JP5933668B2 - 生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置に関するものであって、対時間電流法（ｃｈｒｏｎｏａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ）で血液試料の濃度を測定する時、血液の多様な妨害物質、特に赤血球容積率によって測定結果に偏差が大きい場合、短時間に階段化されたはしご形波形態の摂動電圧をさらに印加し、一定電圧および摂動電圧が印加された領域の感応電流から得られたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）からなる関数を、多様な条件の試料に対して多変数回帰分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により検定式に最適化して、妨害物質による偏差が最小化された血液試料の濃度を測定する生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置に関するものである。

臨床学的に重要な物質の濃度を測定することは、診断および健康管理のために重要である。特に、血液のような生体内の液体から、グルコース、ケトン、クレアチン、ラクテート、中性脂肪、ピルベート、アルコール、ビリルビン、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、尿酸などのような代謝物質（分析対象物質）の濃度を測定することは、病気の診断、病症の管理において核心とされている。

生体内の液体から臨床学的に意味のある物質の濃度を正確で、迅速で、経済的に測定するための方法として、電気化学的バイオセンサを用いる方法が幅広く使用されている。

このような電気化学的バイオセンサ（時々、「ストリップ」と称する）には、毛細管構造の試料セルに、酵素と電子伝達媒体および各種安定剤と分散剤を含む試薬のコーティングされている一対の電極（作動電極と補助電極）が配置されている。

使用者の血液が前記電気化学的バイオセンサの試料セルに満たされて携帯用測定装置に装着されると、作動電極に一定電圧が印加され、そこから得られる電流が測定され、プログラムされたアルゴリズムにより計算された分析対象物質の濃度値が数秒から数分の間に前記携帯用測定装置の画面に現れる。

このような電気化学的バイオセンサを用いた代謝物質、つまり、分析対象物質の測定およびモニタリングは迅速かつ便利であり、費用も安いことから、全世界的に幅広く使用されている。

しかし、使用者および各国の保健管理機関は、電気化学的バイオセンサに対して便利性以上に正確度を備えることを要求しており、このような要求はＩＳＯ１５１９７：２０１３のような国際的基準として具体化されている。

血液の濃度を測定する電気化学的バイオセンサにおいて正確性を阻害する要因のうち、重要な妨害要素としては、血液中の赤血球容積率が挙げられる。これは、酸化／還元される物質の移動および拡散速度が全血試料に含まれている赤血球容積率に依存して、測定電流信号に大きな影響を与えるからである。

例えば、同一の血糖濃度の血液であっても、赤血球容積率が大きい血液では、酸化／還元物質の移動に抵抗が生じて測定電流信号が減少する。逆に、赤血球容積率が小さい血液では、測定電流信号が増加する。

このような電流信号の増減は、測定される血糖濃度を実際より低く、または高く計算されるようにして測定を不正確にする。このような不正確性を補正するために、電気化学的反応時間を長く調節したり、測定費用の上昇を甘受してもバイオセンサ内に別の装置を導入して正確性を高められる技術が提案されてきた。

赤血球容積率による偏差を最小化するための努力として、フィルタを用いて赤血球を予め除去して分析対象物質を測定する方法が提案されている（米国特許第５，７０８，２４７号、第５，９５１，８３６号）。このような方法は効果的であり得るが、ストリップにフィルタを追加してセンサを製作しなければならないため、生産工程が複雑になり、製品の費用が増加することがある。

赤血球が血液試料において物質の拡散と移動を妨げて血液の抵抗を変化させるため、網構造を用いて赤血球容積率による偏差を減少させる方法が提案されている（米国特許第５，６２８，８９０号）。

また、試薬で赤血球を溶血させて血漿に流れ出たヘモグロビンが容積率の変化に伴う電流信号の増減を補助的に調節する役割を果たすようにする方法も提案されている（米国特許第７，６４１，７８５号）。しかし、これらの方法は、広い赤血球容積率の範囲ではその効果が制限的である。

最近、電気化学的な方法で追加的な信号を得て赤血球容積率による偏差を補正する方法が提案された。例えば、交流電圧を印加して血液試料のインピーダンスを測定して、赤血球容積率を測定した後、この値を用いて、分析物質の測定値を補正する方式がある（米国特許第７，３９０，６６７号、米国特許公開第２００４−００７９６５２号、第２００５−０１６４３２８号、第２０１１−０１３９６３４号、第２０１２−０１１１７３９号）。

しかし、これらの方法は、インピーダンス測定のために、測定装置に単純な直流電圧の印加および、電流測定回路のほか、交流とインピーダンス測定のための別の回路を必要とし、バイオセンサに別の伝導度またはインピーダンス測定電極を備えたりするため、全体的な測定システムの複雑性および費用を増加させる問題がある（米国特許第７，５９７，７９３号、米国特許公開第２０１１−０１３９６３４号）。

一方、交流電圧を使用せず、複数の大きさの互いに異なる矩形波電圧を多様な時間間隔で混合して印加しながら複数の感応電流値を得た後、これに基づいて赤血球容積率を補償する方法が、いくつかの特許で提案された（米国特許第６，４７５，３７２号、第８，４６０，５３７号、米国特許公開第２００９−００２６０９４号、欧州特許公開第２，７４６，７５９号、ＷＯ２０１３／１６４６３２）。

これらの方法は、従来のバイオセンサと測定装置を切り替えなくても適用可能である利点がある。しかし、これらの方法では、測定対象物質と酵素および電子伝達媒体の意図された電気化学反応による電流だけが発生するのではなく、印加電圧が急激に変化する時、電極表面の電気二重層に残っている酸化／還元反応物質の調節不可能な電気化学反応による電流（バックグラウンド電流：ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ）も発生することがある。

したがって、大量生産するバイオセンサでは、電極の表面状態や試薬の溶解性および反応の均質性がストリップセンサごとに正確に一致するように生産することは極めて難しく、 このため、印加電圧が急激に変化する時に発生するバックグラウンド電流の再現性も統計的な誤差範囲内で調節しにくい。また、印加電圧の急激な変化時に発生する充電電流も、各バイオセンサの電極ごとに同じ程度に精密に調節できないため、補正の再現性に劣る欠点がある。

本発明者らは、周期性を有する循環電圧電流方法が赤血球容積率に対する偏差を低減するのに効果的であり得ることを見出し、これを対時間電流法と共に用いて適用した（韓国特許公開第２０１３−０１３１１１７号）。

この方法は、赤血球容積率を補正するために多様な電圧の矩形波を混合して使用する方法に比べて、急激な電圧の変化に伴う不安定な充電電流の影響を低減し、電圧がスキャンされている間、電極の表面において電気二重層内に存在する酸化還元物質の濃度が電圧の変化対比適正な傾きで変化するので、発生するバックグラウンド電流の大きさが特定の範囲内で調節されるため、全体補正の効果も高められる利点がある。

