JP5928937B2 - Cell analysis apparatus and cell analysis method - Google Patents
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Description
本発明は、細胞集団から高密度に単一細胞を捕捉し、当該細胞の細胞情報をハイスループットに解析するための装置、及び当該装置を用いた細胞解析方法に関する。 The present invention relates to an apparatus for capturing single cells at a high density from a cell population and analyzing cell information of the cells with high throughput, and a cell analysis method using the apparatus.
細胞診断、細胞医療を始めとする先端、先進医療の実現に向けた研究開発の進展に伴い、その基盤技術である細胞解析システムの重要性はますます高まっている。フローサイトメーターは、細胞の大きさや内部構造、またはCluster of differentiation (CD) 抗原に基づく蛍光シグナルを指標に、細胞集団から個々の細胞情報をハイスループットに解析できるため、医療分野での血球分析検査や細胞集団のプロファイリングを始めとして、細胞解析システムの中で最も汎用的に用いられている。 With the advancement of cell diagnosis, cell therapy, and other advanced technologies, as well as research and development toward the realization of advanced medicine, the importance of cell analysis systems, which are the basic technology, is increasing. The flow cytometer enables high-throughput analysis of individual cell information from a cell population using the cell size, internal structure, or fluorescence signal based on the Cluster of differentiation (CD) antigen as an indicator. And most commonly used in cell analysis systems, including profiling of cell populations.
例えば、細胞群の情報を簡便に取得する手段として、細胞分析デバイス上のマイクロ流路を通過する蛍光標識された細胞を、光電子増倍管 (Photomultiplier tube: PMT) や電荷結合素子 (Charge-coupled Device: CCD) から構成される光学検出装置により検出することで、5〜30 μｌの細胞懸濁液から5〜100 cells/secのスループットで細胞分析できることが報告されている(非特許文献１−３)。また、最近では、細胞群に含まれる個々の細胞をマイクロアレイ上に集積・捕捉し、蛍光顕微鏡やマイクロアレイスキャナーで画像解析するデバイスが構築されており、10,000〜25,000 cellsを一括して解析できることが報告されている(非特許文献４−７)。 For example, as a means of easily obtaining cell group information, fluorescently labeled cells that pass through a microchannel on a cell analysis device are converted into photomultiplier tubes (PMT) or charge-coupled devices (Charge-coupled devices). It has been reported that cell analysis can be performed at a throughput of 5 to 100 cells / sec from a 5 to 30 μl cell suspension by detecting with an optical detection device comprising a device (CCD) (Non-patent Document 1). 3). Recently, a device has been constructed that collects and captures individual cells in a group of cells on a microarray and analyzes the images using a fluorescence microscope or microarray scanner, and reports that 10,000 to 25,000 cells can be analyzed collectively. (Non-Patent Documents 4-7).
フローサイトメーターは、最も汎用的な細胞解析システムであるものの、非常に高価であること、分析の前準備 (セットアップ) が煩雑であること、操作に熟練した技術を必要とすることなどの理由から、近年、より簡便に細胞群の情報を取得できる微小細胞分析デバイスの開発が求められている。また、上記の微小細胞分析デバイスにおいても、検出器としてPMTやCCDといった外部検出システムや顕微システムが設けられおり、装置の小型化、低価格化という問題は解消されていない。また、アレイ化された細胞に対し蛍光顕微鏡やマイクロアレイスキャナーを用いたイメージ解析を行う場合には、マイクロアレイを走査する必要があることから、スループット性の向上には限界がある。 Although the flow cytometer is the most general-purpose cell analysis system, it is very expensive, complicated to prepare for the analysis (setup), and requires skill in operation. In recent years, there has been a demand for development of a microcell analysis device that can more easily acquire information on a cell group. Also, in the above microcell analysis device, an external detection system such as PMT or CCD or a microscopic system is provided as a detector, and the problems of downsizing and cost reduction of the apparatus have not been solved. Further, when image analysis is performed on the arrayed cells using a fluorescence microscope or a microarray scanner, it is necessary to scan the microarray, and thus there is a limit to improving the throughput.
斯かる状況の下、本出願人は、各撮像素子の周囲に隔壁 (Micro-partition) を形成し、各撮像素子上に直接細胞を収容した後に細胞に由来する光シグナルを検出する撮像装置(フォトセンサ)を開発した（特許文献１）。これによれば、フォトセンサ上にアレイ化された全細胞情報を同時並列的に取得できることから、ハイスループット性を保持したまま、更なるシステム全体の小型化・低価格化が可能となる。
しかしながら、一つの撮像素子上に複数個の細胞が収容されてしまうことを避けること、全48,000撮像素子上に細胞を収容することは困難であった。
Under such circumstances, the present applicant forms a partition (Micro-partition) around each imaging device, and after receiving cells directly on each imaging device, detects an optical signal derived from the cells ( Photosensor) was developed (Patent Document 1). According to this, since all cell information arrayed on the photosensor can be acquired simultaneously in parallel, further downsizing and cost reduction of the entire system can be achieved while maintaining high throughput.
However, it has been difficult to avoid accommodating a plurality of cells on one image sensor and to accommodate cells on all 48,000 image sensors.
本発明は、試料中の大量の細胞を、ダメージを与えることなく高密度に単一細胞レベルで捕捉し、当該細胞の細胞情報をハイスループットに解析可能な細胞解析装置、及び当該装置を用いた細胞解析方法を提供することに関する。 The present invention uses a cell analysis apparatus capable of capturing a large amount of cells in a sample at a single cell level with high density without causing damage and analyzing the cell information of the cells with high throughput, and the apparatus. The present invention relates to providing a cell analysis method.
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（５）に係るものである。
（１）受光面を上方向に向けて設けられた光電変換素子を有する撮像装置の受光面に、試料中の細胞を捕捉可能なマイクロキャビティアレイを具備するマイクロ流路デバイスが構築された細胞解析装置。
（２）前記マイクロ流路デバイスが、撮像装置の受光面に載置され、撮像装置の受光面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップする試料貯留溝を形成するための開口窓が設けられた下部基板と、
前記下部基板の上面に積層載置され、細胞捕捉用の孔径、孔数、及び配置が制御された複数の微細貫通孔と、試料溶液を供給排出するための貫通孔を有するマイクロキャビティアレイと、
前記マイクロキャビティアレイの上面にフレームシールを介して積層載置され、該マイクロキャビティアレイの上側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部と、該マイクロキャビティアレイの下側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部を備え、該マイクロキャビティアレイの微細貫通孔上面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップするチャンバーを形成するための開口窓が設けられた上部平板、を含む上記（１）の細胞解析装置。
（３）マイクロキャビティアレイの微細貫通孔の孔径が２〜２０μｍで、孔間隔が１０〜１００μｍである上記（２）の細胞解析装置。
（４）上部平板が、プラスチック、ガラス又は金属製である上記（２）又は（３）の細胞解析装置。
（５）上記（１）〜（４）の細胞解析装置を用いて、試料中に含まれる細胞をマイクロキャビティアレイに捕捉し、光照射下、細胞由来のシグナルを撮像することを特徴とする細胞解析方法。
That is, the present invention relates to the following (1) to (5).
(1) Cell analysis in which a microchannel device having a microcavity array capable of capturing cells in a sample is constructed on the light-receiving surface of an imaging device having a photoelectric conversion element provided with the light-receiving surface facing upward apparatus.
(2) The microchannel device is mounted on the light receiving surface of the imaging device, and an opening window is provided for forming a sample storage groove for trapping a sample solution containing cells in cooperation with the light receiving surface of the imaging device. A lower substrate,
A plurality of fine through-holes stacked and mounted on the upper surface of the lower substrate and controlled in cell diameter, number of holes, and arrangement, and a microcavity array having through-holes for supplying and discharging a sample solution;
A sample injection / suction part for supplying or aspirating a sample from the upper side of the microcavity array and a sample from the lower side of the microcavity array are stacked and mounted on the upper surface of the microcavity array. Or an upper flat plate provided with an opening window for forming a chamber for trapping a sample solution containing cells in cooperation with the upper surface of the fine through-holes of the microcavity array, comprising a sample injection / suction part for aspiration, The cell analysis device according to (1), comprising:
(3) The cell analysis device according to the above (2), wherein the pore diameter of the fine through hole of the microcavity array is 2 to 20 μm and the hole interval is 10 to 100 μm.
(4) The cell analysis device according to (2) or (3), wherein the upper flat plate is made of plastic, glass, or metal.
(5) A cell characterized in that cells contained in a sample are captured by a microcavity array using the cell analysis device according to (1) to (4) above, and a cell-derived signal is imaged under light irradiation. analysis method.
本発明の細胞解析装置は、小型かつ廉価で構築でき、これを用いれば、マイクロキャビティアレイ上に細胞を含む試料を滴下し、吸引するという操作のみで、細胞を高密度・高効率で捕捉可能であり、個々の細胞情報を同時並列に検出することができる。すなわち、簡易な操作で且つ安価に、個々の細胞の細胞情報を得ることができ、汎用性が極めて高い。また、撮像装置上の約5万の個々の検出素子の一つ一つに細胞を配置することができ、最大で約5万個の細胞シグナルを一括取得することが可能となり、従来までの微小細胞分析デバイスと同等以上のスループットを有する。 The cell analyzer of the present invention can be constructed in a small size and at a low cost. By using this device, cells can be captured with high density and high efficiency simply by dropping a sample containing cells onto a microcavity array and sucking it. And individual cell information can be detected simultaneously in parallel. That is, cell information of individual cells can be obtained with a simple operation and at a low cost, and the versatility is extremely high. In addition, cells can be placed on each of the approximately 50,000 individual detection elements on the imaging device, making it possible to collect up to approximately 50,000 cell signals at a time. It has a throughput equivalent to or better than that of cell analysis devices.
