JP5611504B2 - アカフジツボ検出用プライマーセットとこれを利用したアカフジツボ幼生の検出・定量方法 - Google Patents

Description

本発明は、アカフジツボ検出用プライマーセットとこれを利用したアカフジツボ幼生の検出・定量方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、複数種のフジツボ幼生が混在している被験試料からアカフジツボ幼生を検出するためのプライマーセットと、このプライマーセットを利用して被験試料中のアカフジツボ幼生の検出・定量を行う方法に関する。

フジツボは、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へ付着することにより生物汚損を引き起こす代表的汚損生物として知られている。例えば、火力・原子力発電所の冷却水路系にフジツボが付着すると、冷却水の流量が流動抵抗の増大により低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボが付着したり、剥がれたフジツボが詰まることにより管壁が腐食される。そこで、各発電所では、付着したフジツボを機械的に除去したり、フジツボの付着を抑制するための様々な防除対策を行っている。

フジツボの付着を抑制する対策としては、防汚塗料を冷却水路系や復水器管等に塗布したり、あるいは塩素を注入してフジツボ幼生の付着を防ぐ手法がとられている。ここで、汚損性のフジツボとして特に問題なのは、アカフジツボである。しかしながら、アカフジツボの付着時期を予測する技術が確立されていないため、結果的には長期間にわたって塩素注入を継続することによりアカフジツボの付着を抑制しているのが現状であり、環境負荷が非常に大きいという問題がある。したがって、環境負荷を低減し、また、防除対策のコストダウンを図るためにも、アカフジツボが付着する直前にピンポイントで塩素注入を行うことが好ましい。そこで、アカフジツボの付着時期を正確に予測する技術の確立が望まれている。

アカフジツボの付着時期を予測するためには、付着前のアカフジツボ幼生の発生量を調査することが必要である。そこで、特定海域からプランクトンを採集し、このプランクトンサンプル中に含まれるアカフジツボ幼生の個体数を顕微鏡観察により計数することで、その海域におけるアカフジツボ幼生の発生量を確認することができると考えられる。しかしながら、プランクトンサンプル中に存在する複数種のフジツボ幼生から形態分類学上の差異のみを頼りにフジツボ種の判定を行うことは極めて困難である。

そこで、付着期のフジツボ幼生の種を判定する技術として、特許文献１のような方法が提案されている。具体的には、海水から採集されたタテジマフジツボ、アメリカフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ、オオアカフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボおよびヨーロッパフジツボを含むフジツボ種の付着期幼生に対して、波長が４００〜４４０ｎｍの励起光を照射し、発光した波長４７５ｎｍ以上の蛍光分布パターンをデジタル画像情報としてコンピュータに入力し、この情報をコンピュータに予め登録された種に固有の体内蛍光分布パターン認識情報と比較して、これらの蛍光分布パターンがマッチングしたフジツボ類の種を判定するものである。
特開２００４−１２４６７

しかしながら、特許文献１に記載の方法では、ノープリウス幼生期のフジツボ種の判定を行うことができず、汚損種であるアカフジツボの付着時期の予測が遅れて付着抑制対策を確実に実行できなくなる虞がある。また、蛍光パターンが類似している種が存在する結果、高精度に種判定を行うことができない。さらに、キプリス幼生が死んでいる場合、励起光を照射してもキプリス幼生からの蛍光発光が起こらず、種判定ができない。したがって、特許文献１に記載の方法では、キプリス幼生を生きたまま種判定に供する必要があるという煩雑さが伴う。

また、アカフジツボの付着時期を正確に予測するためには、アカフジツボ幼生の高精度な種判定手法と共に、アカフジツボ幼生個体数の定量分析手法を確立することが必要である。

そこで、本発明は、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のアカフジツボを簡易に検出する方法を提供することを目的とする。

また、本発明は、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のアカフジツボを簡易に検出すると共にその個体数を定量する方法を提供することを目的とする。

かかる課題を解決するため、本願発明者は、遺伝子解析技術からのアプローチによりアカフジツボを分子レベルで種々検討した。その結果、アカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列情報に基づき、アカフジツボのみを分子レベルで特異的に認識するオリゴヌクレオチドプライマーセットを開発することに成功し、本発明に至った。

即ち、本発明のアカフジツボ検出用プライマーセットは、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーとからなるものである。

このプライマーセットは、アカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。したがって、このプライマーセットによれば、この特定領域の遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。

ここで、「特異的」とは、アカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには、アカフジツボの近縁種であるオオアカフジツボの遺伝子を認識しないこと、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しないことを意味している。

また、アカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列とは、図１に示す１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、５６〜８１番目の塩基配列と、１２２〜１４５番目の塩基配列を意味する。

次に、本発明のアカフジツボ幼生の検出方法は、被験試料に対し上述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料にアカフジツボ幼生が存在しているか否かを判定するようにしている。

被験試料にアカフジツボ幼生が含まれている場合には、上述のプライマーセットがアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識してＰＣＲを起こし、アカフジツボ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にアカフジツボ幼生が含まれていない場合には、上述のプライマーセットによりＰＣＲを起こす対象遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料にアカフジツボ幼生が存在しているか否かを判定することができる。

次に、本発明のアカフジツボ幼生の定量方法は、アカフジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりアカフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対し上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られる被験試料のＣｔ値から被験試料中のアカフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしている。

被験試料に対して上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、被験試料に存在するアカフジツボ幼生個体数に対応したＣｔ値が得られる。したがって、アカフジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりアカフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用いることで、被験試料のＣｔ値から被験試料に存在するアカフジツボ幼生個体数を定量することができる。

ここで、本発明のアカフジツボ幼生の定量方法において、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することが好ましい。アカフジツボ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、初期ノープリウス幼生期にあるアカフジツボ幼生と、後期ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期にあるアカフジツボ幼生とを分画して定量することができる。

