孔Ｂとなる。その上で、前記接線Ａ１は前記接線Ｂ１より前記回転軸に近い側に位置し、かつ前記接線Ａ２は前記接線Ｂ２より前記回転軸に近い側に位置するように、遠心力の向きは、設定される。それによって、工程(B)において、上記マルチウェルプレート(1)のウェル内に格納された液体の一部がマルチウェルプレート(2)のウェル内に少なくとも２つの貫通孔の少なくとも１つを通過して移行する。通常、遠心力を与える遠心分離機中における隔離シートを介在させて固定したマルチウェルプレート(1)および(2)の配置が決まれば、マルチウェルプレートに対する遠心力の向きは決まるので、この遠心力の向きに応じて、上記接線を引けるように、隔離シート表面における開口の配置を適宜決定する。尚、マルチウェルプレート(1)および(2)の平面形状は方形である場合には、方形の対向する二辺が遠心力の向きと、平行かまたは直交することが多いため、隔離シート表面における開口の配置は、この点を考慮して、適宜決定できる。 As will be described later, the kit of the present invention is centrifuged in a direction perpendicular to the direction of the bottom from the opening of the well with respect to (B) the multiwell plate (1) and (2) fixed with an isolation sheet interposed therebetween. When used in the method of dividing the liquid including the step of applying force, the direction of the centrifugal force applied to the multiwell plates (1) and (2) in the above step (B) Assuming tangents perpendicular to the centrifugal force with respect to the opening edges of two through holes A and B of at least two through holes for each opening in the well, the following is set: The
In the through hole A, a tangent on the side close to the rotation axis for applying centrifugal force is A1 and a tangent on the side far from the rotation axis is A2, and in the through hole B, a tangent on the side near the rotation axis is B1 and the rotation. The tangent on the side far from the axis is B2.
The tangent line A1 is a tangent line closest to the rotation axis among tangent lines orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent line B2 is a tangent line farthest from the rotation axis among tangent lines orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes. In other words, the through hole through which the tangent line A1 can be drawn is the through hole A, and the through hole through which the tangent line B2 can be drawn becomes the through hole B. In addition, the direction of centrifugal force is set so that the tangent line A1 is located closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is located closer to the rotation axis than the tangent line B2. Is done. Thereby, in step (B), a part of the liquid stored in the well of the multi-well plate (1) passes through at least one of at least two through holes in the well of the multi-well plate (2). To migrate. Normally, if the arrangement of the multiwell plates (1) and (2) fixed with an isolation sheet in the centrifuge that gives centrifugal force is determined, the direction of the centrifugal force relative to the multiwell plate is determined. Depending on the orientation, the arrangement of the openings on the surface of the isolation sheet is appropriately determined so that the tangent line can be drawn. When the planar shape of the multiwell plates (1) and (2) is a square, the two opposite sides of the square are often parallel or orthogonal to the direction of the centrifugal force. The arrangement of the openings can be appropriately determined in consideration of this point.

上記状態を、図３を例に説明する。尚、例１、２、５、６は本発明の態様であり、例３、４は本発明の上記遠心力の向きに関する条件を満たさない様態である。図３の例１では、外側の円がウェル開口を示し、その中に左右に位置する貫通孔の開口Ａ及びＢが示されている。例１では、遠心力の向きは、接線Ａ１は接線Ｂ１より回転軸に近い側に位置し、かつ接線Ａ２は接線Ｂ２より回転軸に近い側に位置するように、設定されている。この状態であれば、上記工程(B)において、二つの貫通孔の一方は空気流通孔として機能し、他方は、液体流通孔として機能する。   The above state will be described with reference to FIG. Examples 1, 2, 5, and 6 are aspects of the present invention, and Examples 3 and 4 are aspects that do not satisfy the conditions regarding the direction of centrifugal force of the present invention. In Example 1 of FIG. 3, the outer circle shows the well opening, and the openings A and B of the through holes located on the left and right are shown therein. In Example 1, the direction of the centrifugal force is set so that the tangent line A1 is positioned closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is positioned closer to the rotation axis than the tangent line B2. In this state, in the step (B), one of the two through holes functions as an air circulation hole, and the other functions as a liquid circulation hole.

図３の例２には、２つの貫通孔を有する例を示す。外側の円はウェル開口を示し、その中の左下に位置する貫通孔の開口Ａ、及び右上に位置する貫通孔の開口Ｂが示されている。例１に比べれば、貫通孔開口Ａ及びＢの位置が近づいているが、依然として、遠心力の向きは、接線Ａ１は接線Ｂ１より回転軸に近い側に位置し、かつ接線Ａ２は接線Ｂ２より回転軸に近い側に位置するように、設定されている。例３では、接線Ｂ１が接線Ａ２より回転軸に近い側に位置しているが、接線Ａ１と接線Ｂ１の位置関係及び接線Ａ２は接線Ｂ２の位置関係は上前記条件を満たしている。従ってこの状態であれば、工程(B)において、二つの貫通孔の一方は空気流通孔として機能し、他方は、液体流通孔として機能する。   Example 2 in FIG. 3 shows an example having two through holes. The outer circle indicates a well opening, and a through hole opening A located in the lower left and a through hole B located in the upper right are shown therein. Compared to Example 1, the positions of the through-hole openings A and B are approaching, but the direction of the centrifugal force is still the tangent line A1 located closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is closer to the tangent line B2. It is set to be located on the side closer to the rotation axis. In Example 3, the tangent line B1 is located closer to the rotation axis than the tangent line A2, but the positional relationship between the tangent line A1 and the tangent line B1 and the tangent line A2 satisfy the above-mentioned conditions. Therefore, in this state, in the step (B), one of the two through holes functions as an air circulation hole, and the other functions as a liquid circulation hole.

図３の例３は、２つの貫通孔を有する例を示す。外側の円はウェル開口を示し、図中の縦に貫通孔の開口Ａ及び開口Ｂが配置され、開口Ａの接線Ａ１及び開口Ｂの接線Ｂ１は重複しており、かつ開口Ａの接線Ａ２及び開口Ｂの接線Ｂ２が重複している。この状態では、工程(B)において、二つの貫通孔の一方が空気流通孔として機能させ、他方が液体流通孔として機能させることはできず、ウェル中の液体分割は困難である。なお、図示していないが、接線Ａ１及び接線Ｂ１または接線Ａ２及び接線Ｂ２のいずれか一方が、重複してない場合であっても、工程(B)において、二つの貫通孔の一方が空気流通孔として機能させ、他方を液体流通孔として機能させることはできず、ウェル中の液体分割は困難である。   Example 3 in FIG. 3 shows an example having two through holes. The outer circle indicates a well opening, and an opening A and an opening B of the through hole are arranged vertically in the figure, the tangent line A1 of the opening A and the tangent line B1 of the opening B overlap, and the tangent line A2 of the opening A and The tangent line B2 of the opening B overlaps. In this state, in step (B), one of the two through holes cannot function as an air circulation hole, and the other cannot function as a liquid circulation hole, and it is difficult to divide the liquid in the well. Although not shown, even if any one of the tangent line A1 and the tangent line B1 or the tangent line A2 and the tangent line B2 does not overlap, in step (B), one of the two through holes is air-flowing. It is impossible to function as a hole and the other as a liquid circulation hole, and it is difficult to divide the liquid in the well.

図３の例４には、２つの貫通孔を有する例を示す。外側の円はウェル開口を示し、図中の下側に大きさが大きい貫通孔の開口Ａ、及び上側に大きさが小さい貫通孔の開口Ｂが示されている。この状態では、接線Ａ１は接線Ｂ１より回転軸に近い側に位置し、かつ接線Ｂ２は接線Ａ２より回転軸に近い側に位置する。このような状態になるように遠心力の向きを設定すると、接線Ａ１と接線Ｂ１の位置関係は上前記条件を満たしているが、接線Ａ２は接線Ｂ２の位置関係は上前記条件を満たしておらず逆転している。従ってこの状態では、工程(B)において、二つの貫通孔の一方は空気流通孔として機能させ、他方を液体流通孔として機能させることはできず、ウェル中の液体分割は困難である。   Example 4 in FIG. 3 shows an example having two through holes. An outer circle indicates a well opening, and a through-hole opening A having a large size is shown on the lower side in the drawing, and an opening B having a small through-hole is shown on the upper side. In this state, the tangent line A1 is located closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line B2 is located closer to the rotation axis than the tangent line A2. When the direction of the centrifugal force is set so as to be in such a state, the positional relationship between the tangent line A1 and the tangent line B1 satisfies the above condition, but the tangent line A2 does not satisfy the above condition. It is not reversed. Accordingly, in this state, in the step (B), one of the two through holes cannot function as an air circulation hole and the other cannot function as a liquid circulation hole, so that it is difficult to divide the liquid in the well.

