JP6000033B2 - Liposomes imparting heat resistance to encapsulated substance and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、易熱変性物質が内包され耐熱性を与えたリポソーム及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a liposome encapsulating an easily heat-denaturing substance and imparting heat resistance, and a production method thereof.
従来より、化粧品分野では、美白、保湿、抗酸化効果を有する有効成分を肌へ届ける手段として有効成分をリポソームに内包させることがよく行われている。リポソームとは、主にリン脂質から成る脂質二重層あるいは多重層であり、細胞膜に類似した構造を有している。有効成分のカプセル化は、水溶性薬物の場合はリポソームの内水相に取り込まれるか、脂溶性薬物の場合は脂質層に組み込まれることが多い。 2. Description of the Related Art Conventionally, in the cosmetics field, it has been common to encapsulate active ingredients in liposomes as a means for delivering active ingredients having whitening, moisturizing and antioxidant effects to the skin. Liposomes are lipid bilayers or multilayers mainly composed of phospholipids, and have a structure similar to a cell membrane. Encapsulation of the active ingredient is often incorporated into the internal aqueous phase of liposomes for water-soluble drugs or incorporated into the lipid layer for fat-soluble drugs.
このリポソームの製法としては、種々の方法が知られている。例えば、(1)脂質を有機溶媒に溶解し、溶媒を減圧除去して薄膜を形成した後、緩衝液等の水溶液を加えて振とう膨潤させ、さらに機械的撹拌手段により薄膜をはがすことで調製する方法、(2)脂質をエーテル又はエタノール等の有機溶媒に溶解し、緩衝液等の水溶液中に注入した後、溶媒を除去することにより調製する方法、さらに、機械的な方法として、(3)超音波処理による方法(特許文献1)、(4)高圧ホモジナイザーや高速回転分散機による方法(特許文献2)、(5)ポリカーボネイト製メンブランフィルターを用いた高圧ろ過による方法、(6)水相の上部に脂質を溶解させた油相を用意し、油相に液滴を導入し、遠心分離による力で液滴を水相に引きずり込む方法等が知られている。そのほかに、(7)脂質をエタノール等の水と相溶する有機溶媒に溶解した後、透析膜を介して水と置換する方法(特許文献3)等が挙げられる。 Various methods are known for producing the liposome. For example, (1) prepared by dissolving lipid in an organic solvent, removing the solvent under reduced pressure to form a thin film, adding an aqueous solution such as a buffer solution to swell with shaking, and further peeling the thin film with a mechanical stirring means (2) A method in which a lipid is dissolved in an organic solvent such as ether or ethanol, poured into an aqueous solution such as a buffer solution, and then prepared by removing the solvent. Further, as a mechanical method, (3 ) Method by ultrasonic treatment (Patent Document 1), (4) Method by high-pressure homogenizer or high-speed rotary disperser (Patent Document 2), (5) Method by high-pressure filtration using a membrane filter made of polycarbonate, (6) Aqueous phase There is known a method in which an oil phase in which lipid is dissolved is prepared on the top of the lip, a droplet is introduced into the oil phase, and the droplet is dragged into the aqueous phase by centrifugal force. In addition, (7) a method in which lipid is dissolved in an organic solvent compatible with water such as ethanol and then replaced with water through a dialysis membrane (Patent Document 3).
しかし、上記の(1)(2)の方法は有機溶媒の残留、(3)の方法は超音波照射により溶液温度が上昇し、薬物、脂質の分解や変性が見られること、超音波照射にムラが見られること等の欠点を有していた。(4)(5)の方法も、脂質の相転移温度以上の温度で処理するため薬物、脂質の分解や酸化等の恐れがある等の欠点がある。(6)については、遠心機による力学的ストレスにより、リポソームが破壊されてしまうことがある。さらに、これらの方法は、操作が煩雑で工業的でなかったり、特別な装置を必用とする等の問題がある。(7)は簡便な方法であるが、やはり、有機溶媒が残留したり、有機溶媒を除去するために、高温を必要とする等の欠点があった。 However, in the methods (1) and (2), the organic solvent remains, and in the method (3), the solution temperature rises due to ultrasonic irradiation, and degradation and denaturation of drugs and lipids are observed. It had drawbacks such as unevenness. The methods (4) and (5) also have drawbacks such as the risk of decomposition and oxidation of drugs and lipids because the treatment is performed at a temperature higher than the phase transition temperature of the lipid. Regarding (6), the liposome may be destroyed by mechanical stress due to the centrifuge. Furthermore, these methods have problems such as complicated operations and are not industrial, or require special devices. Although (7) is a simple method, there are still disadvantages such as the fact that the organic solvent remains or a high temperature is required to remove the organic solvent.
