JP5527642B2 - Liposomes and methods for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、脂質２分子膜を備えたリポソーム及びその作製方法に関するものであり、前記脂質２分子膜が非対称性を有するとともに、ミクロドメイン構造が形成された新規なリポソーム及びその作製方法に関する。 The present invention relates to a liposome having a lipid bilayer membrane and a method for producing the same, and relates to a novel liposome in which the lipid bilayer membrane has asymmetry and a microdomain structure is formed, and a method for producing the same.
これまで生体膜の構成成分は膜面内で一様に分布し自由に拡散しているものと考えられてきたが、近年、飽和脂質やコレステロールが豊富な秩序相からなるミクロドメイン構造の存在が報告されている。このミクロドメインは、「ラフト」と称され、シグナル伝達や小胞輸送等の機能発現の場として注目を集めている。 Until now, the components of biological membranes were thought to be uniformly distributed and freely diffused within the membrane surface, but in recent years there has been a microdomain structure consisting of ordered phases rich in saturated lipids and cholesterol. It has been reported. This microdomain is called “raft”, and has attracted attention as a place of function expression such as signal transduction and vesicle transport.
例えば、飽和脂質と不飽和脂質とコレステロールを混合したモデル膜リポソームにおいても、ラフト様のドメインを観察することができ、時間変化に応じたドメイン成長、コレステロール濃度によるドメイン形状の変化等に関する研究が行われている。 For example, even in model membrane liposomes in which saturated lipids, unsaturated lipids, and cholesterol are mixed, raft-like domains can be observed, and domain growth according to changes over time, changes in domain shape due to cholesterol concentration, etc. have been studied. It has been broken.
しかしながら、ドメインサイズや安定性の面で、実際のラフト構造を再現することには未だ成功していない。この原因として、モデル膜研究では生態環境がほとんど考慮されていなかったことが挙げられる。例えば、生体膜の非対称性については、これまでほとんど考慮されたことがない。生体膜の非対称性の生物学的意義は未だほとんど明らかにされていないが、非対称な疎水基同士の相互作用は、ドメイン構造の不安定化を引き起こすことが予測される。 However, in terms of domain size and stability, the actual raft structure has not been successfully reproduced. This is because the ecological environment was hardly considered in the model membrane research. For example, the asymmetry of biological membranes has hardly been considered so far. Although the biological significance of asymmetry in biological membranes has not been clarified yet, the interaction between asymmetric hydrophobic groups is expected to cause destabilization of the domain structure.
リポソームの作製方法としては、油水界面を利用する方法が一般的であり、例えば、特許文献１には、内膜リン脂質を含む油性液体中に、微細毛細管により粒径を調整した水滴を導入し、Ｗ／Ｏエマルジョンを形成する工程と、Ｗ／Ｏエマルジョンを捕捉する工程と、油性液体と外膜脂質を介して油水界面を形成する水相に、捕捉されたエマルジョンを移行させ、Ｗ／Ｏエマルジョンの外側に外膜脂質を付加する工程とを有するリポソームの製造方法が開示されている。ただし、特許文献１記載の発明も、内膜リン脂質と外膜リン脂質とが同一であるリポソームを作製対象とするもので、前記非対称性については何ら言及されていない。
As a method for producing liposomes, a method utilizing an oil-water interface is generally used. For example, in
脂質２分子膜が非対称性を有するリポソームの作製に関しては、ほとんど研究が進んでおらず、わずかに数例において報告が見られるに過ぎない（例えば非特許文献１や非特許文献２を参照）。この非特許文献１に記載される技術においても、内膜リン脂質を含む油性液体中に水滴を導入することでエマルジョンを形成し、外膜リン脂質の単分子膜が形成された油水界面を通過させることで外膜脂質を付加するという点で特許文献１記載の発明と共通するものであるが、遠心力を利用してエマルジョンを水相に移行させる点に特徴を有する。
There has been little research on the production of liposomes having lipid bilayer membranes that are asymmetric, and only a few examples have been reported (see, for example, Non-Patent
すなわち、非特許文献１に記載される発明では、水相の上部に脂質を溶解させた油相を用意する。油相に液滴を導入し、遠心分離による力で液滴を水相に引きずり込む。これにより、液滴が２分子膜小胞（リポソーム）に移行する。この際、油相に予め溶解させる脂質と導入する液滴を覆う脂質の組成を変えることで、非対称２分子膜を備えたリポソームが形成される。非特許文献２記載の発明も、遠心力を利用するという点で非特許文献１記載の発明と同様である。
しかしながら、非特許文献１に記載される技術では、遠心分離という厳しい条件下でリポソームの形成を行うため、必ずしも目的とするモデル膜リポソームを得ることができないのが実情である。例えば、遠心分離による力を利用して液滴を水相に移行させると、目的とするリポソームの形成率が低いという問題がある。これは、遠心機による力学的ストレスにより、リポソームが破壊されてしまうためである。また、遠心分離中は溶液の状態を確認することができず、リポソーム形成過程を視認することができないので、条件設定等が難しいという問題もある。さらには、遠心分離ではリポソームのサイズをほとんどコントロールすることができないという問題もある。遠心力を加えた場合、サイズに依存せず、リポソームが破壊されてしまうからである。
However, in the technique described in
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、生体膜の非対称性を模倣したリポソームの構築及びドメイン形成を実現することを目的とし、穏やかな条件下でリポソームの形成が可能で、リポソームを破壊することなく高い形成率で形成することが可能なリポソームの作製方法を提供することを目的とする。また、本発明は、リポソームの形成過程を視認することができ、形成されるリポソームのサイズをある程度コントロールすることが可能なリポソームの作製方法を提供することを目的とする。 The present invention has been proposed in view of such conventional circumstances, and aims to realize the construction and domain formation of liposomes that mimic the asymmetry of biological membranes, and the formation of liposomes under mild conditions. An object of the present invention is to provide a method for producing a liposome that can be formed at a high formation rate without destroying the liposome. It is another object of the present invention to provide a method for producing a liposome that can visually recognize the formation process of the liposome and can control the size of the formed liposome to some extent.
