JP5992926B2 - 心血管系疾患および血栓症の治療および予防のための組成物 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

〔関連出願の相互参照〕
本発明は、２０１１年２月１０日に出願した米国仮特許出願番号第６１／４４１，３１５号の利益を主張し、参照によりその全体が援用される。

〔技術分野〕
本明細書において、心血管系疾患（ＣＶＤ）の治療および／または予防のための組成物、ならびにそれらの応用および使用の方法を提供する。特に、本発明は、３，３−ジメチル−１−ブタノール（ＤＭＢ）および関連化合物、ならびにその製剤処方を用いる心血管系疾患の治療および／または予防を提供する。他の実施形態において、本発明は、血栓症、心臓発作および／または血小板過剰反応性を引き起こすリスクに関連する治療の前に、腸内細菌叢を標的とする抗生物質を対象に投与する方法を提供する。

〔背景技術〕
心血管系疾患（ＣＶＤ）とは、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、脳血管疾患、大動脈腸骨疾患および末梢血管疾患を含む、心臓および血管の疾患に対する一般的な用語である。ＣＶＤを有する対象は、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、一過性脳虚血発作、うっ血性心臓疾患、大動脈瘤および死亡を含むがこれらに限定されない、多くの合併症を発生する可能性がある。ＣＶＤは、アメリカ合衆国における死亡原因の５０％を占めており、ナンバーワンの致死性疾患である。ゆえに、心血管系疾患の予防は、住民の健康にとって重要な位置を占めている。

低脂肪の食事と、運動が、ＣＶＤ予防のために推奨されている。さらに、ＣＶＤを有するリスクがあるとわかっている個人に対し、多くの治療剤が、医療専門家により処方され得る。それらには、コレステロールおよびトリグリセリドの血中レベルを減少させる脂肪低下剤、たとえばアスピリン等の血圧を正常化させる薬剤、または血小板の活性化を阻害する、および血管の炎症を減少させる血小板ＡＤＰ受容体アンタゴニスト（たとえば、クロピドグレルおよびチクロピジン）、ならびにたとえばペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト等の、炎症を減少させる、インスリン感受性化を促進する、血管機能を改善する、および脂質異常を是正するといった広範囲の代謝効果を伴う多面的な薬剤が挙げられる。ＣＶＤを有する可能性の高い個人においては、より積極的な治療（たとえば、多剤の投与または外科的介入）を用いてもよい。ＣＶＤ治療には有害な副作用がある可能性があるため、リスクがある個人を識別するための方法、特に、近々、有害な心臓事象を発生するリスクが高い個人を識別するための方法が望まれている。

心血管系疾患の主なリスク要因には、年齢、高血圧、早発ＣＶＤの家族歴、喫煙、総コレステロールの高値、ＨＤＬコレステロールの低値、肥満および糖尿病が挙げられる。ＣＶＤの主なリスク要因は加算的であり、ＣＶＤ治療により利益を得る可能性が最も高い個人を標的とするリスク予測アルゴリズムにおいて、典型的には医師により一緒に用いられる。ＣＶＤの検証可能なマーカーとしては、大動脈プラークの形成のレベル、総血中コレステロールのレベル、血中トリグリセリドのレベル、血中低密度リポタンパク質のレベル、血中高密度リポタンパク質のレベル、泡沫細胞の形成、ならびにコリン関連トリメチルアミン（ＴＭＡ）および、たとえばトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）等のトリメチルアミン含有化合物のレベルが挙げられる。

〔発明の概要〕
一部の実施形態において、本発明は、心血管系疾患および／または血栓症の治療および／または予防に対する方法であって、ａ）対象の血小板凝集が増加している、および／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別すること、ｂ）当該対象に、ジメチルブタノールおよび／もしくはその誘導体、ならびに／または消化管標的抗生物質ならびに／またはプレバイオティック（たとえば、腸内細菌叢組成を変化させるファイバー含有食物）ならびに／またはプロバイオティック（たとえば、ヨーグルト等のプロバイオティック含有食物）を含有する組成物を投与することが含まれる、方法を提供する。ある実施形態において、組成物は、ジメチルブタノールを含有する。さらなる実施形態において、識別することには、血小板凝集の増加を示す対象由来の試料で実施された血小板凝集分析の結果を見る（たとえば、紙上で、またはコンピュータースクリーン上で）ことが含まれる。さらなる実施形態において、識別することには、ＴＭＡＯレベルの上昇を示す対象由来の試料で実施されたＴＭＡＯ分析の結果を見ることが含まれる。ある実施形態において、識別することには、ＴＭＡまたはＴＭＡＯレベルの上昇を示す当該対象由来の試料または呼気試料で実施されたＴＭＡまたはＴＭＡＯ分析の結果を見ることが含まれる。

一部の実施形態において、組成物は、ＤＭＢ含有食物または飲料を含む。さらなる実施形態において、組成物は、限定されないが、オリーブ油、エキストラバージンオリーブ油、グレープシード油、イースト菌含有食物および赤ワインからなる群から選択されるＤＭＢ含有食物を含む。他の実施形態において、組成物は、ＴＭＡＯレベルを減少するのに有益な化合物を含む。ある実施形態において、組成物は、錠剤またはカプセル（たとえば、充填剤または結合剤を有する）で提供される。特定の実施形態において、ジメチルブタノールおよび／またはその誘導体は、腸内細菌叢由来のコリンまたは他のトリメチルアミン栄養素（たとえば、カルニチン、グリセロホスホコリン、ホスホコリン、ホスファトジルコリン）からのＴＭＡ形成を阻害、またはコリン輸送を損なう。さらなる実施形態において、ジメチルブタノールおよび／またはその誘導体は、対象に投与された場合、以下のうち一つ以上を誘導する：トリメチルアミンレベルの減少、総コレステロールレベルの減少、ＬＤＬレベルの減少、ＨＤＬレベルの上昇、およびトリグリセリドレベルの減少。さらなる実施形態において、ジメチルブタノールおよび／またはその誘導体は、対象に投与された場合、心血管系疾患のリスクを減少させる。他の実施形態において、ジメチルブタノールおよび／またはその誘導体は、対象に投与された場合、血小板活性化および／または血栓症のリスクを減少させる。

一部の実施形態において、本発明は、ジメチルブタノールおよび／またはその誘導体を含有する組成物を対象に投与することを含む、心血管系疾患および／または血栓症の治療および／または予防の方法を提供する。さらなる実施形態において、対象は、血小板凝集が増加していると決定されている。ある実施形態において、対象は、ＴＭＡＯレベルが上昇していると決定されている。さらなる実施形態において、投与することは、心血管系疾患および／または血栓症の少なくとも一つの症状が減少または除去されるような条件下で行われる。さらなる実施形態において、対象は、高コリンの食事を摂取している。他の実施形態において、組成物はジメチルブタノールを含有している。ある実施形態において、組成物の投与は、コリンがトリメチルアミンに転換することを阻害する。他の実施形態において、組成物の投与は、コリン輸送を阻害する。

特定の実施形態において、組成物は、心血管系疾患に対する治療を提供する一つ以上の薬剤と共に投与される。さらなる実施形態において、その一つ以上の薬剤は、腸内細菌叢を標的とする抗生物質（たとえば、ＴＭＡＯ産生の原因となる腸の中の細菌を殺す抗生物質）を一つ以上、含有する。さらなる実施形態において、組成物は、炎症疾患に対する治療を提供する一つ以上の薬剤と共に投与される。さらなる実施形態において、組成物は、ＴＭＡおよび／またはＴＭＡレベルを減少する一つ以上の薬剤、または腸運動性を改善する一つ以上の薬剤（たとえば、ファイバー、サイリウムまたは他の一部のプレバイオティック）と共に投与される。

一部の実施形態において、本発明は、対象における血栓症、心臓発作を防ぐ方法および／または血小板過剰反応性を減少させる方法を提供するものであり、当該対象は、以下を含む治療を受けているものである：治療の前に対象に腸内細菌叢を標的とする抗生物質を投与することであって、当該治療は、血栓症、心臓発作および／または血小板過剰反応性を引き起こすリスクに関連し、当該投与は、血栓症および／また心臓発作を防ぎ、および／または血小板過剰反応性を減少させるような条件下で行われる。

ある実施形態において、治療は、歯科、外科、大腸内視鏡検査および心臓血管ステント治療からなる群から選択される、機器を使用する治療である。ある実施形態において、腸内細菌叢を標的とする抗生物質は、シプロフロキシン、フラジル（メトロニダゾール）、バンコマイシン、硫酸ネオマイシンおよびアンピシリンからなる群から選択される。特定の実施形態において、投与は、治療の５０時間以内（たとえば、治療の４８時間…４０時間…３６時間…２８時間…２２時間…１５時間…１０時間…７時間…５時間…４時間…３時間…２時間…１時間…５分以内）である。さらなる実施形態において、方法は、治療の前に、腸内細菌叢を標的とする抗生物質の投与の後に対象から採取された試料で行われた血小板凝集分析の結果をみることをさらに含む。さらなる実施形態において、方法は、治療を実施することをさらに含む。

一部の実施形態において、本発明は、以下を含む方法を提供する：ａ）対象由来の試料で血小板凝集分析を実施し、正常レベルと比較して、当該試料が血小板凝集の上昇を示すかどうか、決定すること、およびｂ）当該対象が、心血管系疾患または血栓症を治療するための治療用組成物を受けることを推奨する、および／または、心血管系疾患または血栓症を治療するための治療用組成物を受けることを推奨する報告書を作製することであって、当該治療用組成物は、ジメチルブタノールおよび／もしくはその誘導体、ならびに／または腸内細菌叢を標的とする抗生物質、プレバイオティックおよび／もしくはプロバイオティックである。

ある実施形態において、本発明は、以下を含む方法を提供する：ａ）対象由来の試料でＴＭＡＯレベル分析を実施し、正常レベルと比較して、当該試料がＴＭＡＯレベルの上昇を示すかどうか、決定すること、およびｂ）当該対象が、心血管系疾患または血栓症を治療するための治療用組成物を受けることを推奨する、および／または、当該対象が、心血管系疾患または血栓症を治療するための治療用組成物を受けることを推奨する報告書を作製することであって、当該治療用組成物は、ジメチルブタノールおよび／もしくはその誘導体、ならびに／または腸内細菌叢を標的とする抗生物質、プレバイオティックおよび／もしくはプロバイオティックである。

