JP5862373B2 - Method for measuring the concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in biological samples - Google Patents
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Description
本発明は、馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を液状試薬にて測定する方法ならびにキットに関する。 The present invention relates to a method and a kit for measuring respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid with a liquid reagent.
馬尿酸はトルエンの尿中代謝物として、メチル馬尿酸はキシレンの尿中代謝物として、特殊健康診断での測定項目のひとつになっている。 Hippuric acid is a urinary metabolite of toluene, and methylhippuric acid is a urinary metabolite of xylene.
しかしながら、これらの測定は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるものであり（例えば、特許文献１および２参照）、測定が煩雑である。また、測定を簡便に行うには、液状試薬にすることが挙げられるが、馬尿酸およびメチル馬尿酸はメチル基の有無しか化学構造の差異がないため、これらを区別して測定することは困難とされている。 However, these measurements are based on high performance liquid chromatography (HPLC) (see, for example, Patent Documents 1 and 2), and the measurement is complicated. In addition, for easy measurement, liquid reagents can be used, but hippuric acid and methylhippuric acid have only a difference in chemical structure with or without a methyl group, and it is difficult to measure them separately. Has been.
本発明は、より簡便に馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を測定するための方法ならびにキットを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method and a kit for more easily measuring the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid.
本発明者らは、馬尿酸とメチル馬尿酸との間で特定の酵素に対する基質特異性が大きく異なることに着目し、これらの酵素を複数組み合わせて用いることによって、より簡便に馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を測定できることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventors paid attention to the fact that the substrate specificity for a specific enzyme is greatly different between hippuric acid and methylhippuric acid, and by using a combination of these enzymes, hippuric acid and methylhippuric acid are more easily used. It was found that each concentration of uric acid can be measured, and the present invention was completed.
本発明は、生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を測定する方法を提供し、該方法は、（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させる工程、（２）（１）の工程で得た反応液に、（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、または（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程、（３）（２）の工程で発生した過酸化水素の濃度を特定する工程、（４）（１）〜（３）の工程とは別に、該生体試料の別の一定量に、馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素を作用させて、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する工程、（５）（４）の工程で得た反応液に、安息香酸に対する基質特異性が高い酵素を作用させる工程、（６）（５）の工程で得た反応液中の酵素反応産物の濃度を特定する工程、および（７）（３）の工程で得た過酸化水素の濃度と、（６）の工程で得た酵素反応産物の濃度とから該生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を算出する工程を含む。 The present invention provides a method for measuring the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in a biological sample, the method comprising: (1) quantifying hippuric acid into benzoic acid for a certain amount of biological sample collected from the living body; (2) a step of allowing an enzyme that hydrolyzes methylhippuric acid to methylbenzoic acid and glycine, and (2) (a) a D-amino acid And D-amino acid oxidase, or (b) a step of mixing S-adenosyl-L-methionine, glycine-N-methyltransferase and sarcosine oxidase to generate hydrogen peroxide, (3) generated in steps (2) Separately from the steps of (4) (1) to (3), the biological hydrogen sample has a high substrate specificity for hippuric acid and methyl hippuric acid. A step of hydrolyzing hippuric acid into benzoic acid and glycine by acting an enzyme with low specific activity, and (5) an enzyme having a high substrate specificity for benzoic acid in the reaction solution obtained in steps (4) A step of effecting, a step of specifying the concentration of the enzyme reaction product in the reaction solution obtained in the steps of (6) and (5), and a concentration of hydrogen peroxide obtained in the steps of (7) and (3), and (6 The step of calculating the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in the biological sample from the concentration of the enzyme reaction product obtained in the step).
本発明によれば、より簡便に馬尿酸とメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を測定することができる。 According to the present invention, the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid can be measured more easily.
本発明は、馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を液状試薬にて測定する方法ならびにキットに関する。 The present invention relates to a method and a kit for measuring respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid with a liquid reagent.
本発明における「馬尿酸」とは、何も修飾されていない馬尿酸そのものをいい、別名でＮ−ベンゾイルグリシンをいう。馬尿酸は、トルエンの代謝産物である。 In the present invention, “hippuric acid” refers to hippuric acid itself which is not modified at all, and also refers to N-benzoylglycine. Hippuric acid is a metabolite of toluene.