前述の目的を達成するために、本発明に係るリポソームは、水性溶液相上にリン脂質を含む油性溶液相を配するとともに、油水界面に外層脂質膜となる脂質単分子膜を形成しておき、油性溶液相中に不飽和リン脂質、飽和リン脂質、及びコレステロールを含む内層脂質膜が形成された液滴を導入し、前記液滴を構成する水性溶液と前記水性溶液相を構成する水性溶液に比重差を付与することで、重力により前記液滴を水性溶液相中に移行させ、前記内層脂質膜の外側に外層脂質膜を形成するものであり、この内層脂質膜と外層脂質膜は、互いの組成が異なる非対称性脂質２分子膜であり、前記液滴を構成する水性溶液が前記水性溶液相を構成する水性溶液中にこれよりも比重を重くして存在すると共に、当該非対称性脂質２分子膜の膜面内にドメイン構造が形成されることを特徴とする。 To achieve the foregoing objects, the liposomes of the present invention, as well as arranging the oily solvent liquid phase containing phospholipids on aqueous solution phase, to form a lipid monolayer as the outer lipid membrane in the oil-water interface Place, unsaturated phospholipid in an oil soluble liquid phase, saturated phospholipid, and introducing a droplet inner lipid film is formed including cholesterol, constituting the aqueous solution aqueous solution phase which constitutes the droplets By applying a specific gravity difference to the aqueous solution, the droplets are moved into the aqueous solution phase by gravity, and an outer lipid membrane is formed outside the inner lipid membrane. The inner lipid membrane and the outer lipid membrane Is an asymmetric lipid bimolecular film having a different composition from each other, and the aqueous solution constituting the droplets is present in the aqueous solution constituting the aqueous solution phase with a higher specific gravity than the asymmetric lipid bilayer membrane. In the membrane surface of the functional lipid bilayer Wherein the main structure is formed.
また、本発明のリポソームの作製方法は、水性溶液相上にリン脂質を含む油性溶液相を配するとともに、油水界面に外層脂質膜となる脂質単分子膜を形成しておき、油性溶液相中に不飽和リン脂質、飽和リン脂質、及びコレステロールを含む内層脂質膜が形成された液滴を導入し、前記液滴を構成する水性溶液と前記水性溶液相を構成する水性溶液に比重差を付与することで、重力により前記液滴を水性溶液相中に移行させ、前記内層脂質膜の外側に外層脂質膜を形成することを特徴とする。
Also, a manufacturing method of the liposomes of the present invention, as well as arranging the oily solvent liquid phase containing phospholipids on aqueous solution phase, previously formed a lipid monolayer as the outer lipid membrane in the oil-water interface, the oily solvent solution Introducing droplets in which an inner lipid layer containing unsaturated phospholipids, saturated phospholipids and cholesterol is formed in the phase, the specific gravity difference between the aqueous solution constituting the droplets and the aqueous solution constituting the aqueous solution phase Is applied, whereby the droplets are transferred into the aqueous solution phase by gravity, and an outer lipid membrane is formed outside the inner lipid membrane.