ある実施形態において、本発明は、以下を含む方法を提供する：ａ）対象由来の試料または呼気でＴＭＡレベル分析を実施し、正常レベルと比較して、当該試料または呼気がＴＭＡレベルの上昇を示すかどうか、決定すること、およびｂ）当該対象が、心血管系疾患または血栓症を治療するための治療用組成物を受けることを推奨する、および／または、当該対象が、心血管系疾患または血栓症を治療するための治療用組成物を受けることを推奨する報告書を作製することであって、当該治療用組成物は、ジメチルブタノールおよび／もしくはその誘導体、ならびに／または腸内細菌叢を標的とする抗生物質、プレバイオティックおよび／もしくはプロバイオティックである。

一部の実施形態において、本発明は、対象への投与用に構成された、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物を含有する、心血管系疾患を治療および／または予防するための組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物はジメチルブタノールを含有する。一部の実施形態において、組成物は、心血管系疾患に対する治療を提供する一つ以上の医薬品をさらに含有する。一部の実施形態において、組成物は一つ以上の医薬担体をさらに含有する。一部の実施形態において、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物は、コリン輸送を損なう。一部の実施形態において、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物は、対象に投与された場合に、以下の一つ以上を誘導する：トリメチルアミンレベルの減少、総コレステロールレベルの減少、ＬＤＬレベルの減少、ＨＤＬレベルの上昇、トリグリセリドレベルの減少。一部の実施形態において、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物は、対象に投与された場合に、心血管系疾患のリスクを減少させる。一部の実施形態において、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物は、対象に投与された場合に、炎症性疾患のリスクを減少させる。一部の実施形態において、組成物は、生理学的に受容可能な緩衝液とともに処方される。一部の実施形態において、組成物は、充填剤または結合剤を有する錠剤またはカプセルで提供される。

一部の実施形態において、本発明は、対象に、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物を含有する組成物を投与することを含む、心血管系疾患を治療および／または予防する方法を提供する。一部の実施形態において、対象は、心血管系疾患を発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は心血管系疾患に罹患している。一部の実施形態において、投与することは、当該心血管系疾患の少なくとも一つの症状が減少または除去されるような条件下で行われる。一部の実施形態において、対象は、高コリンの食事を摂取している。一部の実施形態において、組成物は、ジメチルブタノールを含有する。一部の実施形態において、組成物は、コリンがＴＭＡまたは他のトリメチルアミンに転換することを阻害する。一部の実施形態において、組成物の投与は、コリン輸送を阻害する。一部の実施形態において、組成物は、心血管系疾患の治療を提供する一つ以上の薬剤と共に投与される。一部の実施形態において、組成物は、炎症性疾患の治療を提供する一つ以上の薬剤と共に投与される。

一部の実施形態において、本発明は、対象における心血管系疾患の兆候または症状を治療、予防または改善する方法を提供する。一部の実施形態において、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物は、一つ以上の他の治療剤、栄養補助食品、サプリメント、薬剤および／または食物とともにキット中で提供される。一部の実施形態において、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物は、栄養補助食品として提供される。一部の実施形態において、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物は、薬剤として提供される。一部の実施形態において、ジメチルブタノール、その誘導体または関連化合物は、ＣＶＤの総合的治療戦略または総合的予防戦略の一部として、および／または他の治療、健康食、運動および／または医師および当業者に公知の他の戦略とともに提供される。

一部の実施形態において、ＤＭＢ、ＤＭＢを含有する化合物、ＤＭＢ関連化合物および／またはその誘導体の投与は、限定されないが、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心筋症、うっ血性心不全、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、頸動脈疾患、心内膜炎、心臓発作（たとえば、冠静脈血栓症、心筋梗塞［ＭＩ］）、高血圧／高血圧症、高コレステロール血症／脂質異常症、僧房弁逸脱、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、脳卒中等を含む心血管系疾患の一つ以上に対する療法（たとえば、苦痛緩和、予防、治療等）を提供する。

〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕コリン、トリメチルアミンＮ−オキシドおよび３，３−ジメチル−１−ブタノール（ＤＭＢ）の分子式を示す。

〔図２〕構造的類似化合物の、マクロファージコレステロール蓄積への効果、および食品中のＰＣおよびコリンの、腸内細菌叢依存代謝からアテローム性動脈硬化症に連結する経路の全体概要を示す。（ａ）構造的に類似の化合物（コリン、ＴＭＡＯおよびジメチルブタノール（ＤＭＢ））間の、マクロファージにおけるコレステロール蓄積の違い。オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ．Ａｐｏｅ−／−マウス（１５週齢）に、通常固形飼料単独（対照）、またはコリン（１．０％）、ＴＭＡＯ（０．１２％）もしくはＤＭＢ（１．０％）のいずれかで補給した通常固形飼料を与えた。腹膜マクロファージを、示された数の２０週齢のマウスから回収し、細胞性コレステロール含有量を安定同位体希釈ＧＣ／ＭＳにより定量化し、ＤＮＡ含有量に対し正規化した。（ｂ）経路全体の概略図。

〔図３〕大動脈損傷の蓄積への食事の効果を示す、大動脈基部切片の画像を示す。

〔図４〕大動脈損傷の蓄積への食事の効果およびＤＭＢ投与による食品中のコリンからのアテローム性動脈硬化症プラークの減少のプロット図を示す。

〔図５〕コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬコレステロールおよびＨＤＬコレステロールの血漿レベル、およびＤＭＢの投与がどのようにアテローム性の脂質レベルを減少させることができるかを示すプロット図である。

〔図６〕（ａ）固形飼料のみ、（ｂ）コリンを補給、（ｃ）ＤＭＢを補給、および（ｄ）コリン＋ＤＭＢを補給した食物を与えられたマウス由来の腹膜マクロファージの染色を示す。パネル（ｅ）は、算出された泡沫細胞の％を示す。

〔図７〕２０週齢のマウスから回収した腹膜マクロファージ中の総コレステロールのプロット図を示す。また、ＤＭＢ処理により、コレステロール蓄積の減少が誘導された。

〔図８〕ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＤＭＢ投与により、コリンのＴＭＡへの転換阻害が促進されることを図示するプロット図を示す。

〔図９〕経口広域スペクトラム抗生物質での腸内細菌叢の抑制が、ＴＭＡおよびＴＭＡＯ産生を抑制し、ＴＭＡおよびＴＭＡＯ形成には腸内細菌叢が必要であることが確認されたことを示す。図９はまた、高コリン食品を与えられたマウスでＤＭＢがＴＭＡおよびＴＭＡＯ形成を阻害することを示す。

〔図１０〕図１０Ａは、高コリン食品を与えられた動物が、ＡＤＰへの血小板凝集増加により観察されたようにＴＭＡＯ血漿中レベルを上昇させ、血小板過剰反応性を増加させたことを示す。図１０Ｂは、血漿ＴＭＡＯの抑制が、コリン食品誘導性の血小板凝集の増加を著しく減少させることを示す。

〔図１１〕図１１Ａは、高コリン食品を与えられた動物が、血漿ＴＭＡＯレベルが増加したことを示し、図１１Ｂは、ＤＭＢが、マウスにおいて、ＴＭＡＯの形成を阻害すること、および血小板過剰反応性をもまた、著しく減少させることを示す。

〔図１２〕実施例７および他におけるマウス群からのデータを要約したものである。図１２は、血小板凝集応答対指定食品および処置（ＤＭＢまたは細菌叢抑制抗生物質）の最大振幅をプロットするものである。図１２は、ＤＭＢの添加により、高コリン食品または内在性ＴＭＡＯ由来の血小板過剰反応性（凝集）を阻害されることを示す。

〔図１３〕ＴＭＡＯ（食品中のコリンまたは他のトリメチルアミン含有栄養素の腸内細菌叢依存性代謝産物）が、ｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率を、ｉｎ ｖｉｖｏで高めることを示す。本明細書における実験は、アテローム性動脈硬化症の傾向を有するＡｐｏＥ−／−マウスにて行われ、腸内細菌叢が介在するコリンのＴＭＡＯへの転換を阻害する抗生物質が、血栓症発生率の減少を促進するのに有用であることを示す。

〔図１４〕ＴＭＡＯ（食品中のコリンの腸内細菌依存性代謝産物）が、脂質異常症の無い野生型マウスにおける血栓症発生率を、ｉｎ ｖｉｖｏで高めること、および腸内細菌叢が介在するコリンまたは他の食品中のトリメチルアミンのＴＭＡまたはＴＭＡＯへの転換を阻害する抗生物質または他の手段が、血栓症発生率の減少を促進するのに有用であろうことを示す。

〔図１５〕抗生物質またはＤＭＢのいずれかの存在対非存在での、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ血栓症データの要約を示す。図１５は、ＤＭＢおよび抗生物質の両方が、高コリン食品でみられるｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率の減少を阻害し、また、食品誘導性ＴＭＡＯレベルの増加を阻害することを示す。

〔図１６〕２個の固ゆで卵の経口摂取後のホスファチジルコリン代謝物（ＴＭＡＯ、コリン、ベタイン）、および抗生物質前後のｄ９−ホスファチジルコリンのヒト血漿レベルを示す。

〔図１７〕ＴＭＡＯ四分位に従う、長期間の主要心臓有害事象のカプランマイヤーの推定を示す。

〔図１８〕ＴＭＡＯレベルのベースラインに従う、患者亜群間の、主要心臓有害事象のリスクを示す。危険率は、上位から下位への四分位を比較した。ＴＭＡＯは、従来のリスクファクターからはリスクがあるものと特に識別されない複合的な低リスクコホートにおける主要心臓有害事象リスクの増加を予測する。

〔図１９〕２つの固ゆで卵の経口摂取後、および抗生物質前後のｄ９−ホスファチジルコリンの、ヒト２４時間のＴＭＡＯ尿中レベルを示す。

〔定義〕
本明細書において、「心血管系疾患」（ＣＶＤ）または「心血管系障害」という用語は、身体の心臓、心臓弁および血管系（たとえば、動脈および静脈）に影響を与える多くの状態を分類するために用いられる用語であり、限定されないが、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、急性冠症候群、狭心症、うっ血性心不全、大動脈瘤、大動脈解離、腸骨動脈瘤または大腿動脈瘤、肺塞栓症、原発性高血圧症、心房細動、脳卒中、一過性脳虚血発作、収縮機能障害、拡張機能障害、心筋炎、心房性頻脈、心室細動、心内膜炎、動脈症、血管炎、アテローム動脈硬化性プラーク、不安定プラーク、急性冠症候群、急性虚血性発作、突然心臓死、末梢血管障害、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）および脳血管疾患を含む疾患および状態を包含する。

