JP5934805B2 - シュードモナスの生物学的防除方法 - Google Patents
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Description
本発明は、シュードモナス（Pseudomonas）の存在、及びその増殖を生物的に抑制するための新規の方法に関する。
シュードモナスは、シュードモナスグラム科に属する陰性細菌である。ヒトにおいて、この細菌は、種々の皮膚、内臓及び肺の感染症、特に嚢胞性繊維症の原因となる（４，１９）。それらの細菌は、多くの消毒薬及び抗生物質に抵抗でき（２）（７）、病院において度々発生することが疑いなく部分的に明らかであり、それらは湿潤環境（シンク、Ｕベンド、花瓶、タオル及び洗浄物、水を含む容器等）から単離され得る。いくつかの種は、植物（８）、線虫（１０）及びアメーバ（１，１１，１６）に対して病原性を有する。従って、この細菌のモニタリング及び制御は、重要な関心事になっている。
一般に、シュードモナスは土壌、汚水、工業排水から単離されたので、自然環境下において広範に分布することが知られており（５）、バイオフィルムを形成し、自由生活アメーバと共生する特性を有する。いくつかの潜在的病原性細菌（レジオネラニューモフィラ（Legionella Pneumophila）、マイコバクテリウム種（Mycobacteriumspp.）及びエスケリキアコリ（Escherichia coli）O157:H7）では、自由生活アメーバ内で生存及び増殖するためのメカニズムが発達している（１５）。さらに、シュードモナスを含む細菌は、自由生活アメーバによる捕食を回避できる種々の機能を発揮できることが証明されている（１２，１３，１８）。特に、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）によるバイオフィルムの形成は、アカントアメーバポリファーガ（Acanthamoeba polyphaga）等の自由生活アメーバによる捕食を効果的に回避可能とするメカニズムの１つである（１８）。アカントアメーバ（Acanthamoeba）等の特定の自由生活アメーバは、シュードモナスに対する走化性反応を発揮し、これらの細菌を捕食できることが知られているが（１７，１８）、緑膿菌はこれらのアメーバの増殖を急速に阻害し、被嚢形成を誘導し毒素の分泌によりそれらの死を誘導することが証明されている（１１−１３，１７，１８）。シュードモナスの毒作用は、繊毛原生動物においても証明されている（９）。
従って、自由生活原生動物及びアメーバは、シュードモナスの生態の重要な要素を構成することが明らかである。さらに、Michel等により示されているように（１４）、原生動物に感染し、その細胞内で生存するシュードモナスの能力は、これらの原生動物が一般に用いられる殺菌処理に対するシュードモナスの抵抗性を促進する因子となることを示す強力な指標となる。
これに関連して、発明者等は、アメーバ属のウィラーティアマグナ（Willaertia magna）がシュードモナス細菌を根絶することを全く予想外に証明した。この殺菌効果は、シュードモナスの媒介動物となり得る他のアメーバを捕食するウィラーティアマグナの既に証明された能力（３）に付加される。
従って、本発明の対象は、まず、ウィラーティアマグナ属の原生動物を用いて、シュードモナスの増殖を抑制する方法である。本発明に係る方法は、ヒト又は動物の体に適用される治療方法を含まない。本発明に係る方法において、気体又は液体の流れに対して、ウィラーティアマグナ属の原生動物、特にウィラーティアマグナ種を用いて処理することが最も一般的である。
本発明に係る方法は、特に、下水若しくは工業用水の配水管網、工業プラントの冷却回路、又は空調ネットワークの消毒に用いられ得る、又は表面消毒として用いられ得る。原生動物は、処理されるための管又はネットワークを循環する水又は液体に直接に加えられ得る。消毒されるための工業ネットワーク、煙突及びプラント、並びに工業製品の表面に、例えば、エアロゾルとしての水溶液の形態でそれらを噴霧できる。
