JP5950380B2

JP5950380B2 - リン酸化ペプチドならびに硬組織および／または異所性石灰化抑制剤

Info

Publication number: JP5950380B2
Application number: JP2011150487A
Authority: JP
Inventors: 裕二吉子; 朋子南崎; 広陽吉岡; 伊佐雄平田; 克之香西; 憲彦前田; 和晃渡邉; 勉清藤
Original assignee: RAFFINEE INTERNATIONAL CO.,LTD.; Hiroshima University NUC
Current assignee: RAFFINEE INTERNATIONAL CO.,LTD.; Hiroshima University NUC
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2031-07-06
Also published as: WO2013005839A1; JP2013014566A

Description

本発明は、硬組織石灰化および血管等の異所性石灰化に関連する、リン酸化ペプチド、硬組織および／または異所性石灰化抑制剤、抗体ならびに硬組織および／または異所性石灰化促進剤に関する。

生体組織の石灰化には、例えば、骨粗鬆症もしくは骨軟化症等の骨疾患による硬組織石灰化、または、糖尿病、慢性腎疾患もしくは老化等に伴う血管石灰化を含む異所性石灰化等がある。このような硬組織または血管の石灰化が関わる疾患の予防、治療薬としては、主に、カルシウム剤、ビタミンＤ製剤、エストロジェン、イプリフラボン、カルシトニン、ビスフォスフォネート、ビタミンＫ２製剤、リン酸吸着剤またはスタチン等を含むものが挙げられる。

ＳＩＢＬＩＮＧタンパクファミリー（small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins）の一つであるＭＥＰＥ（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein）は、腫瘍性低リン血症骨軟化症の患者から見出されたタンパク質であり、主に骨石灰化の役目を果たす（非特許文献１参照）。例えば、特許文献１には、ＭＥＰＥ（その部分ペプチド、その塩またはこれらをコードするＤＮＡ等も含む）が骨分化促進作用を有することから、代謝性骨疾患および代謝性軟骨疾患の低毒性で安全な予防、治療剤への利用について記載されている。また、特許文献２には、ＭＥＰＥ等の骨細胞産生タンパク質またはその遺伝子を指標とし、骨質を評価する方法が記載されている。さらに、特許文献３には、当該ＭＥＰＥ等を用いた骨塩（骨密度）または腎における疾患の治療において特に有効であるリン酸代謝を調節する手段等も記載されている。一方、ＭＥＰＥノックアウトマウスでは、骨量、骨芽細胞の数がともに増加することから、ＭＥＰＥは骨形成の抑制因子と報告されている（非特許文献２参照）。

また、ＭＥＰＥは、カテプシンＢより切断され、ＡＳＡＲＭ（acidic serine aspartate rich motif）を含むペプチド断片（以下、ＡＳＡＲＭペプチド）が出現する。ＡＳＡＲＭペプチドは、ハイドロキシアパタイトとの結合親和性が高く、in vitroでアパタイト結晶成長を阻害または骨芽細胞による基質石灰化を抑制することが明らかとなっている（非特許文献３および４参照）。ＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドは、カゼインキナーゼIIによるリン酸化部位が存在し、最近の報告では、リン酸化が上記の活性に不可欠であると推察される（非特許文献２参照）。ＡＳＡＲＭペプチドはＳＩＢＬＩＮＧタンパクの全てに見られるモチーフであるが、全てのＡＳＡＲＭペプチドにＭＥＰＥ由来のものと同様の石灰化抑制作用があるか否かは不明である。なお、ＭＥＰＥはエンドペプチターゼ活性を持つとされているＰＨＥＸ（phosphate-regulating gene with homologies to endopeptidases on the Ｘ chromosome）と結合し、カテプシンＢによるＭＥＰＥの分解を抑制すると報告されている（非特許文献５参照）。これに対し、ＰＨＥＸはリン酸化あるいは非リン酸化ＡＳＡＲＭペプチドに結合すること、そのうちリン酸化されたＡＳＡＲＭペプチドを分解することが示されている（非特許文献２参照）。

ＰＨＥＸは、骨（骨芽細胞および骨細胞）ならびに歯（象牙芽細胞）で発現する膜タンパク質で、Ｘ連鎖性低リン酸血症性くる病の原因因子である。すなわちＰＨＥＸの欠損は、その基質（未同定、フォスファトニンと仮称）となるリン利尿因子の血中濃度の増加を来すと考えられている。また、ＰＨＥＸ機能欠損は、フォスファトニンとは異なるリン利尿因子・ＦＧＦ２３（fibroblast growth factor 23）発現を促進することが証明されている。ＦＧＦ２３は骨で産生され、腎臓機能を介して間接的に骨の石灰化を抑制する因子である。なお、このようなＦＧＦ２３の作用は、例えばKlotho等が関連していることが近年明らかとなった（非特許文献６および非特許文献７参照）。また、ＦＧＦ２３は骨に直接作用する可能性も示唆されている。