図３の例５は、例１においてさらに貫通孔開口Ｃが加わった例である。貫通孔開口Ｃが存在するとしても、遠心力の向きは、接線Ａ１は接線Ｂ１より回転軸に近い側に位置し、かつ接線Ａ２は接線Ｂ２より回転軸に近い側に位置するように、設定されている。この状態では、工程(B)において、例えば、貫通孔開口Ａ及びＣが液体流通孔として機能し、貫通孔開口Ｂが空気流通孔として機能する。尚、例５には、図示しないが、貫通孔開口Ｃ以外にも接線Ａ１と接線Ｂの間で、これらの接線に接触しない第４の貫通孔開口を設けることもできる。この場合、工程(B)において、空気流通孔として機能する貫通孔および液体流通孔がとして機能する貫通孔が複数存在することになる。空気流通孔及び／又は液体流通孔として機能する貫通孔が複数あることで、液体の移動が容易となり、遠心力の軽減や遠心時間の短縮が可能である。   Example 5 in FIG. 3 is an example in which a through-hole opening C is further added in Example 1. Even if there is a through-hole opening C, the direction of centrifugal force is set so that the tangent line A1 is located closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is located closer to the rotation axis than the tangent line B2. Has been. In this state, in the step (B), for example, the through hole openings A and C function as liquid circulation holes, and the through hole opening B functions as an air circulation hole. In Example 5, although not shown, a fourth through-hole opening that does not contact these tangents can be provided between the tangent A1 and the tangent B in addition to the through-hole opening C. In this case, in the step (B), there are a plurality of through holes that function as air circulation holes and through holes that function as liquid circulation holes. Since there are a plurality of through holes functioning as air circulation holes and / or liquid circulation holes, the movement of the liquid is facilitated, and the centrifugal force can be reduced and the centrifugation time can be reduced.

例６は、外側の円がウェル開口を示し、その中に中央部に縦に位置する３つの貫通孔の開口Ａ、Ｂ及びＣが示され、開口Ｃが接線Ａ２及び接線Ｂ１を横切る配置となっている。しかし、遠心力の向きは、接線Ａ１は接線Ｂ１より回転軸に近い側に位置し、かつ接線Ａ２は接線Ｂ２より回転軸に近い側に位置するように、設定されている。従って、上記のような開口Ｃが存在しても、この状態であれば、上記工程(B)において、二つの貫通孔の一方は空気流通孔として機能し、他方は、液体流通孔として機能する。   Example 6 is an arrangement in which the outer circle shows a well opening, in which three through-hole openings A, B, and C are vertically arranged in the center, and the opening C crosses the tangent line A2 and the tangent line B1. It has become. However, the direction of the centrifugal force is set so that the tangent line A1 is positioned closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is positioned closer to the rotation axis than the tangent line B2. Therefore, even if the opening C as described above is present, in this state, one of the two through holes functions as an air circulation hole and the other functions as a liquid circulation hole in this state (B). .

隔離シートが少なくとも２層の膜からなるものである(態様2B)場合、各膜の貫通孔は、互いに連通している。各膜の貫通孔が連通していることで、隔離シートの貫通孔を、マルチウェルプレート(2)のウェルとマルチウェルプレート(1)のウェルとの間で、液体や気体（例えば、空気）が流通することができる。互いに連通する貫通孔の開口径は、同一であることも異なることもできる。   When the separator sheet is composed of at least two layers of membranes (Aspect 2B), the through holes of each membrane communicate with each other. By connecting the through-holes of each membrane, liquid or gas (for example, air) is formed between the wells of the multi-well plate (2) and the wells of the multi-well plate (1). Can be distributed. The opening diameters of the through holes communicating with each other can be the same or different.

マルチウェルプレート(1)のウェルとマルチウェルプレート(2)のウェルの開口寸法および形状、ならびに配列が、同一であり、かつ隔離シートは、各ウェルに対して、貫通孔を２つ有するものであることができる。あるいは、マルチウェルプレート(1)のウェルとマルチウェルプレート(2)のウェルの開口寸法および形状、容量ならびに配列の少なくとも一部が相違し、隔離シートは、何れか一方のマルチウェルプレートの前記各ウェルに対して、前記貫通孔を２つ有するものであることができる。この場合、隔離シートは、開口寸法が小さい方のマルチウェルプレートの各ウェルに対して、貫通孔を２つ有することができる。   The wells of the multi-well plate (1) and the wells of the multi-well plate (2) have the same opening size, shape, and arrangement, and the separation sheet has two through holes for each well. Can be. Alternatively, the opening size and shape, capacity, and arrangement of the wells of the multi-well plate (1) and the well of the multi-well plate (2) are different from each other, and the isolation sheet is the above-mentioned each of the multi-well plate. The well may have two through holes. In this case, the isolation sheet can have two through holes for each well of the multi-well plate having the smaller opening size.

隔離シート分離用シート
隔離シートが少なくとも２層の膜からなるものである(態様2B)場合には、2枚の隔離シートの分離を行う際に、隔離シートの分離を容易にすることを目的として、隔離シートと同様の貫通孔を有する分離用シートを隔離シートの間に挿入することかできる。分離用シートを構成する膜を形成する材料は、隔離シートとの密着性が良好であることを考慮して適宜決定され、例えば、プラスチックシート、金属シートを利用できる。分離用シートを構成する膜の厚みは、特に制限はないが、隔離シートへの設置及び隔離シート表面からの剥離等の操作性及び貫通孔を設ける際の加工性等を考慮すると、例えば、0.01〜5mmの範囲であることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。上記操作性や加工性等を考慮すると、膜の厚みは、好ましくは0.05〜1mmの範囲であり、より好ましくは0.1〜0.5mmの範囲である。 Separation sheet separation sheet When the separation sheet consists of at least two layers of membranes (Aspect 2B), it is intended to facilitate separation of the separation sheet when separating the two separation sheets. A separation sheet having a through hole similar to that of the isolation sheet can be inserted between the isolation sheets. The material for forming the film constituting the separation sheet is appropriately determined in view of good adhesion to the isolation sheet, and for example, a plastic sheet or a metal sheet can be used. The thickness of the membrane constituting the separation sheet is not particularly limited. However, in consideration of operability such as installation on the separation sheet and separation from the surface of the separation sheet and workability when providing a through hole, for example, 0.01 Can be in the range of ~ 5mm. However, it is not intended to be limited to this range. In consideration of the above operability and workability, the thickness of the film is preferably in the range of 0.05 to 1 mm, more preferably in the range of 0.1 to 0.5 mm.

上記工程(B)における遠心分離は、バケット式遠心分離機を用いて行うことができる。その場合、前記隔離シートを介在させて固定した前記マルチウェルプレート(1)および(2)は、前記遠心分離機の停止時に、前記仮想直線が、遠心分離操作時の遠心力の向きと平行になるように、前記バケット式遠心分離機のバケットに配置される。   Centrifugation in the step (B) can be performed using a bucket-type centrifuge. In that case, the multi-well plates (1) and (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween are such that when the centrifuge is stopped, the virtual straight line is parallel to the direction of the centrifugal force during the centrifugal operation. It is arranged in the bucket of the bucket type centrifuge.