以下、本発明の実施の形態を図示例と共に説明する。
図１（Ａ）及び図２（Ａ）は、本発明の細胞解析装置の組立図であり、図１（Ｂ）及び図２（Ｂ）はその縦断面図である。この細胞解析装置は、図１及び図２に示すように、撮像装置と、下部基板２、マイクロキャビティアレイ３、フレームシール４、上部平板５を含むマイクロ流路デバイスとを備える。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
1 (A) and 2 (A) are assembly drawings of the cell analysis device of the present invention, and FIGS. 1 (B) and 2 (B) are longitudinal sectional views thereof. As shown in FIGS. 1 and 2, the cell analysis apparatus includes an imaging apparatus and a microchannel device including a lower substrate 2, a microcavity array 3, a frame seal 4, and an upper plate 5.
（１）マイクロ流路デバイス
本発明の細胞解析装置において、撮像装置の受光面に構築されるマイクロ流路デバイスについて以下に説明する。
すなわち、マイクロ流路デバイスは、撮像装置の受光面１３に載置された下部基板２と、当該下部基板２の上面に積層載置されたマイクロキャビティアレイ３と、当該マイクロキャビティアレイ３の上面にフレームシール４を介して積層載置された上部平板５を含んで構築され、
前記下部基板２には、撮像装置の受光面１３と協働して細胞を含む試料溶液をトラップする試料液貯留溝を形成するための開口窓１２が設けられ、
マイクロキャビティアレイ３には、細胞捕捉用の孔径、孔数、及び配置が制御された複数の微細貫通孔９と、試料溶液を供給排出するための貫通孔８が設けられ、
前記上部平板５は、マイクロキャビティアレイ３の上側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部６と、マイクロキャビティアレイ３の下側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部７を備え、マイクロキャビティアレイ上面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップするチャンバーを形成するための開口窓１１が設けられている。
(1) Microchannel device In the cell analyzer of the present invention, a microchannel device constructed on the light receiving surface of an imaging device will be described below.
That is, the microchannel device includes the lower substrate 2 placed on the light receiving surface 13 of the imaging apparatus, the microcavity array 3 placed on the upper surface of the lower substrate 2, and the upper surface of the microcavity array 3. Constructed including an upper flat plate 5 stacked and mounted via a frame seal 4;
The lower substrate 2 is provided with an opening window 12 for forming a sample solution storage groove for trapping a sample solution containing cells in cooperation with the light receiving surface 13 of the imaging device,
The microcavity array 3 is provided with a plurality of fine through holes 9 in which the hole diameter, the number of holes, and the arrangement of the cells are controlled, and the through holes 8 for supplying and discharging the sample solution.
The upper flat plate 5 includes a sample injection / suction unit 6 for supplying or sucking a sample from the upper side of the microcavity array 3 and a sample injection / suction unit for supplying or sucking a sample from the lower side of the microcavity array 3. 7 and an opening window 11 for forming a chamber for trapping a sample solution containing cells in cooperation with the upper surface of the microcavity array.
上部平板５は、マイクロキャビティアレイ３の上面にフレームシール４を介して積層され、マイクロキャビティアレイ３の上側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部６と、マイクロキャビティアレイ３の下側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部７を備え、マイクロキャビティアレイ３上面と協働して試料溶液をトラップするチャンバーを形成するための開口窓１１が設けられた平板であれば特に制限されない。 The upper flat plate 5 is laminated on the upper surface of the microcavity array 3 via a frame seal 4, and a sample injection / suction unit 6 for supplying or sucking a sample from the upper side of the microcavity array 3, A flat plate provided with a sample injection / suction unit 7 for supplying or sucking a sample from the side and provided with an opening window 11 for forming a chamber for trapping a sample solution in cooperation with the upper surface of the microcavity array 3. There is no particular limitation.
試料注入・吸引部６は、マイクロキャビティアレイ３の微細貫通孔に連通し、試料注入・吸引部７は、マイクロキャビティアレイ３に形成された貫通孔８と協働して下部基板２の試料液貯留溝に連通している。
すなわち、細胞を含む試料溶液（細胞懸濁液）が試料注入・吸引部６に注入された場合、試料溶液はマイクロキャビティアレイ上面に供給され、試料注入・吸引部７に接続された吸引手段により吸引することにより、溶液はマイクロキャビティアレイの微細貫通孔９、試料液貯留溝、貫通孔８を順次経由して排出され、このときに細胞がマイクロキャビティアレイの微細貫通孔の上端開口部に１個ずつ捕捉される（図１参照）。一方、細胞を含む試料が試料注入・吸引部７から注入された場合は、細胞を含む試料溶液は、下部基板２と撮像装置の受光面１３で形成される試料液貯留溝に供給され、試料注入・吸引部６に接続された吸引手段により吸引することにより、細胞がマイクロキャビティアレイの微細貫通孔の下端開口部に１個ずつ捕捉される（図２参照）。
The sample injection / suction unit 6 communicates with the fine through-holes of the microcavity array 3, and the sample injection / suction unit 7 cooperates with the through-holes 8 formed in the microcavity array 3 and the sample liquid on the lower substrate 2. It communicates with the storage groove.
That is, when a sample solution (cell suspension) containing cells is injected into the sample injection / suction unit 6, the sample solution is supplied to the upper surface of the microcavity array and is sucked by a suction means connected to the sample injection / suction unit 7. By aspirating, the solution is discharged through the microcavity array through the fine through-holes 9, the sample solution storage groove, and the through-hole 8 in this order, and at this time, the cell is 1 at the upper end opening of the microcavity array. Individually captured (see FIG. 1). On the other hand, when a sample containing cells is injected from the sample injection / suction unit 7, the sample solution containing cells is supplied to the sample solution storage groove formed by the lower substrate 2 and the light receiving surface 13 of the imaging device. By sucking with a suction means connected to the injection / suction unit 6, cells are captured one by one at the lower end opening of the micro through-hole of the microcavity array (see FIG. 2).
上記細胞を含む試料溶液の吸引は、ポンプ、減圧吸引等の手段を用いて行うことができるが、低減圧吸引条件が可能な吸引ポンプ、具体的にはチューブポンプ、プランジャポンプ、ペリスタルティックポンプ等の微小流量を制御可能なマイクロポンプを用いて行うのが好ましい。吸引圧としては、細胞の破壊と捕捉効率を考慮し、−１０ｋＰａ〜−０．１ｋＰａ、好ましくは−５ｋＰａ〜−１ｋＰａとするのがよい。
また、当該吸引手段は、試料送出ラインを介して接続しておくことができる。
The sample solution containing the cells can be sucked using means such as a pump, vacuum suction, etc., but suction pumps capable of reducing pressure suction conditions, specifically tube pumps, plunger pumps, peristaltic pumps, etc. It is preferable to use a micro pump capable of controlling the minute flow rate. The suction pressure is -10 kPa to -0.1 kPa, preferably -5 kPa to -1 kPa, considering cell destruction and trapping efficiency.
The suction means can be connected via a sample delivery line.
開口窓１１は、マイクロキャビティの全微細貫通孔が露出する大きさのものが好ましく、窓の形状は円形、正方形等の矩形を具体的に例示することができる。 The opening window 11 is preferably of a size that exposes all the fine through holes of the microcavity, and the shape of the window can be specifically exemplified by a rectangle such as a circle or a square.
上部平板５の材質は、特に限定されず、プラスチック、ガラス、金属等何れでもよい。プラスチックとしては、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ、ＰＣ、硬質ポリエチレン製等の硬質プラスチックを好適に例示でき、マイクロキャビティアレイとの密着性の点でＰＤＭＳが好ましい。 The material of the upper flat plate 5 is not particularly limited, and may be any of plastic, glass, metal and the like. As the plastic, for example, a hard plastic such as PDMS (polydimethylsiloxane), PMMA, PC, or hard polyethylene can be suitably exemplified, and PDMS is preferable in terms of adhesion to the microcavity array.
上部平板５は、フレームシール４を介してマイクロキャビティアレイ３に積層されるが、これにより、チャンバーの開口窓とマイクロキャビティアレイとの粘着性（密着性）が高められ、試料液の漏出を防止することができる。
フレームシール４の形状は、前記上部平板５と同一の形状とすることが好ましいが、少なくともマイクロキャビティアレイ３の微細貫通孔部分と貫通孔８を含む周辺が液密にシールされれば特に限定されない。
The upper flat plate 5 is laminated on the microcavity array 3 via the frame seal 4, which improves the adhesion (adhesion) between the opening window of the chamber and the microcavity array, and prevents the sample liquid from leaking out. can do.
The shape of the frame seal 4 is preferably the same as the shape of the upper flat plate 5, but is not particularly limited as long as at least the periphery including the fine through hole portion of the microcavity array 3 and the through hole 8 are sealed in a liquid-tight manner. .
