JP2019187285A - Substance detection method using glycine oxidase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、グリシンオキシダーゼを用いた物質検出方法に関し、特に、グリシンそのものを検出するのではなく、出発物質の化学反応により主生成物とともに副生したグリシンを検出することにより、出発物質の存在または主生成物の生成を検出する物質検出方法に関する。 The present invention relates to a substance detection method using glycine oxidase, and in particular, it does not detect glycine itself but detects by-product glycine as a by-product together with a main product by a chemical reaction of the starting material, or The present invention relates to a substance detection method for detecting production of a main product.
グリシンは、Ｄ体またはＬ体の立体異性を持たない最も単純な構造を有するアミノ酸であり、タンパク質を構成するアミノ酸の１種であるとともに、種々の生体物質を生合成する際の原料（出発物質）としても知られている。グリシンを測定する方法の一つとしては、質量分析法（ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アミノ酸分析装置等を用いた機械測定法が知られている。ただし、機械測定法では一般に、測定機器が高価かつ維持費用が高コストであるとともに、操作にも熟練を要する。 Glycine is an amino acid having the simplest structure that does not have stereoisomerism of D-form or L-form, and is one of amino acids constituting proteins, and a raw material (starting material) for biosynthesis of various biological substances. ) Also known as As one of the methods for measuring glycine, a mechanical measurement method using mass spectrometry (MS), high performance liquid chromatography (HPLC), an amino acid analyzer or the like is known. However, in the mechanical measurement method, in general, the measuring instrument is expensive and the maintenance cost is high, and the operation requires skill.
そこで、より低コストかつ簡便な測定方法として、グリシンに作用するグリシンオキシダーゼを用いた酵素測定法等も提案されている。例えば、非特許文献１には、グリシンオキシダーゼが分析用酵素として利用可能性があることが報告されている。ただし、グリシンオキシダーゼは、一般的には、タンパク質に対して活性が低い、基質阻害がある、Ｋｍ値が低い等の問題があるといわれている。また、特許文献１には、アミノ酸残基の少なくとも１つを変位させて、グリシンオキシダーゼの酵素活性、熱安定性、基質特異性等の特性を改変した改変グリシン酸化酵素と、これを用いたグリシンの分析方法が開示されている。 Therefore, an enzyme measurement method using glycine oxidase that acts on glycine has been proposed as a simpler and cheaper measurement method. For example, Non-Patent Document 1 reports that glycine oxidase may be used as an analytical enzyme. However, glycine oxidase is generally said to have problems such as low activity against proteins, substrate inhibition, and low Km value. Patent Document 1 discloses a modified glycine oxidase in which at least one amino acid residue is displaced to modify properties such as enzyme activity, thermal stability, and substrate specificity of glycine oxidase, and glycine using the same. An analysis method is disclosed.
ところで、グリシンは、種々の生体物質の原料となるだけでなく、種々の化学反応において副生成物として生成することがある。また、化学反応によっては、当該化学反応における主生成物を直接測定することが難しい場合もある。そこで、副生したグリシンを検出することで、任意の試料の中に出発物質が存在するか否か、もしくは、出発物質を化学反応させて主生成物が生成しているか否か、を間接的に判定することが可能となる。しかしながら、副生したグリシンの検出を出発物質または主生成物の検出の指標にするような物質検出方法は、今のところ、ほとんど知られていない。 By the way, glycine is not only used as a raw material for various biological substances, but may be produced as a by-product in various chemical reactions. Also, depending on the chemical reaction, it may be difficult to directly measure the main product in the chemical reaction. Therefore, by detecting the by-produced glycine, it is indirectly determined whether or not the starting material is present in any sample, or whether or not the main product is generated by chemical reaction of the starting material. Can be determined. However, few substance detection methods have been known so far, in which detection of by-produced glycine is used as an indicator for detection of starting material or main product.
例えば、非特許文献１では、生物試料中のグリシンの測定、サイクリングアッセイの構築によるサルコシン（Ｎ−メチルグリシン）等の増幅測定、基質特異性の違いによるグリシン以外のＤ−アミノ酸の測定等について可能性が示唆されている。また、特許文献１でも、改変グリシン酸化酵素を用いたグリシンの測定、グリシン以外のＬ−α−アミノ酸の測定について開示されている。しかしながら、これら文献では、副生成物であるグリシンをグリシンオキシダーゼで酸化することにより、出発物質または主生成物を検出することに関しては全く開示も示唆もない。 For example, in Non-Patent Document 1, measurement of glycine in biological samples, amplification measurement of sarcosine (N-methylglycine), etc. by construction of a cycling assay, measurement of D-amino acids other than glycine due to differences in substrate specificity, etc. are possible Sex has been suggested. Patent Document 1 also discloses measurement of glycine using a modified glycine oxidase and measurement of L-α-amino acids other than glycine. However, these references do not disclose or suggest any detection of the starting material or main product by oxidizing the byproduct glycine with glycine oxidase.
本発明はこのような課題を解決するためになされたものであって、グリシンオキシダーゼを用いてグリシンを酸化することにより、グリシンを副生する化学反応における出発物質または主生成物を検出することが可能な、物質検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve such a problem, and it is possible to detect a starting material or a main product in a chemical reaction by-producing glycine by oxidizing glycine using glycine oxidase. An object is to provide a possible substance detection method.