特開２００４−２６６９２号公報特開２００７−１７８３５６号公報特開２００９−１５９９７４号公報

Rowe, P. S. N., et al., Genomics 67 (1), 54-68, 2000 Gowen LC., et al., J. Biol. Chem. 278 (3), 1998-2007, 2003 Rowe, P. S. N., et al., Bone 34 (2), 303-319, 2004 Addison W. N., et al., J. Bone Miner Res. 23 (10), 1638-1649, 2008 Guo R., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 297 (1), 38-45, 2002 Urakawa I., et al., Nature 444 (7120), 770-774, 2006 Kawaguchi H., et al., J. Clin. Invest., 104 (3), 229-237, 1999

このように、ＭＥＰＥ、ＡＳＡＲＭペプチド、ＰＨＥＸおよびＦＧＦ２３等による、硬組織（主に、骨（骨芽細胞および骨細胞））における石灰化のメカニズムの詳細が少しずつ明らかとなってきている。特に、ＭＥＰＥ、さらにはその分解産物ＡＳＡＲＭペプチドの石灰化抑制作用を用いた骨疾患の予防、治療剤の開発は大いに期待されており、関連した様々な研究が多くなされている（非特許文献３および４参照）。また、前述したように、腎疾患の治療において特に有効であるリン酸代謝調節に関連した研究開発も多くなされている（特許文献４参照）。

このように、当該ＭＥＰＥおよびＡＳＡＲＭペプチドの機能を利用する様々な研究はなされているが、骨の石灰化抑制作用活性は、当該ＡＳＡＲＭペプチドにおけるどのような配列および形態等によるものであるのかは未だ明確には分かっていない。さらには、硬組織（主に、骨（骨芽細胞および骨細胞））での石灰化抑制、ならびに、それに伴う腎でのリン酸代謝調節における当該ＭＥＰＥ、ＡＳＡＲＭペプチドの効果については相反する報告もあり、その実体は不明である。さらに、これらの作用とＡＳＡＲＭペプチドのリン酸化との関係、ならびに血管等の異所性石灰化についての効果については不明である。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドの石灰化抑制作用活性部位を利用する、硬組織および／または異所性石灰化抑制作用を有するリン酸化ペプチド、硬組織および／または異所性石灰化抑制剤、硬組織および／または異所性石灰化促進作用を有する抗体、ならびに、硬組織および／または異所性石灰化促進剤を提供することを目的とする。

上記目的を達成する為、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、ＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドの石灰化抑制活性部位は、当該ＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列における少なくとも二つ（特に好ましくは三つ）以上のリン酸化されたセリンであり、あわせて例えばヒトＡＳＡＲＭペプチドのＰＨＥＸ切断部位（Ｎ末端側から１２番目のセリンと１３番目のアスパラギン酸）からＮ末端側の３アミノ酸残基を含む配列が不可欠であることを発見した。また、このような石灰化抑制活性部位を有するリン酸化ペプチドは、硬組織石灰化抑制作用だけでなく異所性石灰化抑制作用（特に、血管石灰化抑制作用）を有することも発見した。さらには、このような石灰化抑制活性部位を認識、結合する抗体は、硬組織石灰化促進作用および異所性石灰化促進作用（特に、血管石灰化促進作用）を有することも発見した。

そこで、本発明の第１の態様に係るリン酸化ペプチドは、ＭＥＰＥに由来するＡＳＡＲＭペプチドの全部または一部のアミノ酸配列を含有し、前記アミノ酸配列における少なくとも二つ以上のアミノ酸残基がリン酸化されたセリンであり、かつ硬組織石灰化および／または異所性石灰化を抑制する作用を有することを特徴とする。

好ましくは、前記アミノ酸配列は、ヒトにおけるＰＨＥＸ切断部位からＮ末端側の３アミノ酸残基を含むことを特徴とする。

好ましくは、前記アミノ酸配列における少なくとも三つ以上のアミノ酸残基がリン酸化されたセリンであることを特徴とする。

より好ましくは、前記リン酸化ペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基を有することを特徴とする。

さらに好ましくは、前記ＡＳＡＲＭペプチドは、以下（ａ）ないし（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする。
（ａ）配列番号１ないし３のいずれかに記載のアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１ないし３のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号１ないし３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列。

好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有し、前記配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて３番目と５番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする。

より好ましくは、さらに、前記配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて１番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする。

さらに好ましくは、前記リン酸化ペプチドは、配列番号５ないし８のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする。

本発明の第２の態様に係る硬組織および／または異所性石灰化抑制剤は、第１の態様に係るリン酸化ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。