ただし、この方法では、循環電圧電流法で得られた電流を用いて赤血球容積率を別途に推定した後、推定された赤血球容積率を濃度を求める式に適用して赤血球容積率の影響を補正するため、推定された赤血球容積率の正確性に応じて全体補正の効果が大きく左右される欠点がある。

また、この方法では、循環電圧電流法を安定的に実現し、これに対応する感応電流を測定するために、矩形波形の一定電圧の対時間電流法だけを使用する場合に比べて、複雑な測定回路を必要とし得る欠点がある。

電気化学的バイオセンサにおいて、非対称循環電圧電流法（ａｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）を用いて順方向走査と逆方向走査の電圧を非対称的に適用して、赤血球容積率が補正された血液の濃度を求める方法が提案されている（米国特許第８，２８７，７１７号）。

この方法では同様に、非対称循環電圧電流法を適用して得ることのできる電圧の関数で構成された感応電流を適切に組み合わせて赤血球容積率を求め、別の計算式によって求められた赤血球容積率を血液の濃度を求める式に適用して妨害効果を除去しなければならず、広い範囲の電圧で速いスキャンに応答可能な別の回路が必要である欠点がある。

前記言及した方法のほか、赤血球容積率の影響を最小化または除去しようとする多くの努力が見受けられる。しかし、大部分のかかる方法は、新たなストリップ構造を必要としたり、別の回路構造を有する測定装置の使用が必要であったり、従来の市場に供給されたストリップおよび測定装置は活用できないものであった。

本発明は、上記の問題を解消するためになされたものであって、本発明の目的は、従来の市場に提供されたストリップと測定装置のハードウェアをそのまま使用しながら、単に測定装置のファームウェアだけを簡単にアップグレードして、赤血球容積率による測定誤差を減少させることのできる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置を提供することである。

また、本発明の目的は、一定電圧を主電圧として印加し、引き続き印加する階段化されたはしご形波形の印加電圧を摂動電圧として用いることにより、血液内の物質による妨害作用を効果的かつ経済的に除去または最小化する生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置を提供することである。

さらに、本発明の目的は、従来の市場に供給された電気化学的バイオセンサと測定装置で用いられていた対時間電流法をそのまま使用しながら、短時間に階段化されたはしご形波形の印加電圧を対時間電流法に引き続き適用して得られる多様な情報を共に活用することにより、従来の製品で用いられていた検定の方法（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）をほぼそのまま維持しながらも、赤血球容積率の影響を画期的に減少させることのできる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置を提供することである。

本発明の一実施形態にかかる電気化学的バイオセンサを用いた生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法は、分析対象物質の酸化還元反応を触媒可能な酵素と電子伝達媒体が固定されており、作動電極および補助電極を備えた試料セルに液状の生体試料を注入した後、
前記分析対象物質の酸化還元反応を開示し電子伝達反応を進行させることができるように、前記作動電極に一定の直流電圧を印加して第１感応電流を得る段階と、
前記一定の直流電圧を印加後、Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を印加して第２感応電流を得る段階と、
前記第１感応電流または前記第２感応電流から、２視点以上の特徴点から予め定められたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を計算する段階と、
前記生体物質内の妨害物質の影響が減少する、少なくとも１以上のフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）関数で構成された検定式を用いて、分析対象物質の濃度を計算する段階とを含む。

本発明の一実施形態にかかる電気化学的バイオセンサを用いた生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置は、
前記分析対象物質の酸化還元反応を触媒可能な酸化還元酵素と電子伝達媒体が固定されており、作動電極および補助電極を備えた試料セルが挿入されるコネクタと、
前記分析対象物質の酸化還元反応を開示し電子伝達反応を進行させるための一定の直流電圧と、前記一定の直流電圧に続いて、前記試料セルの電位を揺動させるための、Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を印加するためのデジタル−アナログコンバータ回路と、
前記デジタル−アナログコンバータ回路を制御し、前記Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を用いて、検定式から直接前記分析対象物質の濃度値を求めるマイクロコントローラとを含む。

本発明の一実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置は、一定電圧とΛ（ラムダ）状の階段化されたはしご形パルス（または摂動電圧）とで構成された印加電圧に対する互いに異なる特性の第１または第２感応電流を、予め設定されたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）に変形して適切な統計数学的方法で検定式を得るため、生体試料のバックグラウンド物質による妨害効果（ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔ）を除去または最小化して、分析対象物質の濃度を測定することができる。

本発明の一実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置により効果的に低減可能な妨害要素のうち、血液試料の場合、代表的なものが赤血球容積率であって、電気化学的バイオセンサ、つまり、ストリップの構造や試薬の改善を必要とせず、測定装置の構造も、一定電圧を印加して電流値を測定する従来の回路をそのまま用いることができる。

また、本発明の一実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置は、すでに従来の市場で普遍的に用いる対時間電流法の区間を全く変更せず、その直後に印加される摂動電圧領域から補正信号を得るため、従来の測定性能および特性をそのまま維持しながら、赤血球容積率に対する偏差を最小化することができる。

さらに、本発明の一実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置は、赤血球容積率に対する偏差が最小化されるように、感応電流から抽出したフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）で構成された関数を、標準実験結果と比較して、多変数回帰分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により得られた検定式を用いて分析対象物質の濃度を決定することができて、別途に赤血球容積率を求める過程が必要でなく、２種類の他の測定値を別に得る過程で発生し得る再現性の変異（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）の問題を最小化することができる。

本発明の一実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置は、本発明の一実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法により決定された検定式を用いて作成されたプログラムをアップグレードして入力することにより、従来のストリップとハードウェアをそのまま活用し、赤血球容積率の影響が最小化された分析対象物質の濃度を得ることができる。

また、本発明の一実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法は、赤血球容積率を求めた後、これを検定式に別途に代入するよりも経済的かつ効率的な過程を通じて分析対象物質の濃度をより正確に決定することができる。