本発明は、上記本発明のキットにおける隔離シートを介在させて固定したマルチウェルプレート(1)および(2)、並びに遠心分離機を含む液体分割用装置を包含する。この液体分割用装置においては、遠心分離機の停止時に、隔離シートを平面視した状態において、ウェルの各開口に対して少なくとも２つ存在する貫通孔の開口のうち１つを横切り、かつ他の開口のうちの少なくとも１つを横切らない仮想直線が、遠心分離操作時の遠心力の向きと平行になるように、遠心分離機に隔離シートを介在させて固定したマルチウェルプレート(1)および(2)が配置される。この液体分割用装置において、遠心分離機は、例えば、バケット式遠心分離機であることができるが、それ以外の、例えば、アングル式遠心機のような遠心分離機を用いることができる。アングル式ローターは、遠心停止時および遠心操作時にかかわらず、遠心操作時の遠心力の向きに対して遠心試料を一定の角度に固定して遠心する方式のローターである。その場合、前記隔離シートを介在させて固定した前記マルチウェルプレート(1)および(2)は、前記仮想直線が、遠心分離操作時の遠心力の向きと垂直になるように、前記アングル式遠心分離機のローターに配置される。
The present invention includes a multi-well plate (1) and (2) fixed via an isolation sheet in the kit of the present invention, and a liquid dividing apparatus including a centrifuge. In this liquid dividing apparatus, when the centrifuge is stopped, in a state where the separation sheet is viewed in plan, at least two through-hole openings existing for each opening of the well are crossed, and the other A multi-well plate (1) fixed with a separating sheet interposed between the centrifuge and an imaginary straight line that does not cross at least one of the openings parallel to the direction of the centrifugal force during the centrifuge operation (1) and ( 2) is arranged. In this liquid dividing apparatus, the centrifuge can be a bucket centrifuge, for example, but other centrifuges such as an angle centrifuge can be used. The angle type rotor is a rotor of a type in which a centrifuge sample is fixed at a fixed angle with respect to the direction of the centrifugal force during the centrifuge operation, regardless of when the centrifuge is stopped or during the centrifuge operation. In that case, the multi-well plates (1) and (2) fixed with the separator sheet interposed therebetween are arranged so that the imaginary straight line is perpendicular to the direction of the centrifugal force during the centrifugation operation. Located in the rotor of the separator.

＜液体分割方法＞
本発明の態様1Aの液体分割方法は、前記マルチウェルプレート(1)のウェル内に、前記マルチウェルプレート(2)の少なくとも一部のウェルから、このウェル内に格納された液体の一部を移行させて、前記液体を分割する方法であって、以下の工程(A)および(B)を含む。さらに本発明の態様2Aの液体分割方法は、上記工程(B)に続いて工程(C)〜(E)を含む。図４及び５を参照しながら以下に説明する。尚、図４及び５では、隔離シートが２層の膜からなるものである場合を例に説明する。 <Liquid splitting method>
In the liquid dividing method according to aspect 1A of the present invention, a part of the liquid stored in the well of at least a part of the well of the multiwell plate (2) is placed in the well of the multiwell plate (1). A method of transferring the liquid to divide the liquid, which includes the following steps (A) and (B). Furthermore, the liquid splitting method of Embodiment 2A of the present invention includes steps (C) to (E) following the step (B). This will be described below with reference to FIGS. 4 and 5, the case where the separation sheet is made of a two-layer film will be described as an example.

工程(A)
工程(A)は、マルチウェルプレート(1)と少なくとも一部のウェルに移行させるべき液体を注入したマルチウェルプレート(2)とを、前記隔離シートを介在させて、両プレートが有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように、かつ前記隔離シート有する貫通孔が対向するウェル同士の各開口に対して少なくとも２つ存在するように固定する工程である。マルチウェルプレート(1)、マルチウェルプレート(2)及び隔離シートは上記液体分割用キットにおいて説明したものと同様のものである。 Process (A)
In step (A), at least a part of both plates has a multi-well plate (1) and a multi-well plate (2) into which a liquid to be transferred to at least some of the wells is injected with the isolation sheet interposed therebetween. In this step, the wells are fixed so that the wells face each other and at least two through-holes of the isolation sheet exist with respect to the openings of the wells facing each other. The multiwell plate (1), the multiwell plate (2), and the isolation sheet are the same as those described in the liquid dividing kit.

図４（１）に示すように、少なくとも一部のウェルに移行させるべき液体を注入したマルチウェルプレート(1)(MMV1)と、前記液体の移送(分割)先であるマルチウェルプレート(2) (MMV2)とを準備する。次に、図４（２）に示すように、マルチウェルプレート(1)(MMV1)と、マルチウェルプレート(2) (MMV2)との間に、隔離シートを構成することになる２枚の膜(1)及び(2)を配置する。次に、図４（３）に示すように、膜(1)及び(2)が有する各貫通孔が連通できるようにして膜(1)及び(2)が隔離シートを構成するようにし、かつマルチウェルプレート(1)(MMV1)の液体を格納した少なくとも一部のウェルとマルチウェルプレート(2) (MMV2)の液体の移送(分割)先となる少なくとも一部のウェル同士が対向するように固定する。ウェルを有効に利用するという観点からは、両プレートが有する全てのウェル同士が対向するように固定することが好ましい。両プレートの固定には、例えば、クリップ、クランプ、固定用治具等を用いることができる。
As shown in FIG. 4 (1), a multiwell plate (1) (MMV1) into which a liquid to be transferred to at least some of the wells is injected, and a multiwell plate (2) that is a transfer (dividing) destination of the liquid Prepare (MMV2). Next, as shown in FIG. 4 (2), the two films that will form an isolation sheet between the multiwell plate (1) (MMV1) and the multiwell plate (2) (MMV2). Place (1) and (2). Next, as shown in FIG. 4 (3), the through holes of the membranes (1) and (2) can be communicated so that the membranes (1) and (2) constitute an isolation sheet, and At least some of the wells that store the liquid in the multi-well plate (1) (MMV1) and at least some of the wells that are the transfer (split) destination of the liquid in the multi-well plate (2) (MMV2) face each other. Fix it. From the viewpoint of effectively using wells, it is preferable to fix so that all the wells of both plates face each other. For example, a clip, a clamp, a fixing jig, or the like can be used to fix both plates.

工程(B)
工程(B)は、 前記隔離シートを介在させて固定した前記マルチウェルプレート(1)および(2)に対して、前記ウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力を与える工程であり、かつマルチウェルプレート(1)および(2)に対して与えられる遠心力の向きは、隔離シートを平面視した状態においてウェルの各開口に対して少なくとも２つ存在する貫通孔のうちの２つの貫通孔Ａ及びＢの開口縁に対して遠心力に直交する接線を想定し、
貫通孔Ａにおける、遠心力を付与する回転軸に近い側の接線をＡ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＡ２とし、
貫通孔Ｂにおける、前記回転軸に近い側の接線をＢ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＢ２とし、
前記接線Ａ１は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も近い側の接線であり、
前記接線Ｂ２は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も遠い側の接線であり、
前記接線Ａ１は前記接線Ｂ１より前記回転軸に近い側に位置し、かつ
前記接線Ａ２は前記接線Ｂ２より前記回転軸に近い側に位置するように設定される。
遠心力の向きを上記のように設定することで、マルチウェルプレート(1)のウェル内に格納された液体の一部がマルチウェルプレート(2)のウェル内に少なくとも２つの貫通孔の少なくとも１つを通過して移行する。 Process (B)
Step (B) is a step of applying centrifugal force to the multi-well plates (1) and (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween in a direction orthogonal to the bottom direction from the well opening. And the direction of the centrifugal force applied to the multi-well plates (1) and (2) is two of the through-holes that exist at least two for each opening of the well in a state where the isolation sheet is viewed in plan view. Assuming a tangent perpendicular to the centrifugal force with respect to the opening edges of the through holes A and B,
In the through-hole A, the tangent on the side close to the rotation axis that applies the centrifugal force is A1, and the tangent on the side far from the rotation axis is A2.
In the through-hole B, the tangent on the side close to the rotation axis is B1, and the tangent on the side far from the rotation axis is B2.
The tangent line A1 is a tangent line closest to the rotation axis among tangent lines orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent B2 is a tangent farthest from the rotation axis among tangents orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent line A1 is set to be closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is set to be closer to the rotation axis than the tangent line B2.
By setting the direction of the centrifugal force as described above, a part of the liquid stored in the well of the multi-well plate (1) is transferred to at least one of at least two through holes in the well of the multi-well plate (2). Transition through one.