一方、自然界にある元の構造を保持した成分は熱に弱いものが多く、保管の際は冷蔵・冷凍保管を要したり、あるいは耐熱性や安定性を向上させるために誘導体化が必要であった。例えば、化粧品原料として最も配合されている保湿成分であるコラーゲンは、生物由来の原料であり元々生物に存在しているときは3重らせん構造をとっているが、3重らせん構造を保持した状態のまま原料化することは技術的に難しく、酸処理や熱処理等することによって化粧品原料化されていた。 On the other hand, many components that retain the original structure in nature are vulnerable to heat, and refrigeration or freezing storage is required during storage, or derivatization is necessary to improve heat resistance and stability. It was. For example, collagen, which is the most moisturizing ingredient blended as a cosmetic raw material, is a biologically derived raw material that originally has a triple helical structure when present in living organisms, but retains the triple helical structure. It is technically difficult to make the raw material as it is, and it has been made into a cosmetic raw material by acid treatment or heat treatment.
また、ビタミンCは、美白作用、コラーゲン合成促進作用、過酸化脂質抑制作用等の化粧品原料としての多くの機能をもっているが、酸化安定性が悪く着色しやすいためにそのまま皮膚外用剤に配合することは難しく、過去さまざまな誘導体が開発されている(特許文献4)。 Vitamin C has many functions as a cosmetic raw material such as whitening action, collagen synthesis promoting action, lipid peroxide inhibiting action, etc., but it is poorly oxidatively stable and easily colored, so it should be blended directly into a skin preparation. In the past, various derivatives have been developed (Patent Document 4).
近年、例えば、コラーゲンにおいては3重らせん構造を保持した状態のまま原料化する技術が開発され、3重らせん構造を保持している成分の方が3重らせん構造を保持していない成分より効果が優れていることが発見されており、化粧品市場ではそのような有効成分の元の構造を保持した成分をそのまま適用することの要求が強まってきている。 In recent years, for example, collagen has been developed as a raw material with a triple helix structure maintained, and a component having a triple helix structure is more effective than a component having no triple helix structure. In the cosmetics market, there is an increasing demand for applying ingredients that retain the original structure of such active ingredients as they are.
本発明は、有機溶剤等の有害成分の混入を抑えて、特に低温で変性しやすい易熱変性物質からなる有効成分を、元の構造を保持したまま含有したリポソーム及びその製造方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a liposome containing an active ingredient composed of an easily heat-denaturing substance that is easily denatured particularly at low temperatures while suppressing the mixing of harmful components such as organic solvents, and a method for producing the liposome. With the goal.
本発明者らは、水相上に油相を配置した水/油界面に、第1脂質膜を形成し、続いて、易熱変性物質を含有する水溶液が第2脂質膜に内包された液滴を形成した後、これを油相に導入して液滴を水相に移行し、内層脂質膜となる第2脂質膜の外側を第1脂質膜で覆い外層脂質膜を形成することにより、熱に弱い有効成分を元の構造を保持したままリポソーム化することができることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下のようなものを提供する。 The present inventors have formed a first lipid film at a water / oil interface in which an oil phase is disposed on an aqueous phase, and subsequently a liquid in which an aqueous solution containing a heat-modifying substance is encapsulated in the second lipid film. After forming the droplet, this is introduced into the oil phase, the droplet is transferred to the aqueous phase, the outer side of the second lipid membrane that becomes the inner lipid membrane is covered with the first lipid membrane, and the outer lipid membrane is formed, The present inventors have found that an active ingredient weak against heat can be made into a liposome while maintaining the original structure, and have completed the present invention. Specifically, the present invention provides the following.
(1)未変性の易熱変性物質が内包されているリポソーム。
(2)易熱変性物質の変性温度が、10〜50℃であることを特徴とする(1)に記載のリポソーム。
(3)(1)又は(2)のリポソームを含有する化粧料、医薬品又は食品。
(4)未変性の易熱変性物質を内包するリポソームの製造方法であって、水相に接するかたちで油相を配置した水/油界面に、第1脂質膜を形成する第1工程、易熱変性物質を含有する水溶液が第2脂質膜に内包された液滴を形成する第2工程、液滴を油相に導入し、これを水相に移行させるとともに、内層脂質膜となる第2脂質膜の外側を第1脂質膜で覆い外層脂質膜を形成する第3工程、を備えることを特徴とするリポソームの製造方法。
(5)液滴を、易熱変性物質の変性温度未満で作成する工程を含むことを特徴とする(4)に記載のリポソームの製造方法。
(6)第1工程及び第2工程を易熱変性物質の変性温度未満で行うことを特徴とする(4)又は(5)に記載のリポソームの製造方法。
(1) Liposomes containing an undenatured heat-denaturing substance.