マイクロキャビティアレイ３は、細胞捕捉用の孔径、孔数、及び配置が制御された複数の微細貫通孔９と、前記上部平板５の試料注入・吸引部７に対応する位置に貫通孔８が設けられている。
微細貫通孔の形状は、反すり鉢状又は円筒状であり、これにより確実に細胞を１細胞レベルで分離・捕捉することが可能となる。
微細貫通孔の上端開口径は、捕捉する細胞の径よりも少し小さい径とされ、２〜２０μｍとすることができる。また、微細貫通孔の数は、１００〜１０００００、好ましくは１０００〜１００００である。また、微細貫通孔の中心間の距離を１０〜１００μｍ、好ましくは１５〜７０μｍ、さらに好ましくは２０〜６０μｍとすることで細胞の捕捉効率を高めることができる。したがって、１０００００個の微細貫通孔を備えたマイクロキャビティアレイの大きさは、０．８ｃｍ×２ｃｍ程度になる。
微細貫通孔の孔径及び微細貫通孔の中心間の距離は、各撮像素子のサイズと配列間隔に応じて決めるのが良く、例えば、撮像素子（３０μｍ×３０μｍ）が５０μｍ間隔で整列している場合は、孔径２〜２０μｍ、孔間隔５０μｍのものを用いるのが良い。
The microcavity array 3 is provided with a plurality of fine through-holes 9 in which the diameter, number of holes, and arrangement of the cell-capturing holes are controlled, and through-holes 8 at positions corresponding to the sample injection / suction part 7 of the upper flat plate 5. It has been.
The shape of the fine through hole is an anti-mortar shape or a cylindrical shape, which makes it possible to reliably separate and capture cells at the level of one cell.
The upper end opening diameter of the fine through hole is set to be slightly smaller than the diameter of the cell to be captured, and can be 2 to 20 μm. The number of fine through holes is 100 to 100,000, preferably 1000 to 10,000. Moreover, the cell capture efficiency can be increased by setting the distance between the centers of the fine through holes to 10 to 100 μm, preferably 15 to 70 μm, and more preferably 20 to 60 μm. Therefore, the size of the microcavity array having 100,000 fine through holes is about 0.8 cm × 2 cm.
The hole diameter of the fine through-holes and the distance between the centers of the fine through-holes should be determined according to the size and arrangement interval of the image pickup elements. For example, when the image pickup elements (30 μm × 30 μm) are aligned at intervals of 50 μm Is preferably used with a pore diameter of 2 to 20 μm and a hole interval of 50 μm.
また、マイクロキャビティアレイとしては、電鋳技術を用いてニッケル基板に形成された微細貫通孔を有するものや、レーザー技術を用いてガラス基板、好ましくは石英基板に形成された微細貫通孔を有するものや、プラスチックを加工したものを好適に例示することができる。プラスチックの材質としては、自家蛍光の少ない材質が好ましく、具体的には、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート樹脂）、ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル樹脂）、ＰＣ（ポリカーボネート樹脂）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー樹脂）、エポキシ等のプラスチックを例示することができるが、レーザー加工による熱変形が少なく、加工精度が高い点でＰＥＴが好ましい。 The microcavity array has a fine through-hole formed in a nickel substrate using an electroforming technique, or a fine through-hole formed in a glass substrate, preferably a quartz substrate, using a laser technique. Moreover, what processed the plastic can be illustrated suitably. As the plastic material, a material with less autofluorescence is preferable. Specifically, PET (polyethylene terephthalate resin), PMMA (polymethyl methacrylate resin), PC (polycarbonate resin), COP (cycloolefin polymer resin), epoxy Examples of such plastics can be exemplified, but PET is preferable in that thermal deformation due to laser processing is small and processing accuracy is high.
下部基板２は、マイクロ流路デバイスの外枠であり、減圧吸引条件下に、撮像装置の受光面１３及びマイクロキャビティアレイ３との隙間を気密に維持しうる平板形状をなしている。マイクロキャビティアレイ３の微細貫通孔９と貫通孔８の下方に相当する位置に、撮像装置の受光面１３と協働して試料溶液をトラップする試料液貯留溝を形成するための開口窓１２が設けられている。開口窓の形状は、マイクロキャビティアレイ３の微細貫通孔９と貫通孔８が含まれれば特に制限されない。 The lower substrate 2 is an outer frame of the micro-channel device, and has a flat plate shape that can keep the gap between the light-receiving surface 13 of the imaging device and the microcavity array 3 airtight under reduced pressure suction conditions. An opening window 12 for forming a sample liquid storage groove for trapping the sample solution in cooperation with the light receiving surface 13 of the imaging device is provided at a position corresponding to the lower side of the micro through holes 9 and the through holes 8 of the microcavity array 3. Is provided. The shape of the opening window is not particularly limited as long as the fine through holes 9 and the through holes 8 of the microcavity array 3 are included.
斯かる下部基板２は、所望の形状に整形したプラスチック製の平板を撮像措置の受光面１３に通常の接着手段を用いて接着固定してもよいが、フレームシール等を用いて光面上に同形状に形成するのが好ましい。
プラスチック製の平板を用いる場合、その材質は、マイクロキャビティアレイに比較して軟質のプラスチックとするのが好ましい。これにより、下部基板とマイクロキャビティアレイとの粘着性（密着性）を高められ、試料液の漏出を防止することができる。
尚、撮像装置に用いる撮像デバイスや照射光波長に応じて、最適なイメージコントラストが得られるように撮像装置上面とマイクロキャビティアレイ間の距離を調整すべく、下部平板の厚さ（高さ）は適宜変更することができる。例えば、２５μｍ〜２０００μｍ、とするのが好ましい。
Such a lower substrate 2 may be a plastic flat plate shaped into a desired shape and bonded and fixed to the light receiving surface 13 of the image pickup device using a normal bonding means, but it may be mounted on the light surface using a frame seal or the like. It is preferable to form in the same shape.
When a plastic flat plate is used, the material is preferably a soft plastic compared to the microcavity array. Thereby, the adhesiveness (adhesion) between the lower substrate and the microcavity array can be enhanced, and leakage of the sample liquid can be prevented.
Note that the thickness (height) of the lower plate is adjusted to adjust the distance between the upper surface of the imaging device and the microcavity array so that an optimum image contrast can be obtained according to the imaging device used in the imaging device and the wavelength of irradiation light. It can be changed as appropriate. For example, it is preferable to set it as 25 micrometers-2000 micrometers.
尚、マイクロ流路デバイス内に細胞を含む試料を注入するに際し、マイクロ流路デバイスの内面やマイクロキャビティの上面を非イオン性界面活性剤であらかじめ処理しておくことが、細胞の付着を防除する上で好ましい。この非イオン性界面活性剤処理に先だって、表面プラズマ処理をすることがより好ましい。かかる非イオン性界面活性剤としては、ブロックポリマー型エーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル（シュガーエステル）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルを例示することができるが、ブロックポリマー型エーテル、特にポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤が好ましい。上記ブロックポリマー型 エーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＰ１２３）、ポリオキシエチレンオキシプロピレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ４Ｐ．Ｏ）を挙げることができる。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、例えば、水素添加ヒマシ油ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン水素添加ヒマシ油等を挙げることができる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリソルベート４０（ツイーン４０）、ポリソルベート６０（ツイーン６０）、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ）を挙げることができる。例えば、プルロニックＦ１２７などのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤を用いる場合、その濃度は０．５〜１０％、好ましくは１〜５％程度である。 In addition, when injecting a sample containing cells into the microchannel device, the inner surface of the microchannel device or the upper surface of the microcavity is previously treated with a nonionic surfactant to prevent cell adhesion. Preferred above. It is more preferable to perform a surface plasma treatment prior to the nonionic surfactant treatment. Examples of such nonionic surfactants include block polymer type ether, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, sucrose fatty acid ester (sugar ester), polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, and sucrose fatty acid ester. Block polymer type ethers, particularly polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymer type nonionic surfactants are preferred. Examples of the block polymer type ether include polyoxyethylene (196) polyoxypropylene (67) glycol (Pluronic F127), polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) glycol (Pluronic F68), polyoxyethylene ( 42) Polyoxypropylene (67) glycol (Pluronic P123) and polyoxyethyleneoxypropylene cetyl ether (20E.O4P.O) can be mentioned. Examples of the polyoxyethylene hydrogenated castor oil include hydrogenated castor oil polyoxyethylene ether, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, and the like. Examples of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester include polysorbate 40 (Tween 40), polysorbate 60 (Tween 60), polysorbate 65, polysorbate 80 (Tween 80), and polyoxyethylene sorbitan monolaurate (20EO). it can. For example, when a polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymer type nonionic surfactant such as Pluronic F127 is used, its concentration is about 0.5 to 10%, preferably about 1 to 5%.
本発明の細胞解析装置において、解析対象となる細胞は、特に限定されず、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳動物細胞、昆虫細胞等の動物細胞等、何れのものでよい。当該細胞を含む試料としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞等の免疫細胞を含む流体試料、例えば、血液、リンパ液、培養細胞懸濁液、体細胞懸濁液等が挙げられる。 In the cell analysis apparatus of the present invention, the cells to be analyzed are not particularly limited, and may be any of human cells, non-human mammalian cells, animal cells such as insect cells, and the like. Examples of the sample containing the cells include fluid samples containing immune cells such as T cells and B cells, such as blood, lymph, cultured cell suspension, and somatic cell suspension.