本発明者らは、前記課題に鑑み鋭意検討した結果、酵素サイクリング反応系を構築せずに、グリシンをダイレクトに反応させて過酸化水素を生成させることで、出発物質の存在または主生成物の生成を検出できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the inventors of the present invention did not construct an enzyme cycling reaction system, but directly reacted glycine to generate hydrogen peroxide, so that the presence of the starting material or the main product was reduced. The inventors have independently found that generation can be detected, and have completed the present invention.
すなわち、本発明に係る物質検出法は、前記の課題を解決するために、出発物質の化学反応により生成する主生成物とともに副生したグリシンを、グリシンオキシダーゼの触媒作用により、酵素サイクリング反応を構成しないダイレクト反応により酸化して、生成する過酸化水素を測定することにより、前記出発物質の存在または前記主生成物の生成を検出する構成である。 That is, in order to solve the above problems, the substance detection method according to the present invention configures an enzyme cycling reaction by using glycine produced as a by-product together with the main product generated by the chemical reaction of the starting material, by the catalytic action of glycine oxidase. In this configuration, the presence of the starting material or the formation of the main product is detected by measuring hydrogen peroxide that is oxidized by direct reaction.
前記構成によれば、副生成物であるグリシンを、グリシンオキシダーゼによりダイレクトに酸化して過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を測定する。これにより、複数の酵素を利用したサイクリング反応系を構築することなく、酵素としてグリシンオキシダーゼのみを用いた簡素なダイレクト反応系によりグリシンから過酸化水素を生成させることができる。そのため、過酸化水素の測定からグリシンを有効に定量できるとともに、グリシンを副生する化学反応において、グリシンを定量化すれば出発物質または主生成物を定量的に検出することが可能となる。 According to the above configuration, glycine as a by-product is directly oxidized with glycine oxidase to generate hydrogen peroxide, and this hydrogen peroxide is measured. Accordingly, hydrogen peroxide can be generated from glycine by a simple direct reaction system using only glycine oxidase as an enzyme without constructing a cycling reaction system using a plurality of enzymes. Therefore, glycine can be quantified effectively from the measurement of hydrogen peroxide, and if the glycine is quantified in a chemical reaction by-produced glycine, the starting material or main product can be detected quantitatively.
しかも、副生したグリシンをダイレクト反応により酸化して過酸化水素を生成させるため、グリシンの定量化にはエンドポイント法による機械測定を有効に利用することができる。これにより、グリシンの自動測定システムを構築し、グリシンの測定量を自動的に測定することで、化学反応比に基づいて出発物質または主生成物の定量を決定することができる。それゆえ、出発物質または主生成物の自動測定による検出も可能になる。 Moreover, since the by-produced glycine is oxidized by direct reaction to generate hydrogen peroxide, mechanical measurement by the endpoint method can be effectively used for quantification of glycine. Thereby, the automatic measurement system of glycine is constructed, and the measurement amount of glycine is automatically measured, whereby the quantification of the starting material or the main product can be determined based on the chemical reaction ratio. Therefore, detection by automatic measurement of starting material or main product is also possible.
前記構成の物質検出方法においては、前記過酸化水素の測定は、当該過酸化水素とアミノアンチピリンとトリンダー試薬とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、生成するキノン系色素による呈色度を測定することにより行われる構成であってもよい。 In the substance detection method having the above-described configuration, the measurement of the hydrogen peroxide is performed by reacting the hydrogen peroxide, aminoantipyrine, and a Trinder reagent with the catalytic action of peroxidase, and measuring the coloration degree by the quinone-based dye produced. The structure performed by may be sufficient.
また、前記構成の物質検出方法においては、前記化学反応が、酵素により触媒される反応である構成であってもよい。 Further, in the substance detection method having the above configuration, the chemical reaction may be a reaction catalyzed by an enzyme.
また、前記構成の物質検出方法においては、前記酵素が、アミノアシラーゼまたはペプチターゼである構成であってもよい。 Further, in the substance detection method having the above configuration, the enzyme may be an aminoacylase or a peptidase.
また、前記構成の物質検出方法においては、前記出発物質が、馬尿酸またはメチル馬尿酸であり、前記主生成物が、安息香酸またはメチル安息香酸である構成であってもよい。 In the substance detection method having the above configuration, the starting material may be hippuric acid or methylhippuric acid, and the main product may be benzoic acid or methylbenzoic acid.
本発明では、以上の構成により、グリシンオキシダーゼを用いてグリシンを酸化することにより、グリシンを副生する化学反応における出発物質または主生成物を検出することが可能な、物質検出方法を提供することができる、という効果を奏する。 The present invention provides a substance detection method capable of detecting a starting material or a main product in a chemical reaction by-producing glycine by oxidizing glycine using glycine oxidase with the above configuration. There is an effect that can be.
本開示に係る物質検出方法は、出発物質の化学反応により生成する主生成物とともに副生したグリシンを、グリシンオキシダーゼの触媒作用により、酵素サイクリング反応を構成しないダイレクト反応により酸化して、生成する過酸化水素を測定することにより、出発物質の存在または主生成物の生成を検出する方法である。 In the substance detection method according to the present disclosure, a glycine produced as a by-product together with a main product generated by a chemical reaction of a starting material is oxidized by a direct reaction that does not constitute an enzyme cycling reaction by a catalytic action of glycine oxidase. It is a method of detecting the presence of starting material or the formation of the main product by measuring hydrogen oxide.
グリシンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１９）は、グリシンの酸化による脱アミノ化を触媒する。下記（１）に示すように、グリシンの酸化により、グリシンからアンモニアが遊離してグリオキシル酸が生成するとともに過酸化水素も生成する。そのため、過酸化水素を検出することによりグリシンの酸化を判定することができる。また、下記式（１）から明らかなように、１モルのグリシンが酸化されることにより１モルの過酸化水素が生じるので、過酸化水素の生成量を定量することにより酸化されたグリシンの量（グリオキシル酸の生成量）を定量することができる。 Glycine oxidase (EC1.4.3.19) catalyzes the deamination of glycine by oxidation. As shown in (1) below, oxidation of glycine generates ammonia from glycine to produce glyoxylic acid and hydrogen peroxide. Therefore, the oxidation of glycine can be determined by detecting hydrogen peroxide. Further, as is clear from the following formula (1), 1 mol of hydrogen peroxide is produced by oxidizing 1 mol of glycine. Therefore, the amount of glycine oxidized by quantifying the amount of hydrogen peroxide produced The amount of glyoxylic acid produced can be quantified.
グリシン＋Ｈ2Ｏ ＋Ｏ2 → グリオキシル酸＋ＮＨ3 ＋Ｈ2Ｏ2 ・・・（１）
前記式（１）のダイレクト反応に発生した過酸化水素を検出する方法（過酸化水素の測定方法）は特に限定されないが、一般的には、過酸化水素とアミノアンチピリンとトリンダー試薬とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、生成するキノン系色素による呈色度を測定する方法、いわゆるトリンダー（Trinder）反応を好適に用いることができる。
Glycine + H 2 O + O 2 → Glyoxylic acid + NH 3 + H 2 O 2 (1)
The method for detecting hydrogen peroxide generated in the direct reaction of the above formula (1) (method for measuring hydrogen peroxide) is not particularly limited, but in general, hydrogen peroxide, aminoantipyrine, and a Trinder reagent are mixed with peroxidase. A method of measuring the coloration degree by the quinone dye produced by reacting with a catalytic action, that is, a so-called Trinder reaction can be suitably used.
トリンダー反応では、試料中の過酸化水素を酸化剤とし、トリンダー試薬を水素供与体として、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）を酸化酵素の触媒反応により反応させる。これにより、試料中に酸化縮合によりキノン系色素が発生するので、当該試料が呈色する。そこで、呈色の程度を吸光度装置等により測定することで、試料中の過酸化水素の量、延いては、酵素反応前に存在するグリシンの量を定量することができる。 In the Trinder reaction, 4-aminoantipyrine (4-AA) is reacted by a catalytic reaction of an oxidase using hydrogen peroxide in the sample as an oxidizing agent and the Trinder reagent as a hydrogen donor. Thereby, since a quinone dye is generated in the sample by oxidative condensation, the sample is colored. Therefore, by measuring the degree of coloration with an absorbance device or the like, the amount of hydrogen peroxide in the sample, and hence the amount of glycine present before the enzyme reaction can be quantified.
なお、トリンダー試薬の具体的な種類は特に限定されず、公知の化合物を好適に用いることができる。具体的には、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）等のアニリン誘導体；フェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリクロロフェノール、２，４，６−トリブロモフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、または３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイル酸等のフェノール誘導体；トルイジン誘導体；等を挙げることができる。本開示では、特にＴＯＯＳが好適に用いられる。 In addition, the specific kind of Trinder reagent is not specifically limited, A well-known compound can be used suitably. Specifically, for example, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (TOOS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (ADPS), N -Ethyl-N-sulfopropylaniline (ALPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methylaniline (TOPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (ADOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS) and other anilis Derivatives: phenol, 4-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,6-dichlorophenol, 3,5-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, 2,4,6-trichlorophenol, 2,4 Examples thereof include phenol derivatives such as 6-tribromophenol, 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid, or 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoyl acid; toluidine derivatives; and the like. In the present disclosure, TOOS is particularly preferably used.
グリシンを副生する化学反応とは、例えば、下記式（２）に模式的に示すように、１種以上の出発物質から１種以上の主生成物とともにグリシンが副生成物として生成する反応である。このような化学反応では、出発物質、主生成物、およびグリシンの生成量のモル比が一定になる。そこで、グリシンを定量することで、化学反応比（モル比）から、主生成物の生成量または出発物質の存在量（試料中の含有量または濃度）を容易に定量することができる。 The chemical reaction that produces glycine as a by-product is, for example, a reaction in which glycine is produced as a by-product together with one or more main products from one or more starting materials, as schematically shown in the following formula (2). is there. In such chemical reactions, the molar ratio of the starting material, the main product, and the amount of glycine produced is constant. Therefore, by quantifying glycine, the production amount of the main product or the abundance of the starting material (content or concentration in the sample) can be easily quantified from the chemical reaction ratio (molar ratio).