(2) The liposome according to (1), wherein the heat-denaturing substance has a denaturation temperature of 10 to 50 ° C.
(3) A cosmetic, pharmaceutical product or food containing the liposome of (1) or (2).
(4) A method for producing a liposome encapsulating a non-denatured easily heat-denatured substance, the first step of forming a first lipid membrane at the water / oil interface where the oil phase is arranged in contact with the aqueous phase, A second step of forming droplets in which an aqueous solution containing a heat-denaturing substance is encapsulated in the second lipid membrane; introducing the droplets into the oil phase and transferring them to the water phase; A third step of covering the outer side of the lipid membrane with a first lipid membrane to form an outer lipid membrane, and a method for producing liposomes.
(5) The method for producing a liposome according to (4), which comprises a step of producing droplets at a temperature lower than the denaturation temperature of the heat-denaturing substance.
(6) The method for producing a liposome according to (4) or (5), wherein the first step and the second step are performed at a temperature lower than the denaturation temperature of the heat-denaturing substance.
本発明によれば、特に低温で変性しやすい易熱変性物質の有効成分を、有機溶剤等の有害成分の混入を抑えて、元の構造を保持したまま含有したリポソームを製造することができる。しかも、熱に弱い有効成分をリポソームに内包することで耐熱性を向上することができるため、有効成分を含む化粧料、医薬品、食品等の常温保管が可能になり、保管管理の手間を省くことができる。 According to the present invention, it is possible to produce a liposome containing an active ingredient of an easily heat-denaturing substance that is easily denatured particularly at a low temperature while suppressing the mixing of harmful components such as organic solvents while retaining the original structure. In addition, heat resistance can be improved by encapsulating active ingredients that are sensitive to heat in liposomes, so that cosmetics, pharmaceuticals, foods, etc. containing active ingredients can be stored at room temperature, saving the trouble of storage management. Can do.
以下、本発明の実施形態について説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
本発明のリポソームは、易熱変性物質を含有することを要する。易熱変性物質とは、例えば、比較的低温で、熱により構造の一部又は全体が変化してしまうものである。なお、この構造変化とは、易熱変性物質の適用により得られる効果が失われる変化であれば、一次構造のみならず、二次構造、三次構造、四次構造の変化をも包含する。 The liposome of the present invention needs to contain an easily heat-denaturing substance. An easily heat-denaturing substance is, for example, a substance whose structure is partially or entirely changed by heat at a relatively low temperature. The structural change includes not only the primary structure but also the secondary structure, tertiary structure, and quaternary structure as long as the effect obtained by application of the heat-denaturing substance is lost.
これら易熱変性物質の変性温度としては、広い温度範囲のものが利用でき、80℃以下のものであれば問題なく利用できる。変性温度は高ければ高いものを使用するほど安定性という面では好ましい。しかしながら、本発明によれば、比較的変性温度の低い有効成分まで、リポソーム化することが可能であり、室温付近のもの、例えば、10〜50℃、あるいは、30〜40℃のものまでも使用することができる。 As the denaturation temperature of these heat-denaturing substances, those having a wide temperature range can be used, and those having a temperature of 80 ° C. or lower can be used without any problem. The higher the denaturation temperature, the better in terms of stability. However, according to the present invention, an active ingredient having a relatively low denaturation temperature can be made into a liposome, and those having a temperature near room temperature, for example, 10 to 50 ° C. or 30 to 40 ° C. are used. can do.
本発明の易熱変性物質として望ましいのは、美白、保湿、抗酸化効果や医療効果を有する有効成分であって、具体的には、例えば、水溶性のコラーゲン、プラセンタエキス、エラスチン、絹タンパク質等のタンパク質、ビタミン類、DNAあるいはRNA等の核酸類、酵素等が使用できる。 Desirable as an easily heat-denaturing substance of the present invention is an active ingredient having whitening, moisturizing, antioxidant effect and medical effect, specifically, for example, water-soluble collagen, placenta extract, elastin, silk protein, etc. Proteins, vitamins, nucleic acids such as DNA or RNA, enzymes and the like can be used.