本明細書において、「アテローム動脈硬化性心血管系疾患」または「障害」は、限定されないが、ＣＡＤ、ＰＡＤ、脳血管疾患を含む、心血管系疾患の特定のタイプの構成要素または前駆体としてアテローム動脈硬化症を含む心血管系疾患のサブセットを指す。アテローム性動脈硬化症は、動脈血管の壁に発生する慢性炎症応答である。アテローム性動脈硬化症は、動脈が狭まる（狭窄）ことをもたらすアテローム性のプラークの形成を引き起こし、最終的に、動脈の解放部の部分的または完全な閉鎖および／またはプラークの破裂をもたらす。ゆえに、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性障害は、アテローム性プラークの形成および破裂という結果を含み、そのような結果には、限定されないが、動脈の狭窄または狭小化、心不全、動脈瘤形成（大動脈瘤を含む）、大動脈解離および心筋梗塞もしくは脳卒中等の虚血性事象が含まれる。

本明細書において、心血管系事象とは、対象に、たとえば突然の心臓死または急性冠不全症候群（限定されないが、心筋梗塞、不安定狭心症、動脈瘤または脳卒中が含まれる）等の心血管系疾患によりもたらされる、有害な状態の兆候を指す。「心血管系事象」という用語は、本明細書において、心血管系合併症と相互交換可能に用いることができる。心血管系事象は急性疾患である一方で、従前に検出された疾患が、対象の健康を著しく脅かすことを示すポイントまで悪くなっていること（たとえば、従前に発見されている動脈瘤の拡大または生命の危機レベルにまで上昇した高血圧等）もまた、表すことができる。

本明細書において、「診断」という用語は、対象における疾患の性質を決定すること、ならびに疾患の重篤度および推定転帰、または症状の発現および／もしくは回復の予測（予後診断）を決定することを包含する。「診断」はまた、合理的な治療法との関連における診断を包含し、診断は、治療法の初期選択、治療法の変更（たとえば、用量および／もしくは投薬計画、または推奨されるライフスタイルの変化）等を含む治療法の指針となる。

「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において相互交換可能に用いられ、一般に、限定されないが、霊長類（類人猿およびヒトを含む）、ウマ科（たとえば、馬）、イヌ科（たとえば、犬）、ネコ科、様々な家畜（たとえば、イノシシ属の動物、ブタ、山羊、ヒツジ等の有蹄動物）ならびに家庭内ペットおよび動物園で維持される動物を含む哺乳類を指す。一部の実施形態において、対象は、特にヒト対象である。

〔発明を実施するための形態〕
本発明は、心血管系疾患を発症するリスクのあるまたは有する対象を治療するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態において、３，３−ジメチル−１−ブタノール（ジメチルブタノール、ＤＭＢとしてもまた知られる。コリンの窒素原子が炭素に置換されているコリンのアナログ（図１を参照のこと））が対象に投与される。一部の実施形態において、本発明は、心血管系疾患を発症するリスクのあるまたは有する対象に、ＤＭＢを投与することを提供する。一部の実施形態において、治療効果を有する量のＤＭＢ、ＤＭＢを含有する化合物、ＤＭＢ関連化合物および／またはそれらの誘導体をＣＶＤの治療および／または予防のために対象に投与する。一部の実施形態において、ＤＭＢ、ＤＭＢを含有する化合物、ＤＭＢ関連化合物および／またはそれらの誘導体を、ＣＶＤに対して受容されている治療の一つ以上と併せて、対象に共に投与する。ある実施形態において、腸内細菌叢を標的とする抗生物質が、ＣＶＤおよび／または血栓症を治療または予防するために対象に投与される。

本発明は、任意の特定の作用機序に限定されないし、作用機序の理解は本発明の実施に必要ではないが、対象（たとえば、ヒト対象、実験動物対象等）に投与される際、ＤＭＢは、コリン輸送を損なうプレバイオティックとして機能し、ゆえに、血漿中のトリメチルアミン（たとえば、ＴＭＡＯ）レベルを減少させることができる。一部の実施形態において、ＤＭＢ投与は、ＴＭＡレベルの減少をもたらす。一部の実施形態において、ＤＭＢ投与は、ＴＭＡＯレベルの減少をもたらす。一部の実施対応において、ＤＭＢ投与により、トリメチルアミン（たとえば、ＴＭＡＯ）が関連する、または原因となっている状態および／または疾患（たとえば、ＣＶＤ，炎症性疾患（たとえば関節リウマチ））が治療および／または予防される。トリメチルアミンは、炎症状態で増加し、マクロファージの活性を静止状態から活性型へと調節する。一部の実施形態において、ＤＭＢは、炎症性疾患（たとえば、ＣＶＤ、関節リウマチ等）に対する治療として投与される。

一部の実施形態において、ＣＶＤのリスクのある対象、ＣＶＤを有する疑いのある対象またはＣＶＤに罹患している対象へのＤＭＢ、ＤＭＢ含有化合物、ＤＭＢ関連化合物および／またはそれらの誘導体の投与は、ＣＶＤに対するマーカーおよびリスクファクター（たとえば、総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＴＭＡＯ等）の一つ以上の改善をもたらす。一部の実施形態において、ＤＭＢ、ＤＭＢ含有化合物、ＤＭＢ関連化合物および／またはそれらの誘導体の、ＣＶＤのリスクがある対象、ＣＶＤを有する疑いのある対象またはＣＶＤに罹患している対象への投与は、大動脈プラーク形成の減少、総コレステロールの減少、血中トリグリセリドレベルの減少、血中ＬＤＬレベルの減少、血中ＨＤＬレベルの上昇、泡沫細胞の産生および／または数の減少、ＴＭＡ（例えば、ＴＭＡＯ）産生（たとえば、コリン由来）の減少、微生物叢が触媒するＴＭＡ（たとえば、ＴＭＡＯ）産生の減少、およびＣＶＤの他の指標および／またはリスクファクターの変化のうちの一つ以上をもたらす。

一部の実施形態において、ＤＭＢ、ＤＭＢ含有化合物、ＤＭＢ関連化合物、および／またはそれらの誘導体の投与は、限定されないが、アルツハイマー病、関節炎（たとえば、関節リウマチ）、喘息、ＣＶＤ（たとえば、アテローム性動脈硬化症）、クローン病、結腸炎、皮膚炎、憩室炎、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、エリテマトーデス、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎等を含む炎症性疾患の一つ以上に対する治療（たとえば、苦痛緩和的、予防的、治療的等の）を提供する。一部の実施形態において、ＤＭＢ、ＤＭＢ含有化合物、ＤＭＢ関連化合物および／またはそれらの誘導体の投与は、限定されないが、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心筋症、うっ血性心不全、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、頸動脈疾患、心内膜炎、心臓発作（たとえば、冠状動脈血栓症、心筋梗塞（ＭＩ））、高血圧／高血圧症、高コレステロール血症／脂質異常症、僧房弁逸脱、末梢動脈障害（ＰＡＤ）、脳卒中等を含む、心血管系疾患の一つ以上に対する治療（たとえば、苦痛緩和的、予防的、治療的等の）を提供する。

一部の実施形態において、ＤＭＢは、過剰なコリン（たとえば、過剰な食品中のコリン）が関連する（たとえば、原因となる）心血管系疾患および／または炎症線疾患に対する治療（たとえば、苦痛緩和的、予防的、治療的等）を提供する。一部の実施形態において、ＤＭＢは、過剰なトリメチルアミン（たとえば、ＴＭＡＯ、コリン誘導性ＴＭＡ等）が関連する（たとえば、原因となる）疾患、状態および／または障害に対する治療（たとえば、苦痛緩和的、予防的、治療的等）を提供する。一部の実施形態において、ＤＭＢは、トリメチルアミン（たとえば、ＴＭＡＯ、コリン誘導性ＴＭＡ等）が関連する（たとえば、原因となる）疾患、状態および／または障害に対する治療（たとえば、苦痛緩和的、予防的、治療的等）を提供する。一部の実施形態において、ＤＭＢは、過剰なトリメチルアミン（たとえば、ＴＭＡＯ、コリン誘導性ＴＭＡ等）が関連する（たとえば、原因となる）疾患、状態および／または障害に対する治療（たとえば、苦痛緩和的、予防的、治療的等）を提供する。一部の実施形態において、コリンのＴＭＡ（たとえば、ＴＭＡＯ）への転換を阻害するＤＭＢ関連化合物および／またはその誘導体は、疾患に対する治療を提供する。一部の実施形態において、コリン輸送を阻害するＤＭＢ関連化合物、およびその誘導体は、疾患に対する治療を提供する。一部の実施形態において、ＤＭＢ関連化合物および／またはその誘導体は、ＣＶＤおよび／または任意のメカニズムによる他の炎症性疾患のリスクを減少させる。

本発明の一部の実施形態において、組成物は、単独で、または他の治療、薬剤、サプリメントおよび／または特定の食事と組み合わせて、または賦形剤（複数を含む）もしくは他の薬学的に受容可能な担体と混合された医薬組成物として患者に投与される。投与の目的（たとえば、状態の重篤度、治療期間等）次第で、組成物（たとえば、ＤＭＢを含有する）は、処方され、全身または局所的に投与され得る。処方および投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ， Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．）の最新版で見つけることができる。適切な経路には、たとえば、経口または経粘膜投与、ならびに非経口送達（筋肉内、皮下、髄内、くも膜下、脳室内、静脈内、腹腔内または経鼻投与を含む）が挙げられる。一部の実施形態において、ＤＭＢは、固形、半固形または液体の剤型（たとえば、所望の治療プロファイルを提供するために適切に製剤された錠剤、カプセル、丸薬、粉末、座薬、溶液、エリキシル剤、シロップ、懸濁液、クリーム、トローチ剤、ペーストおよびスプレー等）の形態で投与され得る。当業者であれば分かるように、選択された投与経路次第で、組成物の形態は選択される。

一部の実施形態において、医薬組成物（たとえば、ＤＭＢ含有）は、単回または複数回投与で投与される。一部の実施形態において、医薬組成物（たとえば、ＤＭＢ含有）は、単回投与で投与される。一部の実施形態において、単回経口丸剤またはカプセルは、医薬組成物（たとえば、ＤＭＢ含有）および一つ以上の追加の薬剤を含んで提供される。一部の実施形態において、カプセルは放出する形態（たとえば、即時放出、徐放、遅延放出等）で、医薬組成物（たとえば、ＤＭＢ含有）を含んで用いられる。特定の投与経路および投薬計画は、治療される個体の状態、および当該個体の治療への応答に合わせて、当業者により決定される。一部の実施形態において、本発明の組成物の置換が、任意の適切な技術により、所望の溶解度または投与の他の特性を提供するために調整され得る。

ＤＭＢは、窒素原子の炭素原子への置換によりＣ−Ｎ結合を欠く以外は、コリンに構造的に類似している（図２を参照のこと）。そのため、本発明は、同じような窒素から炭素への置換によりＣ−Ｎ結合を欠くように改変されたコリン誘導体（たとえば、欧州特許第０１５５８２５号および米国特許出願公開第２００６０２０５８５号を参照のこと。参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）の使用を企図する。