さらに、本発明のアカフジツボ検出用キットは、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーをプローブとして含むものである。したがって、このプローブがアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）し、被験試料にアカフジツボ幼生が存在するか否かを判定することができる。

請求項１に記載の発明によれば、プライマーセットが配列番号１記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーとからなるので、アカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、このプライマーセットをＰＣＲに供することで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。

請求項２に記載の発明によれば、被験試料に複数のプランクトン種が含まれている場合であっても、アカフジツボ幼生のみを特異的に検出することができる。

請求項３に記載の発明によれば、被験試料に複数のプランクトン種が含まれている場合であっても、アカフジツボ幼生のみを特異的に定量することができる。しかも、請求項１に記載のアカフジツボ検出用プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うようにしているので、増幅されるＤＮＡ断片長が８０〜１２０ｂｐの範囲内に収まり、リアルタイムＰＣＲによるＣｔ値の測定を高精度に行うことが可能になる。

請求項４に記載の発明によれば、被験試料が予め分画処理されてからリアルタイムＰＣＲに供されるので、例えば、初期ノープリウス幼生期にあるアカフジツボ幼生と、後期ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期にあるアカフジツボ幼生とを分画して定量することにより定量精度を高めることが可能となる。

請求項５に記載の発明によれば、検出キットが配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーをプローブとして含んでいるので、アカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して、被験試料にアカフジツボ幼生が存在するか否かを判定することができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。

本発明のアカフジツボ検出用プライマーセットは、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーとからなるものである。即ち、配列番号１記載の塩基配列で表される２１塩基からなるプライマーと、配列番号２記載の塩基配列で表される２３塩基からなるプライマーとからなるものである。

このプライマーセットにより、図１に示すアカフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、５６〜１４５番目に含まれる８４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。

本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知の他の方法を用いて合成してもよい。

次に、本発明のアカフジツボ幼生の検出方法は、被験試料に対し上述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより被験試料にアカフジツボ幼生が存在していたか否かを判定するようにしている。

被験試料としては、アカフジツボ幼生を１個体以上含有する可能性のあるあらゆる種類の試料が包含される。例えば、複数のプランクトンが混在した人工飼育サンプルや、海洋中から採集した環境サンプル等を用いることができるが、これらに限定されない。

被験試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、被験試料中のプランクトンをエタノールに浸漬して固定することが好ましい。この処理により、被験試料中のプランクトンに含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなり、被験試料の長期保存が可能となると共に、ＰＣＲに悪影響を及ぼす虞のある塩分の析出を防ぐことができる。エタノール固定後は、室温（２０℃程度）で保存してもよいが、１５℃程度で保存することが好適であり、１０℃程度で保存することがより好適であり、５℃程度で保存することがさらに好適である。低温保存することで、プランクトンに含まれる酵素の活性を確実に抑えることができ、ＤＮＡの分解を防止することができる。エタノールに固定した被験試料は、例えばエッペンドルフチューブなどのチューブに入れて乾燥させる。エタノールは揮発しやすいので、乾燥を素早く行うことができる。尚、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。

上記方法以外の方法により塩分を除いても良い。例えば、滅菌水等で被験試料中のプランクトンを十分に洗浄したのち、風乾等を行うようにしても良いし、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うようにしても良い。

ここで、被験試料に対しＤＮＡ抽出処理を施すことが好ましい。この場合、複数種のプランクトンに含まれる有機物等によるＰＣＲへの悪影響を防いで、より確実にアカフジツボ幼生の検出を行うことが可能になる。ＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知の方法を適宜用いることができる。

ＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡを鋳型として、上述のプライマーセットを用いて行われる。ＰＣＲ条件としては、当該技術分野において公知の条件を適宜用いることができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）を用いたＰＣＲが挙げられるが、これに限られるものではない。ＰＣＲを行うことにより、被験試料中にアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。

ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、非検出対象成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー等）と検出対象成分である増幅産物とを分離した状態で蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量から判断して特定し、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行うことができる。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該技術分野において公知の他の方法を用いることもできる。増幅産物が検出された場合には、被験試料中にアカフジツボ幼生が存在していると判定することができる。

次に、本発明のアカフジツボ幼生の定量方法は、アカフジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりアカフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対し上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られる被験試料のＣｔ値から被験試料中のアカフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしている。

即ち、アカフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を用いて、被験試料のＣｔ値から、被験試料のアカフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしている。

ここで、リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。この手法を用いることで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。即ち、段階希釈した濃度既知の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡを標準試料としてＰＣＲを行い、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定する。この結果に基づいて、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ濃度を横軸にプロットし、検量線を作成する。つまり、この検量線が、試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を表す。したがって、濃度未知の被験試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲにより測定することで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度を決定することができる。

リアルタイムＰＣＲは、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置により行うことができる。また、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、蛍光試薬を用いた蛍光モニター法により行われる。例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレータ）をＰＣＲ反応系に添加し、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）にインターカレータを結合させ、励起光を照射することにより蛍光発光を生じさせて、蛍光強度を検出することによりＤＮＡ増幅量のモニタリングを行う、所謂インターカレータ法を用いることができる。尚、インターカレータ法に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法などを適宜採用することができる。

また、リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値とは、蛍光標識されたＰＣＲ産物量が指数関数的なＤＮＡ増幅期の中で一定量となるときの値、即ち、一定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲサイクル数を表している。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、初期には指数関数的に起こり、１次関数的な増幅を経て、最終的にはプラトーに達する。指数関数的なＤＮＡ増幅期における一定ＰＣＲ産物量に達するＰＣＲサイクル数と初期鋳型ＤＮＡ量には高い相関がある。したがって、初期鋳型ＤＮＡ量、つまり、試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度とＣｔ値との相関を調べることで、Ｃｔ値から試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度を推定する為の検量線を作成することができる。また、ＤＮＡの増幅曲線を二回微分して最大値を算出し、この最大値に達するまでのサイクル数、つまり、ＰＣＲ産物量の増幅がバックグラウンド値から指数関数的に変化する時点のサイクル数を検出し、これをＣｔ値とするようにしてもよい。