（２）撮像装置
本発明に用いられる撮像装置は、捕捉された細胞に対して光照射（白色光照射、UV照射等）した場合に、当該細胞由来の光シグナル又は影シグナルを撮像できるものであればよく、例えば、固体撮像デバイスとしてＣＣＤ（Charge Coupled Device）、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）、ダブルゲート構造のＴＦＴ（Thin Film Transistor）等の撮像素子を用いたフォトセンサを用いることができる。
ＣＭＯＳセンサを用いる場合、検出素子サイズが２〜８μｍ四方であり、素子数が３０万〜１８１０万のものでカラーイメージングが可能なものが望ましく、例えばDFK130C02, Imaging Source, Germanyなどを挙げることができる。
また、ＣＭＯＳセンサを用いた蛍光カラーイメージングの際には、センサ受光面へ到達する励起光をセンサ直上で遮蔽する機構を設ける必要がある。これは、マイクロキャビティアレイに捕捉した粒子または細胞に由来する蛍光シグナルのみをセンサで受光するためである。励起光遮蔽機構としては、ＵＶカット薄膜フィルムの利用や酸化チタン膜コーティングを例示できる。
(2) Imaging device The imaging device used in the present invention can capture a light signal or a shadow signal derived from a cell when the captured cell is irradiated with light (white light irradiation, UV irradiation, etc.). For example, a photosensor using an image sensor such as a charge coupled device (CCD), a complementary metal oxide semiconductor (CMOS), or a TFT (Thin Film Transistor) having a double gate structure can be used as the solid-state imaging device.
When a CMOS sensor is used, it is desirable that the detection element size is 2 to 8 μm square, the number of elements is 300,000 to 181,000,000 and color imaging is possible, and examples thereof include DFK130C02, Imaging Source, Germany, and the like. .
In addition, in the case of fluorescent color imaging using a CMOS sensor, it is necessary to provide a mechanism for shielding excitation light reaching the sensor light receiving surface directly above the sensor. This is because only the fluorescent signal derived from the particles or cells captured in the microcavity array is received by the sensor. Examples of the excitation light shielding mechanism include use of a UV-cut thin film and titanium oxide film coating.
以下に、固体撮像デバイスとして、アモルファスシリコンを用いたフォトセンサとＴＦＴからなる光電変換素子部をもつ撮像装置（前記特許文献１）を用いた場合を例に挙げて説明する。
図３は、本発明の細胞解析装置８０の構成を示すブロック図である。図３に示すように、細胞解析装置８０は、固体撮像デバイスとこれに接続されるトップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７１及びドレインドライバ７３と、トップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７１及びドレインドライバ７３を介して撮像装置１を制御するコンピュータ８１と、コンピュータ８１から出力された信号により出力（表示又はプリント）を行う出力装置８２と、コンピュータ８１により制御される励起光照射装置８３と、を備える。
Hereinafter, as an example, a case where an imaging device having a photoelectric conversion element portion including a photosensor using amorphous silicon and a TFT is used as a solid-state imaging device will be described.
FIG. 3 is a block diagram showing the configuration of the cell analysis device 80 of the present invention. As shown in FIG. 3, the cell analysis apparatus 80 includes a solid-state imaging device, a top gate driver 74, a bottom gate driver 71 and a drain driver 73 connected thereto, and a top gate driver 74, a bottom gate driver 71 and a drain driver 73. A computer 81 that controls the imaging device 1 via the output device, an output device 82 that outputs (displays or prints) the signal output from the computer 81, and an excitation light irradiation device 83 that is controlled by the computer 81.
コンピュータ８１は、ＣＰＵ、ＲＡＭ等を備え、撮像装置１のトップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７１及びドレインドライバ７３に制御信号を出力することによって、トップゲートドライバ７４、ボトムゲートドライバ７１及びドレインドライバ７３に固体撮像デバイス１４の駆動動作を行わせる機能を有する。また、コンピュータ８１は入力した二次元の画像データに従った画像を出力装置８２に出力させる機能を有する。 The computer 81 includes a CPU, a RAM, and the like, and outputs a control signal to the top gate driver 74, the bottom gate driver 71, and the drain driver 73 of the image pickup apparatus 1, whereby the top gate driver 74, the bottom gate driver 71, and the drain driver 73 are output. Has a function of causing the solid-state imaging device 14 to perform a driving operation. The computer 81 has a function of causing the output device 82 to output an image according to the input two-dimensional image data.
出力装置８２はプロッタ、プリンタ又はディスプレイであり、コンピュータ８１のＲＡＭに記録された二次元の画像データを出力する。
励起光照射装置８３は、蛍光色素を励起する励起光を撮像装置１に照射する。
The output device 82 is a plotter, printer, or display, and outputs two-dimensional image data recorded in the RAM of the computer 81.
The excitation light irradiation device 83 irradiates the imaging device 1 with excitation light that excites the fluorescent dye.
撮像装置１は、固体撮像デバイス１４と、それを駆動するボトムゲートドライバ７１、ドレインドライバ７３及びトップゲートドライバ７４と、を具備する。撮像装置１には、固体撮像デバイス１４の光電変換素子として複数のダブルゲート型電界効果トランジスタ（以下、ダブルゲートトランジスタという。）２０がマトリクス状に配列されている。 The imaging apparatus 1 includes a solid-state imaging device 14, and a bottom gate driver 71, a drain driver 73, and a top gate driver 74 that drive the solid-state imaging device 14. In the imaging apparatus 1, a plurality of double-gate field effect transistors (hereinafter referred to as double-gate transistors) 20 are arranged in a matrix as photoelectric conversion elements of the solid-state imaging device 14.
図４〜図５を用いて固体撮像デバイス１４について説明する。
図４は１つのダブルゲートトランジスタ２０を示す平面図であり、図５は図４のIV−IV矢視断面図である。図４〜図５に示すように、固体撮像デバイス１４は、透明基板１７と、ボトムゲート絶縁膜２２と、トップゲート絶縁膜２９と、保護絶縁膜３２と、平坦化膜３５とを積層してなり、これらの層間に、複数のボトムゲートライン４１、ソースライン４２、ドレインライン４３、トップゲートライン４４、及び、ダブルゲートトランジスタ２０を形成するボトムゲート電極２１、半導体膜２３、チャネル保護膜２４、不純物半導体膜２５，２６、ソース電極２７、ドレイン電極２８、トップゲート電極３１が適宜設けられている。
The solid-state imaging device 14 will be described with reference to FIGS.
4 is a plan view showing one double gate transistor 20, and FIG. 5 is a cross-sectional view taken along arrows IV-IV in FIG. As shown in FIGS. 4 to 5, the solid-state imaging device 14 includes a transparent substrate 17, a bottom gate insulating film 22, a top gate insulating film 29, a protective insulating film 32, and a planarizing film 35. Between these layers, a plurality of bottom gate lines 41, source lines 42, drain lines 43, top gate lines 44, bottom gate electrodes 21 that form double gate transistors 20, semiconductor films 23, channel protective films 24, Impurity semiconductor films 25 and 26, a source electrode 27, a drain electrode 28, and a top gate electrode 31 are provided as appropriate.
透明基板１７は、後述する感光性樹脂を感光させる波長の光の透過性を有するとともに、絶縁性を有する。このような透明基板１７としては、石英ガラス等といったガラス基板又はポリカーボネート、ＰＭＭＡ等といったプラスチック基板を用いることができる。 The transparent substrate 17 has transparency of light having a wavelength for exposing a photosensitive resin described later, and has an insulating property. As the transparent substrate 17, a glass substrate such as quartz glass or a plastic substrate such as polycarbonate or PMMA can be used.
図４、図５に示すように、ダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・は何れも、受光部である半導体膜２３と、半導体膜２３上に形成されたチャネル保護膜２４と、ボトムゲート絶縁膜２２を挟んで半導体膜２３の下に形成されたボトムゲート電極２１と、トップゲート絶縁膜２９を挟んで半導体膜２３の上に形成されたトップゲート電極３１と、半導体膜２３の一部に重なるよう形成された不純物半導体膜２５と、半導体膜２３の別の部分に重なるよう形成された不純物半導体膜２６と、不純物半導体膜２５に重なったソース電極２７と、不純物半導体膜２６に重なったドレイン電極２８と、を備え、半導体膜２３において受光した光量に従ったレベルの電気信号を出力するものである。 As shown in FIGS. 4 and 5, each of the double gate transistors 20, 20,... Has a semiconductor film 23 as a light receiving portion, a channel protective film 24 formed on the semiconductor film 23, and a bottom gate insulation. A bottom gate electrode 21 formed under the semiconductor film 23 with the film 22 in between, a top gate electrode 31 formed over the semiconductor film 23 with the top gate insulating film 29 in between, and a part of the semiconductor film 23 The impurity semiconductor film 25 formed so as to overlap, the impurity semiconductor film 26 formed so as to overlap another portion of the semiconductor film 23, the source electrode 27 overlapped with the impurity semiconductor film 25, and the drain overlapped with the impurity semiconductor film 26 And an electrical signal of a level according to the amount of light received by the semiconductor film 23.
ボトムゲート電極２１は、ダブルゲートトランジスタ２０ごとに透明基板１７上に形成されている。また、透明基板１７上には横方向に延在する複数本のボトムゲートライン４１，４１，・・・が形成されており、横方向に配列された同一の行のダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・のそれぞれのボトムゲート電極２１が共通のボトムゲートライン４１と一体となって形成されている。ボトムゲート電極２１及びボトムゲートライン４１は、導電性及び遮光性を有し、例えばクロム、クロム合金、アルミ若しくはアルミ合金又はこれらの合金からなる。 The bottom gate electrode 21 is formed on the transparent substrate 17 for each double gate transistor 20. Further, a plurality of bottom gate lines 41, 41,... Extending in the horizontal direction are formed on the transparent substrate 17, and the double gate transistors 20, 20, 20 in the same row arranged in the horizontal direction are formed. Are formed integrally with a common bottom gate line 41. The bottom gate electrode 21 and the bottom gate line 41 have conductivity and light shielding properties, and are made of, for example, chromium, a chromium alloy, aluminum, an aluminum alloy, or an alloy thereof.
