JP5880867B2 - Ape1遺伝子導入による高機能化幹細胞・前駆細胞 - Google Patents
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Description
こうした幹細胞・前駆細胞機能の高機能化により、本発明の幹細胞・前駆細胞は、血管新生・血管修復を含む、種々の再生医療において好適に利用することができる。
本発明の細胞製剤において、用いられる幹細胞・前駆細胞は治療を必要とする患者由来のものであることが好ましい。
前記キット方法は、たとえば、以下の(a)〜(c)の少なくとも1つを含むものとして構成される:
(a)抗Ape1抗体、
(b)Ape1遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、
(c)Ape1遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するためのポリヌクレオチドプローブ。
本発明の「幹細胞」は、複数系統の細胞に分化できる能力(多分化能)と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力(自己複製能)を併せ持つ細胞であって、生体内各組織に存在する種々の幹細胞、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、ならびにES細胞やiPS及びこれらから誘導された幹細胞を包含する。「前駆細胞」とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞であって、幹細胞と同様に種々の前駆細胞を包含する。本発明においては、後述する血管内皮前駆細胞及び間葉系幹細胞を好適な例として挙げることができる。
「血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cell; EPC)」とは、骨髄や末梢血、臍帯血などに由来する細胞群で、最終的に血管内皮細胞への分化能を有することで血管新生を促し、血管再生に貢献する細胞群である。
血管内皮前駆細胞は、骨髄のほか末梢血や臍帯血などからも分離・採取することができる。
間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)は、間葉に由来する体性幹細胞で、間葉系に属する細胞への分化能を有するため、骨や血管、心筋の再生医療への応用が期待されている。
Ape1(Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1)は、APEX1(Official Gene Symbol)、HAP1又はRef-1としても知られ、AP部位のすぐ5'側にあるホスホジエステル・バックボーンを加水分解によって切断し、3'-ヒドロキシル及び5'-デオキシリボースリン酸末端をもつ一本鎖DNA断片を産生するAPエンドヌクレアーゼである。
FOREWARD PRIMER:5-GGA TTG GGT AAA GGA AGA AGC A-3 (マウス、ラット共用:配列番号1)
5-GTG CCC ACT CAA AGT TTC TTA C-3(ヒト用:配列番号2)
REVERSE PRIMER:5-CAA GGC GCC AAC CAA CAT TCT T-3(ヒト、マウス、ラット共用:配列番号3)
3.1 Ape1発現の亢進
本発明にかかる幹細胞・前駆細胞は、Ape1の発現が亢進していることを特徴とする高機能化幹細胞・前駆細胞である。ここで、「Ape1の発現が亢進している」とは、Ape1タンパクの発現量の増加による直接的なApe1活性亢進と、関連する抑制系の解除等による間接的なApe1活性亢進の両方を包含する。
本発明において「高機能化」とは、幹細胞・前駆細胞の有する臓器再生能、新生能(例えば、血管再生能、新生能)、酸化ストレス抵抗性等の機能やviabilityが向上していることを意味する。前述のとおり、本発明において幹細胞・前駆細胞の高機能化は、Ape1発現の亢進によってもたらされる。
本発明の高機能化幹細胞・前駆細胞は、たとえばApe1発現誘導により調製することができる。
4.1 Ape1遺伝子導入
Ape1遺伝子を幹細胞・前駆細胞に導入することにより、Ape1発現誘導を行うことができる。
Ape1遺伝子は、常法に従い、前述した公知の配列を基に調製することができる。たとえば、骨髄や末梢血由来の細胞からRNAを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、PCR法でクローニングすることにより目的とするApe1遺伝子のcDNAが調製できる。
Ape1タンパク質を幹細胞・前駆細胞に導入することにより、Ape1発現誘導を行うことも可能である。
Ape1発現を外的に誘導することのできる「Ape1発現誘導剤」を目的とする幹細胞・前駆細胞に導入することにより、Ape1発現誘導を行うことができる。
本発明の高機能化幹細胞・前駆細胞は、通常の幹細胞・前駆細胞と同様の方法で培養・増殖させることができる。