本発明における「メチル馬尿酸」とは、馬尿酸のベンゼン環構造のｏ−位、ｍ−位、ｐ−位のいずれか１つがメチル基で修飾されたものをいい、別名でＮ−トルオイルグリシンをいう。メチル馬尿酸は、キシレンの代謝産物である。なお、「メチル馬尿酸」は、馬尿酸の不斉炭素がメチル基で修飾されたもの（Ｎ−ベンゾイルアラニン）の別名としても用いられることがあるが、本発明における「メチル馬尿酸」としては、Ｎ−ベンゾイルアラニンは除外される。 “Methylhippuric acid” in the present invention refers to a compound in which any one of o-position, m-position and p-position of the benzene ring structure of hippuric acid is modified with a methyl group. It refers to glycine. Methyl hippuric acid is a metabolite of xylene. “Methylhippuric acid” is sometimes used as an alternative name for the compound in which the asymmetric carbon of hippuric acid is modified with a methyl group (N-benzoylalanine). N-benzoylalanine is excluded.
本発明における「安息香酸」とは、何も修飾されていない安息香酸そのものをいう。安息香酸は、馬尿酸の分解産物である。 The term “benzoic acid” in the present invention refers to benzoic acid itself that is not modified at all. Benzoic acid is a degradation product of hippuric acid.
本発明における「メチル安息香酸」とは、安息香酸のベンゼン環構造のｏ−位、ｍ−位、ｐ−位のいずれか１つがメチル基で修飾されたものをいい、別名でトルイル酸をいう。メチル安息香酸は、メチル馬尿酸の分解産物である。 “Methylbenzoic acid” in the present invention refers to one in which any one of the o-position, m-position and p-position of the benzene ring structure of benzoic acid is modified with a methyl group. . Methylbenzoic acid is a degradation product of methylhippuric acid.
本発明の生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を測定する方法は、（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させる工程、（２）（１）の工程で得た反応液に、（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、または（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程、（３）（２）の工程で発生した過酸化水素の濃度を特定する工程、（４）（１）〜（３）の工程とは別に、該生体試料の別の一定量に、馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素を作用させて、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する工程、（５）（４）の工程で得た反応液に、安息香酸に対する基質特異性が高い酵素を作用させる工程、（６）（５）の工程で得た反応液中の酵素反応産物の濃度を特定する工程、および（７）（３）の工程で得た過酸化水素の濃度と、（６）の工程で得た酵素反応産物の濃度とから該生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を算出する工程を含む。 The method for measuring the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in the biological sample of the present invention includes (1) hydrolyzing hippuric acid into benzoic acid and glycine for a certain amount of the biological sample collected from the living body. And (2) a step of allowing an enzyme that hydrolyzes methylhippuric acid to methylbenzoic acid and glycine, (2) (a) D-amino acid and D-amino acid oxidase, or (B) Step of mixing S-adenosyl-L-methionine, glycine-N-methyltransferase and sarcosine oxidase to generate hydrogen peroxide, (3) Specifying the concentration of hydrogen peroxide generated in step (2) (4) Separately from the steps of (1) to (3), the biological sample has a high substrate specificity for hippuric acid and a low specific activity for methylhippuric acid. A step of hydrolyzing hippuric acid into benzoic acid and glycine by acting an element, a step of allowing an enzyme having a high substrate specificity for benzoic acid to act on the reaction solution obtained in steps (5) and (4), ( 6) The step of specifying the concentration of the enzyme reaction product in the reaction solution obtained in the step (5), the concentration of hydrogen peroxide obtained in the steps (7) and (3), and the step (6). And calculating the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in the biological sample from the concentration of the enzyme reaction product.
まず、（１）〜（３）の工程において、生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度を測定する。次いで、（４）〜（６）の工程において、生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のいずれか一方の濃度を測定する。 First, in the steps (1) to (3), the total concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in the biological sample are measured. Next, in the steps (4) to (6), the concentration of either hippuric acid or methylhippuric acid in the biological sample is measured.
（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させる工程
生体としては、特に限定されず、例えば、ヒト、動物（イヌ、ネコ、ブタ、ウシなど）が挙げられる。好ましくはヒト、より好ましくは有機溶媒を取り扱うヒトである。本発明の方法は、有機溶媒を取り扱うヒトの特殊健康診断に好適に用いられる。
(1) A step of acting an enzyme that hydrolyzes hippuric acid into benzoic acid and glycine and hydrolyzes methylhippuric acid into methylbenzoic acid and glycine on a certain amount of biological sample collected from the living body Is not particularly limited, and examples thereof include humans and animals (dogs, cats, pigs, cows, etc.). A human is preferable, and a human who handles an organic solvent is more preferable. The method of the present invention is suitably used for special health diagnosis of humans who handle organic solvents.
