JP5946139B2 - 抗凝固薬測定用センサ - Google Patents
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Description
(1) 分子インプリント高分子を固定化した基板から構成される、抗凝固薬測定用センサ。
(2) 分子インプリント高分子を固定化した基板が、分子インプリント高分子を固定化した電極である、(1)に記載の抗凝固薬測定用センサ。
(3) 分子インプリント高分子を固定化した基板が、開始剤を固定化した基板に機能性モノマーと架橋性モノマーと抗凝固薬を接触させて重合させることにより得られる基板である、(1)又は(2)に記載の抗凝固薬測定用センサ。
(4) 機能性モノマーが、カチオン性モノマーである、(3)に記載の抗凝固薬測定用センサ。
(5) 機能性モノマーが、メタクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドである、(4)に記載の抗凝固薬測定用センサ。
(6) 架橋性モノマーが、メチレンビスアクリルアミドである、(3)から(5)の何れか1項に記載の抗凝固薬測定用センサ。
(7) 抗凝固薬が、ヘパリン類である、(1)から(6)の何れか1項に記載の抗凝固薬測定用センサ。
(8) (1)から(7)の何れか1項に記載の抗凝固薬測定用センサに、抗凝固薬を含有する試料を接触させ、信号の変化を検出することを含む、抗凝固薬の測定方法。
(9) (2)に記載の抗凝固薬測定用センサに、抗凝固薬を含有する試料をレドックスマーカーの存在下において接触させ、信号の変化として電流の変化を検出することを含む、抗凝固薬の測定方法。
(10) 体内に存在する物質をレドックスマーカーとして使用する、(9)に記載の抗凝固薬の測定方法。
(11) 前記試料が全血または血液成分(例えば、血漿又は血清など)である、(8)から(10)の何れか1項に記載の抗凝固薬の測定方法。
(12) (1)から(7)の何れか1項に記載の抗凝固薬測定用センサに、抗凝固薬を含有する灌流血液を接触させ、信号の変化を検出することを含む、抗凝固薬の測定方法。
(13) 抗凝固薬が、ヘパリン類である、(8)から(12)の何れか1項に記載の抗凝固薬の測定方法。
本発明の抗凝固薬測定用センサは、分子インプリント高分子を固定化した基板から構成されることを特徴とする。
(1)電極表面への開始剤固定
インジウム・スズ酸化物薄膜(ITO)を担持したガラス板を、3-アミノプロピルトリメトキシシランの10 wt%トルエン溶液中で加熱処理し、ITO表面にアミノ基を導入した。このITOを、水溶性カルボジイミド(0.2 M)及び4-クロロメチル安息香酸(0.1 M)のジメチルホルムアミド溶液に浸し、ITO表面にクロロメチルベンジル基を導入した。さらに、このITO表面のクロロベンジル基を、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムのエタノール溶液(0.3 M)中で反応させ、ITO表面にラジカル重合開始剤であるジエチルジチオカルバミルベンジル基を導入した。
MIPの鋳型として80 mgのヘパリンナトリウムとカチオン性機能性モノマーとしてのメタクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド 225 mg、架橋度調整用モノマーとしてのアクリルアミド250 mgを1mLの水に溶解した。上記水溶液を、架橋性モノマーのメチレンビスアクリルアミド 250 mgをジメチルホルムアミドに3 mLに溶解した溶液と混合した。混合液を石英試験管に仕込み、ジエチルジチオカルバミルベンジル基導入ITOを浸し、5分間のアルゴン流入による脱酸素の後、殺菌灯の紫外線を同時に24時間照射してグラフト重合することにより、MIPを固定した。このITOは、未反応モノマーと鋳型の除去のために、蒸留水(蒸留水の代わりに、酢酸等の有機酸、メタノール等のアルコール、又はこれらの混合液、又は蒸留水とこれらの混合液を使用してもよい)中で超音波洗浄した。
0.1Mの支持電解質(硝酸カリウム)および5mMのレドックスマーカー(フェロシアン化カリウム)を含むヘパリンナトリウム(0〜33 unit/mL)水溶液に、作用極として分子インプリント高分子固定化した電極、対極として未処理のITO電極、参照極として銀/塩化銀参照電極を浸し、ポテンシオスタットに接続した。
MIP固定電極より得られたサイクリックボルタモグラムを図6に示す。ヘパリン濃度0unit/mLのボルタモグラムを取ったのち、同濃度22unit/mLでボルタモグラムを取ったところ、酸化電流、還元電流とも著しく減少した。その後に再びヘパリン0unit/mLフェロシアン化カリウム中でサイクリックボルタメトリーを行ったところ、電流はヘパリン添加前の測定値に回復した。これらの結果は、分子インプリント固定電極が検出する酸化還元電流は、ヘパリン濃度の増加に対しても、減少に対しても可逆的に応答できることを示している。
全血系において分子インプリント高分子固定電極がヘパリンに対して応答を示すか否かを明らかにするために、実施例1の方法に準じて以下の方法で実験を行った。
