JP5965398B2 - 任意の種類の注目される核酸配列に結合するタンパク質を単離するための新規な方法 - Google Patents
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Description
第1の工程では、三重鎖形成タグ配列(Triplex Forming Tags sequence:TFT配列)を生細胞の前記核酸配列に導入して、前記生細胞を生育させ、
第2の工程では、第1の工程で得られた細胞を収集し、核酸三重鎖の形成を許容する条件で、導入されたTFT配列に特異的な分子プローブ(TFOプローブ)と混合し、
第3の工程では、第2の工程で形成された核酸三重鎖を単離し、結合しているタンパク質を分析する、方法に関する。
ロックド核酸(LNA)とは、2’−O,4’−C−メチレン結合を有するリボヌクレオチドを含む核酸である。LNA含有TFOは近年、顕著な三重鎖の安定化の効果を有することが報告されている。より正確に言えば、これまでの研究により、TFO配列中にLNAと通常のヌクレオチドとを交互に配置することが、三重鎖の形成に好適であることが分かっている。即ち、本発明によれば、TFOは、核酸(LNA)ヌクレオチドを、通常のヌクレオチドと混合した状態で含むことが好ましい(Alexei A. et al., (1998). "LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine and uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition". Tetrahedron 54 (14): 3607-30; Satoshi Obika et al. (1998). "Stability and structural features of the duplexes containing nucleoside analogues with a cross-linked N-type conformation, 2'-O,4'-C-methyleneribonucleosides". Tetrahedron Lett. 39 (30): 5401-4)。
本発明によれば、図1に示すように、TFO−1プローブの最終構築物は以下の特徴を有する。
プラスミドpAS03(6290bp)は、pcDNA3.1(+)CAT(6217bp、Invitrogen)から、数箇所の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を修飾することにより誘導される。
TFO−1プローブがプラスミドDNA内のTFT−1配列を効率的に認識することを確認するために、実施例2で調製されたプラスミドをTFO−1プローブと混合、攪拌する。
本発明の方法論を用いてタンパク質を単離するためには、架橋DNA−タンパク質複合体を溶解させるために、弱い界面活性剤をバッファーに加える必要がある。
TFO法の実現可能性、即ち生体内におけるTFT配列含有特異的DNA配列に結合するタンパク質の単離能を検証するために、まず大腸菌(E. coli)株を用いた実験を行った。
次の段階として、TFO法を、ヒト細胞におけるプラスミドDNAの捕捉に適用した。
Claims (40)
- 任意の種類の注目される核酸配列(注目配列:Sequence-of-interest:SoI)に結合したタンパク質を単離する方法であって、
第1の工程では、三重鎖形成タグ配列(Triplex Forming Tags sequence:TFT配列)を生細胞の前記核酸配列に導入して、前記生細胞を生育させ、
第2の工程では、第1の工程で得られた細胞を収集し、核酸三重鎖の形成を許容する条件で、導入されたTFT配列に特異的な分子プローブ(TFOプローブ)と混合し、
第3の工程では、第2の工程で形成された核酸三重鎖を単離し、任意の注目される核酸配列に結合したタンパク質を分析する、方法。 - 前記注目される核酸配列が、ゲノム核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノム核酸が、ゲノムDNA又はエピソームDNAである、請求項2に記載の方法。
- 前記三重鎖形成タグ配列(TFT配列)が、タグとして使用し得る任意の核酸配列である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TFT配列が、SoIが存在する核酸配列内に通常は存在しない配列である、請求項4に記載の方法。
- 前記TFT配列が、ポリピリミジン−ポリプリン配列である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TFT配列が、長さ10〜50塩基対の短い三重鎖形成タグ配列(TFT配列)である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記の短い三重鎖形成タグ配列(TFT配列)が、15〜35塩基対長を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記の短い三重鎖形成タグ配列(TFT配列)が、20塩基長である、請求項7に記載の方法。
- 第2の工程において、第1の工程で得られた細胞の収集時、及び、TFOプローブとの混合前に、更に細胞解砕の工程を実施する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- TFOプローブを加える前に、更に細胞の核を精製及び単離する工程を実施する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸に結合したタンパク質の架橋工程を追加する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋工程を、第1の工程の直後、収集工程の前に追加する、請求項12に記載の方法。