出発物質 → 主生成物＋グリシン（副生成物） ・・・（２）
前記式（１）に示すように、グリシンオキシダーゼの触媒作用によりグリシンからダイレクトに過酸化水素が生成するので、反応前のグリシンの量と反応後に生成した過酸化水素の量とは等モルである。それゆえ、過酸化水素を検出（定量）することにより、グリシンを検出（定量）することができ、その結果、主生成物の生成または出発物質の存在も検出（定量）することが可能になる。
Starting material → Main product + Glycine (by-product) (2)
As shown in the formula (1), hydrogen peroxide is generated directly from glycine by the catalytic action of glycine oxidase, so that the amount of glycine before the reaction and the amount of hydrogen peroxide generated after the reaction are equimolar. . Therefore, by detecting (quantitatively) hydrogen peroxide, it is possible to detect (quantitatively) glycine, and as a result, it is also possible to detect (quantitatively) the formation of main products or the presence of starting materials. .
本開示に係る物質検出方法に用いられるグリシンオキシダーゼは特に限定されず、公知のものを好適に用いることができる。具体的には、例えば、Bacillus cereus由来、Bacillus subtilis由来、Geobacillus kaustophilus由来のもの等を挙げることができる。 The glycine oxidase used in the substance detection method according to the present disclosure is not particularly limited, and a known glycine oxidase can be suitably used. Specific examples include those derived from Bacillus cereus, Bacillus subtilis, and Geobacillus kaustophilus.
グリシンを副生する化学反応としては特に限定されないが、例えば、酵素により触媒される反応が挙げられる。出発物質からグリシンが副生されるということは、１種以上の出発物質にグリシン構造が含まれていることになる。このような出発物質は、生体中に存在して酵素による触媒作用で代謝されるものであったり、生体由来ではなく化学合成された物質であっても、酵素反応によりグリシンを脱離することが可能な物質であったりすると考えられる。 Although it does not specifically limit as a chemical reaction to byproduce glycine, For example, the reaction catalyzed by an enzyme is mentioned. That glycine is by-produced from the starting material means that one or more starting materials contain a glycine structure. Such starting materials exist in the living body and are metabolized by the catalytic action of enzymes, or even substances that are chemically derived and not derived from living bodies can release glycine by an enzymatic reaction. It may be a possible substance.
より具体的な化学反応の一例としては、例えば、図１または図２に示す、馬尿酸またはメチル馬尿酸のアミノアシラーゼによる加水分解反応が挙げられる。馬尿酸はトルエンの代謝産物として知られ、メチル馬尿酸はキシレンの代謝産物として知られる。つまり、本開示の代表的な具体例としては、出発物質が、馬尿酸またはメチル馬尿酸であり、主生成物が、安息香酸またはメチル安息香酸である化学反応を挙げることができる。 An example of a more specific chemical reaction is, for example, a hydrolysis reaction of hippuric acid or methylhippuric acid with aminoacylase shown in FIG. 1 or FIG. Hippuric acid is known as a metabolite of toluene, and methylhippuric acid is known as a metabolite of xylene. That is, as a typical example of the present disclosure, a chemical reaction in which the starting material is hippuric acid or methylhippuric acid and the main product is benzoic acid or methylbenzoic acid can be mentioned.
馬尿酸は、ＩＵＰＡＣ名としては、ベンゾイルアミノ酢酸（Benzoylaminoacetic acid）が挙げられ、別名としてＮ−ベンゾイルグリシン（N-benzoylglycine）等も知られている。メチル馬尿酸は、馬尿酸のベンゼン環構造のオルト位、メタ位またはパラ位がメチル基で修飾された構造を有する。ＩＵＰＡＣ名では、オルト位を例に挙げると、（２−メチルベンゾイルアミノ）酢酸（(2-methylbenzoylamino)acetic acid）が挙げられ、別名としては、Ｎ−（ｏ−トルオイル）グリシン（N-(o-Toluoyl)glycine）等も知られている。 As hippuric acid, the IUPAC name includes benzoylaminoacetic acid, and N-benzoylglycine is also known as another name. Methyl hippuric acid has a structure in which the ortho, meta, or para position of the benzene ring structure of hippuric acid is modified with a methyl group. In the IUPAC name, taking the ortho position as an example, (2-methylbenzoylamino) acetic acid is exemplified, and another name is N- (o-toluoyl) glycine (N- (o -Toluoyl) glycine) is also known.
アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１４）は、馬尿酸またはメチル馬尿酸を、安息香酸またはメチル安息香酸とグリシンとに分解する反応を触媒する。なお、この反応を触媒する酵素（アミノアシラーゼの類縁酵素）としては、馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）またはＮ−アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．８１）等も知られている。アミノアシラーゼまたはその類縁酵素の具体的な種類は特に限定されず、市販されている種々の酵素試薬を好適に用いることができる。また、種々の生体由来のもので、生体組織等から精製可能なものを用いることができる。アミノアシラーゼまたはその類縁酵素を用いた場合の反応条件等についても特に限定されない。 Aminoacylase (EC 3.5.1.14) catalyzes the reaction that decomposes hippuric acid or methylhippuric acid into benzoic acid or methylbenzoic acid and glycine. In addition, as an enzyme (an aminoacylase-related enzyme) that catalyzes this reaction, hippuric acid hydrolase (EC3.5.1.32) or N-acyl-D-amino acid deacylase (EC3.5.1.81) is also available. Are known. The specific type of aminoacylase or its related enzyme is not particularly limited, and various commercially available enzyme reagents can be suitably used. In addition, those derived from various living bodies that can be purified from living tissues or the like can be used. There are no particular limitations on the reaction conditions and the like when aminoacylase or its related enzyme is used.