ボトムゲート電極２１及びボトムゲートライン４１，４１，・・・はボトムゲート絶縁膜２２によってまとめて被覆されている。すなわち、ボトムゲート絶縁膜２２は全てのダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・に共通して形成された膜である。ボトムゲート絶縁膜２２は、絶縁性及び光透過性を有し、例えば窒化シリコン（ＳｉＮ）又は酸化シリコン（ＳｉＯ２）からなる。 The bottom gate electrode 21 and the bottom gate lines 41, 41,... Are collectively covered with the bottom gate insulating film 22. That is, the bottom gate insulating film 22 is a film formed in common to all the double gate transistors 20, 20,. The bottom gate insulating film 22 has insulating properties and light transmittance, and is made of, for example, silicon nitride (SiN) or silicon oxide (SiO 2).
ボトムゲート絶縁膜２２上には、複数の半導体膜２３がマトリクス状に配列するよう形成されている。半導体膜２３は、ダブルゲートトランジスタ２０ごとに独立して形成されており、それぞれのダブルゲートトランジスタ２０においてボトムゲート電極２１に対して対向配置され、ボトムゲート電極２１との間にボトムゲート絶縁膜２２を挟んでいる。半導体膜２３は、平面視して略矩形状を呈しており、受光した蛍光の光量に応じた量の電子−正孔対を生成するアモルファスシリコン又はポリシリコンで形成された層である。 A plurality of semiconductor films 23 are formed on the bottom gate insulating film 22 so as to be arranged in a matrix. The semiconductor film 23 is formed independently for each double gate transistor 20, and is disposed opposite to the bottom gate electrode 21 in each double gate transistor 20, and the bottom gate insulating film 22 is interposed between the bottom gate electrode 21. Is sandwiched. The semiconductor film 23 has a substantially rectangular shape in plan view, and is a layer formed of amorphous silicon or polysilicon that generates electron-hole pairs in an amount corresponding to the amount of received fluorescence.
半導体膜２３上には、チャネル保護膜２４が形成されている。チャネル保護膜２４は、ダブルゲートトランジスタ２０ごとに独立してパターニングされており、それぞれのダブルゲートトランジスタ２０において半導体膜２３の中央部上に形成されている。チャネル保護膜２４は、絶縁性及び光透過性を有し、例えば窒化シリコン又は酸化シリコンからなる。チャネル保護膜２４は、パターニングに用いられるエッチャントから半導体膜２３の界面を保護するものである。半導体膜２３に光が入射すると、入射した光量に従った量の電子−正孔対がチャネル保護膜２４と半導体膜２３との界面付近を中心に発生するようになっている。この場合、半導体膜２３にはキャリアとして正孔及び電子が発生する。 A channel protective film 24 is formed on the semiconductor film 23. The channel protective film 24 is patterned independently for each double gate transistor 20, and is formed on the central portion of the semiconductor film 23 in each double gate transistor 20. The channel protective film 24 has insulating properties and light transmissive properties, and is made of, for example, silicon nitride or silicon oxide. The channel protective film 24 protects the interface of the semiconductor film 23 from an etchant used for patterning. When light enters the semiconductor film 23, an amount of electron-hole pairs according to the amount of incident light is generated around the interface between the channel protective film 24 and the semiconductor film 23. In this case, holes and electrons are generated as carriers in the semiconductor film 23.
半導体膜２３の一端部上には、不純物半導体膜２５が一部、チャネル保護膜２４に重なるようにして形成されており、半導体膜２３の他端部上には、不純物半導体膜２６が一部、チャネル保護膜２４に重なるようにして形成されている。不純物半導体膜２５，２６は、ダブルゲートトランジスタ２０ごとに独立してパターニングされている。不純物半導体膜２５，２６は、ｎ型の不純物イオンを含むアモルファスシリコン（ｎ＋シリコン）からなる。 An impurity semiconductor film 25 is partially formed on one end portion of the semiconductor film 23 so as to overlap the channel protection film 24, and an impurity semiconductor film 26 is partially formed on the other end portion of the semiconductor film 23. The channel protective film 24 is formed so as to overlap. The impurity semiconductor films 25 and 26 are patterned independently for each double gate transistor 20. The impurity semiconductor films 25 and 26 are made of amorphous silicon (n + silicon) containing n-type impurity ions.
不純物半導体膜２５上には、ソース電極２７が形成され、不純物半導体膜２６上には、ドレイン電極２８が形成されている。ソース電極２７及びドレイン電極２８はダブルゲートトランジスタ２０ごとに形成されている。縦方向に延在する複数本のソースライン４２，４２，・・・及びドレインライン４３，４３，・・・がボトムゲート絶縁膜２２上に形成されている。縦方向に配列された同一の列のダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・のソース電極２７は共通のソースライン４２と一体に形成されており、縦方向に配列された同一の列のダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・のドレイン電極２８は共通のドレインライン４３と一体に形成されている。ソース電極２７、ドレイン電極２８、ソースライン４２及びドレインライン４３は、導電性及び遮光性を有しており、例えばクロム、クロム合金、アルミ若しくはアルミ合金又はこれらの合金からなる。 A source electrode 27 is formed on the impurity semiconductor film 25, and a drain electrode 28 is formed on the impurity semiconductor film 26. The source electrode 27 and the drain electrode 28 are formed for each double gate transistor 20. A plurality of source lines 42, 42,... And drain lines 43, 43,... Extending in the vertical direction are formed on the bottom gate insulating film 22. The source electrodes 27 of the double gate transistors 20, 20,... In the same column arranged in the vertical direction are formed integrally with the common source line 42, and the double gates in the same column arranged in the vertical direction. The drain electrodes 28 of the transistors 20, 20,... Are integrally formed with a common drain line 43. The source electrode 27, the drain electrode 28, the source line 42, and the drain line 43 have conductivity and light shielding properties, and are made of, for example, chromium, a chromium alloy, aluminum, an aluminum alloy, or an alloy thereof.
ダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・のソース電極２７及びドレイン電極２８並びにソースライン４２，４２，・・・及びドレインライン４３，４３，・・・は、トップゲート絶縁膜２９によってまとめて被覆されている。トップゲート絶縁膜２９は全てのダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・に共通して形成された膜である。トップゲート絶縁膜２９は、絶縁性及び光透過性を有し、例えば窒化シリコン又は酸化シリコンからなる。 The source electrode 27 and the drain electrode 28 and the source lines 42, 42, ... and the drain lines 43, 43, ... of the double gate transistors 20, 20, ... are covered together by the top gate insulating film 29. ing. The top gate insulating film 29 is a film formed in common to all the double gate transistors 20, 20,. The top gate insulating film 29 has insulating properties and light transmissive properties, and is made of, for example, silicon nitride or silicon oxide.
トップゲート絶縁膜２９上には、複数のトップゲート電極３１がダブルゲートトランジスタ２０ごとに形成されている。トップゲート電極３１は、それぞれのダブルゲートトランジスタ２０において半導体膜２３に対して対向配置され、半導体膜２３との間にトップゲート絶縁膜２９及びチャネル保護膜２４を挟んでいる。また、トップゲート絶縁膜２９上には横方向に延在する複数本のトップゲートライン４４，４４，・・・が形成されており、横方向に配列された同一の行のダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・のトップゲート電極３１が共通のトップゲートライン４４と一体に形成されている。トップゲート電極３１及びトップゲートライン４４は、導電性及び光透過性を有し、例えばＩＴＯからなる。 A plurality of top gate electrodes 31 are formed for each double gate transistor 20 on the top gate insulating film 29. The top gate electrode 31 is disposed opposite to the semiconductor film 23 in each double gate transistor 20, and the top gate insulating film 29 and the channel protective film 24 are sandwiched between the top gate electrode 31 and the semiconductor film 23. Further, a plurality of top gate lines 44 extending in the horizontal direction are formed on the top gate insulating film 29, and the double gate transistors 20 in the same row arranged in the horizontal direction are formed. .. Are formed integrally with a common top gate line 44. The top gate electrode 31 and the top gate line 44 are conductive and light transmissive, and are made of, for example, ITO.
ダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・のトップゲート電極３１及びトップゲートライン４４，４４，・・・は保護絶縁膜３２によってまとめて被覆され、保護絶縁膜３２は全てのダブルゲートトランジスタ２０，２０，・・・に共通して形成された膜である。保護絶縁膜３２は、絶縁性及び光透過性を有し、窒化シリコン又は酸化シリコンからなる。 The top gate electrode 31 and the top gate lines 44, 44,... Of the double gate transistors 20, 20,... Are collectively covered by the protective insulating film 32, and the protective insulating film 32 is covered by all the double gate transistors 20, 20. ,... Are formed in common. The protective insulating film 32 has insulating properties and light transmittance, and is made of silicon nitride or silicon oxide.