ある実施形態において、血小板凝集テストが（たとえば、患者の血小板が、ＣＶＤまたは血栓症リスクの増加を導く過剰反応性であるかどうかを決定するために）実施される。血小板凝集テストまたは機能テストは、血液試料中で血小板が凝集し、凝固を促進させる能力を計測する設備を使用する分析の一群である。血小板機能を測定するために用いられる、様々なテストがあり、以下に記載する。

分析の１種は、閉鎖時間分析（ｃｌｏｓｕｒｅ ｔｉｍｅ ａｓｓａｙ）と呼ばれる。この分析では、血小板を活性化させる様々な物質に血液を暴露させる。次いで、血液は、コラーゲン（傷への血小板の結合を促進するタンパク質）でコートされた小さな管の、傷を真似た小さな穴を通って引き抜かれる。正常な血液では、活性化された血小板はコートされた穴に結合し、最終的にはそれをふさいでしまう。穴をふさぐまでに要する時間を計測し、これを閉鎖時間と呼ぶ。閉鎖時間が長いほど、血小板機能は低いということになる。このテストは、血小板数が低い場合や、血小板機能が減少している場合、血小板機能に必要な他のタンパク質が減少している場合、または抗血小板薬剤が存在している場合には、異常値となりうる。

他の分析のタイプには、粘弾性測定分析（ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ）と呼ばれるものがある。この分析タイプは、血液凝固が形成されるときの血液凝固の強度を測定するために設計されている。経時的に凝固の強度を測定しながら、血液に物質を加えて凝固を開始させる。測定値は、総凝固強度、最大強度に達する時間、および経時的な強度の減少からなる。これらのテストは、血小板数が低い場合、血小板機能が減少している場合、または抗血小板薬剤が存在している場合に、異常値となりうる。

他の分析のタイプには、エンドポイントビーズ（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｂｅａｄ）またはエンドポイント血小板凝集分析がある。これらの分析は、物質を加え血小板を活性化した後に凝集するコートされたビーズの数または血小板の数を測定する。それらは、経時的な凝集測定よりも、単一の凝集測定（エンドポイント）を提供する。より多くの血小板凝集またはビーズへの付着があれば、血小板機能が良いことを示す。これらのテストは、血小板数が低い場合、血小板機能が減少している場合、または抗血小板薬剤が存在している場合に、異常値となりうる。

他の分析のタイプには、出血時間分析と呼ばれるものがある。従来、血小板機能障害に対する初期スクリーニングは、出血時間であり、このテストは、２つの小さく、浅く、標準化された内側前腕上の傷口を作り、出血が止まるまでにかかる時間を測定することを含む。

他の分析のタイプには、血小板凝集能分析がある。傷口にあるタンパク質、他の活性化血小板から放出される因子、および出血を止めるための強固な栓を血小板が形成するのに役立つ凝固システムにより産生される因子を含む、多くの異なる物質が血小板を活性化することができる。多くの様々な血小板異常が、これらの活性化システムの一つ以上の問題に起因して報告されている。血小板凝集能分析は、一般に、４〜８の分離されたテストで構成される。それぞれのテストにおいて、異なる血小板活性化物質が血液に加えられ、次いで、数分間以上、血小板凝集測定が行われる。完了したとき、医師または技師が、テストパネル全体を見直して解釈し、異常な血小板機能のなんらかの証拠があるかどうか、決定する。

さらなる分析は、フローサイトメトリーに基づいている。フローサイトメトリーを用いて、血小板を、機能的欠陥について評価することができる。このテストはレーザーを用いて、血小板の表面上に存在するタンパク質、および血小板が活性化された際に、それらがどのように変化するかを測定する。

さらなる分析は、ｉｎ ｖｉｖｏの血栓症発生率に基づいている。生きている生物体内での血小板の活性化は、特定の刺激への応答で評価することができ、たとえば血管内の血流および血栓（血小板の血餅）の成長をリアルタイムで直接、撮像する生体顕微鏡等で観測することができる。

ある実施形態において、抗生物質（たとえば、腸内細菌叢を標的とする抗生物質）が、本発明の方法に用いられる。本発明は、使用する抗生物質のタイプに限定されない。そのような抗生物質製剤の例として、限定されないが、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ポリペプチド、ポリミキシン、キノロン、スルホンアミド、テトラサイクリンおよびその他（たとえば、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、ピラジナミド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、リファンピシン（米国ではリファンピン）、チアンフェニコール、チミダゾール、ダプソンおよびクロファジミン）が挙げられる。これらの抗生物質類の例として、限定されないが、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチンまたはセファロシン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、アズトレオナム、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、マフェニド、スルホンアミドクリソイジン（原型）、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメチゾール、スルファニリミド（原型）、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム、リメトプリム−スルファメトキサゾール（コ・トリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、デメクロシクリン、ドキシシクリン、ミノシクリン、オキシテトラサイクリンおよびテトラサイクリンが挙げられる。

〔実施例〕
〔実施例１〕 ファオファチジルコリン代謝の構造特異性
実験は、本発明の実施形態の開発中に行われ、内在性泡沫細胞形成により観察される、アテローム生成促進マクロファージ表現型の促進における、ファオファチジルコリン代謝の構造特異性を検証した。離乳期のＣ５７ＢＬ／６Ｊ．Ａｐｏｅ−／−マウスを通常の固形飼料（対照）、またはコリン、ＴＭＡＯもしくはコリンアナログＤＭＢ（コリンの第四級アミン窒素が炭素に置換されている（図２右を参照のこと））のいずれかを補給された通常の固形飼料を与えた。ＤＭＢは、ゆえに、潜在的な開裂に対するＣ−Ｎ結合が無く、腸内細菌叢によるＴＭＡ形成が無いことを除き、コリンと構造的に同一である。トリメチルアミン類（コリンまたはＴＭＡＯ）のいずれかが補給された食事を与えられたマウスは、マクロファージコレステロール含有量の増加およびＴＭＡＯの血漿レベルの上昇の両方を示した。反対に、食品中のＤＭＢ補給は、ＴＭＡＯの増加をもたらさず、内在性マクロファージ中のコレステロール蓄積の増加ももたらさなかった。

〔実施例２〕 アテローム性動脈硬化症へのＤＭＢの効果
実験は、本発明の実施形態の開発中に行われ、高コリンの食事（たとえば、洋風の食事）により、アテローム性動脈硬化の増加がもたらされ、ＤＭＢ化合物の添加により食事誘導性のアテローム性動脈硬化の増加が阻害されることが示された。離乳期（４週齢）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ．Ａｐｏｅ−／−のオスのマウスに、１．３％コリンを補給した固形飼料、１．３％ＤＭＢを補給した固形飼料、その両方を補給した固形飼料、またはいずれも補給しない固形飼料を与えた。大動脈基部の切片を、オイルレッドＯ／ヘマトキシンで染色した。大動脈内側でレッドオイルに染色される領域は、病変プラークを示す（図３および４を参照のこと）。ＤＭＢを添加した通常の固形飼料により、ａｐｏＥ−／−マウスにおける大動脈プラークの形成が有意に減少した（約９０％）（図４を参照のこと）。さらに、コリンの添加により、高コリン食品により誘導されたアテローム性プラークの増加が完全に阻害された（図４を参照のこと）。これらのデータは、ＤＭＢが、大動脈プラーク形成を減少する能力を有すること、および高コリン食品により誘導されたプラーク形成を食い止める能力を有することを示す。これらのデータはさらに、ＤＭＡがプラーク形成およびアテローム性動脈硬化に関する心臓疾患の予防および／または治療に対する療法を提供しうることを示している。

〔実施例３〕 リポタンパク質プロファイルにおけるＤＭＢの効果
実験は、本発明の実施形態の開発中に行われ、固形飼料または１．３%コリン、１．３％ＤＭＢもしくはその両方を補給された固形飼料を与えられたマウスにおける、（１）コレステロール、（２）トリグリセリド、低密度リポタンパク質−コレステロール、およびＨＤＬコレステロールの血漿中レベルを比較した（図５を参照のこと）。マウスの食事にＤＭＢを添加すると、マウスのアテローム性リポタンパク質プロファイルが改善され、アテローム性コレステロールレベル（総コレステロール、低密度リポタンパク質およびトリグリセリド）が有意に減少し、高密度リポタンパク質が有意に増加した。

〔実施例４〕 コレステロール蓄積および泡沫細胞形成におけるＤＭＢの効果
実験は、本発明の実施形態の開発中に行われ、コレステロール蓄積および泡沫細胞形成におけるＤＭＢ添加の効果を検証した。離乳期（４週齢）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ．Ａｐｏｅ−／−のオスのマウスに、１．３％コリン、１．３％ＤＭＢ、もしくはその両方を補給した固形飼料またはいずれも補給しない固形飼料を与えた。腹膜マクロファージを回収し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、オイルレッドＯ／ヘマトキシンで染色した。ＤＭＢの添加により、高コリン食品により誘導されたコレステロール蓄積および泡沫細胞の形成が食い止められた（図６を参照のこと）。

〔実施例５〕 総コレステロールにおけるＤＭＢの効果
実験は、本発明の実施形態の開発中に行われ、腹膜マウスマクロファージにおける総コレステロールレベルにおけるＤＭＢの効果を測定した（図７を参照のこと）。離乳期（４週齢）のＣ５７ＢＬ／６Ｊ．Ａｐｏｅ−／−のオスのマウスに、１．３％コリン、１．３％ＤＭＢ、もしくはその両方を補給した固形飼料またはいずれも補給しない固形飼料を与えた。細胞の総コレステロールを安定同位体希釈ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量化した。細胞数は、細胞溶解物中のタンパク質含量により定量化した。高コリン食品により誘導されたマクロファージコレステロール含有量の顕著な増加は、ＤＭＢの添加により阻害された（図７を参照のこと）。これらのデータにより、高コリン食品により誘導される泡沫細胞の形成が減少することを示す。

〔実施例６〕 トリメチルアミン産生におけるＤＭＢの効果
実験は、本発明の実施対応の開発中に行われ、腸内微生物叢が触媒する、コリンからトリメチルアミンの産生におけるＤＭＢの効果を検証した。マウスの盲腸を、腸内微生物叢の原料としてホモジナイズした。Ｄ９‐コリンを基質として用いて、ｄ０−ＴＭＡの産生を、安定同位体希釈ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量化した。ＤＭＢの添加により、腸内細菌叢が介在するコリンのＴＭＡへの異化が著しく阻害された（図８を参照のこと）。