本発明においては、内層脂質膜が形成された液滴を脂質単分子膜が形成された油水界面を通過させることで、外層脂質膜を形成する。この時、内層脂質膜を構成する脂質成分と油水界面に形成される脂質単分子膜を構成する脂質成分の組成を変えることで、非対称性脂質２分子膜が形成される。ここで、内層脂質膜が形成された液滴を外層脂質膜となる脂質単分子膜が形成された油水界面を通過させ、水性溶液中へ移行させるためには、何らかの力を加える必要がある。先の非特許文献１記載の発明では、液滴を水性溶液中へ移行させるために、遠心力を利用している。
In the present invention, the outer layer lipid membrane is formed by passing the droplets on which the inner layer lipid membrane is formed through the oil-water interface on which the lipid monomolecular membrane is formed. At this time, the asymmetric lipid bimolecular membrane is formed by changing the composition of the lipid component constituting the inner lipid membrane and the lipid component constituting the lipid monolayer formed at the oil-water interface. Here, it is necessary to apply some force in order to cause the droplet formed with the inner layer lipid membrane to pass through the oil-water interface where the lipid monomolecular film serving as the outer layer lipid membrane is formed and to move into the aqueous solution. In the invention described in
本発明では、力学的ストレスの加わる遠心力に代えて、液滴と水性溶液の比重差を利用し、重力により液滴を油水界面を通過させ、水性溶液中へと移行させる。重力による液滴の水性溶液中への移行は、非常に穏やかな条件下で行われ、力学的ストレス等が加わることがないので、形成されたリポソームが破壊されることがない。また、重力による液滴の移行では、例えば透明容器内で操作を行えば、リポソームの形成過程を視認することができる。 In the present invention, instead of the centrifugal force to which mechanical stress is applied, the difference in specific gravity between the droplet and the aqueous solution is utilized, and the droplet is caused to pass through the oil-water interface by gravity and transferred into the aqueous solution. The transition of the droplets into the aqueous solution by gravity is performed under very mild conditions, and no mechanical stress is applied, so that the formed liposomes are not destroyed. Moreover, in the movement of the droplet by gravity, for example, if the operation is performed in a transparent container, the formation process of the liposome can be visually confirmed.
さらに、前記重力による液滴の移行では、大きな液滴の方が加わる重力が大きく、小さな液滴に比べて油水界面を通過し易いという特徴がある。例えば、前記比重差を大きくすれば、小さな液滴まで油水界面を通過し、水性溶液中に移行する。その結果、小さな粒径のリポソームが形成される。これに対して、前記比重差が小さい場合には、大きな液滴のみが油水界面を通過し、大きな粒径のリポソームが形成される。したがって、例えば液滴と水性溶液の比重を調整することで、形成されるリポソームのサイズコントロールが可能である。 Furthermore, in the transition of the droplet by gravity, there is a feature that the larger droplet is applied with a larger gravity, and is easier to pass through the oil / water interface than the small droplet. For example, if the specific gravity difference is increased, even small droplets pass through the oil-water interface and move into the aqueous solution. As a result, small particle size liposomes are formed. On the other hand, when the specific gravity difference is small, only large droplets pass through the oil-water interface, and liposomes having a large particle size are formed. Therefore, for example, the size of the liposome formed can be controlled by adjusting the specific gravity of the droplet and the aqueous solution.
本発明のリポソームの作製方法によれば、形成されたリポソームを破壊することなく、高い形成率で生体膜の非対称性を模倣したリポソームを作製することが可能である。前記リポソームの作製に際しては、リポソームの形成過程を視認することができ、サイズコントロールも可能である。 According to the method for producing liposomes of the present invention, it is possible to produce liposomes that mimic the asymmetry of biological membranes at a high formation rate without destroying the formed liposomes. When preparing the liposome, the formation process of the liposome can be visually confirmed, and the size can be controlled.
作製されるリポソームは、２分子膜が生体膜と同様の非対称性を有し、ラフト様のミクロドメイン構造も観察される。したがって、本発明のリポソームを用いることにより、内層と外層の組成の異なるリポソーム上での相分離実験系を確立することができ、例えば内外層非対称分布がドメイン形成及びその与える影響等を明らかにすることができる。 In the liposome to be produced, the bilayer membrane has asymmetry similar to that of a biological membrane, and a raft-like microdomain structure is also observed. Therefore, by using the liposome of the present invention, it is possible to establish a phase separation experimental system on liposomes having different inner and outer layer compositions, for example, to clarify the domain formation and its influence by the inner and outer layer asymmetric distribution. be able to.
以下、本発明を適用したリポソーム及びその作製方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。 Hereinafter, the liposome to which the present invention is applied and the production method thereof will be described in detail with reference to the drawings.