図５の左上に示すように、工程(A)で両プレートの間に隔離シートを固定した後に、右上に示すように、両プレートのウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力ｇを与える。このとき、隔離シートの各開口に設けられる２つの貫通孔（液体流通孔および気体流通孔）は、隔離シート表面上において、設定された遠心力の向きと直交する仮想の直線が、上記２つの貫通孔の開口を横切らない配置とする。図５の左下図は、遠心力ｇを与える前の状態を示す図であり、右下図は、遠心力ｇを与えた後の状態を示す図である。遠心力ｇを与えることで、MMV1のウェル中の液体は、遠心力ｇの向きの下(底)側の貫通孔からMMV2のウェル中に移動し、それに伴って、MMV2のウェル中の気体(例えば、空気)は、MMV1のウェル中に移動する。図５に示す例では、MMV1とMMV 2のウェルは同じ形状なので、液体は等分割される。   As shown in the upper left of FIG. 5, after fixing the separation sheet between both plates in step (A), as shown in the upper right, the centrifugal force g in a direction perpendicular to the direction of the bottom from the well opening of both plates. give. At this time, the two through-holes (liquid circulation hole and gas circulation hole) provided in each opening of the separation sheet have a virtual straight line orthogonal to the direction of the set centrifugal force on the surface of the separation sheet. It is arranged so as not to cross the opening of the through hole. The lower left diagram of FIG. 5 is a diagram showing a state before the centrifugal force g is applied, and the lower right diagram is a diagram showing a state after the centrifugal force g is applied. By applying the centrifugal force g, the liquid in the MMV1 well moves from the lower (bottom) through hole in the direction of the centrifugal force g into the MMV2 well, and accordingly, the gas in the MMV2 well ( For example, air) moves into the well of MMV1. In the example shown in FIG. 5, since the wells of MMV1 and MMV2 have the same shape, the liquid is equally divided.

遠心力ｇは、ウェル開口の寸法等、隔離シートの貫通孔における液体の流通性等を考慮して、適宜決定されるが、例えば、10×g以上であることができる。例えば、貫通孔の開口の最大内径が、0.15mmである場合、遠心力は例えば、20×g以上であることが好ましい。さらに、貫通孔の開口の最大内径が、0.1mmである場合には、遠心力は例えば、100×g以上であることが好ましく、より好ましくは100〜2000×gの範囲である。但し、貫通孔の開口径や液体の種類(特に固形分や粘性物を含有する場合)によっては、さらに高い遠心力を与えることも可能である。バケット式遠心分離機を用いる場合には、通常のバケット式遠心分離機の場合、装置を安全に使用するという観点から、遠心力の上限は約2000×gである。但し、使用する遠心分離機は、バケット式遠心分離機に限られない。   The centrifugal force g is appropriately determined in consideration of the size of the well opening and the like, the fluidity of the liquid in the through-hole of the isolation sheet, and can be, for example, 10 × g or more. For example, when the maximum inner diameter of the opening of the through hole is 0.15 mm, the centrifugal force is preferably 20 × g or more, for example. Furthermore, when the maximum inner diameter of the opening of the through hole is 0.1 mm, the centrifugal force is preferably 100 × g or more, and more preferably in the range of 100 to 2000 × g. However, depending on the opening diameter of the through hole and the type of liquid (especially when containing a solid or a viscous substance), a higher centrifugal force can be applied. In the case of using a bucket centrifuge, the upper limit of the centrifugal force is about 2000 × g from the viewpoint of using the apparatus safely in the case of a normal bucket centrifuge. However, the centrifuge to be used is not limited to the bucket centrifuge.

図６に、バケット式遠心分離機を用いる場合のウェル開口に対する２つの貫通孔の配置並びに静止状態および遠心を付与するための回転状態における重力または遠心力の向きを示す。図面の上方は平面概略図、下方が側面概略図であり、回転軸の左側が静止状態、右側が回転状態におけるバケットとその中に格納された、マルチウェルプレートホルダに保持された、隔離シートを介在させて固定したマルチウェルプレートを記載する。平面概略図（上方）においては、マルチウェルプレートの側面側がマルチウェルプレートホルダとして描かれ(マルチウェルプレートは図示せず)、側面概略図（下方）においては、マルチウェルプレートの平面が描かれ、さらに、ウェル開口と２つの貫通孔の配置および重力（静止状態）と遠心力（回転状態）の向きが矢印で描かれている。隔離シートを介在させて固定したマルチウェルプレートは、遠心分離機の停止時(静止状態)に、遠心力の向きと直交する仮想直線が、遠心分離操作時の遠心力の向きと平行になるように、バケット式遠心分離機のバケットに配置される。   FIG. 6 shows the arrangement of two through holes with respect to the well opening and the direction of gravity or centrifugal force in a stationary state and a rotating state for imparting centrifugation when a bucket-type centrifuge is used. The upper part of the drawing is a schematic plan view, the lower part is a schematic side view, the bucket on the left side of the rotating shaft is stationary, the right side is the rotating state, and the isolation sheet held in the multiwell plate holder stored therein. Describes a multi-well plate fixed in between. In the schematic plan view (upper), the side of the multiwell plate is depicted as a multiwell plate holder (multiwell plate not shown), and in the schematic side view (lower), the plane of the multiwell plate is depicted, Furthermore, the arrangement of the well opening and the two through holes and the direction of gravity (stationary state) and centrifugal force (rotation state) are drawn by arrows. The multi-well plate fixed with the separation sheet interposed is such that when the centrifuge is stopped (stationary), the virtual straight line perpendicular to the direction of the centrifugal force is parallel to the direction of the centrifugal force during the centrifugation operation. In the bucket of the bucket centrifuge.

本発明の態様1Aの液体分割方法では、上記工程(A)および(B)により、マルチウェルプレート(1)のウェル内に格納された液体の一部がマルチウェルプレート(2)のウェル内に少なくとも２つの貫通孔の少なくとも１つを通過して移行することで、マルチウェルプレート(1)のウェル内に格納された液体を分割することができる。工程(B)の後は、マルチウェルプレート(1)のウェル内に残った液体およびマルチウェルプレート(2)のウェル内に移行した液体を適宜利用することができる。   In the liquid dividing method according to aspect 1A of the present invention, a part of the liquid stored in the well of the multi-well plate (1) is contained in the well of the multi-well plate (2) by the above steps (A) and (B). The liquid stored in the wells of the multiwell plate (1) can be divided by passing through at least one of the at least two through holes. After the step (B), the liquid remaining in the well of the multi-well plate (1) and the liquid transferred into the well of the multi-well plate (2) can be used as appropriate.

尚、図７の左に示した貫通孔の配置を有する隔離シートを用いた場合、工程(B)の後にさらに工程(B)とは異なる向きに遠心力を付与して、隔離シートの貫通孔に付着または残存する液体を各マルチウェルプレートのウェル内移行させることができる。この状態を、図７を参照して説明する。図７の左に示した遠心力と貫通孔の配置において１回目の遠心（工程(B)における遠心力）で試料を双方のウェルに分配後、図７の右に示した遠心力と貫通孔の配置にMMVにかける遠心力の方向をかえて２回目の遠心（遠心力ｇの向きと直交する直線が液体流通孔および気体流通孔を横切る向きで、且つ両流通孔を回転中心側に配置）を行うことにより両方の流通孔が気相にくるように配置している。このようにすることで、対向する２つのウェル内の液体を隔離シートの貫通孔が形成されていない領域で分断した状態で２つのMMVを分離でき、ウェル間の相互汚染の可能性を低減できる。   In addition, when the separation sheet having the arrangement of the through holes shown on the left in FIG. 7 is used, a centrifugal force is further applied in a direction different from that in the step (B) after the step (B), so that the through holes of the separation sheet are provided. The liquid adhering to or remaining in the liquid can be transferred into the wells of each multi-well plate. This state will be described with reference to FIG. In the arrangement of the centrifugal force and the through-hole shown on the left in FIG. 7, the sample is distributed to both wells by the first centrifugation (centrifugal force in step (B)), and then the centrifugal force and the through-hole shown on the right in FIG. Change the direction of the centrifugal force applied to the MMV to the arrangement of the second centrifugal (the straight line perpendicular to the direction of the centrifugal force g crosses the liquid flow hole and the gas flow hole, and both flow holes are arranged on the rotation center side) ) Is arranged so that both flow holes come into the gas phase. By doing so, it is possible to separate the two MMV in a state where the liquid in the two wells facing each other is divided in the region where the through hole of the isolation sheet is not formed, and the possibility of mutual contamination between the wells can be reduced. .

本発明の態様2Aの液体分割方法では、上記工程(A)および(B)に続けて、以下の工程(C)〜(E)実施する。   In the liquid splitting method of Embodiment 2A of the present invention, the following steps (C) to (E) are carried out following the steps (A) and (B).

