JP6001818B2 - フジツボ種判定用プライマーセットとこれを利用したフジツボ幼生の種判定方法及び定量方法 - Google Patents
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Description
(1)配列番号1及び2で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるミネフジツボ(Balanus rostratus)検出用プライマー対、
(2)配列番号3及び4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるチシマフジツボ(Semibalanus cariosus)検出用プライマー対、
(3)配列番号5及び6で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるハナフジツボ(Balanus crenatus)検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号1で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号2で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号7で示されるミネフジツボのミトコンドリアDNA上の12S rRNA遺伝子解析領域のうち、36〜148番目の113bpのDNA断片が増幅される。
このプライマー対は、配列番号3で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号8で示されるチシマフジツボのミトコンドリアDNA上の12S rRNA遺伝子解析領域のうち、98〜247番目の150bpのDNA断片が増幅される。
このプライマー対は、配列番号5で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号6で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号9で示されるハナフジツボのミトコンドリアDNA上の12S rRNA遺伝子解析領域のうち、97〜244番目の148bpのDNA断片が増幅される。
各種フジツボ成体の12S rRNA遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいて各種フジツボに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供したフジツボ種を表1に示す。アカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ココポーマアカフジツボは採集後に室内でアルテミア、珪藻(Chaetoceros gracilis)などを餌として与えて飼育されたものを99.5%エタノール(和光純薬製)に浸して固定し、実験に使用するまで4℃で保存した。なお、エタノール浸漬前は、数日間餌を与えずアルテミア由来のDNAの影響を排除した。その他のフジツボは採集直後に99.5%エタノールに浸漬し4℃で保存した。尚、オオアカフジツボは伊豆半島にて採集したものを使用した。
抽出用組織が小さい場合は適宜溶解バッファー量を減らした。また小型のフジツボであるイワフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ムツアナフジツボ、ハナフジツボ、Semibalanus balanoides、Elminius modestus、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、また、上記大型のフジツボ成体に属するタテジマフジツボの中でも小型の個体に関しては、1個体の軟体部全体をそのまま同様の方法で抽出に供した。
(文献1: R.A.Begum,T.Yamaguchi and S.Watabe(2004).Molecular phylogeny of thoracican barnacles based on the mitochondrial 12S and 16S rRNA genes.Sessile organisms,21,47-54.
文献2: T.D.Kocher, W.K.Thomas, A.Meyer, S.V.Edwards, S.Paabo, F.X.Villablansca and A.C.Wilson(1989). Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6196-6200.
文献3: O.Mokady, S.Rozenblatt, D.Graur and Y.Loya(1994). Coral-host specificity of red sea Lithophaga bivalves: interspecific and intraspecific variation in 12S mitochondrial ribosomal RNA.Mol.Mar.Biol.Biotech.,3,158-164.
文献4: S.R.Palumbi(1996). Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. In: Molecular Systematics,ed. D.M.Hillis, C.Mortiz and B.K.Mable, Sinauer Associates, Sunderland, pp.205-248.)
・配列番号10:チシマフジツボ
・配列番号11:ハナフジツボ
・配列番号12:アカフジツボ
・配列番号13:キタアメリカフジツボ
・配列番号14:アメリカフジツボ
・配列番号15:タテジマフジツボ
・配列番号16:サラサフジツボ
・配列番号17:シロスジフジツボ
・配列番号18:サンカクフジツボ
・配列番号19:ケハダカイメンフジツボ
・配列番号20:イワフジツボ
・配列番号21:クロフジツボ
・配列番号22:ムツアナヒラフジツボ
・配列番号23:カメノテ
・配列番号24:エボシガイ
・配列番号25:オオアカフジツボ
・配列番号26:キタイワフジツボ
・配列番号27:ミミエボシ
・配列番号28:オニフジツボ
・配列番号29:コウダカキクフジツボ
・配列番号30:ヨーロッパフジツボ
・配列番号31:ドロフジツボ
・配列番号32:Cryptolepas rhachianechi
・配列番号33:Elminius modestus
・配列番号34:Semibalanus balanoides