本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられたΛ−階段化されたはしご形摂動電圧（Λ−ｓｔｅｐｌａｄｄｅｒ−ｔｙｐｅ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を示すグラフである。 図１において印加した電圧に対応して得られる感応電流を示すグラフである。 本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられたΛ−階段化されたはしご形摂動電圧の構造を説明するためのグラフである。 本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法による検定式が格納された測定装置の前後方斜視図である。 図４の生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置の回路を示すブロック図である。 本発明の好ましい第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法による測定装置の血糖測定値とＹＳＩ測定値との間の相関関係を示すグラフである。 本発明の好ましい第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法による測定装置の血糖測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響を示すグラフ（１００ｍｇ／ｄＬより小さい濃度に対しては絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。 本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を共に用いて得られた血糖測定値とＹＳＩ測定値との間の相関関係を示すグラフである。 本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を用いて得られた血糖測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響を示すグラフ（１００ｍｇ／ｄＬより小さい濃度に対しては絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。 本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法を示すフローチャートである。 本発明の好ましい第３実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧および測定装置で測定した温度値を共に用いて得られた血糖測定値とＹＳＩ測定値との間の相関関係を示すグラフ（赤血球容積率１０、２０、４２、５５、７０％の試料を含む）である。 本発明の好ましい第３実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧および測定装置で測定した温度値を共に用いて得られた血糖測定値の平均値に対する温度の影響を示すグラフ（赤血球容積率１０、２０、４２、５５、７０％の試料を含む。１００ｍｇ／ｄＬより小さい濃度に対しては絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。 本発明の好ましい第４実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法によるケトン体測定値と基準装備測定値との間の相関関係を示すグラフである。 本発明の好ましい第４実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法によるケトン体測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響を示すグラフ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌより小さい濃度に対しては１００を乗算した絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。 本発明の好ましい第５実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を用いて得られたケトン体測定値と基準装備測定値との間の相関関係を示すグラフである。 本発明の好ましい第５実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を用いて得られたケトン体測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響を示すグラフ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌより小さい濃度に対しては１００を乗算した絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。

以下、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置について、添付図面を参照して詳細に説明する。

本明細書において、血糖測定時のヘマトクリットによって測定誤差が発生するのを補正することを好ましい実施形態として説明するが、グルコース検査と同様に、特定の酵素を導入することにより、多様な生体代謝物質、例えば、β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ｌａｃｔａｔｅ、ｐｙｒｕｖａｔｅ、ａｌｃｏｈｏｌ、ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ、ｕｒｉｃ ａｃｉｄ、ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｕｒｉａ、ｃｒｅａｔｉｎｅ、ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのような有機物または無機物の濃度も、同様の方法により測定値を補正することができる。

したがって、本発明は、試料層組成物に含まれる酵素の種類を異ならせることにより、多様な生体代謝物質の定量に利用できる。

例えば、グルコース酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ、ＧＯｘ）、グルコース脱水素化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＤＨ）、グルタメート酸化酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ）、グルタメート脱水素化酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、コレステロール酸化酵素、コレステロールエステル化酵素、ラクテート酸化酵素、アスコルビン酸酸化酵素、アルコール酸化酵素、アルコール脱水素化酵素、ビリルビン酸化酵素などを用いて、グルコース、グルタメート、コレステロール、ラクテート、アスコルビン酸、アルコール、およびビリルビンなどの定量を行うことができる。

前記酵素のように使用可能な電子伝達媒体は、ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ、ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ ｈｅｘａｍｉｎｅ（ＩＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ、１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ−５，６−ｄｉｏｎｅ、ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅあるいはｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅをリガンドとして有するｏｓｍｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ、２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，４−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、２，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−１，４−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、３，７−ｄｉａｍｉｎｏ−５−ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｉｕｍｔｈｉｏｎｉｎｅ、１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ、ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅのうちの１つであってよいが、これらの化合物に限定されず、生体代謝物質の酸化還元反応を触媒する酵素と共に、電子伝達が可能な有機および無機電子伝達媒体を含む。

本発明の一実施形態にかかる携帯用測定装置は、作動電極および補助電極が互いに異なる平面上で対面するように備えられ、前記作動電極上に物質による酵素および電子伝達媒体を含む試薬組成物のコーティングされた対面型電気化学的バイオセンサが適用可能である。

また、本発明の一実施形態にかかる携帯用測定装置は、作動電極および補助電極が一平面上に備えられ、前記作動電極上に物質による酵素および電子伝達媒体を含む試薬組成物のコーティングされた平面型電気化学的バイオセンサが適用可能である。

次に、図１〜図５を参照して、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法および測定装置について詳細に説明する。

図１と図２は、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられたΛ−階段化されたはしご形摂動電圧（Λ−ｓｔｅｐｌａｄｄｅｒ−ｔｙｐｅ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）とこれに対応して得られる感応電流を示すグラフであり、図３は、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられたΛ−階段化されたはしご形摂動電圧の構造を説明するためのグラフであり、図4、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法による検定式が格納された測定装置の前後方斜視図であり、図５は、図４の生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置の回路を示すブロック図である。

図１に示されているように、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、階段化されたはしご形摂動電圧は、一定電圧（Ｖ_ＤＣ）が印加された後に引き続き印加される。これによって感応電流が測定される。

図３に示されているように、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた摂動電圧は、階段化されたはしご形波で構成され、摂動電圧の特徴は、各階段の高さ（Ｖ_ｓｔｅｐ）、各階段の印加時間（ｔ_ｓｔｅｐ）、全体変化範囲における中間電圧と一定電圧との差（Ｖ_{ｃｅｎｔｅｒ}）、中間電圧と山電圧値との差（Ｖ_ｐｅａｋ）、全体の階段化されたはしご形波の山電圧値と隣接する次の階段化されたはしご形波の山電圧値との時間差（ｔ_{ｃｙｃｌｅ}）からなっており、次の表１に示された範囲を有する。

階段化されたはしご形波の範囲を示す表１は、本発明の好ましい一実施形態に過ぎず、応用に応じて多様に変形することができる。

本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、前記分析対象物質の濃度決定のために用いられる電流値は、第１または２感応電流の一段階または複数の階段で得ることのできる点である。

図４に示されているように、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置１００は、従来の電気化学的バイオセンサ、つまり、ストリップ１０の一対の作動電極および補助電極の構造をそのまま維持しながら、電位を変化させる摂動電圧を印加することにより、数秒以内、好ましくは０．１〜１秒以内に補正のための追加信号を得ることができる。

図５に示されているように、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置１００は、前記電気化学的バイオセンサ１０がコネクタ１１０に装着されると、前記コネクタ１１０は、電流−電圧変換器１２０に電気的に接続されるが、マイクロコントローラ（ＭＣＵ）１５０が従来の対時間電流法により一定電圧を印加するように、濃度測定装置１００に備えられていたデジタル−アナログコンバータ回路（ＤＡＣ）１３０を介して、別の摂動電圧回路なしに、摂動電圧を前記ストリップ１０の作動電極に印加できるように構成される。

このために、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置１００のファームウェアは、まず、予め定められた摂動電圧を発生させられる定数を測定装置１００のメモリに格納し、一定電圧を印加する時は、定められた定数をＤＡＣ１３０のレジスタに記録し、摂動電圧を印加する時は、定められた時間を周期として、前記メモリに格納された定数値を増加減させて、ＤＡＣ１３０のレジスタに記録する。