工程(C)
工程(C)は、前記隔離シートを構成する一方の膜は前記マルチウェルプレート(2)の主表面に配置した状態、前記隔離シートを構成する他方の膜は前記マルチウェルプレート(1)の主表面に配置した状態となるように、前記マルチウェルプレート(2)と前記マルチウェルプレート(1)とを分離する工程である。 Process (C)
In the step (C), one film constituting the isolation sheet is disposed on the main surface of the multiwell plate (2), and the other film constituting the isolation sheet is the main film of the multiwell plate (1). In this step, the multiwell plate (2) and the multiwell plate (1) are separated so as to be arranged on the surface.

工程(B)における遠心力の付与が完了したら、図４（４）に示すように、MMV1とMMV 2とをMMV1には膜１が付着した状態、MMV 2には膜２が付着した状態で分離する。膜が付着した状態で、MMV1とMMV 2とを分離することで、MMV1のウェルとMMV 2のウェルとの間での試料の相互汚染の発生を防止できる。隔離シートに設けられた貫通孔の径は、ウェルの開口径より遥かに小さく、MMV1とMMV 2とを分離したときに、貫通孔から試料である液体が漏れだすことはない。   When application of the centrifugal force in step (B) is completed, as shown in FIG. 4 (4), MMV1 and MMV2 are in a state where membrane 1 is attached to MMV1, and in a state where membrane 2 is attached to MMV2. To separate. By separating MMV1 and MMV2 while the film is attached, it is possible to prevent the occurrence of cross-contamination of the sample between the MMV1 well and the MMV2 well. The diameter of the through hole provided in the isolation sheet is much smaller than the opening diameter of the well, and when the MMV1 and MMV 2 are separated, the liquid as the sample does not leak from the through hole.

工程(D)
工程(D)は、前記膜を主表面に配置した少なくとも一方のマルチウェルプレートを、各ウェルの開口から底の方向に遠心力を与える工程である。 Process (D)
Step (D) is a step of applying a centrifugal force from the opening of each well to the bottom of at least one multi-well plate having the membrane disposed on the main surface.

図４（５）に示すように、膜１が付着したMMV1及び膜２が付着したMMV 2には、それぞれ各ウェルの開口から底の方向に遠心力を与える。この遠心力の付与により、膜のウェルの開口に面している表面から液体を退避させる。膜のウェルの開口に面している表面から液体を退避させるためには、遠心力は、例えば、10×g以上であることができ、好ましくは50×g以上、より好ましくは500×g以上である。遠心力の上限は特にないが、バケット式遠心分離機を用いる場合には、通常のバケット式遠心分離機の場合、装置を安全に使用するという観点から、遠心力の上限は約2000×gである。   As shown in FIG. 4 (5), centrifugal force is applied from the opening of each well to the bottom of the MMV 1 to which the film 1 is attached and the MMV 2 to which the film 2 is attached. By applying this centrifugal force, the liquid is withdrawn from the surface of the membrane facing the opening of the well. In order to retract liquid from the surface facing the opening of the membrane well, the centrifugal force can be, for example, 10 × g or more, preferably 50 × g or more, more preferably 500 × g or more. It is. There is no particular upper limit for centrifugal force, but when using a bucket-type centrifuge, the upper limit of centrifugal force is about 2000 × g from the viewpoint of using the device safely in the case of a normal bucket-type centrifuge. is there.

尚、一方または両方の膜が付着したMMVは、遠心力を付与することなく、再度、工程(A)の液体を保持したMMVとして用いることもできる。その場合、再度工程(A)から工程(C)を経た後に、工程(D)に供することができる。   The MMV to which one or both of the films are attached can be used again as an MMV holding the liquid in the step (A) without applying a centrifugal force. In that case, after passing through the process (C) from the process (A) again, it can use for a process (D).

工程(E)
工程(E)は、工程(D)で遠心力を与えたマルチウェルプレートから前記膜を分離して、ウェル中に分割後の液体を含むマルチウェルプレートを得る工程である。
図４（６）に示すように、各ウェルの開口から底の方向に遠心力を与えた後に、MMV1から膜１を分離し、またはMMV 2から膜２を分離する。各ウェルの開口から底の方向に遠心力を与え、膜のウェルの開口に面している表面から液体を退避させた後に膜を分離することで、膜の分離の際の、1つのMMV上でのウェル間の試料の相互汚染の発生を防止できる。 Process (E)
Step (E) is a step of separating the membrane from the multiwell plate to which centrifugal force is applied in step (D) to obtain a multiwell plate containing the divided liquid in the well.
As shown in FIG. 4 (6), after applying centrifugal force from the opening of each well to the bottom, the membrane 1 is separated from MMV1 or the membrane 2 is separated from MMV2. Applying centrifugal force from the opening of each well to the bottom, and withdrawing liquid from the surface facing the opening of the well of the membrane, separating the membrane, it is possible to separate the membrane on one MMV. It is possible to prevent the occurrence of cross-contamination of the sample between wells.

本発明の方法及びキットは、様々な用途を有する。多重並列かつ微量な実験系において、多段階反応を可能とするMMVは、主に、3つ分野で大きな影響がある。   The methods and kits of the present invention have a variety of uses. MMV, which enables multistage reactions in a multi-parallel and small experimental system, has a major impact on three main fields.

1つ目は、創薬の分野である。例えば、ガンをアポトーシスさせるリガンドを核酸アプタマーやペプチドアプタマーから見つけるためのスクリーニングパフォーマンスが10000倍以上向上すると期待される（マイクロプレート法に比べ、試料が2桁以上少なくてよいし、スクリーニング効率が2桁以上向上するため）。さらに、これまでアッセイできなかった特性（刺激応答）、例えば、細胞内のmRNA変動などを調べることができるようになり、創薬の幅が広がる。   The first is in the field of drug discovery. For example, it is expected that the screening performance for finding ligands that cause cancer apoptosis from nucleic acid aptamers and peptide aptamers will be improved by 10,000 times or more (compared to the microplate method, the sample may be two orders of magnitude less and the screening efficiency is two orders of magnitude). To improve it). Furthermore, characteristics (stimulation responses) that could not be assayed until now, such as intracellular mRNA fluctuations, can be examined, and the range of drug discovery is expanded.

2つ目は、‘不明’病原微生物検出の分野への応用である。これまで、見当のついている病原微生物（インフルエンザウイルス、O157、赤痢菌等）に関しての検査試薬は開発されてきたが、まったく見当が付かないものに対しては、検査のしようがないというのが実情であった。本発明の方法を利用する分子増幅可能なスクリーニングシステムによれば、一細胞の微生物からDNAを増幅し、種を同定する[GP（GenomeProfiling）法の偉力]と同時に、微生物集団中の少数派（例えば0.1％の構成割合なら、1000ウェル中の1つに出現することが期待される）であっても同定可能となった（このようなことをするのに必要なコストが微量性のおかげで２桁下がるのは大きい）。そのため、痰の中からジンジバリスなどの口内微生物と区別して結核菌を見つける事が可能になると考えられる。   The second is application to the field of 'unknown' pathogenic microorganism detection. So far, testing reagents for pathogenic microorganisms (influenza virus, O157, Shigella etc.) have been developed, but there is no way to test for those that have no idea whatsoever. Met. According to the screening system capable of amplifying molecules using the method of the present invention, DNA is amplified from a single cell microorganism, and the species is identified [the power of GP (GenomeProfiling) method]. For example, if the composition ratio is 0.1%, it can be identified even if it is expected to appear in one of 1000 wells. It ’s a big two-digit decrease). Therefore, it is considered possible to find M. tuberculosis by distinguishing it from oral microorganisms such as gingivalis in the basket.