本発明において用いられる原生動物は、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ ７８２４として２００６年８月２６日に寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５として２００６年８月２６日に寄託された株と同一であることが有利であり、これらの２つの株は、フランス国立科学研究センター（ＣＮＲＳ；3 rue Michel Ange - 75794 Paris Cedex 16 / France）及びクロード・ベルナール・リヨン第１大学（43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 Villeurbanne Cedex / France）の名義で寄託された。
ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ ７８２５で寄託された株に相当するウィラーティア属に属する原生動物は、本発明の不可欠な部分である。当該寄託された株であるＰＴＡ７８２４及びＰＴＡ ７８２５は、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２００８／０４３９６９にも記載されている。
そのような原生動物は、シュードモナス細菌を排除するために、また、シュードモナスの増殖及び汚染を抑制するために、消毒剤に用いられ得る。
さらに、本発明の対象は、他の態様において、ウィラーティア属の原生動物、特にウィラーティアマグナ種を含む消毒剤である。ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ ７８２５で寄託された株に相当する原生動物が好ましい。本発明に係る消毒剤は、例えば、蒸留水を用いた水溶液又は水性懸濁液の形態であることが有利である。消毒剤は、例えばエアロゾル又は他の適用方法といった噴霧可能な形態であってもよい。
ウィラーティア属、特にウィラーティアマグナ種の原生動物におけるシュードモナス増殖阻害活性は、アメーバモデルとして用いられたアカントアメーバ属及びハルトマンネラ属におけるシュードモナスの複製をウィラーティアアメーバ属の場合と比較することにより、発明者らによって確認された。ウィラーティア属、特にウィラーティアマグナ種の原生動物の活性は、緑膿菌により形成されたバイオフィルムに対するウィラーティアマグナの捕食効果を確認することにより証明される。
本発明の対象は、シュードモナスの殺菌のための上記のような消毒剤の使用又は原生動物の使用である。
外部環境でのシュードモナスの増殖及び維持に対して、アメーバに重要な役割を与える本発明に係る方法及び消毒剤は、特にコスト、有効性及び環境配慮の面で多くの利点を有する。
以下の実施例は、本発明を詳説できるようにするものであり、特性を限定するものでない。
１．材料及び方法
１．１．用いた株
シュードモナス（Pseudomonas）：用いられた菌株は、ＣＬ５２１０菌株（Oxoid, France）である。
１．１．用いた株
シュードモナス（Pseudomonas）：用いられた菌株は、ＣＬ５２１０菌株（Oxoid, France）である。
その菌株は、ＴＳＡ(Tryptone SoyaAgar) (ref PO 5012, Oxoid, France)で維持され、１週間に一度、継代培養される。その菌株は、ＴＳＡ上に広い縞状に播種され、３０℃で２日間培養される。
アメーバ：以下の３つの異なるアメーバ種に属する株が用いられる：
・ハルトマンネラベルミフォーミス（Hartomannellavermiformis）
・アカントアメーバカステラーニ（Acanthamoeba castellanii）（ＡＴＣＣに３００１０番で寄託されている株）
・ウィラーティアマグナ（Willaeriamagna）（ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ ７８２４及びＰＴＡ ７８２５で寄託されている株）。
・ハルトマンネラベルミフォーミス（Hartomannellavermiformis）
・アカントアメーバカステラーニ（Acanthamoeba castellanii）（ＡＴＣＣに３００１０番で寄託されている株）
・ウィラーティアマグナ（Willaeriamagna）（ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ ７８２４及びＰＴＡ ７８２５で寄託されている株）。
これらの３つの株は、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）チューブ（３０３３）に３ｍｌずつ分注された１０％ウシ胎児血清を含むＳＣＧＹＥＭ培地(Serum Casein Glucose Yeast Extract Medium)により無菌状態で培養される。その維持において、増殖型は８〜９日毎に継代維持される。共培養のために、対数増殖期において適切に栄養体が存在するように３〜４日の継代維持が用いられる。