前記の通り、馬尿酸はトルエンの代謝産物であり、メチル馬尿酸はキシレンの代謝産物である。トルエンまたはキシレンは、これら有機溶媒を取り扱う作業者が吸入すると、大部分が体内で安息香酸またはメチル安息香酸に代謝され、その後にグリシン抱合を受けて、馬尿酸またはメチル馬尿酸となり、尿中に排泄される。それゆえ、馬尿酸またはメチル馬尿酸（以下、適宜「馬尿酸等」と略す。）は、トルエンまたはキシレンの曝露指標として用いられる。したがって、本開示において、グリシンを副生する化学反応の試料としては、馬尿酸等を含む（可能性がある）尿等の生体試料が挙げられる。 As described above, hippuric acid is a metabolite of toluene, and methylhippuric acid is a metabolite of xylene. When toluene or xylene is inhaled by workers who handle these organic solvents, most of it is metabolized to benzoic acid or methylbenzoic acid in the body, and then glycine conjugated to hippuric acid or methylhippuric acid, It is excreted. Therefore, hippuric acid or methyl hippuric acid (hereinafter abbreviated as “hippuric acid or the like” where appropriate) is used as an exposure index for toluene or xylene. Therefore, in the present disclosure, examples of a chemical reaction sample that produces glycine as a by-product include biological samples such as urine containing (possibly) hippuric acid and the like.
化学反応の試料としては、尿に限定されず、血液、唾液、骨髄液、細胞間質液等であってもよい。また、試料の由来は、有機溶剤を取り扱う作業者すなわちヒトが挙げられる。それゆえ、本開示に係る物質検出方法は、有機溶媒を取り扱うヒトにおいて、トルエンまたはキシレンの曝露を評価する健康診断等に好適に用いることができる。なお、試料の由来はヒトに限定されず、他の動物（イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ラット、マウス等の哺乳類、もしくは哺乳類以外の脊椎動物等）であってもよい。 The sample for the chemical reaction is not limited to urine, but may be blood, saliva, bone marrow fluid, cell interstitial fluid, or the like. Moreover, the origin of the sample includes an operator who handles organic solvents, that is, a human. Therefore, the substance detection method according to the present disclosure can be suitably used for a health check or the like for evaluating exposure to toluene or xylene in a human handling an organic solvent. The origin of the sample is not limited to humans, but may be other animals (mammals such as dogs, cats, pigs, cows, rats, mice, or vertebrates other than mammals).
ここで、馬尿酸等の従来の測定方法としては、図２の上段に示すように、まず、馬尿酸等を含む（可能性のある）試料を一定量採取し、アミノアシラーゼを添加混合して馬尿酸等を加水分解する。これにより、安息香酸またはメチル安息香酸（安息香酸等）とグリシンとが生成する。さらに、図２の中段に示すように、当該試料に対して、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを添加混合すると、酵素サイクリング反応が生じる。このサイクリング反応では、グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの触媒作用により、グリシンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからサルコシンが生成し、サルコシンオキシダーゼの触媒作用により、サルコシンからグリシンおよび過酸化水素が生成する。 Here, as a conventional method for measuring hippuric acid or the like, as shown in the upper part of FIG. 2, first, a certain amount of a sample containing (possibly) hippuric acid or the like is collected, and aminoacylase is added and mixed. Hydrolyzes hippuric acid, etc. Thereby, benzoic acid or methylbenzoic acid (benzoic acid or the like) and glycine are generated. Furthermore, as shown in the middle part of FIG. 2, when the sample is added and mixed with S-adenosyl-L-methionine, glycine-N-methyltransferase and sarcosine oxidase, an enzyme cycling reaction occurs. In this cycling reaction, sarcosine is produced from glycine and S-adenosyl-L-methionine by the catalytic action of glycine-N-methyltransferase, and glycine and hydrogen peroxide are produced from sarcosine by the catalytic action of sarcosine oxidase.
そこで、図２の下段に示すように、サルコシンから生成した過酸化水素に対して、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、トリンダー試薬（例えば、ＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン）、およびペルオキシダーゼを添加混合する。これにより、キノン系色素が生じるので、例えば、５００〜５５０ｎｍの吸光度でキノン系色素の呈色度を測定すれば、過酸化水素の生成量を定量できる。過酸化水素が定量できれば、グリシンを定量することができる。このようにグリシンを定量することで、馬尿酸等を定量することができる。なお、馬尿酸とメチル馬尿酸とを区別して測定する手法については、公知の手法を適宜用いることができ、特に限定されない。 Therefore, as shown in the lower part of FIG. 2, 4-aminoantipyrine (4-AA), a Trinder reagent (for example, TOOS (N-ethyl-N- (2-hydroxy-) 3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline) and peroxidase are added and mixed in. As a result, a quinone dye is produced, and for example, if the coloration degree of the quinone dye is measured at an absorbance of 500 to 550 nm, it is excessive. The amount of hydrogen oxide produced can be quantified.If hydrogen peroxide can be quantified, glycine can be quantified.By quantifying glycine in this way, hippuric acid, etc. can be quantified. As a method for distinguishing and measuring hippuric acid, a known method can be appropriately used, and it is not particularly limited.