本発明の定量方法に用いる検量線は、アカフジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し上述のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりアカフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成される。

試料の処理方法に関しては、上記と同様、試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、試料中のアカフジツボ幼生をエタノールに浸漬して固定し、乾燥させることが好ましい。

試料のＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）によるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出方法を用いることが好適である。この場合には、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、アカフジツボ幼生の定量をより正確に実施することができる。

また、特にキプリス幼生においては、クチクラの殻（甲皮）の堅さがサンプルにより異なる場合があり、これが原因で試料のＤＮＡ抽出効率が低下する場合がある。そこで、試料からＤＮＡを抽出する前に、クチクラの殻の破砕処理を行うことが好適である。例えば、エタノールを除いて乾燥させた試料の入ったエッペンドルフチューブにジルコニアボール（直径２〜３ｍｍ）を数個（例えば、３〜５個）入れて、強く震盪することで組織を破砕した後、上記のＤＮＡ抽出処理に供することが好適である。

ここで、フジツボ幼生は、Ｉ期ノープリウス幼生として孵化後すぐにＩＩ期ノープリウスとなり、その後は、海水中の植物プランクトンを餌として取り込んで成長する。そしてＶＩ期ノープリウス幼生を経て摂餌をしない付着期のキプリス幼生となる。成長に伴い、個体サイズ、細胞数が増加するため、標的となる１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することになる。したがって、幼生の個体数が同じであっても、リアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値が幼生の発生段階で異なってくる。

本願発明者の実験によると、アカフジツボのキプリス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数は初期（Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数の５倍であることが確認されている。この値はアカフジツボ幼生のキプリス幼生と初期ノープリウス幼生の体積差を反映している。

したがって、検量線を作成する際に使用する試料としては、幼生の各個体の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数がほぼ一定である試料を用いることが好ましい。この場合には、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数が試料中の幼生個体数を正確に反映するので、幼生個体数に対する正確なＣｔ値を得ることができる。例えば、キプリス幼生のみが含まれている試料を用いれば、キプリス幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができるし、初期ノープリウス幼生のみが含まれている試料を用いれば、初期ノープリウス幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができる。

検量線の例を図７に示す。このように、初期ノープリウス幼生の個体数に対応する検量線と、キプリス幼生の個体数に対応する検量線とを作成することで、被験試料をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれているアカフジツボの幼生個体数を初期ノープリウス幼生個体数の総量として、あるいはキプリス幼生個体数とキプリス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数とほぼ同数の遺伝子コピー数を有するＶＩ期ノープリウス幼生個体数との総量として換算することができる。換言すれば、被験試料に含まれているアカフジツボ幼生の総個体数の最大値が初期ノープリウス幼生個体数の総量として換算した場合の値（β）であり、アカフジツボ幼生の総個体数の最小値がキプリス幼生個体数及びＶＩ期ノープリウス幼生個体数の総量として換算した場合の値（α）である。つまり、この検量線を用いることで、被験試料のＣｔ値から、被験試料に含まれているアカフジツボ幼生の総個体数Ｘがα≦Ｘ≦βであると推定することができる。

尚、被験試料の種類や処理方法に関しては、上記と同様である。但し、ＤＮＡ抽出処理方法に関しては、検量線作成時と同様の方法を採用することが定量値のばらつきを抑える上で好ましい。また、被験試料に対して行うリアルタイムＰＣＲは検量線作成時のリアルタイムＰＣＲ条件と同様とする。

ここで、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することにより、精度の高い定量分析を実施することが可能となる。即ち、アカフジツボ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、被験試料を篩にかけて、篩を通過した体積の小さいアカフジツボ幼生を含む分画成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、分画成分に含まれているアカフジツボの幼生個体数を初期ノープリウス幼生個体数の総量として換算することで、被験試料に含まれているアカフジツボの初期ノープリウス幼生の真の個体数により近い値を得ることができる。また、篩を通過しなかった体積の大きいアカフジツボ幼生を含む分画成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、分画成分に含まれているアカフジツボの幼生個体数をキプリス幼生個体数とＶＩ期ノープリウス幼生個体数の総量として換算することで、被験試料に含まれているアカフジツボのキプリス幼生とＶＩ期ノープリウス幼生の真の個体数により近い値を得ることができる。したがって、どの成長段階にあるアカフジツボ幼生が被験試料中にどの程度存在するのかをより具体的に明らかにすることが可能となる。尚、分画方法は篩によるものには限定されず、例えば遠心分離処理を用いてもよい。また、分画処理により、例えば初期(Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生のみを被験試料から分離した成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれている初期(Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生の個体数を高精度に定量することも可能であるし、ＶＩ期ノープリウス幼生及びキプリス幼生を被験試料から分離した成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれているＶＩ期ノープリウス幼生及びキプリス幼生の個体数を高精度に定量することも可能である。

本発明のアカフジツボ幼生の定量方法により、実海域でのアカフジツボの付着時期を予測することが可能になる。即ち、Ｃｔ値から換算される幼生個体数の発生段階による相違は最大でも５倍である。これは、実海域での幼生出現ピーク時の個体数増加に比べれば小さい値であり、付着時期予測には大きな問題点とはならないと考えられる。これまでに実海域でアカフジツボ幼生の個体数変動と付着時期を詳細に調査した報告、例えば、志津川湾におけるフジツボ幼生および付着板の調査（電力中央研究所報告Ｖ０５０３３）や、柳井・三隅火力発電所前面海域での付着板を用いた調査（中国電力 技研時報１０１、ｐ７５−８３）によると、アカフジツボの付着盛期は１ヶ月以内に集中し、この期間内に急激に付着個体が増加すると報告されている。また、飼育実験からアカフジツボの幼生は、孵化後１〜２週間で付着期幼生になり、基盤に付着すると考えられる。したがって、付着期前の比較的短期間に幼生の出現ピークがあり、その際の幼生数の増加率は５倍という値に比較して圧倒的に大きな値、例えば、３日〜１週間毎に被験試料をサンプリングした場合、サンプリング量にもよるが、数十倍〜数百倍、あるいはそれ以上の増加率となることが予想される。よって、本発明の定量方法によりアカフジツボ幼生個体数の定量分析を定期的（例えば、３日〜１週間毎）に行うことで、実海域でのアカフジツボの付着時期を予測することが可能になる。