本発明の第３の態様に係る抗体は、第１の態様に係るリン酸化ペプチドの活性中心である、前記リン酸化されたセリンを認識することを特徴とする。

本発明の第４の態様に係る硬組織および／または異所性石灰化促進剤は、第３の態様に係る抗体を有効成分とすることを特徴とする。

本発明によれば、ＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドの石灰化抑制作用活性部位を利用する、硬組織および／または異所性石灰化抑制作用を有するリン酸化ペプチド、硬組織および／または異所性石灰化抑制剤、硬組織および／または異所性石灰化促進作用を有する抗体、ならびに、硬組織および／または異所性石灰化促進剤が提供される。

マウス（４３３ＡＡ）、ラット（４３５ＡＡ）およびヒト（５２５ＡＡ）のＭＥＰＥのアミノ酸配列ならびにＡＳＡＲＭペプチドの位置、ヒトＡＳＡＲＭペプチドにおけるＰＨＥＸ切断部位を示す図である。実施例１に係る培養Ｏｂｃ細胞の基質石灰化抑制作用を示す図である。実施例２に係るラット血管平滑筋細胞の石灰化抑制作用のデータを示す図である。各種ペプチドの石灰化抑制活性および抗体による認識を示す図である。実施例４に係るｋｌ／ｋｌマウスおよび野生型マウスのそれぞれの大腿骨（骨端部縦断標本）ならびに頭蓋骨（頭頂骨前頭断標本）の免疫染色の様子を示す図である。実施例５に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色の様子を示す図である。実施例５に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈（横断標本）のパラフィン切片の免疫染色の様子を示す図である。実施例６に係るＡＬＰ／von Kossa染色での石灰化のデータを示す図である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。

（リン酸化ペプチド）
本発明の実施の形態１は、ＭＥＰＥに由来するＡＳＡＲＭペプチドの全部または一部のアミノ酸配列を含有し、当該アミノ酸配列における少なくとも二つ以上のアミノ酸残基がリン酸化されたセリンであり、かつ硬組織石灰化および／または異所性石灰化を抑制する作用を有するリン酸化ペプチドに関する。本実施の形態１に係るリン酸化ペプチドにおいて、好ましくは、当該アミノ酸配列はヒトにおけるＰＨＥＸ切断部位からＮ末端側の３アミノ酸残基を含む。なお、好ましくは、当該リン酸化されたセリンは三つまたはそれ以上である。また、より好ましくは、当該リン酸化ペプチドは少なくとも１２アミノ酸残基を有する。

ＭＥＰＥおよびＡＳＡＲＭペプチドについての詳細は、前述した通りである（特許文献１ないし３、および、非特許文献１ないし５参照）。図１は、マウス（４３３ＡＡ）、ラット（４３５ＡＡ）およびヒト（５２５ＡＡ）のＭＥＰＥのアミノ酸配列ならびにＡＳＡＲＭペプチドの位置、ヒトＡＳＡＲＭペプチドにおけるＰＨＥＸ切断部位を示す図である。図中の矢印が、ヒトＡＳＡＲＭペプチドにおけるＰＨＥＸ切断部位を示す。また、配列表においてもＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列を示す。図１に示す、ヒト（Homo sapiens）のＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に、ラット（Rattus norvegicus）のＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に、マウス（Mus musculus）のＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。

なお、本発明において「ＡＳＡＲＭペプチド」とは、アミノ酸配列としては、次の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されることが好ましい。（ａ）配列番号１ないし３のいずれかに記載のアミノ酸配列。（ｂ）配列番号１ないし３のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。なお、相同性に関しては、好ましくは８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。（ｃ）配列番号１ないし３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列。

このようなアミノ酸配列には、脊椎動物におけるＭＥＰＥのＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列が含まれ、具体的には、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類等におけるＭＥＰＥのＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列を挙げることができる。これらのうち好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコまたはイヌ等の哺乳類におけるＭＥＰＥのＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列である。

ここで、本実施の形態１に係るリン酸化ペプチドは、前述のようなＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を含有していればよい。このようなリン酸化ペプチドのアミノ酸配列が少なくとも二つ以上のリン酸化セリンを有することにより、リン酸化セリンが活性部位となり、硬組織石灰化および／または異所性石灰化を抑制する効果を奏する。

さらに、本実施の形態１に係るリン酸化ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有し、当該配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて３番目と５番目のセリンがリン酸化されていると好ましい。当該配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて１番目と３番目と５番目のセリンがリン酸化されているとより好ましい。