ただし、図２に示す従来の方法では、グリシン−サルコシンのサイクリング反応により、グリシンが増幅測定されるので、レート法によりグリシンを定量する必要がある。 However, in the conventional method shown in FIG. 2, glycine is amplified and measured by a cycling reaction of glycine-sarcosine, so that it is necessary to quantify glycine by the rate method.
酵素反応を利用して物質を検出（測定）する方法としては、分析手法の違いから、レート法とエンドポイント法との２種類に分類することができる。 Methods for detecting (measuring) a substance using an enzyme reaction can be classified into two types, a rate method and an endpoint method, depending on the difference in the analysis method.
レート法は、酵素の触媒作用により基質を化学反応させたときに、反応進行中の速度（レート）を測定することにより、物質を定量的に検出する方法である。この方法では、例えば、酵素により触媒される反応が進行している間の速度を、吸光度または濁度等の変化として測定する。 The rate method is a method for quantitatively detecting a substance by measuring a rate (rate) during the reaction when a substrate is chemically reacted by an enzyme catalytic action. In this method, for example, the speed during the progress of the reaction catalyzed by the enzyme is measured as a change in absorbance or turbidity.
エンドポイント法は、酵素の触媒作用により基質を化学反応させ、基質を十分に反応させた後（エンドポイントに達した後）に、反応前後の総変化量を測定することにより、物質を定量的に検出する方法である。この方法では、例えば、基質である出発物質の減少もしくは出発物質から生成物の増加が実質的に停止するまで反応を進行させ、吸光度または濁度等により生成物の生成量を測定する。エンドポイント法では、化学反応による生成物の生成が飽和に漸近するため、レート法に比べて機械測定による自動化に適用させやすいという利点がある。 In the endpoint method, a substance is quantitatively measured by measuring the total amount of change before and after the reaction after the substrate is chemically reacted by the catalytic action of the enzyme and the substrate is sufficiently reacted (after reaching the endpoint). It is a method to detect. In this method, for example, the reaction is allowed to proceed until the decrease in the starting material as a substrate or the increase in the product from the starting material is substantially stopped, and the amount of product produced is measured by absorbance or turbidity. The end point method has an advantage that it can be easily applied to automation by mechanical measurement as compared with the rate method because the production of a product by a chemical reaction is asymptotic to saturation.
本開示に係る方法では、図１の中段に示すように、グリシンオキシダーゼを用いてグリシンを酸化することにより、グリオキシル酸およびアンモニアとともに、過酸化水素をダイレクトに生成させる。 In the method according to the present disclosure, hydrogen peroxide is directly generated together with glyoxylic acid and ammonia by oxidizing glycine using glycine oxidase as shown in the middle part of FIG.
本開示では、馬尿酸等を含む（可能性のある）試料においてアミノアシラーゼにより安息香酸等とグリシンとを生成させる点、並びに、生成した過酸化水素を酸化剤としてペルオキシダーゼによりキノン系色素を生成させる点は、従来と同様である。しかしながら、図１の上段、中段および下段の各化学反応式からも明らかなように、馬尿酸等から等モルのグリシンが副生し、グリシンから等モルの過酸化水素が生成し、過酸化水素を酸化剤として、過酸化水素に等モルのキノン系色素を生成することになる。 In the present disclosure, in a sample containing hippuric acid or the like (possible), benzoic acid or the like and glycine are generated by aminoacylase, and a quinone dye is generated by peroxidase using the generated hydrogen peroxide as an oxidizing agent. The point is the same as the conventional one. However, as is apparent from the chemical reaction formulas in the upper, middle and lower parts of FIG. 1, equimolar glycine is by-produced from hippuric acid and the like, and equimolar hydrogen peroxide is produced from glycine. Is used as an oxidizing agent to produce equimolar quinone dyes in hydrogen peroxide.
これにより、馬尿酸等から等モルのキノン系色素を生成させることになるので、レート法ではなくエンドポイント法を好適に用いることが可能になる。前記のように、エンドポイント法は、機械測定に適用させやすいため、本開示に係る物質検出方法を用いることで、馬尿酸等の検出（定量）を自動測定することが可能となる。 As a result, equimolar quinone dyes are produced from hippuric acid or the like, and therefore the endpoint method can be suitably used instead of the rate method. As described above, since the endpoint method is easily applied to mechanical measurement, detection (quantitative) of hippuric acid or the like can be automatically measured by using the substance detection method according to the present disclosure.
なお、過酸化水素からキノン系色素を生成させる際に用いられるペルオキシダーゼの具体的な種類は特に限定されず、公知のものを好適に用いることができる。また、生成するキノン系色素は、トリンダー試薬となる化合物の種類によりその構造が異なるので、特に限定されない。 In addition, the specific kind of peroxidase used when producing | generating a quinone type pigment | dye from hydrogen peroxide is not specifically limited, A well-known thing can be used suitably. The quinone dye to be produced is not particularly limited because its structure varies depending on the type of the compound serving as the Trinder reagent.