〔実施例７〕 ＤＭＢおよび抗生物質が、ＴＭＡＯ産生および血小板凝集を阻害する。

実験は、本発明の実施形態の開発中に行われ、腸内細菌叢が介在するＴＭＡＯ産生の抑制、および血小板凝集の抑制における、ＤＭＢおよび抗生物質の効果を検証した。

１）ＤＭＢおよび抗生物質が、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＭＡおよびＴＭＡＯの形成を阻害することの実証。

６週齢のメスのマウスに、図９に示される、指定食＋／−（固形飼料、固形飼料＋抗生物質（ＡＢＳ；０．５ｇ／Ｌのバンコマイシン、１ｇ／Ｌの硫酸ネオマイシン、１ｇ／Ｌメトロニダゾール、および１ｇ／Ｌアンピシリン））、ＴＭＡＯ、ＣＨ（１．０％ ｗｔ／ｗｔコリンを補給された固形飼料）、ＣＨおよびＡＢＳ、およびＣＨ＋ＤＭＢを含む）を与えた。マウスに、これらの食事を６週齢で与え、３週間、この食事を維持した。次いで、血漿を回収し、ＴＭＡおよびＴＭＡＯの両方を、安定同位体希釈ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定した。コリンに富む食事（洋風の食事に似ている）は、血漿中のＴＭＡおよびＴＭＡＯレベルの増加をもたらすことに注意されたい。図９において、広域スペクトラム経口抗生物質での腸内細菌叢の抑制により、ＴＭＡおよびＴＭＡＯ産生が阻害され、ＴＭＡおよびＴＭＡＯの形成に腸内細菌叢を必要とすることを確認したことを示す。ＤＭＢが、高コリン食品を与えられたマウスにおけるＴＭＡおよびＴＭＡＯ形成を阻害することを、図９においてさらに示す。

２）高コリン食品が、ｅｘ ｖｉｖｏで血小板凝集を増強し、食品中のコリンを介した血小板過剰反応性は、経口抗生物質での腸内細菌叢の抑制により阻害される。

この実施例において、離乳期のマウスに、通常食または高コリン食品のいずれかを与えた。数週間の後、全血を除去し、血小板を単離した。次いで、血小板の準最大アゴニストであるＡＤＰの、血小板凝集を引き起こす能力を、測定した。平衡して、ＴＭＡＯの血漿レベルを、確立された安定同位体希釈ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により測定した。高コリン食品を与えられた動物は、ＴＭＡＯの血漿レベルを増強させた（図１０Ａに示す）。重要なのは、これらの動物由来の血小板は、血小板凝集応答の著しい増強もまた示すことである。これは、高コリン食品を与えられたマウスにおける、血栓形成促進の表現型の明らかな兆候である。同様の研究において、腸内微生物叢の抑制および血漿ＴＭＡＯレベルの減少のために、高コリンを与えられたマウスに、広域スペクトラムの抗生物質のカクテルをさらに与えた（上述およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２０１１， Ａｐｒｉｌ， ４７２（７３４１）：５７−６３に記載。すべての目的に対し、参照によりその全体が援用される）。図１０Ｂにおいて示されるように、血漿ＴＭＡＯの抑制は、高コリン食品誘導性の血小板凝集の増加を著しく減少させる。これらのデータにより、食品依存性ＴＭＡＯ産生を減少することができる薬剤は、血小板過剰反応性を減少させる抗血栓症薬となりうることが示される。そのような薬剤（たとえば、ＤＭＢまたは抗生物質）は、過剰な出血（たとえば、クロピドグレルまたはワーファリンのような市販の抗血栓症薬のように）を誘発しないはずであるため、魅力的である。すなわち、ＴＭＡＯは血小板の機能のみを増強し、ＴＭＡＯレベルの減少（ＤＭＢ、抗生物質または一部の他の薬剤もしくは方法でのような（それが機能性食品であれ、プロバイオティックであれまたはプレバイオティックであれ））は、ｉｎ ｖｉｖｏの血栓症を減少するが、「正常な」機能以下には下げず、ゆえに、出血のリスクは上昇しない。

３）腸内細菌叢酵素の阻害剤ＤＭＢは、食品中のコリンで誘導される血小板過剰反応性を阻害する。

今回、マウス群のうちの一つは、コリンを補給された食事を与えられ、ＤＭＢを与えられた以外は、上記の２）で記述されたものと同様の実験デザインを用いた。図１１Ａにおいて、高コリン食品を与えられた動物が、血漿ＴＭＡＯレベルを増強したことが示され、図１１Ｂにおいて、ＤＭＢが、マウスにおいてＴＭＡＯ形成を阻害し、血小板過剰反応性もまた著しく減少させることを示す。

４）ＴＭＡＯ形成の主な要因となる腸内細菌叢の酵素を標的とすることにより、食品中のコリンからの血小板過剰反応性を抑制する。

図１２に、上記マウス群からのデータを要約する。図１２は、血小板凝集応答対指定された食事および処置（ＤＭＢまたは抗生物質による細菌叢の抑制）の最大振幅をプロットしている。要約すると、図１２において、高コリン食品または内在性ＴＭＡＯからの血小板過剰反応性（凝集）が、ＤＭＢ添加により阻害されることを示している。図１２において、抗生物質での細菌叢の抑制は、ＴＭＡＯ形成を阻害し、さらに食品誘導性の血小板凝集の増強を阻害するため、損傷を受けていない腸内細菌叢が存在する場合でのみ、高コリン食品は、血小板凝集比率を増強することを示している。図１２においてさらに、ＴＭＡＯを直接補給した食品が、血小板凝集の増強を促進することを示す。

５）食品中のコリンの腸内細菌叢依存性の代謝物であるＴＭＡＯが、アテローム性動脈硬化症の傾向を有するＡｐｏＥ−／−マウスにおいて、血栓症発生率をｉｎ ｖｉｖｏで増強する。

この実施例において、ｉｎ ｖｉｖｏでの頸動脈血栓症の比率を、図１３において指定されるマウス群で、生体顕微鏡を用いて測定した。マウスは、指定された食事＋／−ＡＢＳを３週間、与えられた。抗生物質での細菌叢の抑制は、ＴＭＡＯ形成を阻害し、さらに食品誘導性のｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率の増強を阻害するため、損傷を受けていない腸内細菌叢が存在する場合でのみ、高コリン食品は、ＴＭＡＯを産生し、ｉｎ ｖｉｖｏの血栓症発生率を促進することに注意されたい。また、ＴＭＡＯを直接補給した食品が、ｉｎ ｖｉｖｏの加速した血栓症発生率を促進することにも、注意されたい。

図１３に示されるデータは、ＴＭＡＯ形成の阻害が、血栓症発生率の減少をもたらすはずであることを示唆している。これらの研究は、様々な指定食品を与えたマウスからのｅｘ ｖｉｖｏ血小板凝集研究で以前に見られた結果を、ｉｎ ｖｉｖｏにまで拡大させる。頸動脈の血流停止までの時間により測定されたように、高コリン食品は、ｉｎ ｖｉｖｏの血栓症発生率を増強することに注意されたい。短時間であるほど、血小板凝集が早いことを示す（増強されたｉｎ ｖｉｖｏ血栓症）。

６）食品性コリンの腸内細菌叢依存性の代謝物であるＴＭＡＯが、野生型マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率を増強する。

この実施例は、野生型のマウスを使用することを除き、すぐ前に前述の研究を繰り返すものである。結果は図１４に示す。図１４は、野生型マウスにおけるＴＭＡＯ形成の阻害が、血栓症発生率の減少をもたらすことを示している。ＴＭＡＯ由来の血小板活性化の増強効果を有するには、必ずしも脂質異常症である必要はないことを示すため、これは非常に重要なことである。

７）ＤＭＢは、野生型マウスにおいて、ＴＭＡＯ介在性のｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率の増強を阻害する。

頸動脈のｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率を、図１５に示す指定マウス群で、生体顕微鏡を用いて測定した。マウスは、指定された食事＋／−ＡＢＳまたはＤＭＢを３週間、与えられた。図１５は、抗生物質またはＤＭＢのいずれかの存在対非存在におけるマウスのｉｎ ｖｉｖｏ血栓症データの要約を示す。図１５は、ＤＭＢおよび抗生物質が、高コリン食品で見られるｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率の減少を阻害し、ＴＭＡＯレベルもまた阻害することを示す。

〔実施例８〕 ホスファチジルコリンの腸内細菌叢代謝は、主要心臓有害事象リスクの前兆となる。

この実施例は、ホスファチジルコリンの腸内細菌叢代謝は、主要心臓有害事象リスクの前兆となること、および抗生物質を用いてそのような腸内細菌叢代謝を抑制することができること（ゆえに、心臓事象を防ぐために用いられうること）を示す実施実験を記述する。

方法
研究患者および研究デザイン
この実施例において、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより承認された２つのプロスペクティブ研究を記述する。全ての参加者は、書面でインフォームドコンセントを提出した。最初の研究は、慢性疾患または末端器官の機能不全（心不全、腎不全、肺疾患または血液病の既往歴を含む）が無い健康で、活性化された感染症または抗生物質の摂取が無く、プロバイオティクスを使用していない１8歳以上のボランティアのコホート（Ｎ＝４０）を説明する。Ｖｉｓｉｔ１の間、対象は食品中の「ホスファチジルコリン（ＰＣ）のチャレンジ」（下記参照）を受けた。彼らのうち、６人がメトロニダゾール５００ｍｇを一日２回とシプロフロキサシン５００ｍｇを１日１回、１週間与えられ、抗生物質の後、繰り返しＰＣチャレンジを受けた（Ｖｉｓｉｔ２）。三番目および最後のＰＣチャレンジは、抗生物質の投与停止および腸内細菌叢の再獲得の１か月以上後に実施された（Ｖｉｓｉｔ３）。

２番目の研究は、急性冠不全症候群の兆候がなく、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）が０．０３μｇ／Ｌ未満である、選択的診断心臓カテーテル検査を受けている、１８歳以上の４００７人の安定した成人対象から構成される。ＣＶＤは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患、冠動脈もしくは末梢動脈血行再建術、冠動脈造影の間に一つ以上の血管で５０％超の狭窄、または心筋梗塞（ＭＩ）もしくは脳卒中のいずれかの、実証された既往歴として定義された。クレアチニンクリアランスは、Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ式により推定された。ルーチンの実験テストは、ミエロペルオキシダーゼを除き、Ａｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）で測定され、ミエロペルオキシダーゼは、ＣａｒｄｉｏＭＰＯテスト（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｈｅａｒｔ Ｌａｂｓ， Ｉｎｃ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて測定された。たとえば、全死因の死亡率、非致死的なＭＩまたは非致死的な脳卒中等の、ＭＡＣＥ（主要心臓有害事象）を含む、裁定結果は、すべての対象に対し、登録後の引き続く３年以上で確定された。