コラーゲンは、真皮、靱帯、腱、骨、軟骨等を構成するタンパク質のひとつで、多細胞動物の細胞外基質(細胞外マトリクス)の主成分である。従来、牛、豚等由来のものが主であったが、魚由来、くらげ由来等のコラーゲンも最近増えてきた。どの動物から採ったかで、その変性温度が変わり、例えば、牛では40℃、豚では40℃、ヨシキリザメでは29℃、ピンクサーモンでは19℃である。 Collagen is one of the proteins constituting the dermis, ligaments, tendons, bones, cartilage and the like, and is the main component of the extracellular matrix (extracellular matrix) of multicellular animals. Conventionally, it has been mainly derived from cattle, pigs, etc., but collagens derived from fish, jellyfish, etc. have also increased recently. The denaturation temperature varies depending on which animal was taken, for example, 40 ° C for cattle, 40 ° C for pigs, 29 ° C for blue sharks, and 19 ° C for pink salmon.
プラセンタエキスは、哺乳動物の胎盤抽出物で上皮成長因子(EGF)等の成長因子を含んでおり、従来より、美白効果を期待して、化粧料用として広く使われてきた。使用される哺乳動物の正常分娩胎盤は、ブタ、ウシ、ウマ、ヒト又はヒツジ等の哺乳動物から取得するが、好ましくはヒト又はブタの正常分娩胎盤がよい。ブタのプラセンタは、その分子構造が、ヒトの分子構造に最も近いから有効である。 Placenta extract is a mammalian placenta extract and contains growth factors such as epidermal growth factor (EGF), and has been widely used for cosmetics with the expectation of a whitening effect. The normal delivery placenta of the mammal used is obtained from mammals such as pigs, cows, horses, humans or sheep, preferably the normal delivery placenta of humans or pigs. Porcine placenta is effective because its molecular structure is closest to that of humans.
エラスチンは、靭帯や動脈等の伸縮性や弾力性を有する組織に存在するタンパク質である。また、皮膚の弾性に関与する成分としてコラーゲンとともに真皮結合組織に僅かではあるが存在しており、加齢や紫外線による皮膚中のエラスチンの減少や変性は、皮膚のシワやタルミの一因である。そのため、エラスチンは化粧品や健康食品分野を中心に、現在多くの製品に適用されている。一方、エラスチンは、通常、生体内においては、3次元の網目構造の不溶性のタンパク質として存在しているため、酸又はアルカリで加水分解したり、酵素で処理することによって、水溶性エラスチンが得られることは広く知られている。 Elastin is a protein present in tissues having elasticity and elasticity such as ligaments and arteries. In addition, there is a slight amount in the dermis connective tissue together with collagen as a component involved in skin elasticity, and the reduction or degeneration of elastin in the skin due to aging or ultraviolet rays contributes to skin wrinkles and tarmi . For this reason, elastin is currently applied to many products, mainly in the cosmetics and health food fields. On the other hand, since elastin usually exists in vivo as an insoluble protein having a three-dimensional network structure, water-soluble elastin can be obtained by hydrolysis with acid or alkali or treatment with an enzyme. That is widely known.
絹糸昆虫が産生する家蚕繭や野蚕繭等から、抽出手段により得られる絹タンパク質を健康増進のための飲食品に利用するほかに、化粧料成分として利用することが試みられてきている。絹タンパク質は細胞生育性、抗酸化性、抗菌性、アルコール消化性、抗血液凝固性等、多様な機能を有することが明らかにされた。絹タンパク質は、成分の分子形状により、球状タンパク質(アルブミン、カゼイン、グロブリン、ゼラチン、核・糖・色素・リンタンパク質)と硬タンパク質(フィブロイン、セリシン、ケラチン、コラーゲン、エラスチン)に分類される。しかし、それらの機能が絹タンパクのどのような部位又は構造に起因するかについてはまだすべて明らかになってはいないが、例えば、絹フィブロインの特定の部位のペプチド鎖に細胞生育促進機能があることが知られており、また、セリシンは、しっとり感(保湿性)があり、抗酸化作用(美白効果)も有する化粧料として用いられる。 Attempts have been made to use silk protein obtained by extraction means as a cosmetic ingredient in addition to the use of silk protein obtained by extraction means from rabbits and wild silkworms produced by silk insects. It has been clarified that silk proteins have various functions such as cell growth, antioxidant properties, antibacterial properties, alcohol digestibility, and anticoagulant properties. Silk proteins are classified into globular proteins (albumin, casein, globulin, gelatin, nucleus / sugar / pigment / phosphoprotein) and hard proteins (fibroin, sericin, keratin, collagen, elastin) according to the molecular shape of the components. However, it is not yet clarified at all about the site or structure of the silk protein, but for example, the peptide chain at a specific site of silk fibroin has a cell growth promoting function. In addition, sericin is used as a cosmetic having a moist feeling (moisturizing property) and also having an antioxidant action (whitening effect).