生体試料としては、特に限定されず、例えば、尿、血液、唾液、骨髄液、細胞間質液が挙げられる。好ましくは尿、より好ましくは有機溶媒を取り扱うヒトの尿である。 The biological sample is not particularly limited, and examples thereof include urine, blood, saliva, bone marrow fluid, and cell interstitial fluid. Preferably it is urine, more preferably human urine handling an organic solvent.
「馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素」としては、特に限定されず、例えば、アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１４）、馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）、Ｎ―アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．８１）が挙げられる。好ましくは、アミノアシラーゼである。 The “enzyme that hydrolyzes hippuric acid into benzoic acid and glycine and hydrolyzes methylhippuric acid into methylbenzoic acid and glycine” is not particularly limited, and for example, aminoacylase (EC 3.5.1. 14), hippuric acid hydrolase (EC 3.5.1.32), N-acyl-D-amino acid deacylase (EC 3.5.1.81). Aminoacylase is preferable.
アミノアシラーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されず、例えば、Ｄ−アミノアシラーゼ「アマノ」（和光純薬工業株式会社）、アシラーゼ（シグマアルドリッチ社、ブタ腎臓由来）が挙げられる。生物としては、特に限定されず、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、ブタ腎臓が挙げられる。 The aminoacylase is not particularly limited, and examples thereof include commercially available products and those prepared from living organisms. It does not specifically limit as what is marketed, For example, D-aminoacylase "Amano" (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and an acylase (Sigma Aldrich company, a porcine kidney origin) are mentioned. The organism is not particularly limited, and examples thereof include Aspergillus genus and pig kidney.
（２）（１）の工程で得た反応液に、（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、または（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程
この工程では、（ａ）（１）の工程で得た反応液に存在する安息香酸またはメチル安息香酸の量を評価するために、Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させるか、または（ｂ）（１）の工程で得た反応液に存在するグリシンの量を評価するために、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる。
(2) (a) D-amino acid and D-amino acid oxidase, or (b) S-adenosyl-L-methionine, glycine-N-methyltransferase and sarcosine oxidase are mixed in the reaction solution obtained in the step (1) In this step, in order to evaluate the amount of benzoic acid or methylbenzoic acid present in the reaction solution obtained in steps (a) and (1), D-amino acid and D-amino acid In order to evaluate the amount of glycine present in the reaction solution obtained by mixing oxidase and generating hydrogen peroxide or (b) (1), S-adenosyl-L-methionine (SAM), Glycine-N-methyltransferase and sarcosine oxidase are mixed to generate hydrogen peroxide.
（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３）は、補因子としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を含むペルオキシソーム酵素の一つであり、Ｄ−アミノ酸をイミノ酸に変換し、同時にアンモニアと過酸化水素を合成する。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、動物臓器から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されず、例えば、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＭＰバイオメディカル社）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマアルドリッチ社）が挙げられる。
(A) Step of mixing D-amino acid and D-amino acid oxidase to generate hydrogen peroxide D-amino acid oxidase (EC 1.4.3.3) is a peroxisome containing flavin adenine dinucleotide (FAD) as a cofactor. An enzyme that converts D-amino acids to imino acids and simultaneously synthesizes ammonia and hydrogen peroxide. The D-amino acid oxidase is not particularly limited, and examples thereof include commercially available products and those prepared from animal organs. It does not specifically limit as what is marketed, For example, D-amino acid oxidase (MP Biomedical), D-amino acid oxidase (Sigma Aldrich) is mentioned.
Ｄ−アミノ酸としては、特に限定されず、例えば、α−アミノ酸（アラニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、バリン、グルタミン酸、プロリン、チロシンなど）、β−アミノ酸、γ−アミノ酸が挙げられる。純粋なＤ−アミノ酸のみならず、Ｄ−アミノ酸を含むラセミ体であってもよい。好ましくは、安価に入手できる観点から、アラニン（ラセミ体）である。 The D-amino acid is not particularly limited, and examples thereof include α-amino acids (alanine, leucine, isoleucine, lysine, valine, glutamic acid, proline, tyrosine, etc.), β-amino acids, and γ-amino acids. The racemic body containing not only a pure D-amino acid but D-amino acid may be sufficient. Alanine (racemic) is preferable from the viewpoint of availability at low cost.