ＳＣＧＹＥＭ培地は以下の材料で得られる：
カゼイン(Merck 1.02244.010) １０ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４ １．３２５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．８ｇ
グルコース ２．５ｇ
酵母エキス(Difco 0127-17-9) ５ｇ
蒸留水 ９００ｍｌ
ウシ胎児血清 １００ｍｌ。
カゼイン(Merck 1.02244.010) １０ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４ １．３２５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．８ｇ
グルコース ２．５ｇ
酵母エキス(Difco 0127-17-9) ５ｇ
蒸留水 ９００ｍｌ
ウシ胎児血清 １００ｍｌ。
２．５ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ）、Ｎａ２ＨＰＯ４及びＫＨ２ＰＯ４は９００ｍｌの蒸留水に加えられる。その混合液は、ホットプレート上で少し温められ、マグネチックスターラーを用いながらカゼインが徐々に加えられる。カゼインが溶解した後に、グルコース及び酵母エキスが加えられる。
完全に溶解した後に、混合液は、グラスファイバ(SartoriusSM 6513400)、その後に１μｍメンブレン(Whatman 7190 004)を用いて連続的に濾過される。その後、その培地はガラス瓶にアリコートされる。その瓶は、１２０℃で２０分間のオートクレーブにより滅菌される。培地の最終的な使用及び分配の前に、クリーンベンチ内で血清の割合が１０％となるように、ウシ胎児血清が無菌的に加えられる。
１．２．シュードモナスの単一アメーバとの共培養
１．２．１．接種菌の調製
無菌蒸留水とシュードモナスとの懸濁液は、５５０ｎｍにおいて吸光度単位が１である、すなわち１０９ＣＦＵ(colony-forming units)/ｍｌとなるように、ＴＳＡで２日間培養されたものから調製される。
１．２．２．単一アメーバとの共培養の実施
共培養は、オートクレーブによる無菌水を３ｍｌ含む細胞培養チューブで行われる（Ｆａｌｃｏｎ３０３３）。予めMalassez血球計算盤でカウントされた無菌のアメーバ懸濁液から、１×１０５アメーバ／ｍｌの割合でそのチューブへの播種が行われる。シュードモナスによるアメーバへの寄生は、シュードモナス／アメーバ比が１０となる、すなわち培養培地において１×１０６細菌／ｍｌとなるようにして行われる。寄生後すぐに、共培養チューブは、アメーバと細菌との接触を促進するために低速（７６０ｇで１０分）で遠心機にかけられる。１０分後、そのチューブは、手動で再懸濁され、３０℃のインキュベータ内において傾けられた状態で培養される。
１．２．１．接種菌の調製
無菌蒸留水とシュードモナスとの懸濁液は、５５０ｎｍにおいて吸光度単位が１である、すなわち１０９ＣＦＵ(colony-forming units)/ｍｌとなるように、ＴＳＡで２日間培養されたものから調製される。
１．２．２．単一アメーバとの共培養の実施
共培養は、オートクレーブによる無菌水を３ｍｌ含む細胞培養チューブで行われる（Ｆａｌｃｏｎ３０３３）。予めMalassez血球計算盤でカウントされた無菌のアメーバ懸濁液から、１×１０５アメーバ／ｍｌの割合でそのチューブへの播種が行われる。シュードモナスによるアメーバへの寄生は、シュードモナス／アメーバ比が１０となる、すなわち培養培地において１×１０６細菌／ｍｌとなるようにして行われる。寄生後すぐに、共培養チューブは、アメーバと細菌との接触を促進するために低速（７６０ｇで１０分）で遠心機にかけられる。１０分後、そのチューブは、手動で再懸濁され、３０℃のインキュベータ内において傾けられた状態で培養される。
共培養されたアメーバ及びシュードモナスの結果は、以下の方法により決定される。