食品中のホスファチジルコリンチャレンジ
簡単な食品中のＰＣ／コリンのチャレンジテストが、標準医療用アイソトープとして、摂取可能な重水素で標識された、トレーサレベルのＰＣ（ｄ９−トリメチル−塩化ジパルミトイルホスファチジルコリン［ｄ９−ＰＣ］）とともに、既存のＰＣ源の形態で対象に提供された（治験薬適用免除のもと）。「ＰＣチャレンジ」のそれぞれは、一晩（１２時間）の空腹後のベースラインでの採血および無作為のランダム尿採取から構成される。ベースラインでは、対象は、ゼラチンカプセルに入った５０ｍｇのｄ９−ＰＣと一緒に、黄身を含む２つの固ゆで卵（大型サイズ）（それぞれ、約２５０ｍｇの総コリンと推定される）を提供され、１０分以内に食べた。２４時間の尿採取とともに、静脈血の連続サンプリングが、１，２，３，４，６および８時間の時点で実施された。提供された高精製ｄ９（トリメチル）−ＰＣ（＞９８％アイソトープ濃縮）は、ｄ３−ヨウ化メチル（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ， Ａｎｄｏｖｅｒ ＭＡ）で完全メチル化後、１−パルミトイル、２−パルミトイル、ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンから合成された。ｄ９−ＰＣは、分取薄層クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにより単離され、結晶化および真空乾燥され、その精製度（＞９９％）は多核ＮＭＲおよび質量分析により確認された。

コリン代謝物の測定
分析された血漿アリコートは、採取された全血からエチレンジアミン四酢酸チューブへ単離され、処理されるまで４時間以内、０〜４℃に維持され、−８０℃に保存された。２４時間尿採取からのアリコートは、回転させて任意の潜在的な細胞残渣を沈殿させ、上清を分析まで−８０℃で保存した。ＴＭＡＯ、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、コリン、ベタインおよびそれらのｄ９−同位体物は、最近に記述されたように、内部標準としてｄ４（１，１，２，２）−コリン、ｄ３（メチル）‐ＴＭＡＯおよびｄ３（メチル）−ＴＭＡを用いて、オンラインエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）法で安定同位体希釈ＨＰＬＣを用いて定量化された^１０。血漿中のＴＭＡの測定のために、−８０℃で保存する前に、試料を酸性化した（最終濃度１０ｍＭの塩酸）。尿中のＴＭＡＯ濃度は、尿クレアチニン濃度の分析により、尿希釈に応じて調整された。

統計分析
群間の差異を検証するために、連続変数に対するスチューデントｔ検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定、ならびにカテゴリー変数に対するカイ二乗検定が用いられた。血漿ＴＭＡＯレベルは、分析のために四分位に分けられた。イベントまでの時間分析のために、Ｃｏｘ比例危険回帰分析とカプランマイヤー分析を用いて、ＭＡＣＥに対する危険率（ＨＲ）および９５％信頼区間（９５％ＣＩ）が決定された。年齢、性別、収縮期血圧、糖尿病の既往歴、低密度および高密度リポタンパク質コレステロール、トリグリセリド、喫煙歴、プラスＢＭＩ、薬物治療、推定クレアチニンクレアランスならびに血漿ｈｓＣＲＰレベルを含む、従来の心臓リスクファクターに対する調整により、ロジスティック回帰分析を実施した。ＴＭＡＯの含有により導入されたモデルパフォーマンスの改善が、正味再分類改善（ＮＲＩ）インデックスを用いて評価された。ｃ−統計が、ＲＯＣ曲線下の領域を用いて算出された。ＭＡＣＥ事象の３年予測確率が、Ｃｏｘモデルから推定された。すべての分析は、Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．８．０（Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて実施された。Ｐ値＜０．０５（両側）は統計的有意差があるとみなした。

結果
ＴＭＡＯは、ヒトにおける食品中のＰＣの代謝物であり、腸内細菌叢は、ＴＭＡＯ形成において必須の役割を果たす。

ヒトにおける食品中のＰＣ消化の主な経路は、すい臓リパーゼを介するものであり、すい臓リパーゼは腸管腔内に分泌され、リン脂質からの脂肪酸の開裂を促進し、すぐにグリセロホスホコリンおよび遊離脂肪酸の両方が吸収される^{１６，１７}。近年の、無菌マウスおよびコンベンショナルマウスにおける同位体トレーサ研究により、げっ歯類における食品中のＰＣ（およびコリン）に対する定量的にマイナーな代謝経路が、最終的にはＴＭＡＯ（その産生に腸内細菌叢を要するアテローム生成促進代謝物）を産生することが示された^１０。ヒトにおいて、ＴＭＡＯ産生に腸内細菌叢が必要かどうかは、まだ判明していない。ゆえに、最初の研究において、対象においてＴＭＡＯが食品中のＰＣに由来するかどうか、もしそうであるならば、ＴＭＡＯの形成に腸内細菌叢が必要かどうかを測定するよう努力がなされた。卵の黄身は、食品中のＰＣ源として知られている。ＰＣチャレンジに続き、標識していないＴＭＡＯ、コリンおよびベタインがベースラインで空腹時血漿中に存在しており（図１６ｃ）、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで観察されるように、ＴＭＡＯおよびｄ９−ＴＭＡＯの両方が、ＰＣ／ｄ９−ＰＣ摂取後の血漿中に容易に検出された（図１６ａ、ｂ）。ＴＭＡＯの天然同位体（図１６ｄ）およびｄ９−トレーサ形態（図１６ｃ）の両方、コリンならびにベタインにおいてもまた、時間依存性の増加が食後に観察された。「ＰＣチャレンジ」後の、２４時間尿試料の検査により、ＴＭＡＯおよびｄ９−ＴＭＡＯの存在が同様に見られた（図１９）。健康な対象コホート（ｎ＝４０）において、血漿および尿ＴＭＡＯ絶対濃度（Ｓｐｅａｒｍａｎのｒ＝０．５８，ｐ＜０．００１）の間で、ならびに血漿および尿ＴＭＡＯ／クレアチニン比（Ｓｐｅａｒｍａｎのｒ＝０．９１、ｐ＜０．００１）の間で、強い相関性が観察された。珍しいことに、経口広域スペクトラム抗生物質を１週間、摂取することによる腸内細菌叢の抑制、同様に、ＰＣチャレンジ後のいずれか血漿中のＴＭＡＯまたはｄ９−ＴＭＡＯのいずれか（図１６、中央（Ｖｉｓｉｔ２））、または２４時間尿採集（図１９）もまた、空腹時血漿中の検出可能なＴＭＡＯの完全な抑制をもたらした。並行分析において、血漿ＴＭＡおよびｄ９−ＴＭＡの食事後の増加が、ｖｉｓｉｔ１でのＰＣチャレンジ後に観察されたが、抗生物質の投与後に、検出不可能なレベルにまで完全に抑制された。対照的に、遊離コリンまたはベタイン（天然存在物およびｄ９−同位体物）における食事後変化に対する継時的変化は、腸内細菌叢の抑制により変化しなかった。抗生物質投与の中止、および数か月以上後におこる腸内細菌叢の再獲得の後での、再度のボランティアのＰＣチャレンジは、血漿中のＴＭＡＯおよびｄ９−ＴＭＡＯ（図１６）、ならびに２４時間尿採取（図４）において、容易に検出可能な時間依存性の変化をもたらした。総合すると、これらの結果は、血漿および尿ＴＭＡＯ（およびＴＭＡ）、ならびに遊離コリンおよびベタインはすべて、ヒトにおいて、食品中のＰＣの代謝物として形成されることを立証している。これらの結果はまた、ヒトにおいて、腸内細菌叢はＴＭＡおよびＴＭＡＯ生成において必須の役割があるが、食品中のＰＣ由来のコリンまたはベタインはそうではないことを明らかにしている。最後に、これらの結果は、対象で観察された空腹時血漿レベルの幅と比較して、食後対空腹状態は個体中で少しの変化を示したのみである（以下を参照）ことから、腸内微生物叢は、ＴＭＡＯの血漿レベルに影響を与えることにおいて、食事よりも重要な役割を果たしていることを示している。

腸内細菌叢依存性代謝物ＴＭＡＯの血漿レベルの増加は、致死性ではない心臓発作、脳卒中および死亡に対する発生リスクを予測する。

次に、対象における、空腹時ＴＭＡＯ血漿レベルおよび心血管系発生リスクの間の関連性の検証を求めた。表１に、空腹時血漿ＴＭＡＯレベルおよび長期間の心血管系転帰とともに、４００７人の対象のベースライン特性を示す。

検証したコホートは、比較的良好にコントロールされている空腹時脂質プロファイルおよび腎機能が温存されている、選択的心臓評価を受けている中間リスク群を表す（表１）。最も低い四分位と比較して、最も高い四分位は、２．５倍増加したリスクを有する（ＨＲ２．５、９５％ＣＩ ２．０−３．２；Ｐ＜０．００１、表２）。

ＴＭＡＯ増加に関連したＭＡＣＥに対する段階的なリスクの増加は、図１７に示されるカプランマイヤー分析中に明確に図示される。エンドポイントが別々に分析された場合、ＴＭＡＯレベルが高ければ、３年経過観察時点で、さらに有意に高い死のリスク（ＨＲ３．２、９５％ＣＩ ２．１−４．８；ｐ＜０．００１）および非致死性のＭＩまたは脳卒中のリスク（ＨＲ２．３，９５％ＣＩ １．５−３．６；ｐ＜０．００１）が与えられる。従来的なリスクファクター、ｈｓＣＲＰ、ｅＧＦＲおよび他の炎症性／代謝的な共変量に対し調整された後、血漿ＴＭＡＯレベルの上昇は、３年でのＭＡＣＥ発生リスクが有意に増加したままである（表２）。ＴＭＡＯ含有は、従来的なリスクファクターと比較して、リスク算出において、有意な改善をもたらした（ＮＲＩ ８．６％、ｐ＜０．００１；ＩＤＩ ９．２％、ｐ＜０．００１；Ｃ−統計６８．３％対６６．４％、ｐ＝０．０１）。別の分析において、本研究の登録後３０日以内に血行再建術を受けた対象は排除された。このサブコホート（ｎ＝３，４７５）において、ＴＭＡＯは、ＭＡＣＥ発生リスクに有意に関連したままである（Ｑ４対Ｑ１、未調整ＨＲ（９５％ＣＩ）、２．４７（１．８７−３．２７）；調整ＨＲ（９５％ＣＩ）、１．７９（１．３４−２．４）；両方ともｐ＜０．００１）。

