BR112014012966B1 - Método para o controle da proliferação de Pseudomonas pelo uso de protozoários da espécia Willaertia magna; e uso de um agente de desinfecção - Google Patents

Método para o controle da proliferação de Pseudomonas pelo uso de protozoários da espécia Willaertia magna; e uso de um agente de desinfecção Download PDF

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Abstract

resumo método para o controle da proliferação de pseudomonas; e uso de um agente de desinfecção a invenção refere-se a um método para controle da proliferação de pseudomonas, com exceção dos métodos de tratamento aplicados no corpo humano ou animal, caracterizado pelo fato de que dito método usa protozoários do gênero willaertia magna e também a um agente de desinfecção que contém tais protozoários.

Description

MÉTODO PARA O CONTROLE DA PROLIFERAÇÃO DE PSEUDOMONAS PELO USO DE PROTOZOÁRIOS DA ESPÉCIE WILLAERTIA MAGNA; E USO DE UM AGENTE DE DESINFECÇÃO [0001] A presente invenção refere-se a um novo método para o controle biológico da presença de Pseudomonas e a proliferação da mesma.
[0002] Pseudomonas é uma bactéria Gramnegativa que pertence à família Pseudomonadaceae. Em humanos, essa bactéria é responsável por várias infecções de pele, viscerais e pulmonárias, em particular fibroses císticas (4, 19). Essas bactérias são capazes de resistir a inúmeros antissépticos e antibióticos (2) (7), que indubitavelmente explica parcialmente crescentemente frequente em hospitais, isolados de ambiente úmido (pias, flexões em U, vasos, toalhas e objetos de lavagem, recipientes que contém água, etc.). Algumas espécies também têm patogenicidade para as plantas (8), nematoides (10) e amebas (1, 11, 16). Desse modo, o monitoramento e o controle dessa bactéria constitui uma preocupação cada vez mais importante.
[0003] Em geral, é sabido que, no ambiente, a Pseudomonas tem uma distribuição ubíqua (5), tendo em vista que essa bactéria foi isolada do solo, do esgoto ou de água residual industrial e biofilmes, características que compartilha com amebas de vida livre. Diversas bactérias patogênicas (Legíonella pneumophila, spp. e Escherichia coli O157:H7) desenvolveram mecanismos para sobreviver e replicar dentro de amebas de vida livre (15). Adicionalmente, foi demonstrado que bactérias, incluindo-se Pseudomonas, podem desenvolver várias estratégias que permitem às mesmas evitar a predação por amebas de vida livre (12, 13, 18). Em particular, a formação de biofilme por Pseudomonas potencialmente
Mycobacterium
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2/14 aeruginosa é um dos mecanismos que permite à bactéria efetivamente evitar a predação por amebas de vida livre tal como Acanthamoeba polyphaga (18) . Embora seja sabido que certas amebas de vida livre tal como Acanthamoeba são capazes de desenvolver uma resposta quimiotática em relação à Pseudomonas e de se alimentarem dessas bactérias (17, 18), também foi demonstrado que a Pseudomonas aeruginosa rapidamente inibe o crescimento dessas amebas e induz seu encistamento e sua morte pela secreção de toxinas (11-13, 17, 18) . 0 efeito tóxico de Pseudomonas também foi demonstrado em protozoários ciliados (9) .
[0004] Parece, portanto, claro que protozoários e amebas de vida livre constituem um elemento importante na ecoloqia de Pseudomonas. Adicionalmente, a capacidade de Pseudomonas de infectar e sobreviver em protozoários de modo intracelular é um poderoso indicador de que esses protozoários são fatores que promovem a resistência de Pseudomonas aos tratamentos biocidas usados atualmente, como indicado por Michel et al (14).
[0005] Nesse contexto, os inventores demonstraram, de modo totalmente inesperado, que o qênero amebiano Willaertia magna erradica bactérias Pseudomonas. Esse efeito biocida é acrescentado pela já demonstrada capacidade da Willaertia magna de predação de outros aqentes amebianos que pode servir como um vetor para a Pseudomonas (3) .
[0006] Em primeiro luqar, portanto, um objeto da presente invenção é um método para o controle da proliferação da Pseudomonas, que usa protozoários do qênero Willaertia magna. Os métodos de acordo com a invenção não incluem os métodos de tratamento aplicados ao corpo humano ou animal. No método de acordo com a invenção, é mais comumente um fluxo de qás ou líquido que é tratado com
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3/14 protozoários do gênero Willaertia e, em particular, a espécie Willaertia magna.