本実施の形態１に係るリン酸化ペプチドのアミノ酸配列の例を、配列表の配列番号５ないし８に示す。なお、このようなアミノ酸配列を有するリン酸化ペプチドは、容易に入手、製造または精製することができる。例えば、受託にて合成してもよいし、当該技術分野で公知であるペプチド合成法等を用いて製造しても構わない。この場合、例えば、固相合成法または液相合成法等を挙げることができる。反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーまたは再結晶等を組み合わせてリン酸化ペプチドを精製単離することができる。

前述したように、本実施の形態１に係るリン酸化ペプチドは、硬組織石灰化および／または異所性石灰化を抑制する作用を有する。本発明において、「異所性石灰化」とは、特に「血管石灰化」を意味している。また、本発明において「硬組織」とは、生体硬組織を意味し、例えば、頭蓋および体幹の骨格を形成する骨組織、歯周組織を構成する歯槽骨およびセメント質、あるいは象牙質（これらを構成する細胞等も含む）を示す。最も好ましくは、哺乳動物の骨組織である。

（硬組織石灰化および／または異所性石灰化抑制剤）
本発明の実施の形態２は、前述の実施の形態１に係るリン酸化ペプチドを有効成分として含む硬組織石灰化および／または異所性石灰化抑制剤に関する。有効成分として含まれるリン酸化ペプチドの詳細については、前述の実施の形態１と同様である。

本実施の形態２に係る硬組織石灰化および／または異所性石灰化抑制剤には、例えば、試薬、医薬品または食品（健康食品もしくはサプリメントを含む）等を挙げることができる。さらに具体的に述べると、これらの形態としては、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレットまたはカプセル剤等を挙げることができる。なお、これらの試薬、医薬品または食品等において、前述の実施の形態１のリン酸化ペプチドの有効成分としての含有量は、適宜調節することが可能である。

また、本実施の形態２に係る硬組織石灰化および／または異所性石灰化抑制剤の使用対象については、物質、動物もしくは生物等を挙げることができる。さらに使用方法等については、石灰化抑制剤としての効能、対象とする物質、動物もしくは生物等、および、当該対象の石灰化状態の程度を考慮したうえで、適当な使用量および使用手段を用いればよい。

本実施の形態２に係る硬組織石灰化および／または異所性石灰化抑制剤を用いることにより、変形性関節症または血管石灰化の病態進展阻止等の研究の手段として利用することができる。

（抗体）
本発明の実施の形態３は、前述の実施の形態１に係るリン酸化ペプチドの活性中心（石灰化抑制活性部位）を認識する抗体に関する。すなわち、本実施の形態３に係る抗体は、石灰化抑制活性を中和する中和抗体である。なお、前述の通り、活性中心とは少なくとも二つ以上のリン酸化セリンである。当該少なくとも二つ以上のリン酸化セリンの詳細については、前述の実施の形態１と同様である。

抗体の製造方法は、すでに当業者にとっては周知であり、本抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. （１９８３） Publish. John Wiley and Sons. Section １１．１２〜１１．１３、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York １９８９）。なお、詳細については実施例３を参照されたい。

本実施の形態３に係る抗体は、前述の実施の形態１のリン酸化ペプチドの石灰化抑制活性部位を認識、結合し、当該リン酸化ペプチドの作用を中和する。すなわち、本実施の形態３に係る抗体は、硬組織石灰化および／または異所性石灰化を促進する作用を有する。

（硬組織石灰化および／または異所性石灰化促進剤）
本発明の実施の形態４は、前述の実施の形態３に係る抗体を有効成分として含む硬組織石灰化および／または異所性石灰化促進剤に関する。有効成分として含まれる抗体の詳細については、前述の実施の形態３と同様である。

本実施の形態４に係る硬組織石灰化および／または異所性石灰化促進剤には、例えば、試薬、医薬品または食品（健康食品もしくはサプリメントを含む）等を挙げることができる。これらの具体的形態、含有量、使用対象、使用量および使用手段等の詳細については、前述の実施の形態２に係る硬組織石灰化および／または異所性石灰化抑制剤と同様である。

このような本実施の形態４に係る硬組織石灰化および／または異所性石灰化促進剤を用いることによって、骨粗鬆症、くる病または骨軟化症等の予防、治療の研究の手段として利用することができる。

他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語等は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様のまたは等しい方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。本明細書中に言及するすべての公開物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照として全体が組み入れられる。相反の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法および具体例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。また、以下に述べる実施例において、「ＡＳＡＲＭペプチド」はリン酸化していないＡＳＡＲＭペプチドを意味し、「ｐ−ＡＳＡＲＭペプチド」はリン酸化しているＡＳＡＲＭペプチドを意味する。さらに、それぞれのペプチドのアミノ酸残基の数によって、例えば１９アミノ酸残基の場合には「ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド」または「ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド」のように記す。