前記マイクロコントローラ１５０は、前記ＤＡＣ１３０のレジスタに記録された定数値に応じて、ストリップの２つの電極の間に当該電圧を印加させる。

前記ストリップ１０を介して測定された前記第１または第２感応電流は、前記コネクタ１１０および前記電流−電圧変換器１２０を経て、直接アナログ−デジタルコンバータ回路（ＡＤＣ）１4０を介して測定できる。

前記摂動電圧を図３に示されているような階段波で構成することは、交流や線形走査法を使用する方法に比べて回路が簡単になる利点のほか、多様な電圧のパルス使用の際、分析に妨げとなる充電電流が発生することを低減できる利点がある。

図１に示されているように、一定電圧を印加した直後に、階段化されたはしご形波を一定の周期および振幅をもって印加すると、電極近傍の拡散層で酸化／還元する要素の濃度分布に揺動が発生する。

このような揺動あるいは摂動は感応電流の特性に重要な変化を起こすが、この変化は、階段化されたはしご形波を構成する一階段または複数の階段から得られた電流値をもって赤血球容積率の影響を除去または最小化可能な重要な手段となり得る。

ここで、感応電流を第１感応電流または第２感応電流と表示したのは、揺動あるいは摂動により感応電流の特性が変化し、互いに異なることを表すためである。

一定電圧の印加後に、検定式において、赤血球容積率の影響を除去する目的で、短時間に追加的に印加する、周期性を有する階段化されたはしご形摂動電圧の印加方式を、「Λ−階段化されたはしご形摂動電圧（Λ−ｓｔｅｐｌａｄｄｅｒ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、あるいは簡単に階段化されたはしご形電圧（ｓｔｅｐｌａｄｄｅｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」と定義する。

前記特性が互いに異なる電流とは、血糖と赤血球容積率（妨害物質）に依存する方式が互いに異なっていて、赤血球容積率の影響を効果的に分離または補正可能な変数として使用できる電流をいう。

例えば、２以上の電圧パルスを適当な時間間隔で印加し、各パルスから第１および第２感応電流を測定する場合、前記第１および第２感応電流の電流値は血糖と赤血球容積率に応じて値が決定されるため、次のような血糖と赤血球容積率の関数（ｇ_１、ｇ_２）と表現することができる。

仮に、前記２つの電流を示す関数（ｇ_１、ｇ_２）の間に血糖と赤血球容積率が電流に寄与する方式が同じで、ｉ_１＝ｋｉ_２形態の定数の線形式が成立する場合は、特性が同じ電流として分類し、そうでない場合を特性が異なると表現する。

特性が同じ電流同士は、回帰分析の際、変数間の線形的依存性のため、正確に赤血球容積率の影響を算出できなかったり補正しにくい。

しかし、階段化されたはしご形摂動電圧を印加して得ることのできる感応電流は、それぞれの階段が短時間に昇段する時、または下段する時、電気二重層近傍で試料を揺動させる程度が持続的に変化するため、電子伝達速度および充電電流の影響度に応じて変化し、対時間電流法から得る電流とはその特性が大きく異なり得る。

このように、一定電圧および摂動電圧に対応する第１および第２感応電流において、その特性が大きく異なっていて、本発明の一実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられる検定式（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ）を構成するのに有用な部分を特徴点（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｐｏｉｎｔ）とし、特徴点の電流値をそのまま使用したり、または適切に変形して検定式に使用するのに適切な変数として作ったものを、フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）と定義する。

電気化学的バイオセンサにおいて、対時間電流法の感応電流は、バイオセンサの試薬がサンプルセル内で試料と混ざって均一な液状に到達した時、コットレル方程式で近似することができる。

ここで、ｎは電極において酸化／還元される物質（例えば、電子伝達媒体）の１分子あたりに移動する電子数であり、Ｆはファラデー定数、Ａは電極面積、Ｄは酸化／還元される物質の試料内での拡散係数、Ｃは酸化／還元される物質の濃度である。

対時間電流法の区間における特徴点は、一定電圧が印加された後、安定的にコットレル式でよく表現される地点の電流値で、現在の電気化学的バイオセンサでは、一定電圧が印加された後、数秒から数分以内の時間、好ましくは１〜１０秒以内の時間が経過した時点である。

前述のように、階段化されたはしご形摂動電圧から得られた第２感応電流は、一定電圧を印加する時に得られる第１感応電流とは特性が大きく異なっていて、全体検定式において直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ）の高い変数として使用することができる。

前記摂動電圧の印加される区間に対応する第２感応電流から特徴点を探す方法および、これらの特徴点でフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を作る方法は次の通りである。

下記の方法は１つの例であり、応用の目的に応じて多様に変形して適用することができる。

１）特定の階段化されたはしご形の山および谷電圧付近での感応電流
２）階段化されたはしご形において各階段の感応電流からなる曲線の曲率
３）階段化されたはしご形の山での電流値と谷での電流値との差
４）上りと下りとの中間の階段化されたはしご形での感応電流
５）各階段化されたはしご形サイクルの開始および終了地点での感応電流
６）階段化されたはしご形波から得られた感応電流の平均値
７）前記１〜６のフィーチャーから得られた電流値を、四則演算、指数、ログ、三角関数などの数学的関数で表現して得ることのできる値
このように、前記摂動電圧の印加される区間に対応する第２感応電流から特徴点を探したり、これらの特徴点から得られた電流値をフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）として作り、これを線形に結合して多変数回帰分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｎ ａｌｙｓｉｓ）を適用すれば、赤血球容積率による影響を最小化した検定式を得ることができる。

赤血球容積率による影響を最小化した検定式を作る具体的な方法は、後に説明する第１〜第５実施例を参照して詳細に説明する。

ただし、フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を線形結合して多変数回帰分析を適用した検定式は、電気化学的バイオセンサで用いられる電極の材質、電極の配列方式、流路の形状、使用される試薬の特性などに応じて大きく異なり得る。

本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた検定式は、一対の作動電極および補助電極を含む試料セルを有する電気化学的バイオセンサに普遍的に適用が可能であり、特に、測定しようとする物質が血液中のグルコースまたはケトン体であり、あるいは電気化学的に測定可能な生体代謝物質の場合、例えば、クレアチン、ラクテート、コレステロール、フェニルケトンウリア、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどの分析に有用である。

本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法を実施するためには、一定電圧と階段化されたはしご形摂動電圧に対応する第１および第２感応電流から得ることのできるフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を用いて作ったフィーチャー関数を、多様な条件の試料で実験を通じて赤血球容積率の偏差が最小化できるように、多変数回帰分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｎ ａｌｙｓｉｓ）で最適化して、検定式を開発しなければならない。