この工程では、例えば、Ｄ−アミノ酸としてアラニン（ラセミ体）を用いた場合、ピルビン酸、アンモニアおよび過酸化水素が発生する。（１）の工程で得た反応液に安息香酸またはメチル安息香酸が存在する場合、これらの化合物はＤ−アミノ酸オキシダーゼによる反応を阻害する。したがって、発生する過酸化水素の濃度を特定することによって反応液中の安息香酸またはメチル安息香酸の量を知ることができる。 In this step, for example, when alanine (racemate) is used as the D-amino acid, pyruvic acid, ammonia and hydrogen peroxide are generated. When benzoic acid or methylbenzoic acid is present in the reaction solution obtained in the step (1), these compounds inhibit the reaction by D-amino acid oxidase. Therefore, the amount of benzoic acid or methylbenzoic acid in the reaction solution can be known by specifying the concentration of the generated hydrogen peroxide.
（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを混合し、過酸化水素を発生させる工程
グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２０）は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のメチル基をグリシンに転移してサルコシンとアデノシルホモシテインを合成する。グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、動物臓器（ウサギ肝、ラット肝など）由来のものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されず、例えば、Recombinant human GNMT Glycine N-methyltransferase (aa 1-295), His-tagged（Acris Antibodies GmbH社）が挙げられる。
(B) Step of mixing S-adenosyl-L-methionine, glycine-N-methyltransferase and sarcosine oxidase to generate hydrogen peroxide Glycine-N-methyltransferase (EC2.1.1.20) Sarcosine and adenosyl homocytein are synthesized by transferring the methyl group of adenosylmethionine (SAM) to glycine. The glycine-N-methyltransferase is not particularly limited, and examples thereof include those commercially available and those derived from animal organs (rabbit liver, rat liver, etc.). Examples of commercially available products include, but are not limited to, Recombinant human GNMT Glycine N-methyltransferase (aa 1-295), His-tagged (Acris Antibodies GmbH).
サルコシンオキシダーゼ（ＥＣ１．５．３．１）は、サルコシン、水および酸素からグリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する。サルコシンオキシダーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されず、例えば、サルコシンオキシダーゼ（東洋紡株式会社、SAO−331、微生物由来）、サルコシンオキシダーゼ（ＭＰバイオメディカル社、152047）が挙げられる。微生物としては、特に限定されず、例えば、アリスロバクター（Arthrobactor）属が挙げられる。 Sarcosine oxidase (EC 1.5.3.1) produces glycine, formaldehyde and hydrogen peroxide from sarcosine, water and oxygen. The sarcosine oxidase is not particularly limited, and examples thereof include commercially available products and those prepared from microorganisms. Examples of commercially available products include, but are not limited to, sarcosine oxidase (Toyobo Co., Ltd., SAO-331, derived from microorganisms) and sarcosine oxidase (MP Biomedical, 152047). The microorganism is not particularly limited, and examples thereof include the genus Arthrobactor.
この工程では、（１）の工程で得た反応液中のグリシンの量を、発生する過酸化水素の濃度を特定することによって知ることができる。 In this step, the amount of glycine in the reaction solution obtained in the step (1) can be known by specifying the concentration of generated hydrogen peroxide.
（３）（２）の工程で発生した過酸化水素の濃度を特定する工程
過酸化水素の濃度を特定する方法としては、特に限定されず、公知の液状試薬を用いた方法を採用することができる。例えば、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）および／またはＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）を基質とするペルオキシダーゼを用いた酵素発色法、過酸化水素による鉄イオンの酸化に伴う色素の呈色反応を利用する方法が挙げられる。
(3) Step of specifying the concentration of hydrogen peroxide generated in step (2) The method of specifying the concentration of hydrogen peroxide is not particularly limited, and a method using a known liquid reagent may be adopted. it can. For example, an enzyme coloring method using peroxidase with 4-aminoantipyrine (4-AA) and / or N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -m-anisidine (ADPS) as a substrate, iron with hydrogen peroxide A method utilizing a color reaction of a dye accompanying oxidation of ions can be mentioned.