次に、本発明のアカフジツボ検出用キットについて説明する。本発明のアカフジツボ検出用キットは、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーをプローブとして含むものである。

このキットの一例として、図８に示すＤＮＡチップが挙げられる。このＤＮＡチップ１は、基板２と、基板２の表面に形成されたスポット３と、スポット３内に固定されたＤＮＡプローブ４により構成される。

基板２としては、ガラス基板、シリコンウエハー、ナイロン膜、セルロース膜等を適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。

スポット３には、ＤＮＡプローブ４が等量ずつ固定される。ＤＮＡプローブ４は、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一方である。

ＤＮＡチップ１を用いて、アカフジツボ幼生の検出を行う。被験試料はＤＮＡ抽出処理後、ＤＮＡを一本鎖に調製し、蛍光剤や発色剤を添加して１本鎖ＤＮＡを蛍光標識する。そして、これをＤＮＡチップ１のスポット３に滴下し、ＤＮＡプローブ４と結合（ハイブリダイズ）させる。未結合の一本鎖ＤＮＡは洗い流し、スポット３の蛍光強度を検出することにより、被験試料中のアカフジツボ幼生の検出、定量を行うことができる。

尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。

例えば、本発明者の実験によれば、本発明のプライマーセットのアカフジツボに対する特異性が確認されたことから、このプライマーセットとオオアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解析領域の塩基配列とに基づいてオオアカフジツボを特異的に認識するプライマーを設計することも可能である。例えば、配列番号５記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるオオアカフジツボ検出用プライマーセットを合成して用いることができる。その他のフジツボ種に関しても同様にプライマーセットを合成して用いることができる。

また、ＤＮＡチップ１の各スポット３に別々のＤＮＡプローブ４を固定するようにしてもよい。例えば、１のスポットにはアカフジツボを特異的に認識するＤＮＡプローブを固定し、２のスポットにはオオアカフジツボを特異的に認識するＤＮＡプローブを固定し、３のスポットにはタテジマフジツボを特異的に認識するＤＮＡプローブを固定するといったように、複数種のフジツボを認識するＤＮＡチップとしてもよい。

以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
各種フジツボ成体の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいてアカフジツボに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供したフジツボ種を表１に示す。アカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、オオアカフジツボは採集後に室内でアルテミア、珪藻（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）などを餌として与えて飼育されたものを９９．５％エタノール（和光純薬製）に浸して固定し、実験に使用するまで４℃で保存した。なお、エタノール浸漬前は、数日間餌を与えずアルテミア由来のＤＮＡの影響を排除した。その他のフジツボは採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。

大型のフジツボ成体であるアカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、サンカクフジツボ、チシマフジツボ、クロフジツボ、カメノテ、エボシガイ、オオアカフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、オニフジツボ、Cryptolepas rhachianechi、ミミエボシ、スジエボシは、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、インビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットにより総ＤＮＡの抽出を行った。具体的には、上述のエタノール浸漬保存したフジツボ成体からエタノールを除いた後、これを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、５０μＬのリシスバッファー（インビトロジェン製）を加えてプラスチックペッスルですり潰し、さらに３００μＬのリシスバッファーを加えて６５℃で１０分間処理した。次に、ＤＮＡ沈澱用バッファー（インビトロジェン製、名称Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１５０μＬを加えて強く混合撹拌処理（ｖｏｌｔｅｘ）し、さらにクロロホルム（和光純薬製）５００μＬを加えた後、１３８００ｇで１５分間遠心分離処理してＤＮＡの含まれる水層を別のチューブに移した。これに氷冷した９９．５％エタノール１ｍＬを加え撹拌混合して０℃に３０分間静置してＤＮＡを沈澱させ、遠心分離処理後エタノールを除き、さらに氷冷８０％エタノール（和光純薬製）５００μＬを加えて沈澱させた。最終的に得られた沈澱（ＤＮＡ）を風乾後、５０μＬのＴＥバッファー（インビトロジェン製）に溶解した。抽出用組織が小さい場合は適宜溶解バッファー量を減らした。また小型のフジツボであるイワフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ムツアナフジツボ、ハナフジツボ、Semibalanus balanoides、Elminius modestus、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、また、上記大型のフジツボ成体に属するタテジマフジツボの中でも小型の個体に関しては、１個体の軟体部全体をそのまま同様の方法で抽出に供した。

ＴＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ Ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、ほとんどのサンプルで５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認されたが、イワフジツボなど非常に小型のフジツボにおいては１個体から得られるＤＮＡ量が少なかった。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度としたＴＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。

次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、フジツボミトコンドリアの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対するプライマーとして文献１〜４で報告されているものを用いた。
（文献１: R.A.Begum,T.Yamaguchi and S.Watabe(2004).Molecular phylogeny of thoracican barnacles based on the mitochondrial 12S and 16S rRNA genes.Sessile organisms,21,47-54.
文献２: T.D.Kocher, W.K.Thomas, A.Meyer, S.V.Edwards, S.Paabo, F.X.Villablansca and A.C.Wilson(1989). Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6196-6200.
文献３: O.Mokady, S.Rozenblatt, D.Graur and Y.Loya(1994). Coral-host specificity of red sea Lithophaga bivalves: interspecific and intraspecific variation in 12S mitochondrial ribosomal RNA.Mol.Mar.Biol.Biotech.,3,158-164.
文献４: S.R.Palumbi(1996). Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. In: Molecular Systematics,ed. D.M.Hillis, C.Mortiz and B.K.Mable, Sinauer Associates, Sunderland, pp.205-248.）