- 架橋工程を、第2の工程において、細胞の最終の直後、TFOプローブを加える直前に追加する、請求項12に記載の方法。
- 架橋工程を、紫外光架橋、ホルムアルデヒド架橋法、アジプイミド酸六価クロムジメチル(DMA);スベリン酸ジスクシンイミジル(D88);ジチオビス[プロピオン酸スクシンイミジル](D8P);エチレングリコールビス[スクシン酸スクシンイミジル](EG8)から選択される任意の方法により行う、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋工程を、インビボ(in vivo)ホルムアルデヒド架橋法を用いて行う、請求項15に記載の方法。
- 細胞溶解の工程を更に実施する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に従い架橋工程を実施しないと共に、細胞溶解工程を第2の工程において細胞を収集した後に追加する、請求項17に記載の方法。
- 請求項12〜16のいずれか一項に従い架橋工程を実施すると共に、細胞溶解工程を架橋工程の前又は後に個別に追加する、請求項17に記載の方法。
- 細胞溶解工程を架橋工程の前に個別に追加する、請求項19に記載の方法。
- 前記TFOプローブが、挿入されたTFTに対して相補的な任意の核酸配列、或いは当該配列とその有効性を向上させる他の要素との組み合わせである、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TFOプローブが、通常のDNAヌクレオチドと混合されたロックド核酸(LNA)ヌクレオチドを含む核酸配列である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TFOプローブにおいて、シトシンが5−メチルシトシンで置換されてなる、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TFOプローブが、その3’又は5’末端に、インターカレーターとして機能する芳香環構造からなる化合物を含む、請求項1〜23のいずか一項に記載の方法。
- 前記のインターカレーターとして機能する芳香環構造からなる化合物が、光活性インターカレート剤(intercalating agent)である、請求項24に記載の方法。
- 前記光活性インターカレート剤(intercalating agent)が、ソラーレン、アクリジン、臭化エチジウム、ベルベリン、プロフラビン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、サリドマイド、キナクリン、又はオルトフェナントロリンである、請求項25に記載の方法。
- 前記TFOプローブが、通常のDNAヌクレオチドと混合されたロックド核酸(LNA)ヌクレオチドを含む核酸配列であって、その3’又は5’末端に、芳香環構造からなる化合物を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記のインターカレーターとして機能する芳香環構造からなる化合物が、インターカレート剤を含み、シトシンが5−メチルシトシンで置換されてなる、請求項24に記載の方法。
- 前記TFOプローブが、その3’又は5’末端の芳香環構造を有するプローブに続いて、その反対側末端(3’又は5’末端)に、リンカーを介して連結された捕捉ハンドル(capture handle)を有し、当該捕捉ハンドルが、同種の(cognate)捕捉フック(capture hook)によって特異的に捕捉され得る、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカーが、炭素原子数1〜300の長さを有する炭素スペーサである、請求項29に記載の方法。
- 前記炭素スペーサが、炭素原子数100〜200の長さを有する、請求項30に記載の方法。
- 前記炭素スペーサが、炭素原子数110〜130の長さを有する、請求項30又は31に記載の方法。
- 捕捉ハンドル及び又は同種の捕捉フックが、強く相互作用する任意の分子の組み合わせである、請求項29に記載の方法。
- 前記の強く相互作用する任意の分子の組み合わせが、アフィニティー相互作用を示す任意の種類の物質の組み合わせである、請求項33に記載の方法。
- 前記の強く相互作用する任意の分子の組み合わせが、ヒスチジン−金属、抗原−抗体、特定オリゴヌクレオチド−特定オリゴヌクレオチド結合タンパク質の組み合わせである、請求項34に記載の方法。
- 前記同種の捕捉フックが、ストレプトアビジン又はアビジン又はニュートロアビジンであり、捕捉ハンドルが、ビオチン又はデスチオビオチンである、請求項29に記載の方法。
- 前記フックがカラム又はビーズに固定される、請求項36に記載の方法。
- 前記ビーズが磁性ビーズである、請求項35に記載の方法。
- ヌクレオチド−タンパク質複合体の調製のための、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、前記キットが、生細胞の核酸配列のSoIの近傍に導入されるべき少なくとも1のTFTと、少なくとも1の架橋化合物と、前記TFOプローブと、前記TFOプローブの捕捉ハンドルに結合し得る化合物により構成されるフックとを含み、前記TFTは請求項4〜9のいずれか1項に記載の通りであり、前記TFOプローブは請求項21〜29のいずれか1項に記載の通りであり、及び前記フックは請求項36又は37に記載の通りである、キット。
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