次に、この検定式を測定器のファームウェアに実現して、血液試料を分析する時に使用することができる。

［第１実施例］一定電圧に対する感応電流を用いた血糖測定方法
本発明の第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた電気化学的バイオセンサの試料セルは、スクリーン印刷された２つの炭素電極からなる使い捨てストリップであり、前記電極にグルコース脱水素化酵素および電子伝達媒体（ｔｈｉｏｎｉｎｅ、ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ ｈｅｘａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）が塗布されている。

本発明の第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた測定装置１００は、図４に示された、市中で購入可能なＣａｒｅＳｅｎｓ Ｎ（商標名）である。

本発明の第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法は、この測定装置１００のファームウェアをそのまま用いて、マイクロコントローラ１５０において、デジタル−アナログコンバータ回路１３０を介して作動電極に一定電圧を印加し、これに対する第１感応電流を得て血糖値を計算する。

温度２３℃で実験しており、基準装備としてはＹＳＩ装備を用いる。

赤血球容積率による偏差を確認するために、次のような血液実験を実施することができる。

血液は、静脈血から採血した血液を遠心分離を通じて赤血球と血漿に分離し、所望値の赤血球容積率を有するように、赤血球と血漿を適正比率で再び混合して、１０、２０、３０、４２、５０、６０、７０％の赤血球容積率を有する試料を用意する。グルコースの濃度は、各試料に高濃度のグルコース溶液を添加して用意する。

こうして用意された血液試料は、各赤血球容積率値に対して、３０、８０、１３０、２００、３５０、４５０、６００ｍｇ／ｄＬの血糖値に近い値となるように用意し、実際の各試料の血糖値は基準装備で測定して決定する。

一方、測定装置１００は、従来の対時間電流法により一定電圧に対する第１感応電流を記録する。

この時、印加する電圧の形態は、血液流入後、３秒間、２つの炭素電極の間に印加される電圧は０Ｖであり、以降２秒間、２つの炭素電極の間に印加される電圧は２００ｍＶとなるようにする。したがって、５秒後の電流値を各試料に対して記録する。

血糖測定計算式は、４２％の赤血球容積率の試料を基準として作成する。血糖測定計算式は次の通りである。
Ｇｌｕｃｏｓｅ＝ｓｌｏｐｅ＊ｉ_{ｔ＝５ｓｅｃ}（５秒での電流値）＋ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ

実験データに対して、ｓｌｏｐｅとｉｎｔｅｒｃｅｐｔを最小自乗法で計算し、血糖測定検定式を決定する。

こうして求められた検定式を用いて、すべての赤血球容積率の試料に対して計算した結果は、図６および図７に示した。

図６は、本発明の好ましい第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法による測定装置の血糖測定値とＹＳＩ測定値との間の相関関係を示すグラフであり、図７は、本発明の好ましい第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法による測定装置の血糖測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響を示すグラフ（１００ｍｇ／ｄＬより小さい濃度に対しては絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。

図６および図７に示されているように、本発明の好ましい第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法による測定装置の血糖測定値の平均値は、すべての赤血球容積率に対して線形性を維持しているが、赤血球容積率が増加するほど傾きが減少することを確認することができる。

特に、図７に示されているように、各血糖測定値の赤血球容積率に対する傾向性は、４２％を基準として両端にいくほど偏差が増加することが分かる。

［第２実施例］一定電圧と摂動電圧を印加した後の特徴点から抽出したフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を用いた検定式の例
本発明の好ましい第１実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられたストリップ１０と測定装置１００を用いて、赤血球容積率の影響を最小化した検定式を求めることができる。

本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた実験環境と試料は、本発明の好ましい第１実施例と同一である。

本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置１００は、第１実施例による血糖測定装置１００と電圧印加部分において異なる。

本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置１００は、従来の一定電圧の印加直後に適切な摂動電圧を印加できるように、測定装置１００のファームウェアを次のように変更した。

本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置１００のファームウェアは、まず、予め定められた摂動電圧を発生させられる定数を測定装置１００のメモリに格納し、一定電圧を印加する時は、定められた定数をＤＡＣのレジスタに記録し、摂動電圧を印加する時は、定められた時間を周期として、前記メモリに格納された定数値を増加減させて、ＤＡＣのレジスタに記録する。

前記ＤＡＣのレジスタに記録された定数値に応じて、ストリップの２つの電極の間に当該電圧が印加される。

このような方法で印加した階段化されたはしご形摂動電圧の構造は、下記の表２に記述されている。

こうして用意された血糖値測定装置１００を用いて、調製された試料を測定する。この時、得られた感応電流をコンピュータに格納する。

血糖値計算式は、格納されたデータを分析し、最適な特徴点を抽出してフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）として作り、これらフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）からなる検定式を構成した後、多変数回帰分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により各フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）に対する係数を決定し、検定式を完成する。検定式は次の通りである。

ここで、ｉは第１感応電流および第２感応電流から得ることのできる１以上の電流値であり、使用されたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）は次の通りである。
ｆ_１＝ｉ ａｔ ５ｓｅｃ（一定電圧での感応電流）
ｆ_２＝ｉ ａｔ ５．４９２５ｓｅｃ（６番目の階段化されたはしご形の上る階段における１地点での感応電流）
ｆ_３＝ｉ ａｔ ５．４４２５ｓｅｃ（５番目の階段化されたはしご形の下る階段における１地点での感応電流）
ｆ_４＝ｃｕｒｖａｔｕｒｅ（５番目の階段化されたはしご形の下る階段の感応電流からなる曲率）
ｆ_５＝ｆ_１ ^２
ｆ_６＝ｆ_２ ^２
ｆ_７＝ｆ_３ ^２
ｆ_８＝ｆ_４ ^２
ｆ_９＝１／ｆ_１
ｆ_１０＝１／ｆ_２
ｆ_１１＝１／ｆ_３
ｆ_１２＝１／ｆ_４

前記のようなフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）からなるモデルを設定し、各試料に対して計算された血糖値を、多様な赤血球容積率の試料条件でＹＳＩで測定された値に一致させるために、第１実施例で用いられた測定装置で標準赤血球容積率４２％に対して対時間電流法だけによって得られた濃度と互いに近くなるように加重値を入れた後、各フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）の係数を多変数回帰法で最適化する。こうして得られた新たな検定式は、従来の対時間電流法による検定方式を維持しながらも、妨害物質の効果を最小化できる利点がある。

検定式は、一定電圧の印加後、摂動電圧を加えるように変形したファームウェアと共に測定装置に格納される。新たな検定式による結果は、図８および図９に示される。

図８は、本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を共に用いて得られた血糖測定値とＹＳＩ測定値との間の相関関係を示すグラフであり、図９は、本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を用いて得られた血糖測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響を示すグラフ（１００ｍｇ／ｄＬより小さい濃度に対しては絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。