腸内細菌叢代謝物ＴＭＡＯの血漿レベルの増加により、比較的低いリスクコホートにおけるＭＡＣＥリスクの増加を予測する。

上昇した血漿ＴＭＡＯレベルの予測値は、心臓リスク全体の減少に関連した様々な亜群（若者、女性、ＣＶＤまたはＣＡＤリスク相当の既往歴がない者、積極的治療目的のための脂質治療を受けた者、または正常血液の者、非喫煙者または、たとえばｈｓＣＲＰ、ミエロペルオキシダーゼもしくは白血球数等の他の既知の心臓／炎症リスクマーカーが低いレベルの者を含む）においてで有意なままであった（図１８）。

考察
１８５６年に発見されて以来、コリンおよびＴＭＡＯ代謝は、動物およびヒトの両方において広い範囲で研究されてきた^{４，１１，１８，１９，２０}。無菌マウスを用いた細菌の動物モデル研究により、ＰＣ／コリンに富んだ食事状況での、代謝産物ＴＭＡの形成およびＴＭＡＯへの変換を介した、アテローム性動脈硬化症における腸内細菌叢の役割が示されている^１０（参照により、その全体が本明細書に援用される）。動物において、腸内細菌叢がＴＭＡ／ＴＭＡＯの産生に貢献していることは示されているが、ヒトにおいて、食品中のＰＣ由来のＴＭＡＯ作製における腸内細菌叢の関与は立証されていなかった。本実施例は、安定同位体トレーサ摂取研究の使用を通じ、ヒトにおける、食品中のＰＣ由来のアテローム生成促進代謝物ＴＭＡＯの生成を実証する。本実施例はさらに、経口広域スペクトラム抗生物質での腸内細菌叢の抑制および、抗生物質の中止後のＴＭＡＯの再獲得、腸内での再コロニー形成を介した、ヒトにおける、ＴＭＡＯ産生での腸内細菌叢の役割を実証する。最後に、本実施例は、この腸内細菌叢が産生した代謝産物の潜在的な臨床予後的意義を、第一予防対象および積極的なＬＤＬコレステロールまたはアポリポタンパク質Ｂ目標を有する対象の両方を含む、複合的に低いリスクの亜群内で、空腹時血漿ＴＭＡＯレベルが、従来的な心血管系リスクファクターに依存しないＭＡＣＥの将来的な発症を予測することを示すことにより、実証する。本発見は、ヒトにおけるアテローム性動脈硬化ＣＡＤの病態生理学における腸内細菌叢依存性経路（複数含む）の重要な貢献を指摘し、抗生物質治療がＣＡＤおよび関連病態（たとえば、血栓症）の治療または予防に有用であることを示す。

肥満症のような複雑な代謝性疾患における腸内微生物叢の重要性は、いくつかの独創性に富んだ研究により広く認識されるようになってきた^{６−９，２１，２２}。経口広域スペクトラム抗生物質の、一時的に腸内細菌叢およびＴＭＡＯ産生を抑制する能力は、ヒトにおいて、腸内細菌叢が、ＰＣ／コリン由来のＴＭＡＯ産生における必須の役割を果たしていることを直接的に実証している。腸内細菌叢は食品中のＰＣのコリン部分をＴＭＡに転換し、次いで、ＴＭＡは肝臓ＦＭＯによりＴＭＡＯに転換される^{１０，２４}。ＴＭＡが肝臓ＦＭＯによりＴＭＡＯに転換されるための必要条件^２５は、ＴＭＡおよびｄ９−ＴＭＡ産生を観察する個別分析が前駆体→産生物の関係性と一致する継時的変化を示すために、ｄ９−ＰＣの経口摂取後のｄ９−ＴＭＡＯレベル検出における遅延観察を説明するのに役立つ可能性がある。興味深いことに、ＴＭＡＯは魚類において、重要なオスモライトとして確認されており^２６、魚類摂取は尿ＴＭＡＯレベルを上昇させる。それにもかかわらず、尿および血漿ＴＭＡＯレベル間の高い相関は、窒素性廃棄物の除去手段としての、ＴＭＡＯの効率的な尿のクリアランスに対する証拠となる。ゆえに、ＴＭＡＯに対する効率的な排除メカニズムは、他の「尿毒性の毒素」のように、ＴＭＡＯ蓄積の阻害において保護的である可能性があり、ＴＭＡＯおよび心血管系リスクの間の機構的なリンクを弱体化させない。

感染性の病因およびアテローム性動脈硬化の間の関連性が、従前から主張されていたが、疾患の進行を妨げる抗菌性の治療の役割を見た研究で、満足のいくものはなかった^{２７，２８}。抗菌治療の選択（たとえば、アジスロマイシン）は、腸内細菌叢の組成やその代謝物を調節することよりも、仮想標的とされた生物体（たとえば、肺炎クラミジア）に広く基づいたものであることを認識することが重要である。本実施例における、高レベルのＴＭＡＯと心血管系リスク発生の間の、本研究コホートにおける観察により、動物モデルからヒトにわたる、ＰＣ／コリン代謝および心血管系表現型における、腸内細菌叢‐宿主管の相互関係の直接的なリンクが確認される。病原性微生物を抗生剤で除去する代わりに、本発見は、血漿ＴＭＡＯレベルが、治療的調節に影響を受けやすい比較的に保存された腸内細菌叢の経路を潜在的に識別する可能性があることを暗示する。ゆえに、アテローム性動脈硬化の発症における腸内微生物叢の関与を認識することにより、治療的介入に対する多角的な新規の潜在的手段が提示される。たとえばより多くの野菜および線維類を多く含む食事を摂取することを通じて（これは、腸内細菌叢の組成を潜在的に調節し、総コリン摂取を減少させることができる^２１）、食品中のＰＣの過剰摂取を限定しながら、十分な摂取を維持することに対する明瞭な利益がある。実際に、もし採用できるなら、標準的な食事のアドバイスの一部分に、ＰＣおよびコリンに富んだ食べ物を限定することを入れる。なぜなら、それらは一般に、脂質およびコレステロール含有量も高いからである^３。あるいは、腸内細菌叢調節を標的とした治療介入は、たとえばプロバイオティック等の「機能性食品」^２２または薬理学的治療介入のいずれかとともに、心血管系疾患の予防における重要な追加的役割を果たすはずである。後者の治療介入は、特定の腸内細菌叢が調節する経路を阻害する阻害剤、または過敏性腸症候群の治療でみられるように、ＴＭＡＯ産生微生物の「負荷」を軽減する非全身性抗生物質の短期療法のいずれかの形態をとることができる^２９。

〔参考文献〕
1. Executive Summary of The Third Report of The National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, And Treatment of High Blood Cholesterol In Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 2001;285:2486-97.
2. Kathiresan S, Melander O, Anevski D, et al. Polymorphisms associated with cholesterol and risk of cardiovascular events. N Engl J Med 2008;358:1240-9.
3. Patterson KY, Bhagwat SA, Williams JR, Howe JC, Holden JM. USDA Database for the Choline Content of Common Foods. Release Two.
4. Zhang AQ, Mitchell SC, Smith RL. Dietary precursors of trimethylamine in man: a pilot study. Food Chem Toxicol 1999;37:515-20.
5. Zeisel SH. Choline: critical role during fetal development and dietary requirements in adults. Annu Rev Nutr 2006;26:229-50.
6. Gill SR, Pop M, Deboy RT, et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science 2006;312:1355-9.
7. Dumas ME, Barton RH, Toye A, et al. Metabolic profiling reveals a contribution of gut microbiota to fatty liver phenotype in insulin-resistant mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:12511-6.
8. Wen L, Ley RE, Volchkov PY, et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature 2008;455:1109-13.
9. Backhed F, Ding H, Wang T, et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:15718-23.
10. Wang Z, Klipfell E, Bennett BJ, et al. Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature 2011;472:57-63.
11. de la Huerga J, Popper H. Urinary excretion of choline metabolites following choline administration in normals and patients with hepatobiliary diseases. J Clin Invest 1951;30:463-70.
12. Simenhoff ML, Saukkonen JJ, Burke JF, Wesson LG, Schaedler RW. Amine metabolism and the small bowel in uraemia. Lancet 1976;2:818-21.
13. Ihle BU, Cox RW, Dunn SR, Simenhoff ML. Determination of body burden of uremic toxins. Clin Nephrol 1984;22:82-9.
14. Bain MA, Fornasini G, Evans AM. Trimethylamine: metabolic, pharmacokinetic and safety aspects. Curr Drug Metab 2005;6:227-40.
15. Erdmann CC. On the Alleged Occurrence of Trimethylamine in the Urine. J Biol Chem 1910;8:57-60.
16. Li Z, Vance DE. Phosphatidylcholine and choline homeostasis. J Lipid Res 2008;49:1187-94.
17. Vance DE. Boehringer Mannheim Award lecture. Phosphatidylcholine metabolism: masochistic enzymology, metabolic regulation, and lipoprotein assembly. Biochem Cell Biol 1990;68:1151-65.
18. Dessaignes M. Trimethylamin aus menschenharn. JL Ann Chem 1856;100:2-8.
19. Prentiss PG, Rosen H, Brown N, Horowitz RE, Malm OJ, Levenson SM. The metabolism of choline by the germfree rat. Arch Biochem Biophys 1961;94:424-9.
20. Al-Waiz M, Mikov M, Mitchell SC, Smith RL. The exogenous origin of trimethylamine in the mouse. Metabolism 1992;41:135-6.
21. Stella C, Beckwith-Hall B, Cloarec O, et al. Susceptibility of human metabolic phenotypes to dietary modulation. J Proteome Res 2006;5:2780-8.
22. Martin FP, Wang Y, Sprenger N, et al. Probiotic modulation of symbiotic gut microbial-host metabolic interactions in a humanized microbiome mouse model. Mol Syst Biol 2008;4:157.
23. Loscalzo J. Lipid metabolism by gut microbes and atherosclerosis. Circ Res 2011;109:127-9.
24. Lang DH, Yeung CK, Peter RM, et al. Isoform specificity of trimethylamine N-oxygenation by human flavin-containing monooxygenase (FMO) and P450 enzymes: selective catalysis by FMO3. Biochem Pharmacol 1998;56:1005-12.
25. Al-Waiz M, Mitchell SC, Idle JR, Smith RL. The relative importance of N-oxidation and N-demethylation in the metabolism of trimethylamine in man. Toxicology 1987;43:117-21.
26. Yancey PH, Rhea MD, Kemp KM, Bailey DM. Trimethylamine oxide, betaine and other osmolytes in deep-sea animals: depth trends and effects on enzymes under hydrostatic pressure. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 2004;50:371-6.
27. Cannon CP, Braunwald E, McCabe CH, et al. Antibiotic treatment of Chlamydia pneumoniae after acute coronary syndrome. N Engl J Med 2005;352:1646-54.
28. Grayston JT, Kronmal RA, Jackson LA, et al. Azithromycin for the secondary prevention of coronary events. N Engl J Med 2005;352:1637-45.
29. Pimentel M, Lembo A, Chey WD, et al. Rifaximin therapy for patients with irritable bowel syndrome without constipation. N Engl J Med 2011;364:22-32.
本発明は特定の実施形態に関連付けて記載されているが、特許請求されるように、本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。事実、関連分野の当業者により理解される本発明の実行のために記述された方法の様々な改変が、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