（実施例１）
本実施例１では、培養成熟骨芽細胞／骨細胞（以下、Ｏｂｃ細胞）におけるＡＳＡＲＭペプチドおよびｐ−ＡＳＡＲＭペプチドの基質石灰化抑制作用に係る実施例について詳細に説明する。

まず、Ｏｂｃ細胞および当該Ｏｂｃ細胞の育成、培養方法について説明する。胎生２１齢胎仔ラット由来の頭蓋冠から細胞を分離し（Yoshiko Y, et al., Endocrinology 144, 4134-4143, 2003参照）、当該頭蓋冠細胞を１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、Fetal Bovine Serum）（HyClone）および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含むα−ＭＥＭ（Modified Essential Medium）培地によって培養した。培養期間は１０日、常法通り、３７℃、湿式５％ＣＯ_２気相下においてインキュベータ内において培養した。当該頭蓋冠細胞が類骨様のノジュール（結節）を形成した後に、コラゲナーゼ（タイプＩ）処理により、ノジュールから細胞を選択的に取り出した。その後、取り出した細胞を前述と同様の条件にて培養し、Ｏｂｃ細胞として用いた。なお、Ｏｂｃ細胞としての特徴を確認するため、Ｏｃｎ（osteocalcin）、Ｄｍｐ−１（dentin matrix protein-１）およびＳｏｓｔの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法によって測定した（図示せず）。

本実施例１においては、Ｏｂｃ細胞培養を１０％ＦＢＳ存在下または１％ＦＢＳの低血清条件において培養したものを使用した。さらに、当該細胞を、配列番号７に記載のＭＥＰＥ由来ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド（Ｎ末端側から数えて１２、１４および１６番目のセリンをリン酸化したもの）を１、２、５および１０μＭ含む条件、当該配列番号７に記載のＭＥＰＥ由来ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドを１０μＭ含む条件、および、溶媒のみを含む条件にて培養した。なお、石灰化を誘導するため３ｍＭ β−グリセロリン酸をあわせて添加した。

培養は試薬添加後２４時間行い、ＰＢＳで洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した後にvon Kossa染色を施した。その後、実体顕微鏡でＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）陽性かつvon/Kossa陽性の石灰化巣の数を計測した。図２は、実施例１に係る培養Ｏｂｃ細胞の基質石灰化抑制作用を示す図である。数値（Mineralization foci（No./well））は陰性対照（溶媒のみを含む条件）を１００として表した。「−」は溶媒のみ含む条件を示す。ＡＳＡＲＭ^１９は、配列番号７に記載のＡＳＡＲＭ^１９ペプチドを含む条件を示す。ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９は、配列番号７に記載のｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド（Ｎ末端側から数えて１２、１４および１６番目のセリンをリン酸化したもの）を含む条件を示す。

ＡＬＰ陽性かつvon/Kossa陽性となる石灰化巣の数が少ないほど、石灰化を抑制する作用が強い。従って、図２に示すように、ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドとｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドとを比較すると、ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドにのみ用量依存的な石灰化抑制作用が確認された。なお、ＡＬＰは骨芽細胞のマーカーであるが、ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドとｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドはいずれもＡＬＰ陽性のノジューの数、さらにはＡＬＰを含む骨芽細胞の分子マーカーの遺伝子発現レベルに影響しなかった（図示せず）。

（実施例２）
本実施例２では、ラット血管平滑筋細胞におけるＡＳＡＲＭ^１９ペプチドおよびｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドの石灰化抑制作用（カルシウム量測定）に係る実施例について詳細に説明する。

ラット大動脈平滑筋細胞を、１５％のＦＢＳＤＭＥＭ（Dulbecco's Moodified Eagle's Medium）において、実施例１において述べた方法と同様の方法においてインキュベータ内にて培養した。当該細胞がコンフルエンスになった後、１％ＦＢＳの低血清条件とし、リン酸水素ナトリウム２ｍＭを付加して培養を継続した。低血清条件で培養を始めた２日後、配列番号７に記載のｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド（Ｎ末端側から数えて１２、１４および１６番目のセリンをリン酸化したもの）１０μＭを含む条件、当該配列番号７に記載のＡＳＡＲＭ^１９ペプチド１０μＭを含む条件、および、溶媒のみを含む条件にて、さらに１週間培養した。

培地は２ないし３日おきに新鮮培地と交換した。培養終了後、細胞はＰＢＳで洗浄し、一晩０．６Ｎ塩酸処理した。当該上澄みのカルシウム量を、カルシウムＣ−テストワコー（和光純薬工業）を用いて測定した。図３は、実施例２に係るラット血管平滑筋細胞の石灰化抑制作用のデータを示す図である。数値（Mineralization）は陰性対照（溶媒のみを含む条件）を１００として表した。「−」は溶媒のみ含む条件を示す。ＡＳＡＲＭ^１９は配列番号７に記載のＡＳＡＲＭ^１９ペプチドを含む条件を示す。ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９は配列番号７に記載のｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド（Ｎ末端側から数えて１２、１４および１６番目のセリンをリン酸化したもの）を含む条件を示す。