図８を通じて明らかなように、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を共に用いて得られた血糖測定値とＹＳＩ測定値との間の相関関係が非常に緊密に現れることが分かり、図９を通じて明らかなように、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を用いて得られた血糖測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響がほぼ±５％以内に減少したことが分かる。

本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法について、図１０を参照して説明する。

図１０は、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法を示すフローチャートである。

図１０に示されているように、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法は、前記分析対象物質の酸化還元反応を触媒可能な酸化還元酵素と電子伝達媒体が固定されており、作動電極および補助電極を備えた試料セルに液状の生体試料を注入する段階Ｓ１１０と、前記分析対象物質の酸化還元反応を開示し電子伝達反応を進行させることができるように、前記作動電極に一定の直流電圧を印加して第１感応電流を得る段階Ｓ１２０と、前記一定の直流電圧を印加後、Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を印加して第２感応電流を得る段階Ｓ１３０と、前記第１感応電流または前記第２感応電流の２視点以上の特徴点から予め定められたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を計算する段階Ｓ１４０と、前記生体試料内の少なくとも２以上の妨害物質の影響が最小となるように、少なくとも１以上のフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）関数で構成された検定式を用いて、前記分析対象物質の濃度を計算する段階Ｓ１５０とを含む。

前記一定の直流電圧を印加後、Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を印加することは、前述のように、従来のＤＡＣ回路を用いて階段波形態からなる。

前記第１感応電流または前記第２感応電流から予め定められたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を計算する段階Ｓ１４０は、前記第１感応電流または前記第２感応電流の予め定められた特徴点での電流値をそのまま、または変形してフィーチャーを求めることを含む。

［第３実施例］温度を追加フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）として用いて、様々な範囲の温度で正確な血糖値を計算する検定式の例
本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられたストリップと測定装置を用いて、温度および赤血球容積率の影響を最小化した検定式を求めることができる。

本発明の好ましい第２実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた実験環境および試料と類似の実験環境と試料を使用する。

つまり、試料の用意において、赤血球容積率は１０、２０、４２、５５、７０％と、血糖濃度は５０、１３０、２５０、４００、６００ｍｇ／ｄＬの試料を用意し、実験は５、１２、１８、２３、３３、４３℃で実施した。

本発明の好ましい第３実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた測定装置１００は、第２実施例と同様に、使用された血糖測定装置において電圧印加部分を修正した。

本発明の好ましい第３実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた階段化されたはしご形摂動電圧の構造は、下記の表３に記述されている。

こうして用意された測定装置１００を用いて、調製された試料を各温度で測定する。この時、得られた感応電流をコンピュータに格納する。

血糖計算数式は、格納されたデータを分析し、最適な特徴点を抽出してフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）として作り、これらフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）からなる検定式を構成した後、多変数回帰分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により各フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）に対する係数を決定し、検定式を完成する。検定式は次の通りである。

ここで、ｉは第１感応電流および第２感応電流から得ることのできる１以上の電流値であり、Ｔは独立的に測定した温度値であり、使用されたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）は次の通りである。
ｆ_１＝ｉ ａｔ ５ｓｅｃ（一定電圧での感応電流）
ｆ_２＝ｉ ａｔ ５．２６７５ｓｅｃ（２番目の階段化されたはしご形の山から下る地点に位置した感応電流）
ｆ_３＝ｉ ａｔ ５．３６７５ｓｅｃ（３番目の階段化されたはしご形の谷から上る地点に位置した感応電流）
ｆ_４＝ｃｕｒｖａｔｕｒｅ（２番目の階段化されたはしご形の下る階段の感応電流からなる曲率）
ｆ_５＝Ｐｅａｋ−ｔｏ−Ｐｅａｋ（２番目の階段化されたはしご形の山と谷電圧との差）
ｆ_６＝ｆ_１ ^２
ｆ_７＝ｆ_２ ^２
ｆ_８＝ｆ_３ ^２
ｆ_９＝ｆ_４ ^２
ｆ_１０＝ｆ_５ ^２
ｆ_１１＝１／ｆ_１
ｆ_１２＝１／ｆ_４
ｆ_１３＝Ｔ
ｆ_１４＝Ｔ^２
ｆ_１５＝ｆ_１＊Ｔ

前記のようなフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）からなるモデルを設定し、本発明の好ましい第２実施例で説明しているように、基準設備ＹＳＩで測定された血糖値に基づき、多変数回帰法によりフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）の係数を最適化する。

こうして得られた検定式は、第２実施例と同様に、一定電圧の印加後、摂動電圧を加えるように変形したファームウェアと共に測定装置に格納される。新たな検定式により得られた結果は、図１１および図１２に示す。

図１１は、本発明の好ましい第３実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧および測定装置で測定した温度値を共に用いて得られた血糖測定値とＹＳＩ測定値との間の相関関係を示すグラフ（赤血球容積率１０、２０、４２、５５、７０％の試料を含む）である。

図１２は、本発明の好ましい第３実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧および測定装置で測定した温度値を共に用いて得られた血糖測定値の平均値に対する温度の影響を示すグラフ（赤血球容積率１０、２０、４２、５５、７０％の試料を含む。１００ｍｇ／ｄＬより小さい濃度に対しては絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。

血糖値の測定は、図１０に示されているように、血液の流入、一定電圧印加段階と、階段化されたはしご形摂動電圧印加段階と、感応電流からフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を計算する段階と、新たな検定式を用いて、正確な血糖値を得る段階とを含んで構成される。

［第４実施例］ケトン体測定のための検定式の例
本発明の好ましい第４実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、電気化学的バイオセンサ１０の試料セルは、スクリーン印刷された２つの炭素電極からなる使い捨てストリップであり、電極にケトン体脱水素化酵素および電子伝達媒体（１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ ｈｅｘａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）が塗布されている場合、２３℃で一定電圧を印加して感応電流を得て、ケトン体の濃度を計算する場合である。

赤血球容積率による偏差を確認するための血液実験は、第１実施例と類似して実施する。血液は２０、３０、４２、５０、６０、７０％の赤血球容積率を有する試料を用意する。

各赤血球容積率値に対して、０．１、０．５、１、２、３、４．２、５ｍｍｏｌ／Ｌのケトン体の濃度値に近い値となるように用意し、実際の各試料の血糖値は基準装備（ＲＸ Ｍｏｎａｃｏ、Ｒａｎｄｏｘ）で測定して決定する。