（４）（１）〜（３）の工程とは別に、該生体試料の別の一定量に、馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素を作用させて、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する工程
「馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素」としては、特に限定されないが、好ましくは馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）である。馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）は、野生型では「馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素」であるが、馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）に遺伝子組み換え技術により変異を導入して、上述の「馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素」とすることも可能である。野生型の馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）は、馬尿酸をほぼ１００％安息香酸とグリシンとに加水分解するが、メチル馬尿酸についてはほとんど加水分解しない。また、馬尿酸のベンゼン環構造のメチル基が付加された位置、すなわちｏ−位、ｍ−位またはｐ−位によって、馬尿酸ヒドロラーゼの加水分解活性が異なる。
(4) Separately from the steps (1) to (3), an enzyme having a high substrate specificity for hippuric acid and a low specific activity for methylhippuric acid is allowed to act on another fixed amount of the biological sample, Step of hydrolyzing hippuric acid into benzoic acid and glycine The enzyme having high substrate specificity for hippuric acid and low specific activity for methylhippuric acid is not particularly limited, but preferably hippuric acid hydrolase (EC3. 5.1.32). Hippuric acid hydrolase (EC3.5.1.32) is a “enzyme with high substrate specificity for hippuric acid and low specific activity for methylhippuric acid” in the wild type, but hippuric acid hydrolase (EC3.5. A mutation is introduced into 1.32) by gene recombination technology, and the above-mentioned “enzyme that hydrolyzes hippuric acid into benzoic acid and glycine and hydrolyzes methylhippuric acid into methylbenzoic acid and glycine” is used. It is also possible. Wild-type hippuric acid hydrolase (EC 3.5.1.32) hydrolyzes hippuric acid to almost 100% benzoic acid and glycine, but hardly hydrolyzes methylhippuric acid. Also, the hydrolytic activity of hippuric acid hydrolase varies depending on the position where the methyl group of the benzene ring structure of hippuric acid is added, ie, the o-position, m-position or p-position.
馬尿酸ヒドロラーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されない。微生物としては、特に限定されず、例えば、海産性好熱性細菌（Rhodothermus marinus）が挙げられる。 The hippuric acid hydrolase is not particularly limited, and examples thereof include commercially available products and those prepared from microorganisms. It does not specifically limit as what is marketed. The microorganism is not particularly limited, and examples thereof include marine thermophilic bacteria (Rhodothermus marinus).
馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）以外にも、アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１４）、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．８１）などに遺伝子組換え技術により変異を導入して、「馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素」とすることも可能である。 In addition to hippuric acid hydrolase (EC 3.5.1.32), recombination into aminoacylase (EC 3.5.1.14), N-acyl-D-amino acid deacylase (EC 3.5.1.81), etc. It is also possible to introduce a mutation by a technique to make “an enzyme having high substrate specificity for hippuric acid and low specific activity for methylhippuric acid”.
図１は、海産性好熱性細菌由来馬尿酸ヒドロラーゼについて、馬尿酸の分解（安息香酸の生成）を１００％とした場合のメチル馬尿酸の分解（メチル安息香酸の生成）（相対活性；％）を示す。ｏ−メチル馬尿酸およびｍ−メチル馬尿酸は約１０％であり、そしてｐ−メチル馬尿酸は約４０％である。 FIG. 1 shows the degradation of methylhippuric acid (production of methylbenzoic acid) (relative activity;%) with respect to hippuric acid hydrolase derived from a marine thermophilic bacterium when hippuric acid degradation (production of benzoic acid) is taken as 100%. Indicates. o-methylhippuric acid and m-methylhippuric acid are about 10% and p-methylhippuric acid is about 40%.
（５）（４）の工程で得た反応液に、安息香酸に対する基質特異性が高い酵素を作用させる工程
「安息香酸に対する基質特異性が高い酵素」としては、特に限定されず、例えば、安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．２５）、安息香酸−４−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．１２）、安息香酸−１，２−ジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１２．１０）が挙げられる。
(5) A step of allowing an enzyme having a high substrate specificity for benzoic acid to act on the reaction solution obtained in the step (4) is not particularly limited, and examples thereof include benzoic acid. Acid-CoA ligase (EC 6.2.1.25), benzoate-4-monooxygenase (EC 1.14.113.12), benzoate-1,2-dioxygenase (EC 1.14.1.12.10) Can be mentioned.