図３に示すように、ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドを添加しても石灰化の程度（カルシウム量）はほとんど変化はないが、ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドを添加すると石灰化の程度（カルシウム量）が大きく抑制されるということが解明された。

このように、配列番号７に記載のＡＳＡＲＭ^１９ペプチドおよびｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドだけでなく、様々な配列のＭＥＰＥ由来ＡＳＡＲＭペプチド、および、様々な箇所のアミノ酸残基がリン酸化したＭＥＰＥ由来ｐ−ＡＳＡＲＭペプチドについて、同様の実験を行った。図４は、各種ペプチドの石灰化抑制活性および抗体による認識を示す図である。

図４において、「アミノ酸配列」はＭＥＰＥ由来ＡＳＡＲＭペプチドまたはｐ−ＡＳＡＲＭペプチドの配列である。なお、「Ｓ」はリン酸化したセリンを表している。「ＡＡ数」は当該アミノ酸配列のアミノ酸残基数である。「純度」は合成し、使用した当該ペプチドの純度を示す。「石灰化抑制活性」は、当該アミノ酸配列のペプチドを用い前述と同様の実験を行い、石灰化が抑制されたか否かを示す。「有効濃度」は当該石灰化抑制活性が作用するにあたり、必要とする濃度（μＭ）を示す。「抗ｐ−ＡＳＡＲＭペプチド抗体の認識」は、後述する実施例３ないし６にて述べるが、抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体（配列番号７に記載のｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドのＮ末端側から数えて１２、１４および１６番目のセリンをリン酸化したペプチドを抗原としたポリクローナル抗体）に認識されるか否かを示している。なお、表中の「−」は、テストした最大濃度（２０μＭ）でも石灰化を抑制しなかったため、有効濃度を表示していない。

図４に示すように、まず、ＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドにおいて、配列のセリンがリン酸化されていない場合は石灰化抑制活性を有さないということが解った。さらに、セリンがリン酸化されたｐ−ＡＳＡＲＭペプチドであっても、少なくとも二つ以上のセリン（特に好ましくは三つ以上のセリン）がリン酸化されていなければ、石灰化抑制活性を持たないということが明らかとなった。このように、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端側から数えて１番目、３番目および５番目のセリンがリン酸化はＭＥＰＥ由来ｐ−ＡＳＡＲＭペプチドの石灰化抑制活性に必須である。また、図４に示す種々のアミノ酸配列から、ＭＥＰＥ由来ｐ−ＡＳＡＲＭペプチドはＰＨＥＸ切断部位からＮ末端側の３アミノ酸残基も石灰化抑制活性に関与することは明らかである。また、マウス、ラットにおいて、当該ＰＨＥＸ切断部は当該位置に存在しないものの、両者の配列とヒトとの高い相同性から（図１参照）、セリンのリン酸化に加え、図４の１２または１５アミノ酸残基からなるペプチドのＮ末端側３から６アミノ酸残基を含む配列も活性に寄与することは明白である。

（実施例３）
本実施例３では、抗体作製、精製および抗体吸収試験に係る実施例について詳細に説明する。

まず、抗原用ペプチドの作製のため、配列番号７に記載のｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドのＣ末端側から数えて４、６および８番目のセリンがリン酸化し、さらにＮ末端にシステインが付いたペプチドを使用した。当該ペプチドとサイログロブリンとの結合物を、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Maleidocaproyloxy）−succinimide）法により作製した。すなわち、当該ペプチドを蒸留水に溶解した抗原用ペプチド、０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解したサイログロブリン、および、ジメチルホルムアミドで溶解したＥＭＣＳを混合し、抗原用ペプチド−ＥＭＣＳ−サイログロブリン複合体を作製した。この結合物の溶液を、ＰＢＳを用いて透析し、結合物として１０ｍｇ／ｍｌになるよう濃度を調整した。このようにして得られた当該ペプチドとサイログロブリンとの結合物を免疫用抗原とした。

免疫用抗原として作製したペプチドとサイログロブリンとの結合物と、フロイント完全アジュバントとを等量混合し、エマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫１週間後に、抗原１００μｇとフロイント完全アジュバントとを等量混合して再度作製したエマルジョンを、ウサギに追加免疫し、以降同様の操作を各週の間隔において３回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した後（図示せず）、全採血を行い１，５００ｒｐｍで１５分間の遠心により、抗血清を分離した。さらに、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラム（チオールセファロース担体を使用）を用いて抗原特異精製を行い、抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドポリクローナル抗体を得た。

抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体の特異性確認には、一般的な吸収法を用いて行った。まず、抗体希釈バッファーである１％のＢＳＡを含むＰＢＳへ、抗体溶液とｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド溶液を、抗体：ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド＝１ｍｏｌ：２０ｍｏｌとなるよう添加した。次に、４℃にて一晩転倒混和し充分に反応させた。このように吸収処理を終えたものを陰性対照とし、前述の精製した抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドポリクローナル抗体と併せて、後述する実施例４ないし６の免疫染色等に利用した。

なお、このように作製した抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドポリクローナル抗体の特性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにおいても確認した。すなわち、リン酸化していないＡＳＡＲＭ^１９ペプチドには標識は反応せず、ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドのみに特異性を持つものであった（図示せず）。

（実施例４）
本実施例４では、抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体を用いたin vivoにおける主要な骨組織の部位別（大腿骨骨端の皮膚骨および海綿骨ならびに頭蓋骨）の免疫染色に係る実施例について詳細に説明する。

まず、本実施例４における免疫染色にて使用する標本の作製について説明する。本実施例４では、Klotho変異マウス（以下、ｋｌ／ｋｌマウス、６週齢雄）（日本クレア）および同齢の野生型雄マウスを用い、実験を行った。ｋｌ／ｋｌマウスおよび野生型マウスから採取した当該骨全体を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、１０％ＥＤＴＡＰＢＳを用いて脱灰した後、常法に従って５μｍのパラフィン切片を作製した。

その後、室温にて１時間、Protein Block（DAKO）を用いてブロッキングを行い、次いで洗浄を行った。一次抗体としては、実施例３において述べた、抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体（希釈倍率×１，０００）、または抗原吸収済抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体（希釈倍率×１，０００）を用い、４℃で１６時間置いた。次に、Ｃｙ２／３標識二次抗体（Jackson Immunoresearch Lab.、希釈倍率×４００）を用い、室温で１時間置いた。その後、蛍光顕微鏡を用いてそれぞれを観察した。

図５は、実施例４に係るｋｌ／ｋｌマウスおよび野生型マウスのそれぞれの大腿骨（骨端部縦断標本）ならびに頭蓋骨（頭頂骨前頭断標本）の免疫染色の様子を示す図である。図は実施したそれぞれのマウスのうちの代表例を示す。ここで、ｋｌ／ｋｌマウスにおいては、骨、歯に異常が見られ、通常の野生型マウスと比較して硬組織の石灰化を含む骨の障害が知られている（非特許文献７参照）。なお、図５は抗原吸収済ではない、抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体の場合を示す。図５に示すように、骨細胞の障害を含む多様な骨病変を示すｋｌ／ｋｌマウス（ｋｌ／ｋｌ）では、本実施例４に係る免疫染色の実験において、野生型マウス（ＷＴ）と比較して当該抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体に認識されるｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドが骨芽細胞、とりわけ骨細胞に多く分布していることが観察された。一方、抗原吸収済抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体では、このような陽性反応は認められなかったことから（図示せず）、実施例２にて述べたＡＳＡＲＭのリン酸化とｋｌ／ｋｌマウスにおける骨の障害と関連することが示された。

（実施例５）
本実施例５では、抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体を用いた血管のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色および免疫染色に係る実施例について詳細に説明する。

マウスは、実施例４にて述べたｋｌ／ｋｌマウスを使用した。生後６週間目（４２日目）において、ｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のサンプリングを行った。ｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈は、４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳにおいて４℃で１６時間置き、次いで洗浄を行った。その後、常法において、ｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈の１２μｍのパラフィン切片を作製し、当該パラフィン切片に、アリザリンレッド／トルイジンブルー染色を行った。染色方法は、採取した大動脈を４％パラフォルムアルデヒドによって固定し、水洗後、０．５％水酸化カリウムに浸透させた。その後、同溶液に２０μｇ／ｍｌアリザリンレッドとなるよう溶解し、染色した。トルイジンブルーは対比染色であり、染色方法はアリザリンレッドと同様である。

図６は、実施例５に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色の様子を示す図である。図は、実施したｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のうちの代表例を示す。図６に示すように、ｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈は、アリザリンレッドによって染色される血管石灰化層が見られる。

本発明者らは、前述の実施例４にて確認したｋｌ／ｋｌ硬組織における抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９抗体の陽性反応を、血管石灰化層で確認するため、当該ｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片についても抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体を用いた免疫染色の実験を行った。実験方法については、前述の実施例４と同様である。

図７は、実施例５に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈（横断標本）のパラフィン切片の免疫染色の様子を示す図である。なお、図７は、図６に示すｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片と同様の血管石灰化層の部分を示している。また、右に示す図は、左の血管石灰化層の部分の拡大図である。図７に示すように、血管石灰化層の一部の領域において実施例４にて述べたように抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体による陽性反応が観察された。この結果から、リン酸化ＡＳＡＲＭは、硬組織のみならず、血管石灰化とも関連することが示された。