[0007] O método de acordo com a invenção pode ser usado em particular na desinfecção de redes de distribuição de água de saneamento ou água industrial, circuitos de refrigeração para instalações industriais, ou redes de ar-condicionado. Os protozoários podem ser acrescentados diretamente à água ou aos líquidos que circulam nas tubulações ou redes a serem tratadas. Também é possível aspergi-los, por exemplo, na forma de uma solução aquosa como um aerossol, nas redes industriais, chaminés e instalações, e nas superfícies industriais a serem desinfetadas.
[0008] Vantajosamente, os protozoários usados no contexto da invenção correspondem à cepa depositada no dia 26 de agosto de 2006, sob o número PTA 7824 no ATCC, ou à cepa depositada no dia 26 de agosto de 2006, sob o número PTA 7825 no ATCC, sendo que essas duas cepas foram depositadas no Centro Nacional de Pesquisa Científica (CNRS) (Centre National de la Recherche Scientifique) - 3 rue Michel Ange - 75794 Paris Cedex 16 / França - e na Universidade Lyon 1 Claude Bernard (Université Lyon 1 Claude Bernard) - 43 Boulevard du 11 Novembre 1918 - 69622 Villeurbanne Cedex / França.
[0009] Os protozoários que pertencem ao gênero Willaertia correspondem à cepa depositada sob o número PTA 7824 no ATCC ou à cepa depositada sob o número PTA 7825 no ATCC são uma parte integral da invenção. Ditas cepas depositadas PTA 7824 e PTA 7825 são também descritas na publicação do Pedido Internacional PCT WO 2008/043969.
[0010] Tais protozoários podem, portanto, ser usados em agentes de desinfecção, em particular destinados
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4/14 a eliminar bactérias Pseudomonas e para controlar a proliferação e contaminação por Pseudomonas.
[0011] Adicionalmente, um objeto da invenção é um agente desinfetante que contém protozoários do gênero Willaertia, e, em particular, da espécie Willaertia magna. Os protozoários que correspondem à cepa depositada sob o número PTA 7 824 no ATCC ou à cepa depositada sob o número PTA 7825 no ATCC serão preferenciais. Vantajosamente, o agente de desinfecção de acordo com a invenção está na forma de uma solução ou suspensão aquosa, por exemplo, em água destilada. O agente desinfetante pode estar em uma forma aspergível, por exemplo, como um aerossol ou quaisquer outros meios de aplicação.
[0012] A atividade de inibição de proliferação da Pseudomonas dos protozoários do gênero Willaertia e, em particular, das espécies Willaertia magna, foi demonstrada pelos inventores comparando-se a replicação de Pseudomonas nos gêneros Acanthamoeba e Hartmannella usados como modelos amebianos com o observado no gênero amebiano Willaertia. A atividade dos protozoários do gênero Willaertia e, em particular, da espécie Willaertia magna, também é demonstrada através do efeito de predação da Willaertia magna em biofilmes formados por Pseudomonas aeruginosas.
[0013] A invenção também refere-se ao uso de um agente de desinfecção ou de um protozoário como descrito acima, como um biocida em Pseudomonas.
[0014] Dado o papel essencial desempenhado pela ameba na proliferação e manutenção de Pseudomonas no ambiente externo, o método e o agente de desinfecção de acordo com a invenção têm inúmeras vantagens, em termos de custo, de eficiência e de cuidado ambiental, em particular.
[0015] Os exemplos a seguir tornam possível ilustrar a invenção, mas não têm natureza limitativa.
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5/14 [0016] A FIGURA 1 mostra a evolução espontânea das respectivas populações de amebas Hartmannella vermiformis (símbolo ), Acanthamoeba castellanii (símbolo ♦ ) e Willaertia (Willaertia magna - símbolo A) após mantê-las em cocultura com Pseudomonas a uma taxa inicial de ameba/bactéria de 10.
[0017] As várias amebas de vida livre são colocadas em coculturas (tempo 0 hora = T0) com Pseudomonas a uma taxa de 10 (10 bactérias / 1 ameba) como descrito na seção de materiais e métodos. Alíquotas das suspensões de cocultura são tomadas a cada 3 horas: isto é, T0, T0 + 3h, T0+6h. A porcentagem de amebas vivas é determinada por meio de um teste de exclusão de azul de tripano e observação microscópica utilizando uma célula Malassez. Os dados são expressos como % de células vivas, negativas no teste de exclusão de azul de tripano.
[0018] A FIGURA 2 mostra o crescimento de Pseudomonas em coculturas com Acanthamoeba e Hartmannella, mas não com Willaertia.