一方、測定装置は、前の実施例で用いられた血糖測定装置と同一構造の測定装置において、一定電圧に対する感応電流を記録する。

使用された印加電圧の形態は、血液流入から４秒まで２００ｍＶをストリップ内の２つの電極の間に印加し、次の４秒間は０ｍＶを印加し、その後２秒間再び２００ｍＶを印加する。

１０秒での電流値を各試料に対して記録する。

ケトン体測定計算式は、４２％の赤血球容積率の試料を基準として作成する。

ケトン体測定計算式は次の通りである。
Ｋｅｔｏｎｅ Ｂｏｄｙ＝ｓｌｏｐｅ＊ｉ_{ｔ＝１０ｓｅｃ}（１０秒での電流値）＋ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ

実験データに対して、ｓｌｏｐｅとｉｎｔｅｒｃｅｐｔを最小自乗法で計算して、検定式を求める。

このようなケトン体測定検定式を用いて、すべての赤血球容積率の試料に対して計算した結果は、図１３および図１４に示す。

図１３は、本発明の好ましい第４実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法によるケトン体測定値と基準装備測定値との間の相関関係を示すグラフであり、図１４は、本発明の好ましい第４実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法によるケトン体測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響を示すグラフ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌより小さい濃度に対しては１００を乗算した絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。

図１３および図１４に示されているように、対時間電流法によるケトン体測定値の平均値は、赤血球容積率が増加するほど傾きが減少することを確認することができる。

また、図１４に示されているように、対時間電流法によるケトン体測定値の赤血球容積率に対する傾向性は、４２％を基準として両端にいくほど偏差が増加することが分かる。

［第５実施例］一定電圧と摂動電圧を印加した後の特徴点から抽出したフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を用いたケトン体測定のための検定式の例
本発明の好ましい第４実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられたストリップと測定装置を用いて、一定電圧と摂動電圧を印加した後の特徴点から抽出したフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を用いた、ケトン体測定のための検定式を求めることができる。

本発明の好ましい第４実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法に用いられた実験環境および試料と同一の実験環境と試料を使用する。

測定装置は、第４実施例で用いられた測定装置において電圧印加部分が異なる。つまり、従来の一定電圧の印加直後に、次の表で記述された摂動電圧を印加できるように、測定器のファームウェアを変更した。

本発明の好ましい第５実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、印加された電圧の形態は、第４実施例で用いられた電圧の真後に、下記の表４に記述されている階段化されたはしご形摂動電圧を印加する。

こうして用意された測定装置を用いて、調製された試料を測定する。この時、得られた感応電流をコンピュータに格納する。

血糖計算数式は、格納されたデータを分析し、最適な特徴点を抽出してフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）として作り、これらフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）からなる検定式を構成した後、多変数回帰分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により各フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）に対する係数を決定し、検定式を完成する。

ケトン体測定のための検定式は次の通りである。

ここで、ｉは第１感応電流および第２感応電流から得ることのできる１以上の電流値であり、使用されたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）は次の通りである。
ｆ_１＝ｃｕｒｒｅｎｔ ａｔ １０ｓｅｃ（一定電圧での感応電流）
ｆ_２＝ｃｕｒｒｅｎｔ ａｔ ８．１２ｓｅｃ（一定電圧の初期の感応電流）
ｆ_３＝ｃｕｒｒｅｎｔ ａｔ １０．２７ｓｅｃ（３番目の階段化されたはしご形の谷付近電圧での感応電流）
ｆ_４＝ｃｕｒｒｅｎｔ ａｔ １０．４９２５ｓｅｃ（５番目の階段化されたはしご形の谷付近電圧での感応電流）
ｆ_５＝ｃｕｒｖａｔｕｒｅ（５番目の階段化されたはしご形の下る階段の感応電流からなる曲率）
ｆ_６＝ｆ_１ ^２
ｆ_７＝ｆ_２ ^２
ｆ_８＝ｆ_３ ^２
ｆ_９＝ｆ_４ ^２
ｆ_１０＝ｆ_５ ^２
ｆ_１１＝１／ｆ_１
ｆ_１２＝１／ｆ_５

前記のようなフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）からなるモデルを設定し、各試料に対して計算された血糖の値を、多様な赤血球容積率の試料条件で基準装備で測定された値に一致させるようにするために、標準赤血球容積率４２％で対時間電流法だけによって得られた濃度と互いに近くなるように加重値を入れた後、各フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）の係数を多変数回帰法で最適化する。

こうして得られた検定式は、一定電圧の印加後、摂動電圧を加えるように変形したファームウェアと共に測定装置に格納される。図１５および図１６に検定式を用いた結果を示した。

図１５は、本発明の好ましい第５実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を用いて得られたケトン体測定値と基準装備測定値との間の相関関係を示すグラフであり、図１６は、本発明の好ましい第５実施例による生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、対時間電流法と階段化されたはしご形摂動電圧を用いて得られたケトン体測定値の平均値に対する赤血球容積率の影響を示すグラフ（１．０ｍｍｏｌ／Ｌより小さい濃度に対しては１００を乗算した絶対誤差と表示し、それ以上の濃度に対しては相対誤差（％）と表示する）である。

本発明の好ましい第１実施例と第２実施例とを比較し、第3実施例と第４実施例とを比較すると、本発明の好ましい実施形態にかかる生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法の提供する効果が明確に分かる。

つまり、一般に使用される対時間電流法による測定装置において、通常のバイオセンサをそのまま使用し、通常の電圧印加方式に階段化されたはしご形摂動電圧（図１）を短時間にだけ追加して、赤血球容積率のような妨害因子のバックグラウンド効果（Ｍａｔｒｉｘ ｅｆｆｅｃｔ）の影響が最小化された結果値を、追加的な補正式の使用なしに、検定式から直ちに得ることができる。

また、本発明の好ましい第３実施例から明らかなように、測定装置で測定した温度値を追加的なフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）として用いて検定式を得ると、バックグラウンド効果および温度効果とも最小化された測定結果を簡単な演算で得ることができる。

１０：電気化学的バイオセンサ（ストリップ）
１００：測定装置
１１０：コネクタ
１２０：電流−電圧変換器
１３０：ＤＡＣ
１４０：ＡＤＣ
１５０：マイクロコントローラ

Claims (15)