３つ目は、組合せ問題の分野への貢献である。たとえば、タンパク質などの分子の結晶化条件を見つけるのは、種々の試薬の組合せ（イオン強度、ｐH、界面活性剤・・・）を探るしかなく、実際「タンパク３０００プロジェクト」では、結晶化条件を見つけるための巨大なロボットが組み上げられたほどである。しかし、本発明で提供されるキットを用いると１０２４通りの組合せが容易に発生できる（２N法と名称）。山中先生のiPS細胞は結局４種(最初は５種)の転写調節因子の組合せを見つけるのが難しかったという課題であったし、今後、iPSからさらに種々な細胞に分化誘導する因子の組合せを見つける事は、またまた困難な組合せ問題となる。このような問題解決に“微量”で迅速に対応できる本開発装置は大きな偉力を発揮する。   The third is contribution to the field of combinatorial problems. For example, finding the crystallization conditions for molecules such as proteins can only be done by exploring combinations of various reagents (ionic strength, pH, surfactants ...). A huge robot has been built to find it. However, using the kit provided in the present invention, 1024 combinations can be easily generated (named 2N method). Dr. Yamanaka's iPS cells had a problem that it was difficult to find a combination of 4 types of transcriptional regulatory factors (initially 5 types), and in the future, combinations of factors that induce differentiation from iPS to various cells were further studied. Finding is also a difficult combination problem. This development device, which can respond quickly to such problems with "a small amount", shows great power.

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

実施例１
ウレタンゴム製の隔離シートおよび射出成形によって作製されたポリカーボネート製の２つのマルチウェルプレート（MMV）を用いて、本発明 の液体分割方法を実施した。図９にMMVのウェルと隔離シートの二つの貫通孔(レーザー加工機による穴開け加工で形成)との寸法および位置関係、さらには遠心力ｇの向きを示す。また、使用したMMVのウェルサイズ等、隔離シートの気体流通孔および液体流通孔のサイズ等、さらには遠心の条件等を以下の表1に示す。遠心にはバケット式遠心分離機を用いた。分割する液体としては純水を使用した。結果を表2に示す。具体的には、2枚のプレートの間に2枚の隔離シートが挿入されるように組み上げたものを、さらに2枚のプラスチック板で挟み、クリップで固定した。これを遠心用バケットに装着して遠心操作を施した。遠心後、プレートの間にある２枚の隔離シートの間に楔(本実施例では、ミクロスパーテル)を挿入し、徐々に隙間を押し広げるようにして分離した(工程C)。表面に隔離シートを保持したプレートは、開口面を上にして再度遠心操作を施し、液体試料をプレートの底に移動させた(工程D)。その後、隔離シートとプレートの間に楔を挿入し、隙間を押し広げるようにして分離した(工程E)。 Example 1
The liquid dividing method of the present invention was carried out using a urethane rubber separator sheet and two polycarbonate multi-well plates (MMV) produced by injection molding. FIG. 9 shows the dimensions and positional relationship between the MMV well and the two through holes (formed by drilling with a laser processing machine) of the isolation sheet, and the direction of the centrifugal force g. In addition, Table 1 below shows the well size of the used MMV, the size of the gas flow holes and liquid flow holes of the isolation sheet, and the centrifugal conditions. A bucket centrifuge was used for centrifugation. Pure water was used as the liquid to be divided. The results are shown in Table 2. Specifically, an assembly assembled such that two isolation sheets were inserted between two plates was further sandwiched between two plastic plates and fixed with clips. This was attached to a centrifugal bucket and subjected to centrifugal operation. After centrifugation, a wedge (microspatel in this example) was inserted between the two separator sheets between the plates, and separated so as to gradually widen the gap (step C). The plate holding the isolation sheet on the surface was centrifuged again with the opening face up, and the liquid sample was moved to the bottom of the plate (step D). After that, a wedge was inserted between the isolation sheet and the plate, and the gap was widened and separated (step E).

表２に示す移送率は、供与側MMVのウェル内に充填した水の総重量と遠心操作後に受容側MMVのウェル内に移動した水の総重量から算出した。MMV内での移送有無のバラツキを肉眼で観察したとろ、移送が確認できなかったウェルは1%程度(MMV内での偏りなし)で、ほぼ全面移送が確認された。さらに、顕微鏡観察により全てのウェルにおいて水の移動を確認した。   The transfer rate shown in Table 2 was calculated from the total weight of water filled in the donor MMV well and the total weight of water moved into the receiver MMV well after centrifugation. When the presence or absence of transfer in the MMV was observed with the naked eye, about 1% of the wells where transfer could not be confirmed (no bias in the MMV), almost all of the transfer was confirmed. Furthermore, the movement of water was confirmed in all wells by microscopic observation.

本発明においては、二つのMMVのウェル形状(ウェルの深さや形)に応じて、任意の割合で液体試料を分配可能である。また、孔の位置を変えることで固形物と液体あるいは密度の高い液体と軽い液体を分割することもできる(図８参照)。   In the present invention, the liquid sample can be distributed at an arbitrary ratio according to the well shape (well depth and shape) of the two MMVs. Further, by changing the positions of the holes, it is possible to divide solids and liquids or high-density liquids and light liquids (see FIG. 8).

本発明は、多重並列かつ微量な実験系を扱う種々の分野において有用である。   The present invention is useful in various fields dealing with multiple parallel and minute experimental systems.

Claims (18)