表２と配列番号３及び４にプライマーの配列を示す。なお、これらのプライマーは、合成（シグマジェノシス）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μＬのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μＬとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑポリメラーゼとしてジーンタック（ニッポンジーン）またはアドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μＬに調製した溶液を２μＬ（４０ｎｇ）、各プライマー溶液１μＬ（１０ｐｍｏｌ）を２０μＬの反応液に加えた。反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのＴａｑポリメラーゼに添付された方法に従った。具体的には、ジーンタックに関しては、滅菌水１３．２０μＬ、１０ｘＰＣＲバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１．６０μＬ、ジーンタックポリメラーゼ０．２０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。クローンテックアドバンテージ２に関しては、滅菌水１４．２０μＬ、１０ｘＰＣＲ ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μＬ、５０×ポリメラーゼ ｍｉｘ０．４０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。

まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応７２℃（ジーンタック）または６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３５サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。

その結果、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲにおいては、ニッポンジーンのジーンタックを用いた場合、アニーリング温度は５３℃が最適であり、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適ではあったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片はいずれのフジツボにおいても約３５０ｂｐの長さであった。

アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、DNase、RNaseフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号１に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。

各種フジツボ総ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載された塩基配列からなるプライマーを用いて得られた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果のうち、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、サンカクフジツボ、チシマフジツボ、クロフジツボ、カメノテ、イワフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ムツアナフジツボ、エボシガイの結果を図１に示す。また、残りのフジツボ種のシーケンシング結果を図９に示す。さらに、これらの塩基配列を配列番号７〜３３に示す。なお、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である２９７ｂｐ〜３０５ｂｐの範囲とした。図１及び図９に示した各塩基配列はそれぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。図１において、「：」はアカフジツボと同じ塩基であることを表し、「−」は塩基配列が欠損している部分を表している。図１に示すように、便宜上、比較するＤＮＡ断片の塩基に１から３１１まで番号をつけた。このなかで、種間で変異の大きい領域とほとんど変異のみられない領域があったが、特に５５番付近、７０番付近、１３０番付近、１７２番付近、２２２番付近などは変異の大きな領域であった。なお、同一の鋳型ＤＮＡから１２Ｓ ｒＲＮＡ用プライマーを用いてジーンタック、アドバンテージ２の２種類のＴａｑポリメラーゼにより増幅した場合、得られた塩基配列データは全く同じであった。

次に、図１に示す各種フジツボの塩基配列に基づいて、フジツボ１５種の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のＤＮＡ塩基配列を比較検討し、汚損性のアカフジツボに特異的な領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できると考えられている８０〜１２０ｂｐのＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位として、５６番目から８１番目の塩基配列と１２２番目から１４５番目の塩基配列とを選定することができた。そこで、これらの塩基配列を基に、配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー（以下、ＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｆと呼ぶ）と、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマー（以下、ＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒと呼ぶ）を合成（シグマジェノシス）した。

合成したプライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−ＦとＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒについて、上記方法により得られたアカフジツボ成体並びにタテジマフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、このプライマーセットの有効性とＰＣＲの最適条件について検討した。ＰＣＲは基本的には上述の方法に従い、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行なった。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３％アガロース）後にＳＹＢＲ Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により検出した。また、ＰＣＲにおけるサイクル数を３５サイクルから２５サイクルに変化させることで、定量的検出が可能かどうかを調べた。なお、タテジマフジツボは日本の沿岸に広く生息するフジツボであるとともに、実験室内での飼育法が確立していることから、アカフジツボの対照種として実験に用いた

アニーリング温度の検討を行った結果、５９℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行なうこととした。ＰＣＲの結果、アカフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、１００ｂｐ以下の低分子領域にシングルバンドが確認できた。これは、プライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−ＦとＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒにより増幅した８４ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。また、３５サイクルのＰＣＲでは鋳型ＤＮＡの量によるバンドの差は見られなかったが、図２に示すように、２５サイクルの反応を行なうことでバンドの濃淡が１〜１０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で確認された。一方、タテジマフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型にした場合は上記の濃度範囲でバンドは確認されなかった。また、アカフジツボＤＮＡとタテジマフジツボＤＮＡを混合した鋳型ＤＮＡを用いた場合にも、アカフジツボＤＮＡの量に依存したＰＣＲ産物量（バンドの濃淡）が観察された。以上の結果から、プライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−ＦおよびＲＴＭｒ１２Ｓ−ＲはアカフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。

（実施例２）
フジツボ幼生から総ＤＮＡを抽出するための条件について、アカフジツボのノープリウス幼生を用いて検討を行った。

アカフジツボノープリウス幼生のエタノールへの固定を行った。即ち、実験室内でアカフジツボ成体から孵出したノープリウス幼生をその日のうちに回収して海水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを十分量加えて、アカフジツボノープリウス幼生固定溶液を調製した。この溶液は４℃で保存した。

次に、以下（１）〜（３）に示すＤＮＡ抽出処理について検討した。（１）のＤＮＡ抽出処理は、アカフジツボノープリウス幼生を０、２５、５０、１００個体を含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ３個ずつ用意して行った。（２）のＤＮＡ抽出処理は、アカフジツボノープリウス幼生を０、１、１０、１００個体を含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ４個ずつ用意して行った。（３）のＤＮＡ抽出処理は、アカフジツボノープリウス幼生を０、１、１０、１００個体含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ５個ずつ用意して行った。