図１は、本発明によるリポソームの作製過程を模式的に示すものである。リポソームの作製のためには、油水界面に脂質単分子膜を形成し、内層脂質膜が形成された液滴を油性溶液から水性溶液へと移行する必要がある。そこで、本発明においても、図１（ａ）に示すように、水性溶液相１上に油性溶液相２を形成し、これら水性溶液相１と油性溶液相２の界面（油水界面）に脂質単分子膜３を形成しておく。脂質単分子膜３は、油性溶液相２中に各種リン脂質等の脂質成分を添加することにより容易に形成することが可能である。油性溶液相２中に添加された脂質成分は、各脂質分子４の疎水基部分４ａが油性溶液相２側になり、親水基部分４ｂが水性溶液相１側になるように油水界面において整列し、全ての脂質分子４が一定方向を向いた脂質単分子膜３が油水界面に形成される。
FIG. 1 schematically shows the production process of liposomes according to the present invention. In order to produce liposomes, it is necessary to form a lipid monomolecular film at the oil-water interface and transfer the droplets with the inner lipid membrane formed from the oily solution to the aqueous solution. Therefore, also in the present invention, as shown in FIG. 1 (a), an
油水界面に脂質単分子膜３を形成した後、油性溶液相２中に内層脂質膜６を形成したＷ／Ｏ液滴５を導入する。このＷ／Ｏ液滴５は、水性溶液の液滴７の周囲に内層脂質膜６を形成したものであり、内層脂質膜６は、親水基部分８ｂが水性溶液粒子６側を向き、疎水基部分８ａが外側に向くように各脂質分子８が整列した単分子膜として形成されている。
After the
なお、前記Ｗ／Ｏ液滴５は、別途作製したものを前記油性溶液相２中に導入してもよいし、油性溶液相２中で形成するようにしてもよい。後者の場合、例えば油性溶液相２を下層油性溶液相と上層油性溶液相の２層に分け、上層油性溶液相中に内層脂質膜形成用の脂質成分を添加しておく。そして、上層油性溶液相中に水性溶液の液滴７をマイクロキャピラリ等を用いて導入する。すると、水性溶液の液滴７に脂質成分の親水基部分８ｂが引き寄せられ、水性溶液の液滴７の周囲に前記内層脂質膜６が単分子膜として形成される。
The W /
油性溶液相２中に前記Ｗ／Ｏ液滴５を導入すると、重力によってＷ／Ｏ液滴５は沈んでいき、図１（ｂ）に示すように、油水界面に到達する。油性溶液相２を構成する油性溶液に比べて液滴７を構成する水性溶液の方が重いからである。
When the W /
ただし、Ｗ／Ｏ液滴５と水性溶液相１はいずれも水性溶液により構成されているので、例えばＷ／Ｏ液滴４の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液が同じである場合、Ｗ／Ｏ液滴５はそれ以上降下することができず、水性溶液相１中に移行させることができない。そこで、本発明においては、Ｗ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液に比重差を付与し、重力によってＷ／Ｏ液滴５が水性溶液相１中に移行するにようにしている。
However, since both the W /
Ｗ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液の比重を大とし、水性溶液相１を構成する水性溶液の比重を小とすれば、図１（ｃ）に示すように、重力によってＷ／Ｏ液滴５は油水界面を通過し、水性溶液相１中においても沈んでいく。Ｗ／Ｏ液滴５が油水界面を通過する際には、周囲に前記脂質単分子膜３を巻き込む形になり、当該脂質単分子膜３が外層脂質膜となって脂質２分子膜を備えたリポソーム９が形成される。
If the specific gravity of the aqueous solution constituting the
Ｗ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液に比重差を付与するためには、これら水性溶液にそれぞれ異なる溶質を溶解すればよい。溶質としては、糖類や塩類等を挙げることができ、例えば液滴７を構成する水性溶液にスクロース、水性溶液相１を構成する水性溶液にグルコースを溶解すれば、前記比重差を付与することができる。溶解する溶質の組み合わせとしては、糖類と糖類の組み合わせ、塩類と塩類の組み合わせ等が好適であり、さらには糖類の塩類の組み合わせ等も可能である。
In order to give a specific gravity difference between the aqueous solution constituting the
なお、前記溶質の水性溶液への溶解により比重差を付与するに当たり、液滴７を構成する水性溶液における溶質濃度と、水性溶液相１を構成する水性溶液における溶質濃度（体積モル濃度）は、同等に設定することが好ましい。前記溶質濃度に差があり過ぎると、浸透圧によって形成されるリポソーム９が変形したり破裂するおそれが生ずる。
In addition, in giving a specific gravity difference by dissolution of the solute in the aqueous solution, the solute concentration in the aqueous solution constituting the
Ｗ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液に比重差を付与し、重力を利用してＷ／Ｏ液滴５を水性溶液相１に移行する場合、油水界面に形成された脂質単分子膜３が抵抗になり、これを突き破る必要がある。したがって、脂質単分子膜３を突き破るに足る重力が加わるように前記比重差を設定する必要がある。ここで、前記必要な比重差は、Ｗ／Ｏ液滴５のサイズによって異なる。サイズの大きなＷ／Ｏ液滴５では、前記比重差が比較的小さくても大きな重力が加わり、水性溶液相１に移行し易い。一方、サイズの小さなＷ／Ｏ液滴５では、前記比重差が小さいと加わる重力も小さく、水性溶液相１に移行することができない。
A specific gravity difference is given to the aqueous solution constituting the
したがって、逆に言えば、Ｗ／Ｏ液滴５のサイズと比重差を調整することで、形成されるリポソーム９のサイズをコントロールできることになる。すなわち、前記比重差を大きくすれば、小さなＷ／Ｏ液滴５まで油水界面を通過し、水性溶液相１中に移行する。その結果、小さな粒径のリポソーム９が形成される。これに対して、前記比重差を小さくすれば、大きなＷ／Ｏ液滴５のみが油水界面を通過し、大きな粒径のリポソーム９が形成される。これらのことから、例えばＷ／Ｏ液滴５の液滴７を構成する水性溶液と水性溶液相１を構成する水性溶液の比重を調整することで、形成されるリポソーム９のサイズコントロールが可能となる。
Therefore, in other words, the size of the liposome 9 to be formed can be controlled by adjusting the size and specific gravity difference of the W /
以上が本発明におけるリポソームの作製方法の基本概念であるが、前記作製方法において、内層脂質膜６を構成する脂質成分や外層脂質膜となる脂質単分子膜３の脂質成分は、任意に選択することができる。例えば、内層脂質膜６を構成する脂質成分と外層脂質膜となる脂質単分子膜３の脂質成分の組成を変えれば、形成されるリポソーム９の脂質２分子膜において、非対称性が実現される。