保護絶縁膜３２の上面には、平坦化膜３５が設けられている。平坦化膜３５は絶縁性及び光透過性を有し、例えばＰＭＭＡ、ポリカーボネート、エポキシ樹脂、その他の透明な樹脂を塗布して固体撮像デバイス１４の表面を平坦に形成するものである。平坦化膜３５が設けられた側の面が、固体撮像デバイスの受光面となる。 A planarizing film 35 is provided on the upper surface of the protective insulating film 32. The planarization film 35 has insulating properties and light transmission properties, and for example, PMMA, polycarbonate, epoxy resin, or other transparent resin is applied to form a flat surface of the solid-state imaging device 14. The surface on the side where the planarizing film 35 is provided becomes the light receiving surface of the solid-state imaging device.
以上のように構成された固体撮像デバイス１４は、平坦化膜３５の表面を受光面としており、各ダブルゲートトランジスタ２０の半導体膜２３において受光した光量を電気信号に変換するように設けられている。 The solid-state imaging device 14 configured as described above has the surface of the planarization film 35 as a light receiving surface, and is provided so as to convert the amount of light received by the semiconductor film 23 of each double gate transistor 20 into an electrical signal. .
本発明の細胞解析装置を用いた細胞の解析は、例えば、所望の細胞を適宜染色、標識した後、マイクロ流路デバイスに当該細胞を含む試料溶液を注入し、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉し、光照射（白色光照射、UV照射等）し、当該細胞由来の光シグナル又は影シグナルを撮像装置により検出測定することにより行うことができる。 Cell analysis using the cell analysis apparatus of the present invention is performed by, for example, appropriately staining and labeling desired cells, then injecting a sample solution containing the cells into a microchannel device, and adding cells contained in the sample to 1 It can be performed by capturing at the cell level, irradiating with light (white light irradiation, UV irradiation, etc.), and detecting and measuring the light signal or shadow signal derived from the cell with an imaging device.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１ 細胞解析装置の構築
フォトリソグラフィー技術を用いて撮像装置１（ＴＦＴフォトセンサ）上に高さ２５μｍの下部基板２を作製した。次に、この下部基板上にマイクロキャビティアレイ３を設置した。この時、ＴＦＴフォトセンサの各撮像素子（30μｍ×30μｍ）が50μｍ間隔で整列していることを考慮し、孔径8μｍ、孔間隔50μｍの微細貫通孔９を保持するマイクロキャビティアレイを用いた。続いて、フレームシール４（Frame-Seal Incubation Chambers for In Situ PCR and Hybridization; 9 mm × 9 mm; Bio-Rad）、ＰＤＭＳ製の上部平板５を設置した。最後に、ＰＭＭＡ製クランプを用いてこれら全てを挟み込むことで、細胞解析装置を構築した（図１参照）。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
Example 1 Construction of Cell Analysis Device A lower substrate 2 having a height of 25 μm was produced on the imaging device 1 (TFT photosensor) using photolithography technology. Next, the microcavity array 3 was installed on the lower substrate. At this time, considering that the image pickup elements (30 μm × 30 μm) of the TFT photosensor are aligned at intervals of 50 μm, a microcavity array holding micro through holes 9 having a hole diameter of 8 μm and a hole interval of 50 μm was used. Subsequently, a frame seal 4 (Frame-Seal Incubation Chambers for In Situ PCR and Hybridization; 9 mm × 9 mm; Bio-Rad) and an upper plate 5 made of PDMS were installed. Finally, a cell analyzer was constructed by sandwiching all of these using a PMMA clamp (see FIG. 1).
実施例２
細胞模擬蛍光ビーズ (FluoSpheres Fluorescent Microspheres; 15 μm, ex/em = 365/424 nm; Invitrogen) を用いて、実施例１で構築した細胞解析装置の細胞プロファイリング解析への応用を検討した。
流路にシリンジポンプを接続後、超純水を用いて5倍希釈したBlockmaster CE510で上部平板５の開口窓１１とマイクロキャビティアレイ３により形成されるチャンバーを満たし、60分間静置することでチャンバーの親水処理を行った。続いて、試料注入・吸引部７より50 μl/minの流速で溶液を吸引することで蛍光ビーズの導入、並びに微細貫通孔９への捕捉を行った。蛍光ビーズの捕捉後、白色LED (WTU-6060; NISSIN ELECTRONIC CO., LTD.) 光照射下でTFTフォトセンサを用いて光シグナル検出を行った。また、UV照射下 (バンドパスフィルタを設置した露光装置を使用; 292.5 nm; スポットキュア SP9-250DB; USHIO INC.) でもTFTフォトセンサを用いて光シグナル検出を行った（図６）。
Example 2
The application of the cell analyzer constructed in Example 1 to cell profiling analysis was examined using cell-simulated fluorescent beads (FluoSpheres Fluorescent Microspheres; 15 μm, ex / em = 365/424 nm; Invitrogen).
After connecting the syringe pump to the flow path, the chamber formed by the opening window 11 of the upper plate 5 and the microcavity array 3 is filled with Blockmaster CE510 diluted 5 times with ultrapure water, and left to stand for 60 minutes. The hydrophilic treatment was performed. Subsequently, the solution was sucked from the sample injection / suction part 7 at a flow rate of 50 μl / min to introduce the fluorescent beads and capture the fine through holes 9. After capturing the fluorescent beads, a white LED (WTU-6060; NISSIN ELECTRONIC CO., LTD.) Was used for light signal detection using a TFT photosensor under light irradiation. In addition, optical signal detection was performed using a TFT photosensor even under UV irradiation (using an exposure apparatus equipped with a bandpass filter; 292.5 nm; Spot Cure SP9-250DB; USHIO INC.) (FIG. 6).
＜結果＞
白色光照射下での光シグナル検出においては、蛍光ビーズ捕捉前には確認されなかった影シグナルが確認された。また、UV照射下でも、蛍光シグナルが確認された。さらに、影シグナルパターンと蛍光シグナルパターンを比較したところ、ほぼ一致することが確認された（図７）。
以上より、マイクロキャビティアレイ上に捕捉された蛍光ビーズを、白色光照射下での影シグナル及びUV照射下での蛍光シグナルに基づき検出可能であることが確認され、TFTフォトセンサの細胞プロファイリング解析への応用が可能であると考えられた。
<Result>
In the light signal detection under white light irradiation, a shadow signal that was not confirmed before capturing the fluorescent beads was confirmed. In addition, a fluorescent signal was confirmed even under UV irradiation. Furthermore, when the shadow signal pattern and the fluorescence signal pattern were compared, it was confirmed that they almost coincided (FIG. 7).
From the above, it was confirmed that the fluorescent beads captured on the microcavity array can be detected based on the shadow signal under white light irradiation and the fluorescent signal under UV irradiation, and the cell profiling analysis of TFT photosensor It was thought that the application of was possible.
実施例３
JM細胞に対し、一次抗体 (Mouse anti-CD8 IgG1, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) 及び二次抗体 (Goat HRP-labeled anti-mouse IgG1, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) を用いて免疫染色を行った。実施例１で構築した細胞解析装置を用いて、JM細胞の捕捉・発光検出を以下のように試みた。
まず、試料注入・吸引部７からSuperBlock T20 Blocking Buffer in PBSを注入し、撮像装置の受光面１３と協働して形成された試料液貯留溝を当該溶液で満たし、30分間静置することで親水処理を行った。PBSで洗浄後、試料注入・吸引部６から50 μl/minの流速で吸引することで、HRP標識したJM細胞のマイクロキャビティアレイの微細貫通孔９の下端開口部への捕捉を行った（図２参照）。最後に、試料注入・吸引部７から50 μl/minの流速で基質溶液を導入し、TFTフォトセンサを用いて発光シグナル検出を行った。
Example 3
JM cells were immunostained using a primary antibody (Mouse anti-CD8 IgG1, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) and a secondary antibody (Goat HRP-labeled anti-mouse IgG1, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). Using the cell analyzer constructed in Example 1, JM cell capture and luminescence detection were attempted as follows.
First, SuperBlock T20 Blocking Buffer in PBS is injected from the sample injection / suction unit 7, the sample solution storage groove formed in cooperation with the light receiving surface 13 of the imaging device is filled with the solution, and left to stand for 30 minutes. Hydrophilic treatment was performed. After washing with PBS, the sample was injected from the sample injection / suction part 6 at a flow rate of 50 μl / min, whereby the HRP-labeled JM cells were captured at the lower end opening of the micro through-hole 9 of the microcavity array (FIG. 2). Finally, the substrate solution was introduced from the sample injection / suction unit 7 at a flow rate of 50 μl / min, and the luminescence signal was detected using a TFT photosensor.
＜結果＞
その結果、局所的な化学発光シグナルが確認された（図８）。これより、細胞をマイクロキャビティアレイの微細貫通孔の下端開口部に捕捉した場合でも、高効率な細胞の捕捉並びに解析が可能であることが示された。
<Result>
As a result, a local chemiluminescence signal was confirmed (FIG. 8). From this, it was shown that even when the cells were captured at the lower end opening of the micro through hole of the microcavity array, highly efficient cell capture and analysis were possible.
参考例１ 血球細胞捕捉効率の比較
（１）Micro-partitionを有するTFTフォトセンサを用いた血球細胞捕捉
血球細胞をPBS に懸濁し、細胞濃度を1×103 cells/μＬに調製した。PBSで満たしたMicro-partitionを有するTFTフォトセンサを含む細胞解析装置（前記特許文献１）に対し10 μＬの細胞懸濁液を導入し、シリンジポンプを用いて流速3 mL/minで3分間細胞懸濁液を送液し、細胞を捕捉した。
この時、細胞捕捉効率は9.5%であり、細胞が収容された全撮像素子の5.4 %は複数の二細胞以上が一素子上に収容されていた。
Reference Example 1 Comparison of blood cell capture efficiency (1) Blood cell capture using a TFT photosensor having a micro-partition Blood cells were suspended in PBS and the cell concentration was adjusted to 1 × 10 3 cells / μL. Introduce 10 μL of cell suspension into a cell analyzer including a TFT photosensor with micro-partition filled with PBS (Patent Document 1), and use a syringe pump for 3 minutes at a flow rate of 3 mL / min. The suspension was pumped to capture the cells.