インジウム・スズ酸化物薄膜(ITO)の表面を3-アミノプロピルトリメトキシシランの10 wt%トルエン溶液中で加熱処理し、アミノ基を導入した。ジメチルホルムアミド溶媒中で水溶性カルボジイミド(0.2 M)を用いて、ITOに導入したアミノ基とクロロメチル安息香酸(0.1 M)をペプチド結合させ、ITO表面にクロロメチルベンジル基を導入した。ITO表面のクロロベンジル基をジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムのエタノール溶液(0.3 M)中で反応させ、ITO表面にラジカル重合開始剤であるジエチルジチオカルバミルベンジル基を導入した。
鋳型として80 mgのヘパリンナトリウムとカチオン性機能性モノマーとしてのメタクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド 225 mg、架橋度調整用モノマーとしてのアクリルアミド250 mgを1mLの水に溶解した。一方、ヘパリンナトリウムを含まないこと以外は、同じ組成を持つ水溶液も同時に調製した。上記の両水溶液を、架橋性モノマーのメチレンビスアクリルアミド 250 mgをジメチルホルムアミドに3 mLに溶解した溶液とそれぞれ混合した。両混合液をそれぞれ石英管に仕込み、ジエチルジチオカルバミルベンジル基導入ITOをそれぞれ浸し、殺菌灯の紫外線を同時に24 時間照射してグラフト重合した。その後、蒸留水中で超音波洗浄した。ヘパリンを含む溶液で処理したITOをMIP(Molecularly imprinted Polymer)電極、ヘパリンを含まない溶液で処理したITOをNIP(Non-Imprinted Polymer)電極とした。
新鮮な牛血液にヘパリンを添加(0 unit/mLまたは4 unit/mL)し、フェロシアン化カリウムを5 mM含む生理食塩水で100倍希釈した。この試験液でサイクリックボルタメトリーを行った。作用極にはMIP電極およびNIP電極、対極には未修飾ITO、参照極には塩化銀をメッキした銀線を用いた。
得られたサイクリックボルタグラム(電流−電位曲線)を次ページの図8に示す。MIP電極の場合、試験液中にヘパリンが0.04 unit/mL(血液中にヘパリンが4 unit/mL)加わることにより、酸化電流は増大した。一方、NIP電極の場合は、ヘパリンに対する電流変化が見られなかった。
図11に示すように、MIP固定電極を電気化学フローセルに取り付け、この電極に0.4Vの定電位を印加した。5mMのフェロシアン化カリウム及び0.1M硝酸カリウムを含む水溶液を流し続け、電流が安定した後に、バルブで流路を切り換え、ヘパリン濃度を0.00unit/mL〜0.04unit/mLにステップ的に変化させた。この濃度変化に対する電流の変化を記録し、応答速度を評価した。
ヘパリンを含むウシ全血を用いて、実施例1及び実施例2に記載の方法に準じて、本発明の分子インプリント高分子固定電極を作用電としてサイクリックボルタメトリーを行った。ここでは、ウシ全血は希釈せず、レドックス種も新たに添加しなかった。分子インプリント高分子固定電極は、実施例1で作製したMIP固定電極を使用した。
Claims (9)
- 分子インプリント高分子を固定化した電極から構成される、ヘパリン類測定用センサであって、上記電極が、メタクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドとメチレンビスアクリルアミドをモノマーとして含む重合体を有し、かつレドックス種の酸化還元電流がヘパリンの存在によって変化する電極である、ヘパリン類測定用センサ。
- 請求項1に記載のヘパリン類測定用センサに、ヘパリン類を含有する試料を接触させ、信号の変化を検出することを含む、ヘパリン類の測定方法。
- 請求項1に記載のヘパリン類測定用センサに、ヘパリン類を含有する試料をレドックスマーカーの存在下において接触させ、信号の変化として電流の変化を検出することを含む、ヘパリン類の測定方法。
- 体内に存在する物質をレドックスマーカーとして使用する、請求項3に記載のヘパリン類の測定方法。
- 前記試料が全血または血液成分である、請求項2から4の何れか1項に記載のヘパリン類の測定方法。
- 請求項1に記載のヘパリン類測定用センサに、ヘパリン類を含有する灌流血液を接触させ、信号の変化を検出することを含む、ヘパリン類の測定方法。
- 分子インプリント高分子を固定化した電極から構成される、抗凝固薬測定用センサに、抗凝固薬を含有する試料をレドックスマーカーの存在下において接触させ、信号の変化として電流の変化を検出することを含む、抗凝固薬の測定方法において、体内に存在する物質をレドックスマーカーとして使用する、抗凝固薬の測定方法。
- 前記試料が全血または血液成分である、請求項7に記載の抗凝固薬の測定方法。
- 抗凝固薬が、ヘパリン類である、請求項7又は8に記載の抗凝固薬の測定方法。
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