少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなる第１のマルチウェルプレート(1)の少なくとも一部のウェルから、このウェル内に格納された液体の一部を、少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなる第２のマルチウェルプレート(2)のウェル内に移行させて、前記液体を分割する方法であって、
(A)前記第１のマルチウェルプレート(1)と前記第２のマルチウェルプレート(2)とを、膜の厚み方向に貫通する複数の貫通孔を有する隔離シートを介在させて、前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように、かつ前記貫通孔が前記対向するウェル同士の各開口に対して少なくとも２つ存在するように固定する工程、及び
(B)前記隔離シートを介在させて固定した前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)に対して、前記ウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力を与える工程、を含み、
工程(B)において、前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)に対して与えられる遠心力の向きは、隔離シートを平面視した状態において、ウェルの各開口に対して少なくとも２つ存在する貫通孔のうちの２つの貫通孔Ａ及びＢの開口縁に対して遠心力に直交する接線を想定し、
貫通孔Ａにおける、遠心力を付与する回転軸に近い側の接線をＡ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＡ２とし、
貫通孔Ｂにおける、前記回転軸に近い側の接線をＢ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＢ２とし、
前記接線Ａ１は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も近い側の接線であり、
前記接線Ｂ２は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も遠い側の接線であり、
前記接線Ａ１は前記接線Ｂ１より前記回転軸に近い側に位置し、かつ
前記接線Ａ２は前記接線Ｂ２より前記回転軸に近い側に位置するように設定され、
それにより、前記第１のマルチウェルプレート(1)の前記ウェル内に格納された液体の一部が前記第２のマルチウェルプレート(2)の前記ウェル内に前記少なくとも２つの貫通孔の少なくとも１つを通過して移行する、前記方法。 A part of liquid stored in at least one main surface of at least one main surface of the first multi-well plate (1) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface is transferred to at least one main surface. by shift to the second multi-well plate in the (2) comprising a substrate having a plurality of wells, a method of dividing the liquid,
(A) The first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) are interposed with an isolation sheet having a plurality of through-holes penetrating in the thickness direction of the film . The multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) have at least a part of the wells facing each other and at least two through-holes with respect to the openings of the facing wells. Fixing to exist, and
(B) The first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween are centrifuged in a direction orthogonal to the bottom direction from the opening of the well. A process of applying power,
In step (B), the first multi-well plate (1) and the second centrifugal force in a direction given to a multi-well plate (2), in a state where the isolation sheet is viewed in plane, each opening of the well Assuming a tangent line perpendicular to the centrifugal force with respect to the opening edges of two through holes A and B of at least two through holes,
In the through-hole A, the tangent on the side close to the rotation axis that applies the centrifugal force is A1, and the tangent on the side far from the rotation axis is A2.
In the through-hole B, the tangent on the side close to the rotation axis is B1, and the tangent on the side far from the rotation axis is B2.
The tangent line A1 is a tangent line closest to the rotation axis among tangent lines orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent B2 is a tangent farthest from the rotation axis among tangents orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent line A1 is positioned closer to the rotation axis than the tangent line B1, and the tangent line A2 is set closer to the rotation axis than the tangent line B2.
Thereby, at least the portion of the liquid stored in the wells of the at least two holes in the well of the second multi-well plate (2) said first multiwell plate (1) 1 Said method of transitioning through one. 前記隔離シートは少なくとも２層の膜からなり、かつ各膜の前記貫通孔は互いに連通している、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the separator sheet comprises at least two layers of membranes, and the through holes of each membrane communicate with each other. 前記工程(B)の後に、(C)前記隔離シートを構成する一方の膜は前記第２のマルチウェルプレート(2)の主表面に配置した状態、前記隔離シートを構成する他方の膜は前記第１のマルチウェルプレート(1)の主表面に配置した状態となるように、前記第２のマルチウェルプレート(2)と前記第１のマルチウェルプレート(1)とを分離する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。 After the step (B), (C) state the one film constituting the isolation sheet is disposed on the main surface of said second multiwell plate (2), the other film of the isolation sheet is the as a state of being disposed on the main surface of the first multi-well plate (1), further comprising the step of separating the second multiwell plate (2) and the first multi-well plate (1) The method according to claim 2. 前記工程(C)の後に、 (D)前記膜を主表面に配置した少なくとも一方のマルチウェルプレートを、各ウェルの開口から底の方向に遠心力を与える工程、及び
(E)工程(D)で遠心力を与えたマルチウェルプレートから前記膜を分離して、ウェル中に分割後の液体を含むマルチウェルプレートを得る工程を含む、請求項３に記載の方法。 After the step (C), (D) applying at least one multi-well plate having the membrane disposed on the main surface to a centrifugal force from the opening of each well toward the bottom; and
(E) The method of Claim 3 including the process of isolate | separating the said film | membrane from the multiwell plate which gave the centrifugal force in the process (D), and obtaining the multiwell plate which contains the liquid after a division | segmentation in a well. 前記第１のマルチウェルプレート(1)の前記ウェルと前記第２のマルチウェルプレート(2)の前記ウェルの開口寸法および形状、ならびに配列が、同一であり、かつ前記隔離シートは、各ウェルに対して、前記貫通孔を２つ有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 The wells of the first multi-well plate (1) and the wells of the second multi-well plate (2) have the same opening size, shape, and arrangement, and the isolation sheet is provided in each well. On the other hand, the method of any one of Claims 1-4 which has the said two through-holes. 前記第１のマルチウェルプレート(1)の前記ウェルと前記第２のマルチウェルプレート(2)の前記ウェルの開口寸法および形状、容量ならびに配列の少なくとも一部が相違し、前記隔離シートは、何れか一方のマルチウェルプレートの前記各ウェルに対して、前記貫通孔を２つ有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 The wells of the first multi-well plate (1) and the wells of the second multi-well plate (2) are different in at least part of the opening size, shape, capacity, and arrangement. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein each of the wells of one of the multi-well plates has two through holes. 前記隔離シートは、開口寸法が小さい方の前記マルチウェルプレートの前記各ウェルに対して、前記貫通孔を２つ有する請求項６に記載の方法。 The method according to claim 6, wherein the isolation sheet has two through holes for each well of the multi-well plate having a smaller opening size. 前記第１のマルチウェルプレート(1)及び第２のマルチウェルプレート(2)の前記ウェルは、前記ウェルの開口が上向きの状態で、前記第１のマルチウェルプレート(1)及び第２のマルチウェルプレート(2)を静置したときには、前記ウェルの開口が前記液体で覆われても、前記ウェル内に前記液体は注入されない、寸法、形状および表面状態を有し、かつ前記ウェルの開口が下向きの状態で前記第１のマルチウェルプレート(1)及び第２のマルチウェルプレート(2)を静置したときに、前記ウェル内から前記液体が流出しない、寸法、形状および表面状態を有する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 Wherein the well of the first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) is a opening facing upward in said well, said first multiwell plate (1) and the second multi When the well plate (2) is allowed to stand, even if the well opening is covered with the liquid, the liquid is not injected into the well, and has a size, shape, and surface state, and the well opening has when the first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) was allowed to stand in a downward state, the liquid from within the well does not flow out, according with size, shape and surface condition Item 8. The method according to any one of Items 1 to 7. 前記工程(B)における遠心分離は、バケット式遠心分離機を用いて行い、
前記隔離シートを介在させて固定した前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)は、前記遠心分離機の停止時に、前記仮想直線が、遠心分離操作時の遠心力の向きと平行になるように、前記バケット式遠心分離機のバケットに配置される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 Centrifugation in the step (B) is performed using a bucket centrifuge,
The first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween are arranged such that when the centrifuge is stopped, the virtual straight line is centrifuged at the time of the centrifuge operation. The method according to claim 1, wherein the method is arranged in a bucket of the bucket centrifuge so as to be parallel to a direction of force. 少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなる第１のマルチウェルプレート(1)、
少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなる第２のマルチウェルプレート(2)、及び
膜の厚み方向に貫通する複数の貫通孔を有する隔離シートを含む液体分割用キットであって、
前記貫通孔は、前記第１のマルチウェルプレート(1)と前記第２のマルチウェルプレート(2)とを、前記隔離シートを介在させて、前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように固定したときに、前記第１のマルチウェルプレート(1)及び第２のマルチウェルプレート(2)の少なくとも一方のマルチウェルプレートの少なくとも一部のウェルの開口に対して少なくとも２つ存在するように設けられ、
前記キットは、
(A)前記第１のマルチウェルプレート(1)と前記第２のマルチウェルプレート(2)とを、前記隔離シートを介在させて、前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように、かつ前記貫通孔が前記対向するウェル同士の各開口に対して少なくとも２つ存在するように固定する工程、及び
(B)前記隔離シートを介在させて固定した前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)に対して、前記ウェルの開口から底の向きと直交する向きに遠心力を与える工程、を含み、
工程(B)において、前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)に対して与えられる遠心力の向きは、隔離シートを平面視した状態において、
ウェルの各開口に対して少なくとも２つ存在する貫通孔のうちの２つの貫通孔Ａ及びＢの開口縁に対して遠心力に直交する接線を想定し、
貫通孔Ａにおける、遠心力を付与する回転軸に近い側の接線をＡ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＡ２とし、
貫通孔Ｂにおける、前記回転軸に近い側の接線をＢ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＢ２とし、
前記接線Ａ１は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も近い側の接線であり、
前記接線Ｂ２は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も遠い側の接線であり、
前記接線Ａ１は前記接線Ｂ１より前記回転軸に近い側に位置し、かつ
前記接線Ａ２は前記接線Ｂ２より前記回転軸に近い側に位置するように設定され、
それにより、前記第１のマルチウェルプレート(1)の前記ウェル内に格納された液体の一部が前記第２のマルチウェルプレート(2)の前記ウェル内に前記少なくとも２つの貫通孔の少なくとも１つを通過して移行する、液体を分割する方法に用いるための、前記キット。 A first multi-well plate (1) comprising a substrate having a plurality of wells on at least one main surface;
A liquid divided kit comprising an isolation sheet having at least on one main surface consisting of a substrate having a plurality of wells second multiwell plate (2), and the membrane a plurality of through holes penetrating in the thickness direction of,
The through hole, and said first multiwell plate (1) and said second multiwell plate (2), by interposing the isolation sheet, the first multi-well plate (1) and a second When at least some of the wells of the multi-well plate (2) are fixed so as to face each other, at least one of the first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) At least two openings are provided for the openings of at least some wells of the well plate,