At this time, the cell trapping efficiency was 9.5%, and 5.4% of all the imaging devices containing cells contained a plurality of two or more cells on one device.
（２）マイクロキャビティアレイを用いた血球細胞捕捉
血球細胞をPBS に懸濁し、細胞濃度を1×103 cells/μＬに調製した。マイクロキャビティアレイ３として、10,000 孔の微細貫通孔を持つマイクロキャビティアレイと、250,000孔の微細貫通孔を持つマイクロキャビティアレイを用意し、上部平板５の開口窓１１とマイクロキャビティアレイ３により形成されるチャンバーを、10 μＬの細胞懸濁液をPBS で満たした。
10,000 孔マイクロキャビティアレイの場合、ペリスタルティックポンプを用いて流速180 μＬ/minで60秒間、250,000孔アレイの場合、流速450 μＬ/min で90秒間にわたって細胞捕捉操作を行った。
＜結果＞
10,000孔マイクロキャビティアレイを用いた場合、細胞捕捉は60秒以内に完了し、単一細胞がマイクロキャビティアレイの微細貫通孔上に捕捉されていた（図８）。図９は、細胞集積化デバイスへの導入細胞数とマイクロキャビティアレイの微細貫通孔上に捕捉された細胞数との関係を示した図である。1,000 〜 9,000細胞の導入条件では、捕捉効率は76〜94%の間で安定して得られた (r2 = 0.99)。このことから、10,000 孔の微細貫通孔を配したマイクロキャビティアレイを用いることで、103オーダーの細胞数を捕捉することが可能であった。
また、250,000孔マイクロキャビティアレイを用いた場合、細胞捕捉は90秒以内に完了し、導入した血球細胞の80〜90%を捕捉し、等間隔に配列化させることが可能であった(図１０)。
さらに、いずれのマイクロキャビティアレイを用いた場合にも、二個以上細胞が捕捉された孔は1%以下であった。
(2) Blood cell capture using microcavity array Blood cells were suspended in PBS, and the cell concentration was adjusted to 1 × 10 3 cells / μL. As the microcavity array 3, a microcavity array having 10,000 fine through holes and a microcavity array having 250,000 fine through holes are prepared, and the microcavity array 3 is formed by the opening window 11 of the upper plate 5 and the microcavity array 3. The chamber was filled with 10 μL of cell suspension with PBS.
In the case of a 10,000-hole microcavity array, a cell capture operation was performed using a peristaltic pump for 60 seconds at a flow rate of 180 μL / min, and in the case of a 250,000-hole array, a cell capture operation was performed for 90 seconds at a flow rate of 450 μL / min.
<Result>
When a 10,000-hole microcavity array was used, cell capture was completed within 60 seconds and single cells were captured on the micro-through holes of the microcavity array (FIG. 8). FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the number of cells introduced into the cell integration device and the number of cells captured on the micro through-holes of the microcavity array. Under the introduction conditions of 1,000 to 9,000 cells, the capture efficiency was stably obtained between 76 and 94% (r2 = 0.99). From this, it was possible to capture the number of cells on the order of 10 3 by using a microcavity array having 10,000 fine through holes.
In addition, when a 250,000-hole microcavity array was used, cell capture was completed within 90 seconds, and 80 to 90% of the introduced blood cells could be captured and arrayed at equal intervals (FIG. 10). ).
Furthermore, when any microcavity array was used, the number of pores in which two or more cells were captured was 1% or less.
実施例４ CMOSセンサを配した細胞解析装置の構築
撮像装置として、3.2μm四方の検出素子2048×1536個から構成されるCMOSセンサ (DFK130C02, Imaging Source, Germany) を使用し、この上に下部基板を介してマイクロキャビティアレイを設置した。
マイクロキャビティアレイは直径8μm、孔間距離60μmの貫通孔を保持するもの、又は直径3μm、孔間距離25μmの貫通孔を保持するものを用いた。下部基板はマイクロキャビティアレイとCMOSセンサ保護ガラスの間に、フレームシールにより高さ50μmの間隙を設けるように作製した。さらに、PDMS製の細胞導入用のウェルチャンバー（上部平板）をマイクロキャビティアレイの上に設置した。紫外光源としてはDEEP UVランプ (SPOTCURE SP-9, USHIO, Japan) を使用し、細胞解析装置の上方に設置した。CMOSセンサによる撮像はImaging Source社の制御用ソフトウェア (IC Capture 2.1) を利用して行った。
Example 4 Construction of a cell analysis device with a CMOS sensor A CMOS sensor (DFK130C02, Imaging Source, Germany) composed of 2048 × 1536 detection elements of 3.2 μm square was used as an imaging device, and a lower substrate was formed thereon. Through which a microcavity array was installed.
The microcavity array used was a through hole having a diameter of 8 μm and a distance between holes of 60 μm, or a hole having a diameter of 3 μm and a distance between holes of 25 μm. The lower substrate was fabricated so that a gap of 50 μm in height was provided by a frame seal between the microcavity array and the CMOS sensor protective glass. Further, a well chamber (upper plate) for cell introduction made by PDMS was placed on the microcavity array. A DEEP UV lamp (SPOTCURE SP-9, USHIO, Japan) was used as the ultraviolet light source, and was installed above the cell analyzer. Imaging with a CMOS sensor was performed using Imaging Source's control software (IC Capture 2.1).
実施例５ CMOSセンサを用いた影シグナルイメージングの検討
センサ‐マイクロキャビティアレイ基板間距離及び照射光波長の画像コントラストへの影響を評価するために、蛍光標識細胞模擬粒子 (Flowcheck fluorosphere, Beckman Coulter, USA)を捕捉しUV照射下でイメージングを行った。
はじめにマイクロキャビティアレイをセンサ表面から1100, 1300, 1550, 1800, 2050 μm離した位置に設置した。続いて、細胞導入用ウェルチャンバー（上部平板）に粒子懸濁液を導入し吸引することで粒子をマイクロキャビティアレイに捕捉した。波長を365 nmとした光照射下で、CMOSセンサイメージングを行った。つぎに、HeLa細胞懸濁液200 μlをマイクロキャビティアレイ上に導入した。細胞懸濁液を吸引し、CMOSセンサイメージングを行った。また、同基板上を蛍光顕微鏡観察し、実際の捕捉細胞数を確認した。
Example 5 Examination of shadow signal imaging using CMOS sensor In order to evaluate the influence of sensor-microcavity array substrate distance and irradiation light wavelength on image contrast, fluorescent-labeled cell mimetic particles (Flowcheck fluorosphere, Beckman Coulter, USA) ) And captured under UV irradiation.
First, the microcavity array was placed at a position 1100, 1300, 1550, 1800, 2050 μm away from the sensor surface. Subsequently, the particle suspension was introduced into the cell introduction well chamber (upper flat plate) and sucked to capture the particles in the microcavity array. CMOS sensor imaging was performed under light irradiation with a wavelength of 365 nm. Next, 200 μl of HeLa cell suspension was introduced onto the microcavity array. The cell suspension was aspirated and CMOS sensor imaging was performed. In addition, the number of captured cells was confirmed by observing the same substrate with a fluorescence microscope.
＜結果＞
CMOSセンサ上に統合したマイクロキャビティアレイに対し、上方から光を照射することで、貫通孔を通過した照射光同士の干渉により生じる格子パターンが可視化された。さらに、細胞が捕捉された貫通孔においては、通過光量の減少により暗く可視化された。同基板表面の蛍光顕微鏡観察像と比較すると、粒子配置と黒色パターン配置が一致していることが確認できた（図１２）。種々の検討を行った所、センサ‐マイクロキャビティアレイ基板間距離が短くなるにつれて、黒色パターンのコントラストが増し、S/N比が高くなることが示された（図１３）。また、照射光の波長が短いほど、S/N比は高くなった（図１４）。従って、この後の実験は距離1100 μm、波長365 nmとして行った。
<Result>
By irradiating light from above onto the microcavity array integrated on the CMOS sensor, the lattice pattern caused by the interference of the irradiated light that passed through the through holes was visualized. Furthermore, in the through-hole in which the cell was trapped, it was visualized as dark due to a decrease in the amount of light passing through. Compared with the fluorescence microscope observation image on the surface of the substrate, it was confirmed that the particle arrangement and the black pattern arrangement coincided (FIG. 12). Various studies have shown that the black pattern contrast increases and the S / N ratio increases as the distance between the sensor and the microcavity array substrate decreases (FIG. 13). In addition, the shorter the wavelength of the irradiation light, the higher the S / N ratio (FIG. 14). Therefore, the subsequent experiment was conducted at a distance of 1100 μm and a wavelength of 365 nm.