The above is the basic concept of the liposome production method in the present invention. In the production method, the lipid component constituting the inner lipid membrane 6 and the lipid component of the
前述の作製方法においては、重力を利用した穏やかな条件でリポソームが作製され、形成されたリポソームが力学的ストレスによって破壊されることがない。したがって、高い形成率でリポソームを形成することが可能である。また、前記作製方法においては、例えば遠心分離器等を用いる必要がなく、汎用の容器を用いて一連の工程を行うことができるので、リポソームの形成過程を簡単に視認することが可能である。さらに、前述の通り、本発明の作製方法では、形成されるリポソームのサイズコントロールも可能である。 In the above-described production method, liposomes are produced under mild conditions using gravity, and the formed liposomes are not destroyed by mechanical stress. Therefore, it is possible to form liposomes with a high formation rate. Moreover, in the said preparation method, it is not necessary to use a centrifuge etc., for example, and since a series of processes can be performed using a general purpose container, the formation process of a liposome can be visually recognized easily. Furthermore, as described above, in the production method of the present invention, the size of the liposome formed can be controlled.
得られるリポソームは、２分子膜が生体膜と同様の非対称性を有し、ラフト様のミクロドメイン構造が観察されることも確認されている。このように、本発明により、生体膜の非対称性分布を模倣したリポソームの構築やドメイン形成が可能となり、また比較的大きなサイズのリポソームの形成が可能であるので、例えば巨大リポソーム上ラフトドメインの出芽ダイナミクスの研究等において有用なリポソームの提供が可能となる。 It has also been confirmed that the obtained liposome has a bilayer membrane having asymmetry similar to that of a biological membrane, and a raft-like microdomain structure is observed. Thus, according to the present invention, it is possible to construct liposomes and domain formations that mimic the asymmetric distribution of biological membranes, and it is possible to form relatively large-sized liposomes. It is possible to provide liposomes useful in dynamics research and the like.
以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。 Hereinafter, specific examples of the present invention will be described based on experimental results.
使用試薬
・ＤＯＰＣ（不飽和リン脂質）：dioleoyl L-α phosphatidylcholine（Avanti Polar Lipids社製）
・ＤＰＰＣ（飽和リン脂質）：dipalmitoyl L-α phosphatidylcoline（Avanti Polar Lipids社製）
・コレステロール（Avanti Polar Lipids社製）
・ミネラルオイル（Nacalai Tesque社製）
・Rhodamine red-X DHPE（蛍光色素）：N-(rhodamine red-X)-1,2-dihexadecanoyl -sn-glycero-3-pjosphoethanolamine triethylammonium salt（λex＝560nm、λen＝580nm）（Invitroge社製）
・ＮＢＤ−ＰＥ（蛍光色素）：1-oleoyl-2-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazo-4-yl) amino]dodecanoyl]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（λex＝460nm、λen＝533nm）（Avanti Polar Lipids社製）
・eggＰＣ：egg yolk phosphatidylcholine （卵黄フォスファチジルコリン）
Reagents used : DOPC (unsaturated phospholipid): dioleoyl L-α phosphatidylcholine (Avanti Polar Lipids)
DPPC (saturated phospholipid): dipalmitoyl L-α phosphatidylcoline (Avanti Polar Lipids)
・ Cholesterol (Avanti Polar Lipids)
・ Mineral oil (manufactured by Nacalai Tesque)
・ Rhodamine red-X DHPE (fluorescent dye): N- (rhodamine red-X) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-pjosphoethanolamine triethylammonium salt (λex = 560nm, λen = 580nm) (Invitroge)
NBD-PE (fluorescent dye): 1-oleoyl-2- [12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazo-4-yl) amino] dodecanoyl] -sn-glycero-3-phosphoethanolamine (λex = 460nm, λen = 533nm) (Avanti Polar Lipids)
・ EggPC: egg yolk phosphatidylcholine (egg yolk phosphatidylcholine)
Ｗ／Ｏ液滴の作製
ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、コレステロール、eggＰＣを、濃度が７ｍｇ／ｍＬとなるようにクロロホルム／メタノール混合溶媒（容積比２：１）に溶解した。このリン脂質溶液をガラスの試験管に注いだ。蛍光色素であるRhodamine red-X DHPEとＮＢＤ−ＰＥは、それぞれ１／５０のモル比率でリン脂質と混合した。窒素ガスによって有機溶媒を蒸発させ、３時間以上真空下で乾燥させることで、試験管の底に乾いたリン脂質のフィルムを作製した。ミネラルオイルを入れ、５０℃、６０分間超音波処理をした。オイル中の脂質の最終濃度は０．５ｍＭまたは０．１ｍＭにした。Ｗ／Ｏ液滴は、リン脂質を含むオイルに水溶液を５％加えて、タッピングすることで作製した。
Preparation of W / O droplets DOPC, DPPC, cholesterol and eggPC were dissolved in a chloroform / methanol mixed solvent (volume ratio 2: 1) to a concentration of 7 mg / mL. The phospholipid solution was poured into a glass test tube. The fluorescent dyes Rhodamine red-X DHPE and NBD-PE were each mixed with phospholipid at a molar ratio of 1/50. The organic solvent was evaporated with nitrogen gas and dried under vacuum for 3 hours or more to prepare a dry phospholipid film on the bottom of the test tube. Mineral oil was added and sonicated at 50 ° C. for 60 minutes. The final lipid concentration in the oil was 0.5 mM or 0.1 mM. W / O droplets were prepared by adding 5% aqueous solution to oil containing phospholipid and tapping.
液滴とリポソームの観察
観察チャンバの構成を図２に示す。本実験で使用した観察チャンバは、スライドガラス１１上に円筒形状の孔部１３を形成したシリコンゴムシート１２を載置することにより構成されている。前記孔部１３内でリポソーム形成が行われる。前記観察チャンバにおいては、スライドガラス１１を通して孔部１３内の様子を観察することが可能である。なお、液滴やリポソームの観察は、スライドガラス１１下に顕微鏡の対物レンズ１４を配置して行った。使用した顕微鏡は、６０倍レンズと１００倍オイルレンズを装備した倒立型顕微鏡（オリンパス社製）である。
The configuration of the observation chamber for the droplets and liposomes is shown in FIG. The observation chamber used in this experiment is configured by placing a
前記シリコンゴムシート１２の孔部１３の底に薄い水相をのせ、その上に０．１ｍＭのリン脂質を含むオイル相をのせ、２時間静置した。前記リン脂質が外層脂質膜となる。さらに、オイル相に作製したＷ／Ｏ液滴をのせた。Ｗ／Ｏ液滴が重力によりオイル相から水相まで油水界面を介して自発的に移行することで、脂質２分子膜が形成されたリポソームを作製した。
A thin aqueous phase was placed on the bottom of the
リポソームの形成効率及び粒径分布
リポソームを効率的に作製するために、液滴の比重を大きくすることを試みた。液滴の比重を大きくするために、本実験では、液滴の中にスクロース溶液、水相の中に同じ濃度のグルコース溶液を入れた。スクロース溶液とグルコース溶液は、浸透圧が加わるのを防ぐために同じ濃度に調製した。また、本実験では、スクロース及びグルコースについて、１０ｍＭ、１００ｍＭ、１Ｍ溶液を用いてリポソームを作製し、その大きさと個数を測定した。なお、液滴（内層脂質膜）の脂質はeggＰＣ、単分子膜（外層脂質膜）の脂質は０．１ｍＭ・ＤＯＰＣを用いた。
Liposome formation efficiency and particle size distribution In order to efficiently prepare liposomes, an attempt was made to increase the specific gravity of the droplets. In order to increase the specific gravity of the droplet, in this experiment, a sucrose solution was placed in the droplet and a glucose solution having the same concentration was placed in the aqueous phase. The sucrose solution and glucose solution were prepared at the same concentration to prevent osmotic pressure from being applied. In this experiment, liposomes were prepared using 10 mM, 100 mM, and 1 M solutions of sucrose and glucose, and the size and number thereof were measured. The lipid of the droplet (inner layer lipid membrane) was eggPC, and the lipid of the monomolecular membrane (outer layer lipid membrane) was 0.1 mM · DOPC.
その結果、１０ｍＭ溶液ではリポソームがほとんどできなかったが、１００ｍＭと１Ｍ溶液では多数のリポソームが作製できた。そこで、１００ｍＭと１Ｍ溶液を用いた場合について、リポソームの大きさ（粒径）と個数を比較したところ、図３に示すように、１００ｍＭ溶液を用いた場合と１Ｍ溶液を用いた場合で粒径分布が異なることがわかった。リポソームのサイズ分布は、スクロース・グルコース濃度に依存し、濃度が高い場合にサイズの小さなリポソームが作製され、濃度が低い場合にサイズの大きなリポソームが作製される。 As a result, 10 mM solution hardly produced liposomes, but 100 mM and 1M solutions made many liposomes. Therefore, when 100 mM and 1 M solution were used, the size (particle size) and number of liposomes were compared, and as shown in FIG. 3, the particle size was obtained when the 100 mM solution was used and when the 1 M solution was used. The distribution was found to be different. The size distribution of the liposomes depends on the sucrose / glucose concentration. When the concentration is high, a small liposome is produced, and when the concentration is low, a large liposome is produced.