・配列番号35:スジエボシ
・配列番号36:ココポーマアカフジツボ
配列番号1及び2のミネフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたミネフジツボ成体、ミネフジツボと比較的近縁と考えられるチシマフジツボ成体、ハナフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、サンカクフジツボ成体、イワフジツボ成体、シロスジフジツボ成体、ココポーマアカフジツボ成体、ケハダカイメンフジツボ成体、アメリカフジツボ成体、タテジマフジツボ成体及びサラサフジツボ成体の鋳型DNAを用いてPCRを行い、配列番号1及び2のミネフジツボ検出用プライマー対の有効性とPCRの最適条件について検討した。PCRは基本的には上述の方法に従い、タカラPCRサーマルサイクラーDice(TP600)のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行なった。PCR産物はアガロースゲル電気泳動(3%アガロース)後にSYBR Safe(インビトロジェン)によるDNAバンドの可視化により検出した。PCRにおけるサイクル数は30サイクルとした。
配列番号3及び4のチシマフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたチシマフジツボ成体、チシマフジツボと比較的近縁と考えられるシロスジフジツボ成体、ドロフジツボ成体、サラサフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、ミネフジツボ成体、ココポーマアカフジツボ成体、アカフジツボ成体、クロフジツボ成体、オオアカフジツボ成体、タテジマフジツボ成体及びヨーロッパフジツボ成体の鋳型DNAを用いて上記(1)と同様の条件でPCRと電気泳動を行い、配列番号3及び4のチシマフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
配列番号5及び6のハナフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたハナフジツボ成体、ハナフジツボと比較的近縁と考えられるチシマフジツボ成体、ドロフジツボ成体、ミネフジツボ成体、キタアメリカフジツボ成体、サラサフジツボ成体、ケハダカイメンフジツボ成体、サンカクフジツボ成体、オオアカフジツボ成体、イワフジツボ成体、シロスジフジツボ成体及びタテジマフジツボ成体の鋳型DNAを用いて上記(1)と同様の条件でPCRと電気泳動を行い、配列番号5及び6のハナフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
本発明のプライマー対の混合プランクトン中での有効性について検討した。
配列番号1及び2のミネフジツボ検出用プライマー対について、実施例1で得られたミネフジツボ成体の鋳型DNA、東京湾混合プランクトンの鋳型DNA、志津川湾混合プランクトンの鋳型DNAを用いて、実施例1(1)と同様の条件でPCRと電気泳動を行い、配列番号1及び2のミネフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
配列番号3及び4のチシマフジツボ検出用プライマー対について、実施例1で得られたチシマフジツボ成体の鋳型DNA、東京湾混合プランクトンの鋳型DNA、志津川湾混合プランクトンの鋳型DNAを用いて、実施例1(1)と同様の条件でPCRと電気泳動を行い、配列番号3及び4のチシマフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
配列番号5及び6のハナフジツボ検出用プライマー対について、実施例1で得られたハナフジツボ成体の鋳型DNA、東京湾混合プランクトンの鋳型DNA、志津川湾混合プランクトンの鋳型DNAを用いて、実施例1(1)と同様の条件でPCRと電気泳動を行い、配列番号5及び6のハナフジツボ検出用プライマー対の有効性について検討した。
本発明のプライマー対を用いた定量分析について検討した。
本発明のプライマー対を用いたリアルタイムPCRによる定量分析について検討した。
Claims (5)
- 下記(1)〜(3)のうち少なくとも一組のプライマー対を含むことを特徴とするフジツボ種判定用プライマーセット。
(1)配列番号1及び2で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるミネフジツボ(Balanus rostratus)検出用プライマー対、
(2)配列番号3及び4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるチシマフジツボ(Semibalanus cariosus)検出用プライマー対、
(3)配列番号5及び6で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるハナフジツボ(Balanus crenatus)検出用プライマー対 - 被験試料に対し、請求項1に記載のプライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてPCRを行い、前記被験試料の遺伝子増幅の有無により前記被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定することを特徴とするフジツボ幼生の種判定方法。
- 被験試料に対し、請求項1に記載のプライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてPCRを行い、前記PCRにおける遺伝子増幅量に基づき、前記プライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し前記プライマー対を用いてPCRを行うことにより前記フジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、前記被験試料に存在する前記フジツボ幼生種の個体数の定量を行うことを特徴とするフジツボ幼生個体数の定量方法。
- 前記PCRをリアルタイムPCRとし、前記遺伝子増幅量として前記リアルタイムPCRを行うことにより得られるCt値を利用することを特徴とする請求項3記載のフジツボ幼生個体数の定量方法。
- 前記被験試料を分画処理してから前記PCRに供する請求項3または4に記載のフジツボ幼生個体数の定量方法。
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