ビタミン類としては、水溶性ビタミンの、ナイアシン、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC及びビオチン等が使用できる。ビタミンCは代表的な化粧品成分の一つで皮膚表面の色素細胞のメラミン合成を阻害する作用や、しわと関係の深いコラーゲンの合成を助ける役割を持っている。 As vitamins, water-soluble vitamins such as niacin, vitamin B2, vitamin B6, vitamin C and biotin can be used. Vitamin C is one of the typical cosmetic ingredients, and has a function of inhibiting melamine synthesis of pigment cells on the skin surface and a role of assisting synthesis of collagen closely related to wrinkles.
酵素としては、化粧料に使用されるさまざまな酵素が、特に限定されることなく使用できる。例えば、活性酸素除去酵素(スーパーオキシドディスムターゼ:SOD)、ペルオキシターゼ、チオレドキシンリダクターゼ等が使用できる。 As the enzyme, various enzymes used in cosmetics can be used without particular limitation. For example, an active oxygen removing enzyme (superoxide dismutase: SOD), peroxidase, thioredoxin reductase and the like can be used.
本発明のリポソームの製造方法は、水相上に油相を配するとともに、油水界面にリポソームの外層脂質膜となる脂質単分子膜(第1脂質膜)を形成しておき、続いて、油相中にリポソームの内層脂質膜(第2脂質膜)で覆われた、易熱変性物質を含有する水性溶液液滴を導入し、該液滴を水相中に移行させ、内層脂質膜の外側に外層脂質膜を形成することを特徴とする。 In the method for producing liposomes of the present invention, an oil phase is arranged on an aqueous phase, and a lipid monomolecular film (first lipid membrane) that becomes an outer lipid membrane of the liposome is formed at the oil-water interface, An aqueous solution droplet containing an easily heat-denaturing substance, which is covered with an inner lipid membrane (second lipid membrane) of liposomes, is introduced into the phase, and the droplet is transferred into the aqueous phase, so that the outer side of the inner lipid membrane And forming an outer lipid membrane.
ここで、内層脂質膜に覆われた液滴を外層脂質膜となる脂質単分子膜が形成された油水界面を通過させ、水相中へ移行させるために、液滴及び水相を形成する水性溶液各々の比重差、すなわち重力を利用することが好ましい。重力による液滴の水相中への移行は、非常に穏やかな条件下で行われるため、リポソームの形成時に発熱を伴わず、易熱変性物質が変性することがなく、また、力学的ストレス等も加わることがないので、形成されたリポソームが破壊されることがない。また、重力による液滴の移行では、例えば透明容器内で操作を行うことで、リポソームの形成過程を視認することもできる。 Here, in order to pass the droplet covered with the inner lipid membrane through the oil-water interface on which the lipid monomolecular film as the outer lipid membrane is formed and transfer it into the aqueous phase, an aqueous solution that forms droplets and an aqueous phase is formed. It is preferable to use the specific gravity difference of each solution, that is, gravity. Gravity of the droplets into the aqueous phase is carried out under very mild conditions, so there is no exotherm during the formation of liposomes, the heat-denaturing substance is not denatured, and mechanical stress, etc. Is not added, so that the formed liposome is not destroyed. In addition, in the transfer of droplets by gravity, for example, by performing an operation in a transparent container, the formation process of liposomes can be visually confirmed.
以下に、本発明のリポソームの製造方法を詳述する。 Below, the manufacturing method of the liposome of this invention is explained in full detail.
水相と油相の間の油水界面に形成した脂質単分子膜(第1脂質膜)は、油相中に各種リン脂質等の脂質成分を添加することにより容易に形成することが可能である。油相中に添加された脂質成分は、各脂質分子の疎水基部分が油相側になり、親水基部分が水相側になるように油水界面において整列し、全ての脂質分子が一定方向を向いた脂質単分子膜が油水界面に形成される。 A lipid monomolecular film (first lipid film) formed at the oil-water interface between the water phase and the oil phase can be easily formed by adding lipid components such as various phospholipids to the oil phase. . The lipid components added in the oil phase are aligned at the oil / water interface so that the hydrophobic group part of each lipid molecule is on the oil phase side and the hydrophilic group part is on the water phase side, and all lipid molecules are in a certain direction. A facing lipid monolayer is formed at the oil-water interface.