安息香酸−ＣｏＡリガーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されない。微生物としては、特に限定されず、例えば、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）、鉄還元細菌（Geobacter metallireducens）が挙げられる。 The benzoic acid-CoA ligase is not particularly limited, and examples thereof include commercially available products and those prepared from microorganisms. It does not specifically limit as what is marketed. The microorganism is not particularly limited, and examples thereof include Burkholderia xenovorans and iron-reducing bacteria (Geobacter metallireducens).
安息香酸−４−モノオキシゲナーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されない。微生物としては、特に限定されず、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属が挙げられる。 It does not specifically limit as benzoic acid-4-monooxygenase, For example, what is marketed and what was prepared from microorganisms are mentioned. It does not specifically limit as what is marketed. The microorganism is not particularly limited, and examples thereof include the genus Aspergillus and the genus Rhodotorula.
安息香酸−１，２−ジオキシゲナーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されない。微生物としては、特に限定されず、例えば、アシネトバクター(Acinetobacter)属、ロドコッカス(rhodococcus)属が挙げられる。 The benzoic acid-1,2-dioxygenase is not particularly limited, and examples thereof include commercially available products and those prepared from microorganisms. It does not specifically limit as what is marketed. The microorganism is not particularly limited and includes, for example, the genus Acinetobacter and the genus Rhodococcus.
この工程では、例えば、「安息香酸に対する基質特異性が高い酵素」として安息香酸−ＣｏＡリガーゼを用いた場合、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を添加すると、安息香酸をほぼ１００％ベンゾイルＣｏＡに代謝してアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を生成するが、メチル安息香酸についてはほとんど代謝しない。また、メチル安息香酸のベンゼン環構造のメチル基が付加された位置、すなわちｏ−位、ｍ−位またはｐ−位によって、安息香酸−ＣｏＡリガーゼの代謝活性が異なる。 In this step, for example, when benzoic acid-CoA ligase is used as an “enzyme having high substrate specificity for benzoic acid”, when adenosine triphosphate (ATP) is added, benzoic acid is metabolized to almost 100% benzoyl CoA. Adenosine monophosphate (AMP) is produced, but methylbenzoic acid is hardly metabolized. Further, the metabolic activity of benzoic acid-CoA ligase varies depending on the position where the methyl group of the benzene ring structure of methylbenzoic acid is added, that is, the o-position, m-position or p-position.
図２は、バークホルデリア・ゼノボランス由来安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｂｘｅ）、鉄還元細菌由来安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｇｍｅ）について、安息香酸の代謝を１００％とした場合のメチル安息香酸の代謝（相対活性；％）を示す。ｏ−メチル馬尿酸およびｍ−メチル馬尿酸は１０〜２０％であり、そしてｐ−メチル馬尿酸はほぼ０％である。 FIG. 2 shows the metabolism of methylbenzoic acid when benzoic acid metabolism is taken as 100% for benzoic acid-CoA ligase (Bxe) derived from Burkholderia xenobolans and benzoic acid-CoA ligase derived from iron-reducing bacteria (Gme). Relative activity;%). o-methylhippuric acid and m-methylhippuric acid are 10-20% and p-methylhippuric acid is approximately 0%.
上記のように、馬尿酸の分解（安息香酸の生成）を１００％とした場合のメチル馬尿酸の分解（メチル安息香酸の生成）（相対活性；％）は、ｏ−メチル馬尿酸およびｍ−メチル馬尿酸が約１０％であり、そしてｐ−メチル馬尿酸が約４０％であるから（図１）、安息香酸の代謝を１００％とした場合のメチル安息香酸の代謝（相対活性；％）は、ｏ−メチル馬尿酸およびｍ−メチル馬尿酸が１０％×１０〜２０％＝１〜２％であり、そしてｐ−メチル馬尿酸が４０％×１％＝０．４％である。 As described above, decomposition of methylhippuric acid (production of methylbenzoic acid) (relative activity;%) when the decomposition of hippuric acid (production of benzoic acid) is taken as 100% is defined as o-methylhippuric acid and m- Since methyl hippuric acid is about 10% and p-methyl hippuric acid is about 40% (FIG. 1), methylbenzoic acid metabolism (relative activity;%) when benzoic acid metabolism is taken as 100% O-methylhippuric acid and m-methylhippuric acid are 10% × 10-20% = 1-2% and p-methylhippuric acid is 40% × 1% = 0.4%.