The kit is
(A) The first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) are interposed between the first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) with the isolation sheet interposed therebetween. Fixing so that at least a part of wells of the well plate (2) are opposed to each other and at least two of the through holes are present with respect to each opening of the opposed wells; and
(B) The first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween are centrifuged in a direction orthogonal to the bottom direction from the opening of the well. A process of applying power,
In the step (B), the direction of the centrifugal force applied to the first multiwell plate (1) and the second multiwell plate (2) is as follows:
Assuming a tangent line perpendicular to the centrifugal force with respect to the opening edges of two through holes A and B out of at least two through holes for each opening of the well,
In the through-hole A, the tangent on the side close to the rotation axis that applies the centrifugal force is A1, and the tangent on the side far from the rotation axis is A2.
In the through-hole B, the tangent on the side close to the rotation axis is B1, and the tangent on the side far from the rotation axis is B2.
The tangent line A1 is a tangent line closest to the rotation axis among tangent lines orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent B2 is a tangent farthest from the rotation axis among tangents orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent line A1 is located closer to the rotation axis than the tangent line B1, and
The tangent line A2 is set to be located closer to the rotation axis than the tangent line B2,
Thereby, a part of the liquid stored in the well of the first multi-well plate (1) is transferred to at least one of the at least two through holes in the well of the second multi-well plate (2). Said kit for use in a method of dividing a liquid that passes through one of them . 前記隔離シートは、少なくとも２層の膜からなり、かつ各膜の貫通孔は、互いに連通している、請求項１０に記載の液体分割用キット。 The liquid separating kit according to claim 10, wherein the separator sheet is composed of at least two layers of membranes, and the through holes of the membranes communicate with each other. 前記第１のマルチウェルプレート(1)のウェルと第２のマルチウェルプレート(2)のウェルの開口寸法および形状、ならびに配列が、同一であり、かつ前記隔離シートは、各ウェルに対して、２つの貫通孔を有する請求項１０〜１１のいずれか１項に記載のキット。 The wells of the first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) have the same opening size, shape, and arrangement, and the isolation sheet is The kit according to any one of claims 10 to 11 , which has two through holes. 前記第１のマルチウェルプレート(1)のウェルと第２のマルチウェルプレート(2)のウェルの開口寸法および形状、容量ならびに配列の少なくとも一部が相違し、前記隔離シートは、何れか一方のマルチウェルプレートの各ウェルに対して、２つの貫通孔を有する請求項１０〜１１のいずれか１項に記載のキット。 At least part of the opening size, shape, capacity, and arrangement of the wells of the first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) are different. The kit according to any one of claims 10 to 11 , which has two through holes for each well of the multi-well plate. 前記隔離シートは、開口寸法が小さい方のマルチウェルプレートの各ウェルに対して、２つの貫通孔を有する請求項１３に記載のキット。 The kit according to claim 13 , wherein the isolation sheet has two through holes for each well of the multi-well plate having a smaller opening size. 前記第１のマルチウェルプレート(1)及び第２のマルチウェルプレート(2)のウェルは、前記ウェルの開口が上向きの状態で、マルチウェルプレートを静置したときには、前記ウェルの開口が前記液体で覆われても、ウェル内に液体は注入されない、寸法、形状および表面状態を有し、かつ前記ウェルの開口が下向きの状態でマルチウェルプレートを静置したときに、前記ウェル内の液体がウェルから流出しない、寸法、形状および表面状態を有する請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のキット。 The wells of the first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) are such that when the multi-well plate is left standing with the well opening facing upward, the well opening becomes the liquid. When the multi-well plate is allowed to stand with the dimensions, shape, and surface state, and the well opening facing downward, the liquid in the well is not injected into the well. The kit according to any one of claims 10 to 14 , which has a size, a shape and a surface state which do not flow out of a well. 前記工程(B)における遠心分離は、バケット式遠心分離機を用いて行い、
前記隔離シートを介在させて固定した前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)は、前記遠心分離機の停止時に、前記仮想直線が、遠心分離操作時の遠心力の向きと平行になるように、前記バケット式遠心分離機のバケットに配置される、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のキット。 Centrifugation in the step (B) is performed using a bucket centrifuge,
The first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) fixed with the isolation sheet interposed therebetween are arranged such that when the centrifuge is stopped, the virtual straight line is centrifuged at the time of the centrifuge operation. The kit according to any one of claims 10 to 15 , which is arranged in a bucket of the bucket centrifuge so as to be parallel to the direction of force. 少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなる第１のマルチウェルプレート(1)および少なくとも一方の主表面に複数のウェルを有する基板からなる第２のマルチウェルプレート(2)を、膜の厚み方向に貫通する複数の貫通孔を有する隔離シートを介在させて、前記第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)が有する少なくとも一部のウェル同士が対向するように、かつ前記第１のマルチウェルプレート(1)及び第２のマルチウェルプレート(2)の少なくとも一方のマルチウェルプレートの少なくとも一部のウェルの開口に対して少なくとも２つ存在するように固定したキット、並びに遠心分離機を含み、
前記遠心分離機の停止時に、前記隔離シートを平面視した状態において、
ウェルの各開口に対して少なくとも２つ存在する貫通孔のうちの２つの貫通孔Ａ及びＢの開口縁に対して遠心分離操作時の遠心力に直交する接線を想定し、
貫通孔Ａにおける、遠心力を付与する回転軸に近い側の接線をＡ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＡ２とし、
貫通孔Ｂにおける、前記回転軸に近い側の接線をＢ１及び前記回転軸に遠い側の接線をＢ２とし、
前記接線Ａ１は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も近い側の接線であり、
前記接線Ｂ２は、前記少なくとも２つ存在する貫通孔の開口縁に想定された遠心力に直交する接線の中で前記回転軸に最も遠い側の接線であり、
前記接線Ａ１は前記接線Ｂ１より前記回転軸に近い側に位置し、かつ
前記接線Ａ２は前記接線Ｂ２より前記回転軸に近い側に位置するように、
前記遠心分離機に前記隔離シートを介在させて固定した第１のマルチウェルプレート(1)および第２のマルチウェルプレート(2)が配置される、液体分割用装置。 A second multi-well plate (2) consisting of a substrate having a plurality of wells in the first multi-well plate (1) and at least one main surface consisting of a substrate having multiple wells on at least one major surface, the film At least some of the wells of the first multiwell plate (1) and the second multiwell plate (2) are opposed to each other with an isolation sheet having a plurality of through holes penetrating in the thickness direction of the first multiwell plate (1) and the second multiwell plate (2). And at least two of the first multi-well plate (1) and the second multi-well plate (2) are fixed so that there are at least two well openings. Kit , as well as a centrifuge
When the centrifuge is stopped, the isolation sheet is viewed in plan view.
Assuming a tangent line perpendicular to the centrifugal force during the centrifugal separation operation with respect to the opening edges of two through holes A and B out of at least two through holes for each opening of the well ,
In the through-hole A, the tangent on the side close to the rotation axis that applies the centrifugal force is A1, and the tangent on the side far from the rotation axis is A2.
In the through-hole B, the tangent on the side close to the rotation axis is B1, and the tangent on the side far from the rotation axis is B2.
The tangent line A1 is a tangent line closest to the rotation axis among tangent lines orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent B2 is a tangent farthest from the rotation axis among tangents orthogonal to the centrifugal force assumed at the opening edge of the at least two through holes.
The tangent line A1 is located closer to the rotation axis than the tangent line B1, and
The tangent line A2 is positioned closer to the rotation axis than the tangent line B2,
An apparatus for dividing a liquid, wherein a first multiwell plate (1) and a second multiwell plate (2) fixed to the centrifuge with the isolation sheet interposed therebetween are disposed. 前記第１のマルチウェルプレート(1)の前記ウェル内に格納された液体の一部が前記第２のマルチウェルプレート(2)の前記ウェル内に前記少なくとも２つの貫通孔の少なくとも１つを通過して移行する、液体を分割する方法に用いるための、請求項１７に記載の液体分割用装置。Part of the liquid stored in the well of the first multi-well plate (1) passes through at least one of the at least two through holes into the well of the second multi-well plate (2). 18. The liquid dividing device according to claim 17, for use in a method of dividing a liquid that is transferred.
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JP6300260B2 (en) * 2013-08-28 2018-03-28 国立大学法人埼玉大学 Method for producing replica microarray and original microarray containing target substance produced by the method
JP6489048B2 (en) * 2016-03-16 2019-03-27 ブラザー工業株式会社 Quantitation system and chip
CN106195331B (en) * 2016-07-22 2019-04-26 中禹科技集团有限公司 A kind of multichannel sampling valve
JP6799851B2 (en) * 2016-11-30 2020-12-16 国立大学法人東海国立大学機構 Sample processing method and sample processing kit

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998031466A1 (en) * 1997-01-17 1998-07-23 Corning Incorporated Multi-well plate
JP4387588B2 (en) * 1998-02-04 2009-12-16 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド Virtual wells for high-throughput screening assays
US6423536B1 (en) * 1999-08-02 2002-07-23 Molecular Dynamics, Inc. Low volume chemical and biochemical reaction system
EP1330306A2 (en) * 2000-10-10 2003-07-30 BioTrove, Inc. Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof
JP3910208B2 (en) * 2005-01-24 2007-04-25 松下電器産業株式会社 Liquid feeding device and liquid feeding method
JP3978500B2 (en) * 2005-02-18 2007-09-19 国立大学法人埼玉大学 Injection and transfer methods for various types of micro samples
JP2009281779A (en) * 2008-05-20 2009-12-03 Rohm Co Ltd Microchip and its using method
NO332016B1 (en) * 2009-12-29 2012-05-21 Stiftelsen Sintef Sample processing cartridge and method for processing and / or analyzing a sample under centrifugal force

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