[0019] As amebas (5 χ 104) foram suspensas em água e inoculadas nos poços. Após 1 hora, a Pseudomonas é acrescentada aos poços de modo a alcançar vários MOIs como indicado na Figura 1A. As coculturas são incubadas a 30°C e examinadas após 24 e 48 horas. A: Observe a ausência de proliferação bacteriana no poço que contém Willaertia com Pseudomonas. B: 100 pl de sobrenadante dos poços que contém 100 bactérias / 1 ameba e 10 bactérias / 1 ameba (MOI 100 e MOI 10, respectivamente) são sucessivamente diluídos (diluições que variam de 10-6 a 10-8 com água deionizada estéril) e inoculados em ágar TSA. Observe a ausência de desenvolvimento de colônias bacterianas no sobrenadante das coculturas com Willaertia magna (W) , e, reciprocamente, o
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6/14 forte desenvolvimento de Pseudomonas na presença de Hartmanella (H).
[0020] A FIGURA 3 mostra a cinética do
desenvolvimento de Pseudomonas (símbolo de ♦), obtido em
cocultura com vários gêneros amebianos, que incluem o
gênero Willaertia (Willaertia magna - símbolo X) .
[0021] As várias amebas de vida livre são colocadas separadamente em coculturas (tempo 0 hora = T0) com Pseudomonas a uma taxa de 10 (10 bactérias / 1 ameba).
Alíquotas das suspensões de cocultura são tomadas a cada 3 horas: isto é, T0, T0 + 3h, T0+6h, e as concentrações de Pseudomonas são determinadas como descritas na seção de materiais e métodos. Um controle positivo, que compreende apenas as bactérias Pseudomonas em uma concentração equivalente àquela das coculturas, vai servir como um controle para o crescimento de Pseudomonas no meio. Observe a multiplicação bacteriana nas coculturas com Acanthamoeba castellanii (símbolo ) e Hartmannella vermiformis (símbolo Λ.) .
[0022] A FIGURA 4 mostra o efeito biocida da Willaertia magna em um biofilme formado por Pseudomonas.
[0023] Pseudomonas e Willaertia magna foram inoculadas em ágar TSA, e incubadas a 30°C por 24h. A: As placas de lise do biofilme de Pseudomonas formam nos e além dos depósitos de Willaertia magna, como indicado pelas setas na FIGURA 4A. B: Frente de uma placa de lise do biofilme indicada pela seta. Observe, na direita, o local de depósito de Willaertia magna na ausência de filme bacteriano. Observe, na esquerda, a camada de Pseudomonas.
1. MATERIAIS E MÉTODOS
1.1. Cepas Usadas:
[0024] Pseudomonas: a cepa usada é a cepa CL
5210 (Oxoid, França).
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7/14 [0025] É mantida em TSA (ágar triptona de soja) (ref PO 5012, Oxoid, França) em uma taxa de uma subcultura por semana. A cepa é inoculada em séries amplas em uma chapa de TSA e incubada por 2 dias a 30°C.
[0026] Amebas: as cepas usadas pertencem a três espécies amebianas diferentes:
• Hartmannella vermiformis, • Acanthamoeba castellanii (ATCC 30010), • Willaertia magna (cepas depositadas no ATCC sob no. PTA 7824 e no. PTA 7825).
[0027] Essas três cepas são cultivadas de modo axênico, na presença de 10% de soro fetal bovino, no meio SCGYEM (Meio composto por soro, caseína, glicose e extrato de levedura), distribuído em tubos Falcon® (3033) em uma proporção de 3 ml por tubo. Em manutenção, as formas vegetativas são subcultivadas a cada 8 a 9 dias. Para as coculturas, subculturas de 3 a 4 dias são usadas de modo a ter trofozoítos logo na fase de crescimento exponencial.
[0028] O meio SCGYEM é obtido como se segue
- Caseína (Merck 1.02244.010) 10 g
- Na2HPO4 1,325 g
- KH2PO4 0,8 g
- Glicose 2,5 g
- Extrato de levedura (Difco 0127 -17-9) 5 g
- Água destilada 900 ml
- Soro fetal bovino 100 ml
[0029] 2,5 ml de NaOH ( 1N) , então Na2HPO4 e
KH2PO4, são acrescentados a 900 ml de água destilada. A
mistura é aquecida ligeiramente em uma placa aquecida e
então a caseína é gradualmente acrescentada com agitação magnética. Após a caseína se dissolver, a glicose e o extrato de levedura são incorporados.