このように、（５）の工程と（６）の工程とを経ることによって、生体試料中の馬尿酸はほぼ１００％ベンゾイルＣｏＡまで代謝されるが、生体試料中のメチル馬尿酸はほとんどトルイルＣｏＡまで代謝されない。 Thus, through the steps (5) and (6), hippuric acid in the biological sample is metabolized to almost 100% benzoyl CoA, but methyl hippuric acid in the biological sample is almost all toluyl CoA. It is not metabolized until.
（６）（５）の工程で得た反応液中の酵素反応産物の濃度を特定する工程
酵素反応産物の濃度を特定する方法としては、特に限定されず、酵素反応産物に応じて適宜公知の方法を採用することができる。好ましくは、液状試薬を用いた方法である。例えば、（５）の工程で、「安息香酸に対する基質特異性が高い酵素」として安息香酸−ＣｏＡリガーゼを用いた場合、酵素反応産物としては、例えば、図３に示すように、代謝産物のＡＭＰが挙げられる。図３の例では、最終的に生成するＮＡＤ＋の濃度を特定することによって、酵素反応産物の濃度を特定することができる。
(6) The step of specifying the concentration of the enzyme reaction product in the reaction solution obtained in the step (5) The method for specifying the concentration of the enzyme reaction product is not particularly limited, and is appropriately known depending on the enzyme reaction product. The method can be adopted. A method using a liquid reagent is preferred. For example, in the step (5), when benzoic acid-CoA ligase is used as the “enzyme having high substrate specificity for benzoic acid”, as the enzyme reaction product, for example, as shown in FIG. Is mentioned. In the example of FIG. 3, the concentration of the enzyme reaction product can be specified by specifying the concentration of NAD + that is finally generated.
（７）（３）の工程で得た過酸化水素の濃度と、（６）の工程で得た酵素反応産物の濃度とから該生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を算出する工程
（３）の工程で得た過酸化水素の濃度は、馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度に関連し、一方、（６）の工程で得た酵素反応産物の濃度は、馬尿酸の濃度に関連する。したがって、馬尿酸およびメチル馬尿酸の総濃度から馬尿酸の濃度を差し引くことにより、メチル馬尿酸の濃度も算定することできる。
(7) Calculate the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in the biological sample from the concentration of hydrogen peroxide obtained in the step (3) and the concentration of the enzyme reaction product obtained in the step (6). The concentration of hydrogen peroxide obtained in step (3) is related to the total concentration of hippuric acid and methylhippuric acid, while the concentration of the enzyme reaction product obtained in step (6) is that of hippuric acid. Related to concentration. Therefore, the concentration of methyl hippuric acid can also be calculated by subtracting the concentration of hippuric acid from the total concentration of hippuric acid and methyl hippuric acid.
本発明はまた、上記方法を実施するためのキットを含む。キットは、上記種々の酵素と酵素反応に必要な試薬とを含む。 The present invention also includes a kit for performing the above method. The kit includes the above various enzymes and reagents necessary for the enzyme reaction.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited by these Examples.
（実施例１）
（Ａ１）表１に記載の処方により試薬Ｒ１およびＲ２を準備する。ヒトから採取した尿の一定量に、試薬Ｒ１を表１に記載のＳ／Ｒ比に従って添加し、十分反応させた後、試薬Ｒ２を表１に記載のＳ／Ｒ比に従って添加する。
Example 1
(A1) Reagents R1 and R2 are prepared according to the formulation shown in Table 1. Reagent R1 is added to a certain amount of urine collected from humans according to the S / R ratio described in Table 1, and after sufficient reaction, reagent R2 is added according to the S / R ratio described in Table 1.
（Ｂ１）上記（Ａ１）とは別に表２に記載の処方により試薬Ｒ１およびＲ２を準備する。上記尿の別の一定量に、試薬Ｒ１を表２に記載のＳ／Ｒ比に従って添加し、十分反応させた後、試薬Ｒ２を表２に記載のＳ／Ｒ比に従って添加する。 (B1) Reagents R1 and R2 are prepared according to the formulation shown in Table 2 separately from (A1) above. Reagent R1 is added according to the S / R ratio described in Table 2 to another fixed amount of the urine, and after sufficiently reacting, reagent R2 is added according to the S / R ratio described in Table 2.