共培養は、細菌の播種後に６時間観察される。それぞれの期間（３時間毎）において、共培養チューブは、壁からアメーバを脱離するためのボルテックスによる激しい攪拌後に、アメーバの観点及び細菌の観点の両方からサンプリング及び試験がなされる。各チューブにおいて以下のことが行われる。アメーバは、Malassezセルで直接にカウントされる。シュードモナス濃度は、エッペンドルフマイクロチューブにおいて、無菌蒸留水で１０倍段階希釈後に、ＴＳＡの培養培地に直接に播種することにより測定される。各希釈液は、１プレート毎に１００μｌの割合でＴＳＡにトリプリケートで播種される。そのプレートは、３０℃で最低４８時間インキュベートされる。ＴＳＡの最初の測定は、播種後２４時間にコロニーをカウントすることにより行われ、確認のために２日目に第２測定がなされる。シュードモナスの濃度は、希釈係数を考慮し、各コロニーが希釈懸濁液中に最初に存在する１つの細菌に対応すると想定して、培養培地のＣＦＵ／ｍｌで表される。
各アメーバ属と共生するシュードモナスの増殖曲線は、時間の関数として表される。
さらに、種々のアメーバ種におけるシュードモナスの考えられる細胞毒性は、以下の方法で測定される。トリパンブルー色素排除試験において陽性であるアメーバの割合をカウントする。この試験は、トリパンブルー陽性細胞／細胞総数の数を、顕微鏡を用いてMalassezセルでカウントすることにより行われる。
１．３．シュードモナスのバイオフィルムにおけるウィラーティアの効果
ウィラーティアは、ＴＳＡ上に播種されたシュードモナスの層上に堆積された。その寒天培地は、寒天培地の表面に細菌の膜が生じるように、３０℃で２４時間置かれる。その後、１×１０５のアメーバ（アカントアメーバカステラーニ、ハルトマネラベルミフォーミス又はウィラーティアマグナ）は、寒天培地の中央に播かれ、３０℃で２４時間置かれる。その後、寒天培地は、そこで生じ得る細菌層溶解プラークの形成を検出するために光学顕微鏡（倍率×４００）で観察される。
ウィラーティアは、ＴＳＡ上に播種されたシュードモナスの層上に堆積された。その寒天培地は、寒天培地の表面に細菌の膜が生じるように、３０℃で２４時間置かれる。その後、１×１０５のアメーバ（アカントアメーバカステラーニ、ハルトマネラベルミフォーミス又はウィラーティアマグナ）は、寒天培地の中央に播かれ、３０℃で２４時間置かれる。その後、寒天培地は、そこで生じ得る細菌層溶解プラークの形成を検出するために光学顕微鏡（倍率×４００）で観察される。
２．結果
２．１．ウィラーティアマグナはシュードモナス抵抗性を示す
試験された種々のアメーバ種の生存におけるシュードモナスの影響は、トリパンブルー色素排除試験により測定された。アカントアメーバカステラーニを細菌と共培養した後、このアメーバ種において、共培養の３時間後の生存率が３０％にまで低下するといった大きい細胞毒性効果が見られる（図１参照）。逆に、この現象は、ウィラーティアマグナをシュードモナスと共培養したときには見られず、９時間培養しても１００％に近い生存率が維持されている（図１）。ウィラーティアマグナと同様に、自由生活ハルトマネラベルミフォーミスアメーバでは、トリパンブルー色素排除試験により測定された生存率に関して減少が見られない（図１）。これら全ての観察（シュードモナスにより誘導される被嚢形成及び細胞毒性が無い）は、ウィラーティアマグナ及びハルトマネラベルミフォーミスが、他のアメーバ種であるアカントアメーバカステラーニとは反対に、シュードモナスに抵抗する能力を示すことを証明する。
２．１．ウィラーティアマグナはシュードモナス抵抗性を示す
試験された種々のアメーバ種の生存におけるシュードモナスの影響は、トリパンブルー色素排除試験により測定された。アカントアメーバカステラーニを細菌と共培養した後、このアメーバ種において、共培養の３時間後の生存率が３０％にまで低下するといった大きい細胞毒性効果が見られる（図１参照）。逆に、この現象は、ウィラーティアマグナをシュードモナスと共培養したときには見られず、９時間培養しても１００％に近い生存率が維持されている（図１）。ウィラーティアマグナと同様に、自由生活ハルトマネラベルミフォーミスアメーバでは、トリパンブルー色素排除試験により測定された生存率に関して減少が見られない（図１）。これら全ての観察（シュードモナスにより誘導される被嚢形成及び細胞毒性が無い）は、ウィラーティアマグナ及びハルトマネラベルミフォーミスが、他のアメーバ種であるアカントアメーバカステラーニとは反対に、シュードモナスに抵抗する能力を示すことを証明する。
２．２．ウィラーティアマグナによるシュードモナスの捕食