続いて、上記油相中に内層脂質膜で覆われたW/O液滴を導入する。このW/O液滴は、易熱変性物質が含有された水性溶液の液滴の周囲に内層脂質膜(第2脂質膜)を形成したものであり、内層脂質膜は、親水基部分が内側を向き、疎水基部分が外側に向くように各脂質分子が整列した単分子膜として形成される。W/O液滴は、別途作製したものを油相中に導入してもよいし、油相中で形成するようにしてもよい。 Subsequently, W / O droplets covered with an inner lipid membrane are introduced into the oil phase. These W / O droplets are formed by forming an inner lipid membrane (second lipid membrane) around droplets of an aqueous solution containing an easily heat-denaturing substance. The inner lipid membrane has a hydrophilic group portion on the inner side. And each lipid molecule is formed as a monomolecular film with the hydrophobic group portion facing outward. W / O droplets may be introduced separately into the oil phase, or may be formed in the oil phase.
油相中にW/O液滴を導入すると、重力によってW/O液滴は沈んでいき、油水界面に到達する。油相を構成する油に比べて液滴を構成する水性溶液の方が重いからである。ただし、W/O液滴と水相はいずれも水性溶液により構成されているので、例えばW/O液滴の液滴を構成する水性溶液と水相を構成する水性溶液が同じである場合、W/O液滴はそれ以上降下することができず、水相中に移行させることができない。 When W / O droplets are introduced into the oil phase, the W / O droplets sink due to gravity and reach the oil / water interface. This is because the aqueous solution constituting the droplets is heavier than the oil constituting the oil phase. However, since both the W / O droplet and the aqueous phase are composed of an aqueous solution, for example, when the aqueous solution constituting the droplet of the W / O droplet and the aqueous solution constituting the aqueous phase are the same, The W / O droplet cannot descend any further and cannot be transferred into the aqueous phase.
そこで、本発明においては、W/O液滴の液滴を構成する水性溶液と水相を構成する水性溶液に比重差を付与し、重力によってW/O液滴が水相中に移行するにようになすのがよい。W/O液滴が油水界面を通過する際には、周囲に脂質単分子膜(第1脂質膜)を巻き込む形になり、当該脂質単分子膜が外層脂質膜となって脂質2分子膜を備えたリポソームが形成される。比重差は、W/O液滴の液滴を構成する水性溶液に易熱変性物質を溶解させることで付与できるが、その他水溶性の物質をさらに加えても構わない。 Therefore, in the present invention, a specific gravity difference is given to the aqueous solution constituting the W / O droplet and the aqueous solution constituting the aqueous phase, and the W / O droplet moves into the aqueous phase due to gravity. It is better to do so. When the W / O droplets pass through the oil-water interface, a lipid monomolecular film (first lipid film) is wound around the periphery, and the lipid monomolecular film becomes an outer lipid film to form a lipid bimolecular film. Provided liposomes are formed. The specific gravity difference can be imparted by dissolving the easily heat-denaturing substance in the aqueous solution constituting the droplets of the W / O droplets, but other water-soluble substances may be further added.
リポソームの脂質膜を構成する脂質膜成分には、少なくともリン脂質、糖脂質、ステロール類、グリコール類、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール(PEG)基を有する脂質(例えばPEG−リン脂質)等が含まれる。なかでも、リン脂質及び/又は糖脂質が好ましく使用される。 Lipid membrane components constituting the lipid membrane of the liposome include at least phospholipids, glycolipids, sterols, glycols, cationic lipids, lipids having a polyethylene glycol (PEG) group (for example, PEG-phospholipid), and the like. . Of these, phospholipids and / or glycolipids are preferably used.
使用できるリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホシファチジン酸、ホスファチジルグリセリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン(リゾレシチン)、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの水素添加リン脂質等が特に限定されることなく使用できる。 Examples of phospholipids that can be used include phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerin, dioleoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, palmitoyloleoylphosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, Phosphate, lysophosphatidylcholine (lysolecithin), egg yolk lecithin, soybean lecithin or hydrogenated phospholipids thereof can be used without any particular limitation.
上記リン脂質は、1種又は2種以上を併用することも可能である。また、内層脂質膜と外層脂質膜の組成が異なる非対称性脂質2分子膜を備えるようにしてもよい。 The phospholipids can be used alone or in combination of two or more. Moreover, you may make it provide the asymmetric lipid bimolecular membrane from which the composition of an inner-layer lipid membrane and an outer-layer lipid membrane differs.