上記（Ａ１）で求まる上記尿中の過酸化水素の濃度と、上記（Ｂ１）で求まる上記尿中のＮＡＤＰ＋の濃度から上記尿中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を算出する。 The respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in the urine are calculated from the concentration of hydrogen peroxide in the urine determined in (A1) and the concentration of NADP + in the urine determined in (B1).
（実施例２）
（Ａ２）表３に記載の処方により試薬Ｒ１およびＲ２を準備する。ヒトから採取した尿の一定量に、試薬Ｒ１を表３に記載のＳ／Ｒ比に従って添加し、十分反応させた後、試薬Ｒ２を表３に記載のＳ／Ｒ比に従って添加する。
(Example 2)
(A2) Reagents R1 and R2 are prepared according to the formulation shown in Table 3. Reagent R1 is added to a certain amount of urine collected from humans according to the S / R ratio described in Table 3, and after sufficient reaction, reagent R2 is added according to the S / R ratio described in Table 3.
（Ｂ２）上記（Ａ２）とは別に表４に記載の処方により試薬Ｒ１およびＲ２を準備する。上記尿の別の一定量に、試薬Ｒ１を表４に記載のＳ／Ｒ比に従って添加し、十分反応させた後、試薬Ｒ２を表４に記載のＳ／Ｒ比に従って添加する。 (B2) Separately from the above (A2), reagents R1 and R2 are prepared according to the formulation shown in Table 4. Reagent R1 is added according to the S / R ratio described in Table 4 to a certain amount of the urine, and after sufficient reaction, reagent R2 is added according to the S / R ratio described in Table 4.
上記（Ａ２）で求まる上記尿中の過酸化水素の濃度と、上記（Ｂ２）で求まる上記尿中のＮＡＤ＋の濃度から上記尿中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を算出する。 The respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in the urine are calculated from the concentration of hydrogen peroxide in the urine determined in (A2) and the concentration of NAD + in the urine determined in (B2).
本発明は、特殊健康診断の分野において利用され得る。 The present invention can be used in the field of special health examinations.
Claims (1)
（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解し、かつメチル馬尿酸をメチル安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させる工程、
（２）（１）の工程で得た反応液に、
（ａ）Ｄ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ、または
（ｂ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを
混合し、過酸化水素を発生させる工程、
（３）（２）の工程で発生した過酸化水素の濃度を特定する工程、
（４）（１）〜（３）の工程とは別に、該生体試料の別の一定量に、馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素であって、該馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させて、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する工程、
（５）（４）の工程で得た反応液に、安息香酸に対する基質特異性が高く、メチル安息香酸に対する比活性が低い酵素を作用させる工程、
（６）（５）の工程で得た反応液中の酵素反応産物の濃度を特定する工程、および
（７）（３）の工程で得た過酸化水素の濃度と、（６）の工程で得た酵素反応産物の濃度とから該生体試料中の馬尿酸およびメチル馬尿酸のそれぞれの濃度を算出する工程
を含む、方法。 A method for measuring the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in a biological sample,
(1) A step of acting an enzyme that hydrolyzes hippuric acid into benzoic acid and glycine and hydrolyzes methylhippuric acid into methylbenzoic acid and glycine on a certain amount of biological sample collected from the living body,
(2) To the reaction solution obtained in the step (1),
(A) D-amino acid and D-amino acid oxidase, or (b) S-adenosyl-L-methionine, glycine-N-methyltransferase and sarcosine oxidase are mixed to generate hydrogen peroxide,
(3) a step of specifying the concentration of hydrogen peroxide generated in the step (2);
(4) Separately from the steps of (1) to (3), another amount of the biological sample is an enzyme having a high substrate specificity for hippuric acid and a low specific activity for methylhippuric acid , A step of hydrolyzing hippuric acid into benzoic acid and glycine by acting an enzyme that hydrolyzes hippuric acid into benzoic acid and glycine;
(5) to the reaction liquid obtained in step (4), substrate specificity for benzoate rather high, step of reacting the enzyme has a low specific activity against methyl benzoate,
(6) a step of specifying the concentration of the enzyme reaction product in the reaction solution obtained in the step (5), and (7) the concentration of hydrogen peroxide obtained in the step (3) and the step (6). A method comprising calculating the respective concentrations of hippuric acid and methylhippuric acid in the biological sample from the concentration of the obtained enzyme reaction product.
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