ハルトマンネラ及びアカントアメーバ属に属するアメーバの存在下で行われるシュードモナスの共培養の結果は、６時間後において細菌濃度の増加が見られるため（図２参照）、それら２つのアメーバ属の存在下における細菌のかなりの増殖を証明する。反対に（全く同一の条件で行われるにもかかわらず）、シュードモナスのみを含むコントロールと比較して、ウィラーティアマグナアメーバの存在下においては、検出可能なシュードモナスの約１ｌｏｇの減少が見られる（図２及び図３参照）。測定されるシュードモナスの濃度の減少は、シュードモナスに対するウィラーティアマグナの強力な捕食効果を証明する。
ハルトマンネラ及びアカントアメーバ属に属するアメーバの存在下で行われるシュードモナスの共培養の結果は、６時間後において細菌濃度の増加が見られるため（図２参照）、それら２つのアメーバ属の存在下における細菌のかなりの増殖を証明する。反対に（全く同一の条件で行われるにもかかわらず）、シュードモナスのみを含むコントロールと比較して、ウィラーティアマグナアメーバの存在下においては、検出可能なシュードモナスの約１ｌｏｇの減少が見られる（図２及び図３参照）。測定されるシュードモナスの濃度の減少は、シュードモナスに対するウィラーティアマグナの強力な捕食効果を証明する。
ウィラーティアマグナ及びハルトマンネラベルミフォーミスは生存するが、ウィラーティアマグナのみが細菌の増殖を防ぐ。シュードモナスに対するウィラーティアマグナのこの効果は、図３及び図４においてさらに示される。水で４８時間の培養後、アカントアメーバ及びハルトマンネラと細菌との共培養では、シュードモナスの増殖（細菌の増殖により、シュードモナスとハルトマンネラ又はアカントアメーバとを含むウェルにおいて濁りが見られる）が認められる（図３パネルＡ）。ウィラーティアマグナとの共培養のウェルの上清で測定されるシュードモナス濃度は、その細菌がＭＯＩ１０（１０バクテリア／１アメーバ）で培養された場合、細菌は存在しないことが認められる（図３パネルＢ）。
シュードモナスに対するウィラーティアマグナの捕食効果は、図４において確認される。実際に、ウィラーティアマグナの存在下で２４時間後に細菌の層が見られない寒天培地の表面が現れる（本明細書において、これらの領域は細菌層／バイオフィルム溶解プラークという、図４パネルＡ）。寒天培地の顕微鏡試験では、ウィラーティアマグナがこの溶解プラークの境界に集中することが示され、この効果は図４パネルＢに示され、ウィラーティアマグナの作用による細菌層の消失が明確となっている。これらの全てのデータ及び結果は、バイオフィルムを生じる病原細菌であるシュードモナスに対するウィラーティアマグナの捕食効果を明確に示す。
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Claims (6)
- ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５で寄託された株に相当するウィラーティア（Willaertia）属のアメーバ性原生動物を対象に接触させることを特徴とし、ヒト又は動物の体に適用される治療方法を除く、シュードモナス（Pseudomonas）の増殖を抑制する方法。
- 気体若しくは液体の流れ、又は固体表面が、ウィラーティアマグナ（willaertia magna）種のアメーバ性原生動物を用いて処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 下水若しくは工業用水の配水管網、工業プラントの冷却回路、空調ネットワーク又は工業製品の表面の消毒のために行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 水管内、又はヒト若しくは動物の食品に接触する可能性がある表面におけるバイオフィルムの形成を抑制するために行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 配管又はネットワーク内を循環する水又は液体中のシュードモナス（Pseudomonas）の殺菌のために、ＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２４で寄託された株、又はＡＴＣＣに寄託番号ＰＴＡ７８２５で寄託された株に相当する原生動物を前記水又は液体に加えることを含むシュードモナスの殺菌方法。
- 前記原生動物が水溶液又は懸濁液の形態で用いられることを特徴とする請求項５に記載の方法。
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