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8/14 [0030] Após a dissolução completa, a mistura é filtrada sucessivamente em fibra de vidro (Sartorius SM 6513400), e então em uma membrana de 1 pm (Whatman 7190 004) . O meio é então dividido em alíquotas em garrafas de vidro. As garrafas são esterilizadas em autoclave por 20 minutos a 120°C. Antes do uso e distribuição definitivos do meio, o soro fetal bovino é acrescentado de modo estéril, sob uma capa de fluxo laminar, em uma proporção de 10% do volume final.
1.2. Cocultura Monoamebiana de Pseudomonas
1.2.1. Preparação do inoculo bacteriano:
[0031] Uma suspensão de Pseudomonas em água destilada estéril é preparada a partir de uma cultura de 2 dias em TSA, de modo a obter 1 unidade de Densidade Óptica a 550 nm, isto é, uma concentração de 109 UFC (unidades de formação de colônia)/ml.
1.2.2. Preparação de coculturas monoamebianas [0032] As coculturas são preparadas em tubos de cultura de célula (Falcon® 3033) que contêm 3 ml de água esterilizada em autoclave. A inoculação dos tubos é realizada em uma proporção de 1 χ 105 amebas/ml, a partir de uma suspensão amebiana axênica previamente contadas em um hemocitômetro de Malassez. A infestação das amebas com Pseudomonas é realizada fixando-se uma taxa de Pseudomonas/ameba de 10, isto é, 1 χ 106 bactérias/ml de meio de incubação. Imediatamente após a infestação, os tubos de cocultura são centrifugados a uma velocidade baixa (760 g por 10 min) a fim de promover o contato entre amebas e bactérias. Após 10 minutos, os tubos são ressuspensos manualmente e são incubados, na posição inclinada, em uma incubadora a 30°C.
[0033] Os destinos das amebas e de Pseudomonas colocadas em cocultura são determinados da seguinte forma:
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9/14 [0034] As coculturas são monitoradas por 6 horas após a infestação bacteriana. A cada intervalo de tempo (cada 3 horas), os tubos de cocultura são amostrados e examinados tanto a partir do ponto de vista amebiano quanto do ponto de vista bacteriano após agitação vigorosa em um vórtice a fim de retirar as amebas das paredes. Para cada tubo examinado:
• As amebas são contadas diretamente em uma célula de Malassez.
• As concentrações de Pseudomonas são determinadas laminando-se diretamente em placas o meio de cultura no TSA após diluição em série de 10 vezes em água destilada estéril, em microtubos Eppendorf. Cada diluição é laminada de forma triplicada em TSA em uma proporção de 100 μΐ por placa. As placas são então incubadas a 30°C por um tempo mínimo de 48 horas. Uma primeira leitura dos TSAs é realizada 24 horas após a laminação, contando-se as colônias; é seguida de uma segunda leitura no segundo dia para confirmação. As concentrações de Pseudomonas são expressas em UFC/ml do meio de incubação, levando-se em consideração o fator de diluição e presumindo-se que cada colônia corresponda a uma bactéria inicialmente presente na suspensão diluída.
[0035] Para cada gênero amebiano, as curvas de crescimento de Pseudomonas são representadas como uma função de tempo.
[0036] Além disso, o possível efeito citotóxico de Pseudomonas nas várias espécies amebianas é determinado da seguinte forma:
• contando-se a proporção de amebas que são positivas no teste de exclusão de azul de tripano. Esse teste é realizado sob um microscópio por contagem, em uma
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10/14 colocar Acanthamoeba bactéria, um efeito célula de Malassez, do número de células positivas da cor azul tripano/número de células total.
1.3. Efeito de Willaertia magna em biofilmes de Pseudomonas [0037] As Willaertia foram depositadas na camada de Pseudomonas recém laminadas no TSA. Os ágares são colocados a 30°C por 24 horas de modo a permitir o desenvolvimento de um filme bacteriano na superfície do ágar. Os ágares são então observados sob um microscópio óptico (ampliação de χ 400) a fim de detectar a formação de possíveis placas de lise da camada bacteriana.
2. RESULTADOS
2.1. Willaertia magna exibe resistência a Pseudomonas [0038] O efeito de Pseudomonas na sobrevivência de várias espécies amebianas testadas foi determinado por meio de um teste de exclusão de azul de tripano. Muito rapidamente, após castellanii em cocultura com a citotóxico importante ocorre nessa espécie amebiana, com uma queda de ~30% na viabilidade após 3 horas de cocultura (ver FIGURA 1) . Em contrapartida, esse fenômeno nunca é observado quando a Willaertia magna é colocada em cocultura com Pseudomonas, incluindo-se até 9 horas de incubação com uma viabilidade que é mantida próxima a 100% (FIGURA 1) .