また、１Ｍのスクロース・グルコース溶液を用いた場合のリポソームの粒径分布と液滴の粒径分布を比較したところ、図４に示すように、ほぼ同様の分布を示した。このことから、スクロース・グルコース溶液の濃度が高く液滴と水相の比重差が大きい場合には、液滴の大部分が水相に移行し、リポソームの形成に寄与することがわかる。 Further, when the particle size distribution of the liposome and the particle size distribution of the droplets were compared using a 1M sucrose / glucose solution, almost the same distribution was shown as shown in FIG. This shows that when the concentration of the sucrose / glucose solution is high and the specific gravity difference between the droplet and the aqueous phase is large, most of the droplet moves to the aqueous phase and contributes to the formation of liposomes.
二分子膜内外層の非対称性
液滴から作製されたリポソームが二分子膜内外層非対称であるかを調べた。図５（ａ）は、単分子膜（外層脂質膜）にのみRhodamine red-X DHPEを入れ、液滴（内層脂質膜）には蛍光色素を入れずに作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真であり、図５（ｂ）は、写真のリポソームの赤道面の白い点線上の蛍光強度を示したものである。図６（ａ）は、液滴（内層脂質膜）にのみＮＢＤ−ＰＥを入れ、単分子膜（外層脂質膜）には蛍光色素を入れずに作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真であり、図６（ｂ）は、写真のリポソームの赤道面の白い点線上の蛍光強度を示したものである。図７（ａ）は、単分子膜（外層脂質膜）にRhodamine red-X DHPEを入れ、液滴（内層脂質膜）にＮＢＤ−ＰＥを入れて作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真（Rhodamine red-X DHPE）、図７（ｂ）は、図７（ａ）のリポソームの赤道面の白い点線上の蛍光強度を示したもの、図７（ｃ）は、単分子膜（外層脂質膜）にRhodamine red-X DHPEを入れ、液滴（内層脂質膜）にＮＢＤ−ＰＥを入れて作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真（ＮＢＤ−ＰＥ）、図７（ｄ）は、図７（ｃ）のリポソームの赤道面の白い点線上の蛍光強度を示したものである。
It was investigated whether liposomes made from asymmetric droplets in the bilayer inner and outer layers were asymmetric in the bilayer inner and outer layers. FIG. 5 (a) is a fluorescence micrograph of a liposome prepared by putting Rhodamine red-X DHPE only in a monomolecular membrane (outer lipid membrane) and without putting a fluorescent dye in a droplet (inner lipid membrane). FIG. 5 (b) shows the fluorescence intensity on the white dotted line on the equatorial plane of the liposome in the photograph. FIG. 6 (a) is a fluorescence micrograph of a liposome prepared by putting NBD-PE only in a droplet (inner lipid membrane) and not putting a fluorescent dye in a monomolecular membrane (outer lipid membrane). (B) shows the fluorescence intensity on the white dotted line on the equatorial plane of the liposome in the photograph. FIG. 7 (a) shows a fluorescence micrograph of a liposome prepared by putting Rhodamine red-X DHPE in a monomolecular membrane (outer lipid membrane) and NBD-PE in a droplet (inner lipid membrane) (Rhodamine red-X). DHPE), FIG. 7B shows the fluorescence intensity on the white dotted line on the equatorial plane of the liposome of FIG. 7A, and FIG. 7C shows Rhodamine red on the monomolecular membrane (outer lipid membrane). -X DHPE, fluorescence micrograph (NBD-PE) of a liposome prepared by putting NBD-PE in a droplet (inner lipid membrane), FIG. 7 (d) shows the equatorial plane of the liposome in FIG. 7 (c) It shows the fluorescence intensity on the white dotted line.
これらの図面から明らかなように、単分子膜（外層脂質膜）にのみ蛍光色素を入れた場合、液滴（内層脂質膜）にのみ蛍光色素を入れた場合、単分子膜（外層脂質膜）と液滴（内層脂質膜）の双方に蛍光色素を入れた場合のいずれにおいてもリポソームが作製できており、本実験において、二分子膜内外層非対称なリポソームが作製できたことが明らかである。 As is clear from these drawings, when the fluorescent dye is put only in the monomolecular film (outer lipid membrane), when the fluorescent dye is put only in the droplet (inner lipid membrane), the monomolecular membrane (outer lipid membrane) Liposomes can be produced both when the fluorescent dye is put in both the droplet and the droplet (inner layer lipid membrane), and it is clear that asymmetric bilayer inner and outer layer liposomes can be produced in this experiment.