参考例２ 計測細胞数の比較
細胞解析装置のマイクロキャビティアレイ上にHeLa細胞を捕捉して影シグナルイメージングを行ったところ、細胞捕捉位置は黒色パターンで可視化された（図１５）。このパターンの配置は、蛍光顕微鏡観察下で確認した細胞局在位置と一致した。さらに、黒色パターンの数をCMOSセンサによる細胞数カウントとして定義し、顕微鏡によるカウントと比較したところ、両者の間に相関関係が得られた。以上より、マイクロキャビティアレイ統合CMOSセンサを用いて、細胞数計測が可能であることが示された。
Reference Example 2 Comparison of Counted Cells When HeLa cells were captured on the microcavity array of the cell analyzer and shadow signal imaging was performed, the cell capture position was visualized in a black pattern (FIG. 15). The arrangement of this pattern coincided with the cell localization position confirmed under the fluorescence microscope observation. Furthermore, when the number of black patterns was defined as a cell count by the CMOS sensor and compared with the count by a microscope, a correlation was obtained between the two. From the above, it was shown that the number of cells can be measured using a microcavity array integrated CMOS sensor.
実施例６ CMOSセンサ蛍光カラーイメージングの検討
CMOSセンサの保護ガラスを除去し、センサ受光面を露出させた。マイクロキャビティアレイは直径3 μm、孔間距離25 μmの貫通孔を保持するものを用いた。マイクロキャビティアレイの細胞捕捉面を、UVカットフィルム (T-UV film, TOCHISEN, 厚さ：50 μm) を介して、センサ受光面に接することで蛍光検出系を構築した。また、マイクロキャビティアレイ の35 mm上方に紫外光源を設置し、バンドパスフィルター (FF01-292/15-25, Semrock) を用いて励起光波長を292 nmとした。蛍光標識細胞模擬粒子 (Ex / Em = 488 nm / 586 nm) 懸濁液、Hoechst33342 (Ex / Em = 350 nm / 461 nm) 染色JM細胞懸濁液各200 μLをマイクロキャビティアレイ上に滴下し、溶液を吸引した。粒子または細胞を捕捉したマイクロキャビティアレイを用いて蛍光検出系を構築し、励起光照射下でCMOSセンサイメージングを行った。
Example 6 Investigation of CMOS sensor fluorescence color imaging
The protective glass of the CMOS sensor was removed, and the light receiving surface of the sensor was exposed. A microcavity array having a through hole having a diameter of 3 μm and a distance between holes of 25 μm was used. A fluorescence detection system was constructed by contacting the cell capture surface of the microcavity array with the sensor light-receiving surface via a UV-cut film (T-UV film, TOCHISEN, thickness: 50 μm). In addition, an ultraviolet light source was installed 35 mm above the microcavity array, and the excitation light wavelength was set to 292 nm using a bandpass filter (FF01-292 / 15-25, Semrock). Fluorescently labeled cell mock particles (Ex / Em = 488 nm / 586 nm) suspension, Hoechst33342 (Ex / Em = 350 nm / 461 nm) Stained JM cell suspension 200 μL each was dropped onto the microcavity array, The solution was aspirated. A fluorescence detection system was constructed using a microcavity array capturing particles or cells, and CMOS sensor imaging was performed under excitation light irradiation.
＜結果＞
蛍光標識粒子またはHoechst33342染色細胞捕捉後のマイクロキャビティアレイに対し、励起光照射下でCMOSセンサイメージングを行ったところ、それぞれ黄色、青色の円形カラーイメージが得られた（図１６）。また、円形イメージを横断する直線上におけるシグナル強度の推移を計測した。
その結果、蛍光標識粒子においては赤チャンネル、緑チャンネルのシグナル強度に、Hoechst33342染色細胞においては青チャンネルのシグナル強度にそれぞれピークが確認された。これより、構築した検出系を用いて、粒子及び染色細胞はその蛍光波長に対応したカラーイメージとして撮像可能であることが確認された。
<Result>
When CMOS sensor imaging was performed on the microcavity array after capturing fluorescently labeled particles or Hoechst33342-stained cells under excitation light irradiation, yellow and blue circular color images were obtained (FIG. 16). In addition, the transition of the signal intensity on a straight line crossing the circular image was measured.
As a result, a peak was confirmed in the signal intensity of the red channel and the green channel in the fluorescently labeled particles, and a signal intensity of the blue channel in the Hoechst33342-stained cells. From this, it was confirmed that particles and stained cells can be imaged as a color image corresponding to the fluorescence wavelength using the constructed detection system.
細胞集団から個々の細胞情報をハイスループットに解析する細胞解析は、医療分野では血球分析検査や細胞集団のプロファイリングに利用され、種々の病症診断に利用されている。例えば、血球中に含まれているCD4抗原を発現している細胞とCD8抗原を発現している細胞を計数し、その存在比率を求めることでエイズ等の初期診断に利用される。CD4(+)細胞とCD8(+)細胞の比は、免疫疾患の指標として利用され、例えば、HIV感染症やB型肝炎などの免疫不全疾患の場合、CD4(+)/CD8(+)比が減少することが知られており、一方で、関節リウマチや自己免疫性溶血性貧血などの自己免疫疾患で上昇することが知られている。また、血球中で存在比率の少ないがん細胞を検出することで、がんの早期診断やがんの術後診断 (転移性の評価) に応用される。本発明によれば、これらの診断技術の簡易化を実現し、また細胞解析システムの小型化、廉価化を図ることができる。さらに、稀少細胞の内でも造血幹細胞を始めとする幹細胞を簡易に検出することができれば、細胞医療や免疫療法に利用できる細胞を簡易に調製できる技術として応用できる。 Cell analysis, which analyzes individual cell information from a cell population with high throughput, is used for blood cell analysis and profiling of cell populations in the medical field, and is used for diagnosis of various diseases. For example, cells expressing CD4 antigen and cells expressing CD8 antigen contained in blood cells are counted and used for initial diagnosis such as AIDS by determining their abundance ratio. The ratio of CD4 (+) cells to CD8 (+) cells is used as an indicator of immune disease.For example, in the case of immunodeficiency diseases such as HIV infection and hepatitis B, the ratio of CD4 (+) / CD8 (+) On the other hand, it is known to increase in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and autoimmune hemolytic anemia. In addition, by detecting cancer cells with a small abundance ratio in blood cells, it is applied to early diagnosis of cancer and postoperative diagnosis of cancer (evaluation of metastasis). According to the present invention, these diagnostic techniques can be simplified, and the cell analysis system can be reduced in size and cost. Furthermore, if stem cells including hematopoietic stem cells can be easily detected even among rare cells, it can be applied as a technique for easily preparing cells that can be used for cell medicine and immunotherapy.
１ 撮像装置
２ 下部基板
３ マイクロキャビティアレイ
４ フレームシール
５ 上部平板
６ 試料注入・吸引部
７ 試料注入・吸引部
８ 貫通孔
９ 微細貫通孔
１１ 開口窓
１２ 開口窓
１３ 受光面
１４ 固体撮像デバイス
１７ 透明基板
２０ ダブルゲートトランジスタ（光電変換素子）
２１ ボトムゲート電極
２７ ソース電極
２８ ドレイン電極
３１ トップゲート電極
３２ 絶縁膜
４１ ボトムゲートライン
４２ ソースライン
４３ ドレインライン
４４ トップゲートライン
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Imaging device 2 Lower substrate 3 Microcavity array 4 Frame seal 5 Upper plate 6 Sample injection / suction part 7 Sample injection / suction part 8 Through hole 9 Fine through hole 11 Open window 12 Open window 13 Light receiving surface 14 Solid imaging device 17 Transparent Substrate 20 Double gate transistor (photoelectric conversion element)
21 Bottom gate electrode 27 Source electrode 28 Drain electrode 31 Top gate electrode 32 Insulating film 41 Bottom gate line 42 Source line 43 Drain line 44 Top gate line
Claims (4)
前記マイクロ流路デバイスが、撮像装置の受光面に載置され、撮像装置の受光面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップする試料貯留溝を形成するための開口窓が設けられた下部基板と、
前記下部基板の上面に積層載置され、細胞捕捉用の孔径、孔数、及び配置が制御された複数の微細貫通孔と、試料溶液を供給排出するための貫通孔を有するマイクロキャビティアレイと、
前記マイクロキャビティアレイの上面にフレームシールを介して積層載置され、該マイクロキャビティアレイの上側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部と、該マイクロキャビティアレイの下側から試料を供給又は吸引するための試料注入・吸引部を備え、該マイクロキャビティアレイの微細貫通孔上面と協働して細胞を含む試料溶液をトラップするチャンバーを形成するための開口窓が設けられた上部平板、を含む細胞解析装置。 A cell analysis device in which a microchannel device having a microcavity array capable of capturing cells in a sample is constructed on the light receiving surface of an imaging device having a photoelectric conversion element provided with the light receiving surface facing upward. ,
The microchannel device is mounted on the light receiving surface of the imaging device, and a lower portion provided with an opening window for forming a sample storage groove for trapping a sample solution containing cells in cooperation with the light receiving surface of the imaging device A substrate,
A plurality of fine through-holes stacked and mounted on the upper surface of the lower substrate and controlled in cell diameter, number of holes, and arrangement, and a microcavity array having through-holes for supplying and discharging a sample solution;
A sample injection / suction part for supplying or aspirating a sample from the upper side of the microcavity array and a sample from the lower side of the microcavity array are stacked and mounted on the upper surface of the microcavity array. Or an upper flat plate provided with an opening window for forming a chamber for trapping a sample solution containing cells in cooperation with the upper surface of the fine through-holes of the microcavity array, comprising a sample injection / suction part for aspiration, the including cells analyzer.
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