ここで、本開示に係る物質検出方法が適用可能な化学反応、出発物質、主生成物については、前述した馬尿酸等を安息香酸等およびグリシンに加水分解する反応に限定されない。例えば、出発物質がタンパク質またはペプチドであり、酵素としてペプチターゼを用いて加水分解して、主生成物として新たなペプチドを生成する際にグリシンが副生するような化学反応であってもよい。 Here, the chemical reaction, starting material, and main product to which the substance detection method according to the present disclosure can be applied are not limited to the reaction of hydrolyzing hippuric acid or the like to benzoic acid or the like and glycine. For example, it may be a chemical reaction in which glycine is by-produced when the starting material is a protein or peptide and is hydrolyzed using peptidase as an enzyme to produce a new peptide as the main product.
他にも、例えば、Ｌ−スレオニンアルドラーゼは、Ｌ−スレオニンからグリシンとアセトアルデヒドとを生成する反応を触媒するので、本開示に係る物質検出方法は、このような化学反応にも適用できる。なお、この化学反応では、出発物質がＬ−スレオニンであるが、グリシンを副生成物と見なした場合に、アセトアルデヒドが主生成物に相当する。ただし、化学反応における「主生成物」と「副生成物」との関係は相対的なものであり、グリシン以外の物質が生成する場合であれば、グリシンを便宜上「副生成物」と見なし、他の生成物を「主生成物」と見なすことができる。 In addition, for example, L-threonine aldolase catalyzes the reaction of producing glycine and acetaldehyde from L-threonine, and thus the substance detection method according to the present disclosure can be applied to such a chemical reaction. In this chemical reaction, the starting material is L-threonine, but when glycine is regarded as a by-product, acetaldehyde corresponds to the main product. However, the relationship between the “main product” and the “by-product” in the chemical reaction is relative, and if a substance other than glycine is produced, the glycine is regarded as a “by-product” for convenience, Other products can be considered “main products”.
このように、本開示によれば、副生成物であるグリシンを、グリシンオキシダーゼによりダイレクトに酸化して過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を測定する。これにより、複数の酵素を利用したサイクリング反応系を構築することなく、酵素としてグリシンオキシダーゼのみを用いた簡素なダイレクト反応系によりグリシンから過酸化水素を生成させることができる。そのため、過酸化水素の測定からグリシンを有効に定量できるとともに、グリシンを副生する化学反応において、グリシンを定量化すれば出発物質または主生成物を定量的に検出することが可能となる。 Thus, according to the present disclosure, glycine as a by-product is directly oxidized with glycine oxidase to generate hydrogen peroxide, and this hydrogen peroxide is measured. Accordingly, hydrogen peroxide can be generated from glycine by a simple direct reaction system using only glycine oxidase as an enzyme without constructing a cycling reaction system using a plurality of enzymes. Therefore, glycine can be quantified effectively from the measurement of hydrogen peroxide, and if the glycine is quantified in a chemical reaction by-produced glycine, the starting material or main product can be detected quantitatively.
しかも、副生したグリシンをダイレクト反応により酸化して過酸化水素を生成させるため、グリシンの定量化にはエンドポイント法による機械測定を有効に利用することができる。これにより、グリシンの自動測定システムを構築し、グリシンの測定量を自動的に測定することで、化学反応比に基づいて出発物質または主生成物の定量を決定することができる。それゆえ、出発物質または主生成物の自動測定による検出も可能になる。 Moreover, since the by-produced glycine is oxidized by direct reaction to generate hydrogen peroxide, mechanical measurement by the endpoint method can be effectively used for quantification of glycine. Thereby, the automatic measurement system of glycine is constructed, and the measurement amount of glycine is automatically measured, whereby the quantification of the starting material or the main product can be determined based on the chemical reaction ratio. Therefore, detection by automatic measurement of starting material or main product is also possible.
本発明について、実施例および比較例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。 The present invention will be described more specifically based on examples and comparative examples, but the present invention is not limited to this. Those skilled in the art can make various changes, modifications, and alterations without departing from the scope of the present invention.
（実施例）
１ユニット／ｍＬのグリシンオキシダーゼ、０．０２質量％の４−アミノアンチピリン、および５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）を含有する第一試薬と、５ユニット／ｍＬの馬尿酸加水分解酵素、１０ユニット／ｍＬのペルオキシダーゼ、０．０６質量％のＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、および５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）を含有する第二試薬とを準備した。
(Example)
A first reagent containing 1 unit / mL glycine oxidase, 0.02 mass% 4-aminoantipyrine, and 50 mM phosphate buffer (pH 9.0), and 5 units / mL hippuric acid hydrolase, 10 units / mL peroxidase, 0.06 wt% N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (TOOS), and 50 mM phosphate buffer (pH 9.0) A second reagent containing was prepared.
また、測定用試料（検体）として、馬尿酸の含有量が０ｍＭ（すなわち馬尿酸を含有しないネガティブコントロール）、１ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭの４種類を準備した。 In addition, four types of samples for measurement (specimens) having a hippuric acid content of 0 mM (that is, a negative control not containing hippuric acid), 1 mM, 5 mM, and 10 mM were prepared.
これら４種類の測定用試料それぞれに対して、第一試薬５４０μＬを混合して３７℃で５分間インキュベーションした後に、さらに第二試薬１８０μＬを添加して混合して３７℃で１５分間（９００秒）反応させた。この１５分の反応期間中、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果を図３に示す。 For each of these four types of measurement samples, 540 μL of the first reagent was mixed and incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then 180 μL of the second reagent was further added and mixed for 15 minutes at 37 ° C. (900 seconds). Reacted. Absorbance was measured at a wavelength of 550 nm during this 15 minute reaction period. The result is shown in FIG.