（１）インビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットを用い、このキットに添付されたマニュアルに従ってＤＮＡ抽出を行った。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に５０μＬのリシスバッファーを加えてプラスチックペッスルですり潰し、さらに３００μＬのリシスバッファーを加えて６５℃で１０分間処理した。次にＤＮＡ沈澱用バッファー１５０μＬを加えて強く撹拌混合処理し、さらにクロロホルム５００μＬを加えた後、１３８００ｇで１５分間遠心分離処理してＤＮＡの含まれる水層を別のチューブに移した。これに氷冷した９９．５％エタノールを１ｍＬを加え撹拌混合処理し、０℃で３０分間静置してＤＮＡを沈澱させ、遠心分離処理した後エタノールを除き、さらに氷冷８０％エタノール５００μＬを加えて沈澱させた。最終的に得られたＤＮＡ沈澱は、風乾させた後に５０μＬのＴＥバッファーに溶解した。

（２）乾燥させたサンプルの入った１．５ｍＬエッペンドルフチューブに２４０μＬのＴＥバッファー、１５μＬのリシスバッファー、７．５μＬのＤＮＡ沈澱用バッファー、３．７５μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ， ５ｍｇ／ｍｌ）を加えて６０℃で一定時間（１、２または２４時間）インキュベートし、その後２２５μＬのリシスバッファー、９０μＬのＤＮＡ沈澱用バッファーを加えて強く撹拌混合処理をし、さらに５６２．５μＬのクロロホルムを加えて強く撹拌混合処理をし、１３８００ｇで１５分間遠心分離処理してＤＮＡの含まれる水層を別のチューブに移した。これに氷冷した９９．５％エタノールを７５０μＬ加え撹拌混合処理し、０℃で３０分間静置してＤＮＡを沈澱させ、遠心分離処理した後エタノールを除き、さらに氷冷８０％エタノール５００μＬを加えて沈澱させた。最終的に得られたＤＮＡ沈澱は、風乾させた後に５０μＬのＴＥバッファーに溶解した。

（３）キアゲン社のＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＡＴＬ ｂｕｆｆｅｒ）と２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１、２または２４時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理）。さらに２００μＬのバッファー（ＡＬ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２００μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、２ｍＬのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＴｕｂｅにセットしたＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに処理サンプルを供した。このチューブを１分間遠心分離処理して素通り画分を除いた後、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎのシリカゲル膜フィルターに吸着したＤＮＡをＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１およびＡＷ２で洗浄し、最終的には１００μＬの溶出バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。

ＤＮＡ抽出処理後の試料をリアルタイムＰＣＲによる定量的解析に供して、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定することにより、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを評価した。リアルタイムＰＣＲによる定量的解析は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたインターカレーター法により行った。反応液は、純水９．５μＬ、プライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｆ（１０μＭ）、ＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒ（１０μＭ）それぞれ０．５μＬ（最終濃度０．２μＭ）、鋳型ＤＮＡを２μＬ、そしてＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ｘ２）を１２．５μＬを混合して調製した。装置はＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ（Ｃｅｐｈｉｅｄ社）を使用して、９５℃で初期変性した後、９５℃を５秒、６０℃を２０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返し、最後に融解曲線確認のための反応（６０℃−９５℃）を実施した。そして反応後、各試料のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。

その結果、上記（３）のＤＮＡ抽出処理を行った場合に試料間のＣｔ値ばらつきが最も少ないことが明らかとなった。また、上記（１）のＤＮＡ抽出処理を行った場合よりも上記（２）のＤＮＡ抽出処理を行った場合の方が試料間のＣｔ値ばらつきを抑えることができた。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加した後のインキュベート時間を１、２および２４時間とした場合でもＣｔ値はほとんど同じであった。

したがって、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理を採用することが好適であることがわかった。また、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加した後のインキュベート時間を１時間として処理時間の低減を図れることがわかった。

また、アカフジツボ幼生をエッペンドルフチューブに収容し、乾燥後、ジルコニアボール（直径２ｍｍまたは３ｍｍ）を数個（３〜５個）加えて、強く震盪することで幼生を破砕し、その後、上記（３）のＤＮＡ抽出をしたところ、試料間のＣｔ値ばらつきをさらに抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。この破砕処理を行うことで、クチクラの殻が硬いためにＤＮＡ抽出ばらつきが出やすいキプリス幼生についても、ＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、定量の再現性及び精度を向上することができることが明らかとなった。

また、融解曲線を確認した結果、温度ピークがすべて単一であった。したがって、目的の増幅産物（８４ｂｐのＤＮＡ断片）のみが得られ、その定量が行われたことが明らかとなった。

尚、上記（１）及び（２）のＤＮＡ抽出処理を行った場合には、上記（３）のＤＮＡ抽出処理を行った場合と比較して試料間のＣｔ値ばらつきが若干大きくなったものの、これらのＤＮＡ抽出方法を否定するものではなく、試料のすり潰し操作や、ＤＮＡ沈殿の回収操作の試料間ばらつきを抑えることで、また、上記の破砕処理をＤＮＡ抽出処理前に実施することで、上記（３）のＤＮＡ抽出処理を行った場合と同程度のＣｔ値ばらつきを達成することができると考えられる。

（実施例３）
アカフジツボ幼生に対する特異性と定量性について、プライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｆ及びＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒを用いたリアルタイムＰＣＲにより評価した。

実験室内でタテジマフジツボ、アカフジツボ及びオオアカフジツボ成体から孵出したノープリウス幼生を数時間以内に回収（ほとんどがＩＩ期ノープリウス）し、海水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを十分量加えて、それぞれのノープリウス幼生をエタノールに固定してノープリウス幼生固定溶液を調製し、これを４℃で保存した。ノープリウス幼生固定溶液は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブにアカフジツボではそれぞれ１、２、５、１０、２０、５０および１００個体の幼生を、タテジマフジツボとオオアカフジツボではそれぞれ１００個体の幼生を収容した。ＤＮＡ抽出処理は実施例２（３）と同様の処理とした。最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例２に示したリアルタイムＰＣＲに供した。