1. 生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法において、
   前記分析対象物質の酸化還元反応を触媒可能な酸化還元酵素と電子伝達媒体が固定されており、作動電極および補助電極を備えた試料セルに液状の生体試料を注入する段階と、
   前記分析対象物質の酸化還元反応を開示し電子伝達反応を進行させることができるように、前記作動電極に一定の直流電圧を印加して第１感応電流を得る段階と、
   前記一定の直流電圧を印加後、Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を印加して第２感応電流を得る段階と、
   前記第１感応電流または前記第２感応電流から、２視点以上の特徴点から予め定められたフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）を計算する段階と、
   前記生体試料内の少なくとも１以上の妨害物質の影響が最小となるように、少なくとも１以上のフィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）関数で構成された検定式を用いて、前記分析対象物質の濃度を計算する段階とを含むことを特徴とする、生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
2. 前記Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧の特徴は、各階段の高さ（Ｖ_ｓｔｅｐ）、各階段の印加時間（ｔ_ｓｔｅｐ）、全体変化範囲における中間電圧と一定電圧との差（Ｖ_{ｃｅｎｔｅｒ}）、中間電圧と山電圧値との差（Ｖ_ｐｅａｋ）、全体の階段化されたはしご形波の山電圧値と隣接する次の階段化されたはしご形波の山電圧値との時間差（ｔ_{ｃｙｃｌｅ}）からなることを特徴とする、請求項１に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
3. 前記第２感応電流は、第１感応電流を得た後、０．１〜１秒以内に得られることを特徴とする、請求項１に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
4. 前記一定の直流電圧と前記Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧は、マイクロコントローラに連動する同一のデジタル−アナログコンバータ回路を介して前記作動電極に印加されるように構成されることを特徴とする、請求項１に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
5. 前記第１または第２感応電流から前記分析対象物質と妨害物質に対する線形依存性が異なる特徴点を選択し、前記特徴点でフィーチャーを構成し、前記フィーチャーで構成した検定式を作ることを特徴とする、請求項１に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
6. 前記特徴点で前記フィーチャーを作る方法は、特定の階段化されたはしご形の山および谷電圧付近の第２感応電流、前記階段化されたはしご形摂動電圧において各階段の感応電流からなる曲線の曲率、前記階段化されたはしご形摂動電圧の山での電流値と谷での電流値との差、上りと下りとの中間の階段化されたはしご形摂動電圧での感応電流、各階段化されたはしご形摂動電圧のサイクルの開始および終了地点での感応電流、および階段化されたはしご形摂動電圧から得られた感応電流の平均値のうちの１つを用いたり、これから得られた電流値を、四則演算、指数、ログ、三角関数などの数学的関数で表現して得ることのできる値を用いることを特徴とする、請求項５に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
7. 前記検定式は、前記フィーチャーを線形に結合した前記フィーチャー関数に対して多変数回帰分析を適用して得られ、前記検定式は、電極の材質、電極の配列方式、流路の形状、使用される試薬の特性に応じて異なることを特徴とする、請求項１に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
8. 前記分析対象物質は、ｇｌｕｃｏｓｅ、β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ｌａｃｔａｔｅ、ｐｙｒｕｖａｔｅ、ａｌｃｏｈｏｌ、ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ、ｕｒｉｃ ａｃｉｄ、ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｕｒｉａ、ｃｒｅａｔｉｎｅ、ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ケトン体のうちの１つであることを特徴とする、請求項７に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
9. 前記酸化還元酵素は、グルコース酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ、ＧＯｘ）、グルコース脱水素化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＤＨ）、グルタメート酸化酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ）、グルタメート脱水素化酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、コレステロール酸化酵素、コレステロールエステル化酵素、ラクテート酸化酵素、アスコルビン酸酸化酵素、アルコール酸化酵素、アルコール脱水素化酵素、ビリルビン酸化酵素、ケトン体脱水素化酵素のうちの１つであることを特徴とする、請求項７に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
10. 前記電子伝達媒体は、ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ、ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ ｈｅｘａｍｉｎｅ（ＩＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ、１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ−５，６−ｄｉｏｎｅ、ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅあるいはｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅをリガンドとして有するｏｓｍｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ、２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，４−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、２，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−１，４−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、３，７−ｄｉａｍｉｎｏ−５−ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｉｕｍｔｈｉｏｎｉｎｅ、１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ、ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅのうちの１つであることを特徴とする、請求項１に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
11. 前記一定の直流電圧は、０−８００ｍＶの範囲の電圧で、１秒以上１分以内の時間の間持続的または間欠的に印加され、前記第１感応電流は、前記一定の直流電圧が印加されている間に１回または数回測定することを特徴とする、請求項１に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
12. 前記階段化されたはしご形電圧は、１つの階段の高さ（Ｖ_ｓｔｅｐ）が０．５〜２０ｍＶであり、前記１つの階段の持続時間（ｔ_ｓｔｅｐ）が０．００１〜０．１秒であり、前記階段化されたはしご形電圧の中心電圧と前記一定の直流電圧との差（Ｖ_{ｃｅｎｔｅｒ}）が−１５０〜１５０ｍＶであり、前記階段化されたはしご形電圧の中心電圧と山または谷電圧との差（Ｖ_ｐｅａｋ）が５〜１５０ｍＶであり、前記階段化されたはしご形電圧の周期または１つの山と隣接する他の１つの山との間の時間間隔（ｔ_{ｃｙｃｌｅ}）が０．０１〜１秒の範囲内の値であることを特徴とする、請求項２に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
13. 前記フィーチャー関数は、前記一定の直流電流から得られた感応電流値を用いる関数、前記階段化されたはしご形電圧から得られた感応電流値を用いる関数、前記フィーチャー関数は、測定装置で測定した温度値を用いる関数、測定された感応電流値を、四則演算、指数、ログ、三角関数などの数学的関数で表現して得ることのできる関数であることを特徴とする、請求項１に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定方法。
14. 生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置において、
    前記分析対象物質の酸化還元反応を触媒可能な酸化還元酵素と電子伝達媒体が固定されており、作動電極および補助電極を備えた試料セルが挿入されるコネクタと、
    前記分析対象物質の酸化還元反応を開示し電子伝達反応を進行させるための一定の直流電圧と、前記一定の直流電圧に続いて、前記試料セルの電位を揺動させるための、Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を印加するためのデジタル−アナログコンバータ回路と、
    前記デジタル−アナログコンバータ回路を制御し、前記Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を用いて、検定式から直接前記分析対象物質の濃度値を求めるマイクロコントローラとを含むことを特徴とする、生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置。
15. 前記マイクロコントローラは、予め定められた前記Λ状の階段化されたはしご形摂動電圧を発生させられる定数値を格納し、一定電圧を印加する時は、定められた定数を前記デジタル−アナログコンバータのレジスタに記録し、前記摂動電圧を印加する時は、定められた時間を周期として、前記定数値を増加減させてデジタル−アナログコンバータ回路のレジスタに記録して、前記デジタル−アナログコンバータが前記デジタル−アナログコンバータ回路のレジスタに記録された定数値に応じて、前記２つの電極の間に前記一定電圧または摂動電圧を印加するようにすることを特徴とする、請求項１４に記載の生体試料内の分析対象物質の濃度測定装置。
    

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