これらの成分を配合して得られる培地のpHは5.5〜9.0、好ましくは6.0〜8.0、より好ましくは6.5〜7.5の範囲である。
本発明の高機能化幹細胞・前駆細胞は、優れた血管新生作用、障害血管修復作用(再内皮化作用)、酸化ストレス耐性を有し、虚血性疾患や動脈閉塞性疾患等の血管再生医療に好適に利用できる。すなわち、本発明は高機能化幹細胞・前駆細胞を含む細胞製剤を提供する。
従来、血管内皮前駆細胞の機能を評価する方法としては、培養系での増殖能や遊走能など、in vivoでは、障害血管修復能(再内皮化)や末梢組織血流改善度(血管新生)などがある。しかし、これらの方法は非常に煩雑であるため、簡易的に血管内皮前駆細胞の機能と密接に関連している遺伝子群の発現量を測定することにより、血管内皮前駆細胞機能を「推測」する方法が試行されている。
Ape1遺伝子の発現量は、回収した細胞からまず全RNAを抽出し、この全RNA中におけるApe1遺伝子(mRNA)の発現量を後述するいずれかの方法を用いて測定する。
Ape1タンパク発現量は、たとえば抗原抗体反応を利用した免疫学的方法を用いて測定することができる。
評価は、たとえば、正常幹細胞・前駆細胞における平均的Ape1遺伝子又はApe1タンパク発現量を基準値として、その基準値と被験細胞におけるApe1遺伝子又はApe1タンパク発現量を比較することにより行うことができる。Ape1遺伝子又はApe1タンパク発現量の測定は、前述したApe1発現誘導剤であらかじめ細胞を刺激してから行ってもよい。この場合、「Ape1発現誘導能」として幹細胞・前駆細胞の機能を評価できる。
本発明は、前記した幹細胞・前駆細胞機能評価のための試薬・キットも提供する。キットは、必須の構成要素として、以下の(a)〜(c)の少なくとも1つを含む:
(a)抗Ape1抗体、
(b)Ape1遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー
(c)Ape1遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するためのポリヌクレオチドプローブ。
抗Ape1抗体は、公知の方法にしたがって調製することができる。すなわち、常法により、抗原となるApe1タンパク質、あるいはその任意の部分ポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。
Ape1遺伝子増幅用プライマー、Ape1遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有する5〜30塩基長の連続したオリゴヌクレオチドである。プライマーはApe1遺伝子増幅用の塩基配列(配列番号1)に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いるなど、常法にしたがい容易に設計し、増幅させて調製することができる。このようなプライマーの例としては、たとえば配列番号1〜5に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
Ape1遺伝子検出用プローブは、Ape1遺伝子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、20〜1500塩基長程度のものが好ましい。具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、20塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドか2本鎖DNAが好適に用いられる。また、マイクロアレイであれば、100〜1500塩基長程度の2本鎖DNA、又は20〜100塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。Affimetrix社のGene Chipシステムの場合は、25塩基長程度の1本鎖オリゴがよい。これらは、特にApe1遺伝子の3’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。
1.糖尿病、加齢マウスにおける血管内皮前駆細胞(EPC)機能の低下
糖尿病(DM)マウス及び加齢(aged:1年6月)マウス骨髄から単核球細胞を単離した後、マグネットソーティングシステム(MACS)により、Lin-, cKit+, Flk+ の細胞を精製した。精製したEPCは、α-MEM (GIBCO)(あるいはEndothelial cell basal medium EBM (clontech))(10% FCS, VEGF)を含むfibronectinコーティングした培地で、48時間培養した。接着している細胞のうち、Acetyl-LDL吸着かつLectin結合陽性細胞を接着EPCとして、培養EPC機能の一つであるFibronectinへの接着能を評価した(全培養細胞数の中の割合で算出)。