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル等のグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4等のスフィンゴ糖脂質等を挙げることができる。 Examples of the glycolipid include glycerolipids such as digalactosyl diglyceride and galactosyl diglyceride sulfate, galactosylceramide, galactosylceramide sulfate, lactosylceramide, sphingoglycolipids such as ganglioside G7, ganglioside G6, and ganglioside G4.
リポソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。例えば、脂質膜安定化剤として作用するステロール類、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、又はラノステロール等が挙げられる。また1−O−ステロールグルコシド,1−O−ステロールマルトシド又は1−O−ステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリポソームの安定化に効果があることが知られている。これらの中で、特にコレステロールが好ましい。 As a constituent component of the liposome membrane, other substances can be added as necessary in addition to the lipid. For example, sterols acting as a lipid membrane stabilizer such as cholesterol, dihydrocholesterol, cholesterol ester, phytosterol, sitosterol, stigmasterol, campesterol, cholestanol, lanosterol and the like can be mentioned. It is also known that sterol derivatives such as 1-O-sterol glucoside, 1-O-sterol maltoside or 1-O-sterol galactoside are effective in stabilizing liposomes. Among these, cholesterol is particularly preferable.
ステロール類の使用量として、リン脂質(PEG―リン脂質を含まず)/ステロール類のモル比が100/60〜100/90、好ましくは100/70〜100/85である。このモル比は、PEG−リン脂質を除くリン脂質量を基準としている。モル比が100/60未満であると混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定化が充分に発揮されない。 As the amount of sterols used, the molar ratio of phospholipid (PEG-phospholipid not included) / sterols is 100/60 to 100/90, preferably 100/70 to 100/85. This molar ratio is based on the amount of phospholipid excluding PEG-phospholipid. When the molar ratio is less than 100/60, stabilization by sterols that improve the dispersibility of the mixed lipid is not sufficiently exhibited.
上記ステロール類の他にリポソーム膜の構成成分として、グリコール類を加えてもよい。リポソームを作製する際に、リン脂質等ともにグリコール類を添加すると、リポソーム内での水溶性化合物の保持効率が上昇する。グリコール類として、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、1,4−ブタンジオール等が挙げられる。グリコール類の使用量として、脂質全質量に対して0.01〜20質量%、好ましくは0.5〜10質量%の割合が望ましい。 In addition to the sterols, glycols may be added as a constituent of the liposome membrane. When preparing a liposome, if glycols are added together with phospholipid or the like, the retention efficiency of the water-soluble compound in the liposome is increased. Examples of glycols include ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, trimethylene glycol, and 1,4-butanediol. As a usage-amount of glycols, the ratio of 0.01-20 mass% with respect to lipid total mass, Preferably the ratio of 0.5-10 mass% is desirable.
本発明のリポソームは、目的とする対象器官に、目的とする薬効を有す有効成分を到達させるドラッグデリバリーシステム(DDS)に広く適用可能である。目的に応じ、経口あるいは血管を通じて、本発明のリポソームを含む薬剤を人体に投入できる。また、皮膚外用剤としては、美白、肌質改善、そばかす改善、肌の若返り、肌の引き締めを目的とした、化粧水、乳液、クリーム、パック剤、ピーリング剤等の化粧品だけでなく、毛髪用洗浄剤、浴用剤等の医薬部外品、薬品等の医薬品、健康の保持増進に役立つ健康食品等の食品のいずれにも好適に使用することができる。 The liposome of the present invention can be widely applied to a drug delivery system (DDS) in which an active ingredient having a target medicinal effect reaches a target organ of interest. Depending on the purpose, the drug containing the liposome of the present invention can be introduced into the human body orally or through blood vessels. In addition, as an external preparation for skin, it is not only for cosmetics such as skin lotion, emulsion, cream, pack agent, peeling agent for the purpose of whitening, improving skin quality, improving freckles, rejuvenating skin, and tightening skin, but also for hair. It can be suitably used for any of quasi-drugs such as cleaning agents, bath preparations, pharmaceuticals such as drugs, and foods such as health foods useful for maintaining and promoting health.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
(使用試薬)
コラーゲン:3重らせん構造を保持した状態の原料で、変性温度は約37℃のものを使用した。
リン脂質:レシチン
(Reagent used)
Collagen: A raw material having a triple helical structure with a denaturation temperature of about 37 ° C. was used.
Phospholipid: Lecithin
(評価コラーゲンの準備)
3重らせんコラーゲンのアミノ基に蛍光試薬(NBD Chloride)を常法に従い結合させ、0.3重量%水溶液を作成した。
A fluorescent reagent (NBD Chloride) was bound to the amino group of triple helical collagen according to a conventional method to prepare a 0.3 wt% aqueous solution.