アカフジツボのノープリウス幼生のリアルタイムＰＣＲの結果を図３に示す。図３中のＣｔ値は異なる３バッチのアカフジツボのノープリウス幼生から得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。１、２、５、１０、２０、５０および１００個体の幼生から抽出されたＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４、１および２個体相当の幼生が含まれることになる。このように、非常に少ない幼生個体数であっても、幼生個体数の対数とＣｔ値との間に高い相関性が認められることが確認された。すなわちアカフジツボのノープリウス幼生ではＤＮＡ抽出液１００ｍＬ中に１個体以上存在する場合、プライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｆ及びＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒを用いたリアルタイムＰＣＲにより、高い定量性をもって検出できることがわかった。アカフジツボのノープリウス幼生の個体数が未知のサンプルにおいても、リアルタイムＰＣＲを実施し、そのＣｔ値を測定することで、正確な幼生個体数の推定ができると考えられた。

次に、タテジマフジツボとアカフジツボの近縁種であるオオアカフジツボのノープリウス幼生を用いて同様の実験を行った結果を図４に示す。図４において●はアカフジツボ、■はタテジマフジツボ、▲はオオアカフジツボの結果を表している。図４に示すように、鋳型ＤＮＡを含まない対照区（アカフジツボ幼生０個体）と同様にＣｔ値は３４以上でであることが確認された。したがって、今回設計したプライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｆ及びＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒはアカフジツボに特異的なものであり、タテジマフジツボのＤＮＡを鋳型とした場合は勿論のこと、近縁種のオオアカフジツボのＤＮＡを鋳型にした場合でも、遺伝子増幅は起きないことが明らかとなった。

そこで、アカフジツボと、アカフジツボの近縁種であるオオアカフジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列について比較検討を行った。結果を図５に示す。図５において、ＡＣＴＡＧＴはＳｐｅＩ認識配列を示し、下線部はプライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｆ及びＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒと相補的な領域を、囲い文字および二重下線部はアカフジツボとオオアカフジツボとで異なる塩基配列部分を示している。オオアカフジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列データにおいて、プライマー認識部分でのアカフジツボとの塩基配列の相違はＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｆで２塩基、ＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒでは１塩基であった。つまり、この１〜２塩基の違いによってアカフジツボの近縁種であるオオアカフジツボの遺伝子を増幅させることなく、アカフジツボの遺伝子のみの増幅が可能であることが明らかとなった。このことから、ＲＴＭｒ１２Ｓ−ＦとＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒに基づき、配列番号５記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるプライマーセットを合成することで、オオアカフジツボの遺伝子のみの増幅が可能であると考えられる。また、図１に示す１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列データから、アカフジツボ以外の種ではプライマー認識領域における変異が多いため、ＰＣＲによる増幅は起きないと推測され、さらに、図９に示す１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列データからもアカフジツボ以外の種ではプライマー認識領域における変異が多いため、ＰＣＲによる増幅は起きないと推測された。尚、図９における下線部は、アカフジツボのプライマー認識領域に対応する塩基配列部分である。本発明のプライマーセットを用いれば複数種のフジツボ幼生が混在した被験試料中からアカフジツボの幼生のみを特異的に検出・定量することができると考えられた。

そこで、複数のプランクトンが混在している被験試料を用いて、アカフジツボの幼生のみを特異的に検出・定量できるか確認した。

プランクトンは以下のようにして得た。即ち、２００６年９月５日および１０月１１日に東京湾内でプランクトンネット（ノルパック、口径５０ｃｍ）を用いて約８ｍの鉛直曳きによりプランクトンサンプルの採集を行った。これにより約１６００Ｌ分の海水中のプランクトンが採集されたことになる。採集したプランクトンは実験室に持ち帰った後、１００μｍ（１３ＸＸ）と１ｍｍ（２０ＧＧ）の目開きのメッシュを用いてフジツボ幼生が含まれる画分を得た。つまり、フジツボ幼生は、１ｍｍのメッシュを素通りし、１００μｍのメッシュでトラップされるので、１ｍｍ以上の大型プランクトンはあらかじめ除去して解析に供した。得られたプランクトンサンプルは海水を除いた後、９９．５％エタノールを加えて固定し、４℃で保存した。

尚、９月〜１０月にかけては、東京湾内でアカフジツボ幼生が採集されることは無いため、採集したプランクトンサンプルにアカフジツボ幼生が含まれることは無い。

次に、得られたプランクトンサンプルを固定したエタノールを２０等分してチューブに収容した。つまり、１チューブあたり８０Ｌ分の海水から採集された混合プランクトンを含むことになる。そして、それぞれのチューブにアカフジツボノープリウス幼生を１、２、５、１０、２０、５０または１００個体加えたものをＤＮＡ抽出用サンプルとした。尚、１本のチューブに含まれる混合プランクトンを沈澱させた時の体積は約２００μＬであり、これはアカフジツボノープリウス幼生約１２５００個体分に相当する。すなわち、解析したサンプルにはアカフジツボノープリウス幼生の１２５〜１２５００倍の体積のプランクトンが含まれていることになる。アカフジツボノープリウス幼生のみのサンプルと同様に、それぞれの混合プランクトンを含むサンプルをＤＮＡ抽出処理し、リアルタイムＰＣＲを行った。ＤＮＡ抽出処理は実施例２（３）と同様の処理とし、最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例２に示したリアルタイムＰＣＲに供した。

結果を図６に示す。●はアカフジツボノープリウス幼生だけを含むサンプルの結果（図３と同じ）であり、□はアカフジツボノープリウス幼生と野外採集混合プランクトンを含むサンプルの結果である。また、図６におけるＣｔ値は異なる３バッチのサンプルから得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。野外採集プランクトンサンプル（アカフジツボ幼生は含有しない）を体積比で標的アカフジツボ幼生の１０^２〜１０^４倍量以上含んでいても、アカフジツボ幼生の定量性には影響を与えないことが判明した。さらに、別の時期にも海域で採集したプランクトンサンプルを用いて実験を行ったが、アカフジツボ幼生の定量には影響を及ぼさないことが確認された。