12〜14週齢のマウス及び加齢マウス(1年6月)から、前項と同様にしてEPCを調製した。調製した細胞は、前項と同様の方法で培養するが、培養期間をさらに1週間延ばしてコンフルエントにしたのち、炎症性サイトカインTNFα 5-10 ng/mlを含む培地に交換して、16時間後に細胞を回収した。回収した細胞よりRNAを精製し、RT-PCR法によりmRNA量を測定した。使用したプライマー配列を下記に示す。
Forward; atg ccg aag cgt ggg aaa aag(配列番号4)
Reverse; cag tgc tag gta tag ggt g(配列番号5)
Adenovirusを用いてマウス血管内皮前駆細胞にヒトApe1遺伝子を導入した。導入後のEPCにおけるApe1発現量(赤)を測定した。Adenovirusへの導入は、マグネット感染キット(MagnetofectionTM-AdenoMag)を利用したMagnet Transfection Methodと通常の方法(Standard Method)の2種類で行った。すなわち、Ape1導入ウイルス(AdenoApe)20μlとAdenoMag2μlを混合し、20分間室温でインキュベートした後、サブコンフルエント状態のEPCが入っている培養プレートに添加した。このプレートを、magnetic plateにのせ、60分間静置した後、通常の37℃で培養して感染させた。感染細胞は、抗Ape1抗体で免疫反応させ、TRITC二次抗体で可視化(赤色)した。
12〜14週齢のマウス大腿動脈障害モデルに、前項で作製したApe1導入EPCを経静脈より導入し、4週間後に血管リモデリング(新生内膜肥厚度=I/M比)を評価した。
1.間葉系幹細胞株の樹立、調製
間葉系幹細胞株は、温度感受性SV40T抗原発現トランスジェニックマウス(株式会社ファクトより購入)の末梢毛細血管組織由来より、抗NG2抗体を用いてNG2陽性細胞としてマグネットソーティング法にて単離して細胞株を樹立した。
コラーゲンコーティング培養皿に培養した上記間葉系幹細胞にヒトApe1(hApe1)発現用組み換えアデノウイルスを感染させることにより、間葉系幹細胞内にhuman Ape1 (hApe1)を強制発現させた。コントロール(Ct) として、LacZ発現アデノウイルス感染細胞を用いた。
ヒト心臓由来心筋幹細胞株(CSC03)は慢性心筋梗塞患者右室より採取した微小心筋組織から酵素分解法及びbFGF添加による継代培養にて樹立した。
配列番号2:Ape1増幅用プライマー(フォワード:ヒト用)
配列番号3:Ape1増幅用プライマー(リバース:ヒト、マウス、ラット用)
配列番号4:Ape1 RT-PCR用プライマー(フォワード:マウス用)
配列番号5:Ape1 RT-PCR用プライマー(リバース:マウス用)
Claims (11)
- Ape1(Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1)の発現が亢進していることを特徴とする血管内皮前駆細胞を含み、血管再生、臓器再生、癌の予防・治療、又は、下肢虚血、心筋梗塞、及び脳梗塞を含む虚血疾患の予防・治療に用いられる細胞製剤。
- Ape1の発現の亢進がApe1発現誘導に基づくものである、請求項1に記載の細胞製剤。
- Ape1発現誘導がApe1遺伝子導入に基づくものである、請求項2に記載の細胞製剤。
- Ape1発現誘導がApe1タンパク質導入に基づくものである、請求項2に記載の細胞製剤。
- Ape1発現誘導がApe1発現誘導剤に基づくものである、請求項2に記載の細胞製剤。
- Ape1発現誘導剤がTNF-α、IL1β、及びIFγから選ばれるいずれか1又は2以上である、請求項5に記載の細胞製剤。
- 細胞が前記細胞製剤による治療を必要とする患者由来のものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞製剤。
- 静脈投与、筋肉内投与、又は組織に直接適用されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞製剤。
- シート状である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の細胞製剤。
- 血管内皮前駆細胞において、Ape1(Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1)の発現を亢進させることを特徴とする、臓器再生能又は新生能が向上した血管内皮前駆細胞のin vitroでの製造方法であって、前記発現の亢進が、Ape1遺伝子導入、Ape1タンパク質導入、又はApe1発現誘導剤によるApe1発現誘導に基づくものである方法。
- 血管内皮前駆細胞において、Ape1(Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1)の発現を亢進させることを特徴とする、血管再生能又は新生能が向上した血管内皮前駆細胞のin vitroでの製造方法であって、前記発現の亢進が、Ape1遺伝子導入、Ape1タンパク質導入、又はApe1発現誘導剤によるApe1発現誘導に基づくものである方法。
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