Como a Willaertia magna, a ameba Hartmanella vermiformis de vida livre não exibe qualquer queda em termos de viabilidade determinada por exclusão de azul de tripano (FIGURA 1) . Todas essas observações (nenhum encistamento e nenhuma citotoxicidade induzida por Pseudomonas) claramente demonstram que Willaertia magna e Hartmanella vermiformis, ao contrário das outras espécies amebianas do tipo Acanthamoeba castellanii, exibem a habilidade inicial para resistir a Pseudomonas.
2.2 Predação de Pseudomonas pela Willaertia magna
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11/14 [0039] Os resultados das coculturas de Pseudomonas realizados na presença de amebas que pertencem aos gêneros Hartmannella e Acanthamoeba demonstram uma multiplicação considerável da bactéria na presença desses dois gêneros amebianos tendo em vista que um aumento nas concentrações bacterianas é observado em 6 horas (ver FIGURA 2) . Em contrapartida (embora as coculturas sejam executadas sob condições estritamente idênticas), uma redução de cerca de 1 log nas concentrações de Pseudomonas detectáveis é observada na presença da ameba Willaertia magna, em comparação ao controle contendo apenas Pseudomonas (ver FIGURA 2 e FIGURA 3) . A queda medida nas concentrações de predação massiva Pseudomonas.
Pseudomonas demonstra um de Wíllaertía magna em efeito de relação à [0040] Wíllaertía magna e Hartmannella vermiformis sobrevivem, mas apenas a Wíllaertía magna impede a proliferação bacteriana. Esse efeito da Wíllaertía magna em Pseudomonas é ilustrado adicionalmente nas FIGURAS 3 e 4. Após a incubação por 48 horas em água, as coculturas de Acanthamoeba e Hartmannella com a bactéria demonstram uma proliferação de Pseudomonas (observe a aparência nebulosa dos poços que contêm Pseudomonas e Hartmannella ou Acanthamoeba, devido à proliferação bacterina) (FIGURA 3A). As concentrações de Pseudomonas determinadas no sobrenadante dos poços de cocultura demonstram a ausência de bactérias com Willaertia magna (FIGURA 3B) quando as ditas bactérias foram incubadas em um MOI de 10 (10 bactérias / 1 ameba).
[0041] O efeito de predação da Wíllaertía magna em Pseudomonas é também demonstrado na FIGURA 4. De fato, após 24 horas na presença de Willaertia magna, as superfícies do ágar onde a camada bacteriana desapareceu
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12/14 aparecem muito claramente (essas zonas são denominadas no presente documento como placas de lise da camada/biofilme bacteriana(o) - FIGURA 4A). O exame microscópico dos ágares também mostra que as Willaertia magna estão concentradas no limite dessa placa de lise; esse efeito também é ilustrado na Figura 4B, onde o desaparecimento da camada bacteriana sob a ação da Wíllaertía magna é claramente aparente. Todos esses dados e observações claramente mostram o efeito de predação da Wíllaertía magna em relação à bactéria patogênica Pseudomonas que desenvolveu um biofilme.

Claims (5)

1. Método para o controle da proliferação de Pseudomonas, com a exceção dos métodos de tratamento aplicados ao corpo humano ou animal, caracterizado pelo fato de colocar um fluxo de gás ou líquido ou uma superfície sólida em contato com protozoários da espécie Willaertia magna, correspondente à cepa depositada sob o número PTA 7 824 no ATCC ou à cepa depositada sob o número PTA 7825 no ATCC.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mesmo é implantado para a desinfecção de redes de distribuição de água de saneamento ou água industrial, circuitos de refrigeração para instalações industriais ou redes de ar-condicionado.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mesmo é implantado para controlar a formação de biofilmes em tubulações de água ou superfícies possivelmente em contato com produtos alimentícios humanos ou animais.
4. Uso de um agente de desinfecção caracterizado pelo fato de conter protozoários da espécie Willaertia magna, correspondente à cepa depositada sob o número PTA 7824 no ATCC ou à cepa depositada sob o número PTA 7825 no ATCC, como um biocida em Pseudomonas, com a exceção do uso para o tratamento aplicado ao corpo humano ou animal.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente de desinfecção está na forma de uma solução ou suspensão aquosa.
BR112014012966-5A 2011-12-20 2012-12-20 Método para o controle da proliferação de Pseudomonas pelo uso de protozoários da espécia Willaertia magna; e uso de um agente de desinfecção BR112014012966B1 (pt)

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