非対称性ドメインリポソーム
内層に３種類の脂質と蛍光色素、外層にＤＯＰＣのみ入ったリポソームにおいて、脂質組成によるドメインの形成の様子を観察した。先ず、図８（ａ）に示すように、内層脂質膜がＤＯＰＣのみでできた液滴から作製したリポソームでは、ドメイン構造が観察されなかった。内層脂質膜がＤＯＰＣとＤＰＰＣの比率が１対１の組成でコレステロールを１０％含む液滴から作製したリポソームでは、図８（ｂ）に示すように、蛍光色素で染まった無秩序相の膜面に、蛍光色素で染まっていない秩序相のドメインが点在する様子が観察された。内層脂質膜がＤＯＰＣとＤＰＰＣの比率が１対１の組成でコレステロールを６０％含む液滴から作製したリポソームでも、図８（ｃ）に示すように、蛍光色素で染まった無秩序相の膜面に、蛍光色素で染まっていない秩序相のドメインが点在する様子が観察された。
The formation of domains by lipid composition was observed in liposomes containing three types of lipids and fluorescent dyes in the inner layer of the asymmetric domain liposome and only DOPC in the outer layer. First, as shown in FIG. 8 (a), no domain structure was observed in liposomes prepared from droplets in which the inner lipid membrane was made only of DOPC. As shown in FIG. 8 (b), the inner layer lipid membrane is a liposome prepared from droplets containing 10% cholesterol with a ratio of DOPC to DPPC of 1: 1, and the membrane surface of the disordered phase stained with a fluorescent dye is formed on the membrane surface as shown in FIG. The order phase domains not stained with fluorescent dyes were observed. Even when the inner lipid membrane is a liposome prepared from a droplet containing 60% cholesterol with a ratio of DOPC to DPPC of 1: 1, as shown in FIG. 8 (c), the membrane surface of the disordered phase stained with a fluorescent dye is used. The order phase domains not stained with fluorescent dyes were observed.
１ 水性溶液相、２ 油性溶液相、３ 脂質単分子膜、４ 脂質分子、５ Ｗ／Ｏ液滴、６ 内層脂質膜、７ 液滴、８ 脂質分子、９ リポソーム、１１ スライドガラス、１２ シリコンゴムシート、１３ 孔部、１４ 対物レンズ 1 aqueous solution phase, 2 oily solution phase, 3 lipid monolayer, 4 lipid molecules, 5 W / O droplet, 6 inner lipid membrane, 7 droplet, 8 lipid molecule, 9 liposome, 11 slide glass, 12 silicone rubber Sheet, 13 holes, 14 objective lens
Claims (6)
この内層脂質膜と外層脂質膜は、互いの組成が異なる非対称性脂質２分子膜であり、前記液滴を構成する水性溶液が前記水性溶液相を構成する水性溶液中にこれよりも比重を重くして存在すると共に、当該非対称性脂質２分子膜の膜面内にドメイン構造が形成されることを特徴とするリポソーム。 With arranging the oily solvent liquid phase containing phospholipids on aqueous solution phase, previously formed a lipid monolayer as the outer lipid membrane in the oil-water interface, unsaturated phospholipid in an oil soluble liquid phase, saturated phospholipids And introducing a droplet in which an inner lipid membrane containing cholesterol is formed , and providing the specific gravity difference between the aqueous solution constituting the droplet and the aqueous solution constituting the aqueous solution phase, thereby causing the droplet to fall by gravity. Is transferred into an aqueous solution phase to form an outer lipid membrane on the outer side of the inner lipid membrane,
The inner lipid membrane and the outer lipid membrane are asymmetric lipid bimolecular membranes having different compositions, and the aqueous solution constituting the droplet has a higher specific gravity than the aqueous solution constituting the aqueous solution phase. And a domain structure is formed in the membrane surface of the asymmetric lipid bilayer membrane.
油性溶液相中に不飽和リン脂質、飽和リン脂質、及びコレステロールを含む内層脂質膜が形成された液滴を導入し、前記液滴を構成する水性溶液と前記水性溶液相を構成する水性溶液に比重差を付与することで、重力により前記液滴を水性溶液相中に移行させ、前記内層脂質膜の外側に外層脂質膜を形成することを特徴とするリポソームの作製方法。 With arranging the oily solvent liquid phase containing phospholipids on aqueous solution phase, previously formed a lipid monolayer as the outer lipid membrane in the oil-water interface,
Unsaturated phospholipids in the oily solvent liquid phase, an aqueous constituting saturated phospholipids, and introducing a droplet inner lipid film is formed including cholesterol, the liquid above the aqueous solution aqueous solution phase which constitutes a drop solution A method for producing a liposome, wherein the droplet is transferred into an aqueous solution phase by gravity by giving a difference in specific gravity to the outer layer to form an outer lipid membrane on the outer side of the inner lipid membrane.
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