尚、野外採集プランクトンサンプルのみをＤＮＡ抽出処理し、リアルタイムＰＣＲに供した結果、Ｃｔ値が３６．９、３４．０３、３６．４７、３６．６となり、図３に示したアカフジツボ幼生が０個体の試料の場合と同じ結果が得られた。つまり、野外採集プランクトンサンプルは、アカフジツボ幼生の定量には何ら影響を及ぼすことがないことがこの点からも明らかである。

（実施例４）
フジツボ幼生は、Ｉ期ノープリウス幼生として孵化後すぐにＩＩ期ノープリウスとなり、その後は、海水中の植物プランクトンを餌として取り込んで成長する。そしてＶＩ期ノープリウス幼生を経て摂餌をしない付着期のキプリス幼生となる。成長に伴い、サイズ、細胞数が増加するため、標的となる１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することになる。したがって、幼生個体数が同じであってもリアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値も幼生の発生段階で異なってくる。そこで、幼生の最終段階であるアカフジツボキプリス幼生を用いて、アカフジツボノープリウス幼生と同様の実験を行なった。

実験室内でアカフジツボ成体から孵出したノープリウス幼生の一部を、珪藻Chaetoceros gracilisを餌として与え、キプリス幼生まで飼育し、ノープリウス幼生と同様に海水をできるだけ除いた後、99.5％エタノールを十分量加えて固定し、4℃で保存した。エタノールで固定した後、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに１、２、５、１０、２０および５０個体のキプリス幼生を収容し、ノープリウス幼生と同様に、ＤＮＡ抽出処理し、リアルタイムＰＣＲを行った。ＤＮＡ抽出処理は実施例２（３）と同様の処理とし、最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例２に示したリアルタイムＰＣＲに供した。

結果を図７に示す。図７において、●は初期ノープリウス幼生の結果（図３と同じ）であり、△はキプリス幼生の結果である。また、図７におけるＣｔ値は異なる３バッチの幼生から得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。この結果から、キプリス幼生１個体に対応するＣｔ値は、初期ノープリウス幼生約５個体分に対応することが判明した。例えば図７においてＣｔ値が２０の場合の個体数をみてみると、キプリス幼生では約４個体、初期ノープリウス幼生では約２０個体に相当することが読み取れる。すなわち、キプリス幼生と初期ノープリウス幼生の標的鋳型ＤＮＡの量比は、およそ５：１であると考えられる。これらの幼生のサイズを体積換算すると、ＩＩ期ノープリウス幼生からキプリス幼生で約５〜１０倍になることが推定される（R. Kado and R. Hirano (1994). Larval development of two Japanese megabalanine barnacles, Megabalanus volcano (Pilsbry) and Megabalanus rosa (Pilsbry) (Cirripedia, Balanidae), reared in the lanoratory. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 175, 17-41.に記載された実測値から推定。）。このことから、この5：1という値はおおよそフジツボ幼生の体積を反映していると考えられる。また、それぞれの幼生のグラフでの直線の傾きはほぼ同じであることから、幼生の個体数によらず正確な定量が可能であると考えられる。

以上の結果から、実際に野外採集プランクトンサンプルに含まれるアカフジツボ幼生の個体数を、キプリス幼生に換算した値として、または初期ノープリウス幼生に換算した値として算出できることが明らかとなった。また、本実施例により、Ｃｔ値から換算される幼生個体数の発生段階による相違が最大でも５倍程度であることが明らかとなった。付着期前の比較的短期間（１ヶ月以内）に幼生の出現ピークがあることと、その際の幼生数の増加率は、５倍という値に比較して圧倒的に大きな値になることとを勘案すると、今回開発されたリアルタイムＰＣＲによるアカフジツボ幼生の定量的検出は、実海域での付着時期予測に十分適用可能と考えられる。

各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列を示す図である。 アカフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。 アカフジツボノープリウス幼生のリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。 アカフジツボ、タテジマフジツボ及びオオアカフジツボのノープリウス幼生のリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。 リアルタイムＰＣＲで増幅される遺伝子領域の塩基配列についてアカフジツボとオオアカフジツボとを比較した図である。 アカフジツボ幼生だけを含むサンプルのリアルタイムＰＣＲの結果と、アカフジツボ幼生と野外採集混合プランクトンを含むサンプルのリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。 発生段階の異なるアカフジツボ幼生のリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。 本発明の検出キットの一例であるＤＮＡチップの構成例を示す概略図である。 図１にしたフジツボ種以外のフジツボ種の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列を示す図であり、オオアカフジツボ、キタイワフジツボ、ミミエボシ、オニフジツボの塩基配列を示す図である。 図１にしたフジツボ種以外のフジツボ種の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列を示す図であり、図９Ｂはコウダカキクフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、ハナフジツボの塩基配列を示す図である。 図１にしたフジツボ種以外のフジツボ種の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列を示す図であり、Cryptolepas rhachianechi、Elminius modestus、Semibalanus balanoides、スジエボシの塩基配列を示す図である。

符号の説明

１ ＤＮＡチップ
４ ＤＮＡプローブ

Claims (5)

1. 配列番号１記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーとからなるアカフジツボ検出用プライマーセット。
2. 被験試料に対し請求項１記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、前記被験試料の遺伝子増幅が生じたか否かにより前記被験試料にアカフジツボ幼生が存在していたか否かを判定することを特徴とするアカフジツボ幼生の検出方法。
3. アカフジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し請求項１記載のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりアカフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用い、被験試料に対し前記プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られる前記被験試料のＣｔ値から前記被験試料中のアカフジツボ幼生個体数の定量を行うことを特徴とするアカフジツボ幼生の定量方法。
4. 前記被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供する請求項３記載のアカフジツボ幼生個体数の定量方法。
5. 配列番号１記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーをプローブとして含むアカフジツボ検出用キット。