コリン、トリメチルアミンＮ−オキシドおよび３，３−ジメチル−１−ブタノール（ＤＭＢ）の分子式を示す。 構造的類似化合物の、マクロファージコレステロール蓄積への効果、および食品中のＰＣおよびコリンの、腸内細菌叢依存代謝からアテローム性動脈硬化症に連結する経路の全体概要を示す。 構造的類似化合物の、マクロファージコレステロール蓄積への効果、および食品中のＰＣおよびコリンの、腸内細菌叢依存代謝からアテローム性動脈硬化症に連結する経路の全体概要を示す。 大動脈損傷の蓄積への食事の効果を示す、大動脈基部切片の画像を示す。 大動脈損傷の蓄積への食事の効果およびＤＭＢ投与による食品中のコリンからのアテローム性動脈硬化症プラークの減少のプロット図を示す。 コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬコレステロールおよびＨＤＬコレステロールの血漿レベル、およびＤＭＢの投与がどのようにアテローム性の脂質レベルを減少させることができるかを示すプロット図である。 （ａ）固形飼料のみ、（ｂ）コリンを補給、（ｃ）ＤＭＢを補給、および（ｄ）コリン＋ＤＭＢを補給した食物を与えられたマウス由来の腹膜マクロファージの染色を示す。パネル（ｅ）は、算出された泡沫細胞の％を示す。 ２０週齢のマウスから回収した腹膜マクロファージ中の総コレステロールのプロット図を示す。また、ＤＭＢ処理により、コレステロール蓄積の減少が誘導された。 ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＤＭＢ投与により、コリンのＴＭＡへの転換阻害が促進されることを図示するプロット図を示す。 経口広域スペクトラム抗生物質での腸内細菌叢の抑制が、ＴＭＡおよびＴＭＡＯ産生を抑制し、ＴＭＡおよびＴＭＡＯ形成には腸内細菌叢が必要であることが確認されたことを示す。図９はまた、高コリン食品を与えられたマウスでＤＭＢがＴＭＡおよびＴＭＡＯ形成を阻害することを示す。 図１０Ａは、高コリン食品を与えられた動物が、ＡＤＰへの血小板凝集増加により観察されたようにＴＭＡＯ血漿中レベルを上昇させ、血小板過剰反応性を増加させたことを示す。図１０Ｂは、血漿ＴＭＡＯの抑制が、コリン食品誘導性の血小板凝集の増加を著しく減少させることを示す。 図１１Ａは、高コリン食品を与えられた動物が、血漿ＴＭＡＯレベルが増加したことを示し、図１１Ｂは、ＤＭＢが、マウスにおいて、ＴＭＡＯの形成を阻害すること、および血小板過剰反応性をもまた、著しく減少させることを示す。 実施例７および他におけるマウス群からのデータを要約したものである。図１２は、血小板凝集応答対指定食品および処置（ＤＭＢまたは細菌叢抑制抗生物質）の最大振幅をプロットするものである。図１２は、ＤＭＢの添加により、高コリン食品または内在性ＴＭＡＯ由来の血小板過剰反応性（凝集）を阻害されることを示す。 ＴＭＡＯ（食品中のコリンまたは他のトリメチルアミン含有栄養素の腸内細菌叢依存性代謝産物）が、ｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率を、ｉｎ ｖｉｖｏで高めることを示す。本明細書における実験は、アテローム性動脈硬化症の傾向を有するＡｐｏＥ−／−マウスにて行われ、腸内細菌叢が介在するコリンのＴＭＡＯへの転換を阻害する抗生物質が、血栓症発生率の減少を促進するのに有用であることを示す。 ＴＭＡＯ（食品中のコリンの腸内細菌依存性代謝産物）が、脂質異常症の無い野生型マウスにおける血栓症発生率を、ｉｎ ｖｉｖｏで高めること、および腸内細菌叢が介在するコリンまたは他の食品中のトリメチルアミンのＴＭＡまたはＴＭＡＯへの転換を阻害する抗生物質または他の手段が、血栓症発生率の減少を促進するのに有用であろうことを示す。 抗生物質またはＤＭＢのいずれかの存在対非存在での、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ血栓症データの要約を示す。図１５は、ＤＭＢおよび抗生物質の両方が、高コリン食品でみられるｉｎ ｖｉｖｏ血栓症発生率の減少を阻害し、また、食品誘導性ＴＭＡＯレベルの増加を阻害することを示す。 ２個の固ゆで卵の経口摂取後のホスファチジルコリン代謝物（ＴＭＡＯ、コリン、ベタイン）、および抗生物質前後のｄ９−ホスファチジルコリンのヒト血漿レベルを示す。 ＴＭＡＯ四分位に従う、長期間の主要心臓有害事象のカプランマイヤーの推定を示す。 ＴＭＡＯレベルのベースラインに従う、患者亜群間の、主要心臓有害事象のリスクを示す。危険率は、上位から下位への四分位を比較した。ＴＭＡＯは、従来のリスクファクターからはリスクがあるものと特に識別されない複合的な低リスクコホートにおける主要心臓有害事象リスクの増加を予測する。 ２つの固ゆで卵の経口摂取後、および抗生物質前後のｄ９−ホスファチジルコリンの、ヒト２４時間のＴＭＡＯ尿中レベルを示す。

Claims (15)

1. ジメチルブタノール（ＤＭＢ）を含有し、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、座薬、及びトローチ剤からなる群より選択される剤型の形態であることを特徴とする
   対象由来の試料で実施された血小板凝集分析および／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）分析に基づき、心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集が増加しているおよび／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別された前記対象に、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される医薬組成物。
2. プレバイオティック、プロバイオティックおよび／またはファイバーと共に投与されるものであることを特徴とする
   対象由来の試料で実施された血小板凝集分析および／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）分析に基づき、心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集が増加しているおよび／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別された前記対象に、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記識別が、血小板凝集の増加を示す前記対象由来の試料で実施された血小板凝集分析の結果を見ることを含むことを特徴とする
   対象由来の試料で実施された血小板凝集分析および／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）分析に基づき、心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集が増加しているおよび／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別された前記対象に、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記識別が、ＴＭＡＯレベルの上昇を示す前記対象由来の試料または呼気で実施されたＴＭＡＯ分析の結果を見ることを含むことを特徴とする
   対象由来の試料で実施された血小板凝集分析および／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）分析に基づき、心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集が増加しているおよび／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別された前記対象に、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記ジメチルブタノールは、コリン輸送を損うことを特徴とする
   対象由来の試料で実施された血小板凝集分析および／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）分析に基づき、心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集が増加しているおよび／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別された前記対象に、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前記ジメチルブタノールは、対象に投与された場合に、以下：
   トリメチルアミンレベルの減少、ＴＭＡＯレベルの減少、総コレステロールレベルの減少、ＬＤＬレベルの減少、ＨＤＬレベルの増加、トリグリセリドレベルの減少、グルコー
   スレベルの減少、およびヘモグロビンＡ１Ｃレベルの減少、
   のうち１つ以上を誘導することを特徴とする
   対象由来の試料で実施された血小板凝集分析および／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）分析に基づき、心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集が増加しているおよび／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別された前記対象に、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１に記載の医薬組成物。
7. 前記ジメチルブタノールは、対象に投与された場合に心血管系疾患のリスクを減少させることを特徴とする
   対象由来の試料で実施された血小板凝集分析および／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）分析に基づき、心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集が増加しているおよび／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別された前記対象に、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１に記載の医薬組成物。
8. 前記ジメチルブタノールは、対象に投与された場合に血栓症のリスクを減少させることを特徴とする
   対象由来の試料で実施された血小板凝集分析および／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）分析に基づき、心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集が増加しているおよび／またはＴＭＡＯレベルが上昇していると識別された前記対象に、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１に記載の医薬組成物。
9. ジメチルブタノール（ＤＭＢ）を含有し、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、座薬、及びトローチ剤からなる群より選択される剤型の形態であることを特徴とする
   心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集レベルおよび／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）レベルを検出する試験を実施する対象由来の試料を得て、前記試料の血小板凝集および／またはＴＭＡＯの上昇したレベルの識別に基づき、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される医薬組成物。
10. 前記試料は、血小板凝集が増加したと決定されていることを特徴とする
    心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集レベルおよび／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）レベルを検出する試験を実施する対象由来の試料を得て、前記試料の血小板凝集および／またはＴＭＡＯの上昇したレベルの識別に基づき、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記試料は、ＴＭＡＯレベルが上昇したと決定されていることを特徴とする
    心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集レベルおよび／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）レベルを検出する試験を実施する対象由来の試料を得て、前記試料の血小板凝集および／またはＴＭＡＯの上昇したレベルの識別に基づき、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項９に記載の医薬組成物。
12. 前記投与が、前記心血管系疾患および／または前記血栓症の少なくとも一つの症状が減少または除去されるような条件下で行われることを特徴とする
    心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集レベルおよび／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）レベルを検出する試験を実施する対象由来の試料を得て、前記試料の血小板凝集および／またはＴＭＡＯの上昇したレベルの識別に基づき、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１１に記載の医薬組成物。
13. プレバイオティック、プロバイオティックおよび／またはファイバーと共に投与されるものであることを特徴とする
    心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集レベルおよび／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）レベルを検出する試験を実施する対象由来の試料を得て、前記試料の血小板凝集および／またはＴＭＡＯの上昇したレベルの識別に基づき、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項９に記載の医薬組成物。
14. 心血管系疾患の治療を提供する一つ以上の薬剤と共に投与されるものであることを特徴とする
    心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集レベルおよび／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）レベルを検出する試験を実施する対象由来の試料を得て、前記試料の血小板凝集および／またはＴＭＡＯの上昇したレベルの識別に基づき、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項９に記載の医薬組成物。
15. 前記一つ以上の薬剤が、腸内細菌叢を標的とする一つ以上の抗生物質であることを特徴とする
    心血管系疾患および／または血栓症を患っており、血小板凝集レベルおよび／またはトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）レベルを検出する試験を実施する対象由来の試料を得て、前記試料の血小板凝集および／またはＴＭＡＯの上昇したレベルの識別に基づき、心血管系疾患および／または血栓症の治療のために投与される請求項１４に記載の医薬組成物。
    

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