(W/O液滴の作製)
リン脂質(レシチン)を、濃度が7.5mg/mLとなるようにミネラルオイル溶媒に溶解した。マイクロチューブ容器に、リン脂質溶液を1000mg、蛍光試薬を結合させたコラーゲン水溶液を50mgで混合した。さらに、この混合液をボルテックスミキサーで撹拌した。
(Preparation of W / O droplet)
Phospholipid (lecithin) was dissolved in a mineral oil solvent to a concentration of 7.5 mg / mL. In a microtube container, 1000 mg of a phospholipid solution and 50 mg of an aqueous collagen solution combined with a fluorescent reagent were mixed. Furthermore, this mixed liquid was stirred with a vortex mixer.
(リポソームの作製)
サンプル瓶に、水相となる精製水を4000mg入れ、その上に濃度が7.5mg/mLのリン脂質を含むオイル相1000mgをのせた。このリン脂質は外層脂質膜となる。さらに、オイル相に作製したW/O液滴を添加した。W/O液滴が重力によりオイル相から水相まで油水界面を介して自発的に移行することで、脂質2分子膜が形成されたリポソームを作製した。
(Preparation of liposome)
In a sample bottle, 4000 mg of purified water serving as an aqueous phase was placed, and 1000 mg of an oil phase containing phospholipid having a concentration of 7.5 mg / mL was placed thereon. This phospholipid becomes an outer lipid membrane. Further, W / O droplets prepared in the oil phase were added. The W / O droplets spontaneously migrated from the oil phase to the aqueous phase by gravity through the oil-water interface, and thus a liposome having a lipid bimolecular film formed thereon.
前述で作製したコラーゲン内包リポソームを含有する水相を取り出した。水相をホットプレートにのせ、蛍光顕微鏡観察しながら45℃になるまで加温し、写真撮影を行った(図1)。一方、比較例として、リポソームに内包していない、蛍光試薬で修飾したコラーゲンについて同様の観察を行った(図2)。 The aqueous phase containing the collagen-encapsulated liposome prepared above was taken out. The aqueous phase was placed on a hot plate, heated to 45 ° C. while observing with a fluorescence microscope, and photographed (FIG. 1). On the other hand, as a comparative example, the same observation was performed on collagen modified with a fluorescent reagent not encapsulated in liposomes (FIG. 2).
コラーゲンが内包されたリポソームの場合、45℃でも3重らせんコラーゲン由来の蛍光がリポソーム内にのみ確認された。45℃でも、3重らせん構造を維持しているものと考えられる。一方、コラーゲン単独の場合は、蛍光は消失したことが確認された。コラーゲン分子をリポソームへ内包することで、熱エネルギーによるコラーゲン分子運動が抑制されたものと考えられる。 In the case of liposomes encapsulating collagen, fluorescence derived from triple helical collagen was confirmed only in the liposomes even at 45 ° C. It is considered that the triple helix structure is maintained even at 45 ° C. On the other hand, in the case of collagen alone, it was confirmed that the fluorescence disappeared. It is considered that collagen molecule movement due to thermal energy is suppressed by encapsulating collagen molecules in liposomes.
Claims (4)
水相に接するかたちで油相を配置した水/油界面に、第1脂質膜を形成する第1工程、
易熱変性物質を含有する水溶液が第2脂質膜に内包された液滴を形成する第2工程、
前記液滴を前記油相に導入し、これを、前記易熱変性物質を含有する水溶液と前記水相との比重差により水相に移行させるとともに、内層脂質膜となる前記第2脂質膜の外側を前記第1脂質膜で覆い外層脂質膜を形成する第3工程であって、前記比重差が前記易熱変性物質により付与される工程、
を備えることを特徴とするリポソームの製造方法。 A method for producing a liposome encapsulating a non-denatured heat-denaturing substance,
A first step of forming a first lipid membrane at the water / oil interface where the oil phase is arranged in contact with the water phase;
A second step in which an aqueous solution containing an easily heat-denaturing substance forms droplets encapsulated in a second lipid membrane;
The droplets are introduced into the oil phase, and the droplets are transferred to the water phase due to the difference in specific gravity between the aqueous solution containing the heat-denaturing substance and the water phase, and the second lipid membrane serving as the inner lipid membrane A third step of covering the outside with the first lipid membrane to form an outer lipid membrane, wherein the specific gravity difference is imparted by the heat-denaturing substance;
A method for producing a liposome, comprising:
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