（実施例６）
本実施例６では、培養骨形成モデルでの抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体の中和活性のＡＬＰ／von Kossa染色における測定に係る実施例について詳細に説明する。

本発明者らは、抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体の石灰化抑制の中和活性の指標を調査した。実験方法は、実施例１にて前述した方法とほぼ同様の方法において実施した。１％ＦＢＳの低血清条件で培養して得たＯｂｃ細胞に対し、抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体、陰性対照の正常ＩｇＧまたは溶媒のみを添加した。２時間後、ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドを３μＭまたは溶媒のみを添加し、その３６時間後にＡＬＰ／von Kossa染色を施した。その後、実体顕微鏡下でＡＬＰ陽性かつvon/Kossa陽性の石灰化巣の数を計測した。数値は陰性対照（溶媒のみ）を１００として表した。

図８は、実施例６に係るＡＬＰ／von Kossa染色での石灰化のデータを示す図である。図８において、「ＮＣ」は溶媒のみの場合、「−」はｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドのみを３μＭ添加したものを示す。また、「Normal IgG」および「Anti-p-ASARM」は、それぞれ陰性対照の正常ＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）および抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体（１μｇ）を、ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド（３μＭ）と併用したものを示す。図８に示すように、溶媒のみの場合と比較して、ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドを添加するとやはり石灰化が抑制されていた。抗ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチド抗体を添加すると、正常ＩｇＧを添加した場合と比較して、ｐ−ＡＳＡＲＭ^１９ペプチドによる石灰化抑制活性が中和される（抑制作用が弱くなる）ことも確認された。

本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

本明細書の中で明示した論文、公開特許公報および特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

本発明者らが鋭意研究を行った結果、ＭＥＰＥ由来のＡＳＡＲＭペプチドの石灰化抑制活性部位は、当該ＡＳＡＲＭペプチドのアミノ酸配列における少なくとも二つ（特に好ましくは三つ）以上のリン酸化されたセリンであることを発見した。また、このような石灰化抑制活性部位を有するリン酸化ペプチドは、少なくともヒトにおけるＰＨＥＸ切断部位のＮ末端側３つのアミノ酸残基を含む１２アミノ酸残基の鎖長を必要とすること、硬組織石灰化抑制作用だけでなく異所性石灰化抑制作用（特に、血管石灰化抑制作用）を有することも発見した。さらには、このような石灰化抑制活性部位を認識、結合する抗体は、硬組織石灰化促進作用および異所性石灰化促進作用（特に、血管石灰化促進作用）を有することも発見した。

そこで、本発明によれば、硬組織および／または異所性石灰化抑制作用を有するリン酸化ペプチド、硬組織および／または異所性石灰化抑制剤、硬組織および／または異所性石灰化促進作用を有する抗体、ならびに、硬組織および／または異所性石灰化促進剤が提供される。これらは、変形性関節症、動脈硬化症等を含む血管石灰化、骨粗鬆症、くる病または骨軟化症等の予防、治療の手段として利用することが可能である。特に、これらの疾患のうち、動脈硬化症等を伴う血管石灰化の予防、治療の手段についてはあまり多く開発されていない為、本発明を用いることにより新規で有用な医薬品の開発に繋がるものと考えられる。

Claims

ＭＥＰＥに由来するＡＳＡＲＭペプチドの一部のアミノ酸配列を含有し、かつ硬組織石灰化および／または異所性石灰化を抑制する作用を有する、以下の（ｉ）〜（ｖ）のいずれかであることを特徴とする、リン酸化ペプチド：
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列で表され、Ｎ末端側から数えて９番目と１１番目のセリンがリン酸化されている、二つのセリン残基がリン酸化されたリン酸化ペプチド、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列で表され、Ｎ末端側から数えて７番目と９番目と１１番目のセリンがリン酸化されている、三つのセリン残基がリン酸化されたリン酸化ペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列で表され、Ｎ末端側から数えて１２番目と１４番目のセリンがリン酸化されている、二つのセリン残基がリン酸化されたリン酸化ペプチド、
（ｉｖ）配列番号５のアミノ酸配列で表され、Ｎ末端側から数えて１０番目と１２番目と１４番目のセリンがリン酸化されている、三つのセリン残基がリン酸化されたリン酸化ペプチド、または、
（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列で表され、Ｎ末端側から数えて１４番目と１６番目のセリンがリン酸化されている、二つのセリン残基がリン酸化されたリン酸化ペプチド。
請求項１に記載のリン酸化ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする、硬組織および／または異所性石灰化抑制剤。