（比較例）
第一試薬として、８ユニット／ｍＬのペルオキシダーゼ、５ユニット／ｍＬの馬尿酸加水分解酵素、０．０２質量％のＴＯＯＳ、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含有するものを用いるとともに、第二試薬として、４ｍＭのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、４０ユニット／ｍＬのサルコシンオキシダーゼ、０．０６質量％の４−アミノアンチピリン、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含有するものを用い、さらに、４種類の測定用試料（検体）の量を６μＬとした以外は、実施例と同様にして、３７℃で３３分間反応させた。この３３分の反応期間中、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果を図４に示す。
(Comparative example)
As the first reagent, one containing 8 units / mL peroxidase, 5 units / mL hippuric acid hydrolase, 0.02 mass% TOOS, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), The second reagent contains 4 mM S-adenosyl-L-methionine, 40 units / mL sarcosine oxidase, 0.06 mass% 4-aminoantipyrine, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). In addition, the reaction was carried out at 37 ° C. for 33 minutes in the same manner as in Example except that the amount of four kinds of measurement samples (specimens) was changed to 6 μL. Absorbance was measured at a wavelength of 550 nm during this 33 minute reaction period. The result is shown in FIG.
（実施例および比較例の対比）
実施例は、図１に示す馬尿酸の検出方法すなわち本開示に係る物質検出方法の一例であり、比較例は、図２に示す馬尿酸の検出方法すなわち従来の検出方法の一例である。図３および図４のいずれも、図中菱型のマーカーで示すネガティブコントロール（０ｍＭ）では、５５０ｎｍの吸光度はほぼ０で変化が見られなかった。
(Contrast of Examples and Comparative Examples)
The example is an example of the hippuric acid detection method shown in FIG. 1, that is, an example of the substance detection method according to the present disclosure, and the comparative example is an example of the hippuric acid detection method shown in FIG. In both FIG. 3 and FIG. 4, in the negative control (0 mM) indicated by the diamond-shaped marker in the figure, the absorbance at 550 nm was almost 0 and no change was observed.
図３に示すように、本開示に係る検出方法では、図中正方形のマーカーで示す１ｍＭ、図中三角形のマーカーで示す５ｍＭ、図中Ｘのマーカーで示す１０ｍＭの結果のいずれも、副生したグリシンの生成量の増加はそれぞれ飽和値に漸近した。また、いずれの結果も、グリシンの生成量は、３００秒経過する前から増加し始め、６００秒（１０分）経過すれば飽和値に達していた。 As shown in FIG. 3, in the detection method according to the present disclosure, 1 mM indicated by the square marker in the figure, 5 mM indicated by the triangular marker in the figure, and 10 mM indicated by the marker X in the figure were by-produced. The increase in the amount of glycine produced gradually approached the saturation value. In all the results, the amount of glycine produced started to increase before 300 seconds passed, and reached a saturation value after 600 seconds (10 minutes) passed.
これに対して、図４に示すように、従来の検出方法では、図中正方形のマーカーで示す１ｍＭ、図中三角形のマーカーで示す５ｍＭ、図中Ｘのマーカーで示す１０ｍＭの結果のいずれも、副生したグリシンの生成量は、反応時間の進行に伴い比例的に増加した。また、いずれの結果も、グリシンの生成量は１７分頃から増加し始めた。 On the other hand, as shown in FIG. 4, in the conventional detection method, all of the results of 1 mM indicated by the square marker in the figure, 5 mM indicated by the triangular marker in the figure, and 10 mM indicated by the marker X in the figure, The amount of glycine produced as a by-product increased proportionally with the progress of the reaction time. In all results, the amount of glycine produced started to increase from around 17 minutes.
このように、本開示に係る検出方法であれば、副生したグリシンをダイレクト反応により酸化して過酸化水素を生成させるため、エンドポイント法による機械測定を有効に利用することが可能であることがわかる。それゆえ、グリシンの自動測定システムを構築し、グリシンの測定量を自動的に測定することで、出発物質または主生成物の自動測定による検出が可能になると判断される。 As described above, in the detection method according to the present disclosure, by-product glycine is oxidized by a direct reaction to generate hydrogen peroxide, so that mechanical measurement by the endpoint method can be effectively used. I understand. Therefore, it is judged that an automatic measurement system for glycine is constructed and the measurement amount of glycine is automatically measured, thereby enabling detection of the starting material or the main product by automatic measurement.
なお、本発明は前記実施の形態の記載に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態や複数の変形例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 It should be noted that the present invention is not limited to the description of the above-described embodiment, and various modifications are possible within the scope shown in the scope of the claims, and are disclosed in different embodiments and a plurality of modifications. Embodiments obtained by appropriately combining the technical means are also included in the technical scope of the present invention.
本発明は、グリシンオキシダーゼを用いて、副生したグリシンを検出することにより、出発物質の存在または主生成物の生成を検出する物質検出方法の分野に好適に用いることができる。 The present invention can be suitably used in the field of a substance detection method for detecting the presence of a starting material or production of a main product by detecting glycine by-produced using glycine oxidase.
Claims (5)
物質検出方法。 By oxidizing the glycine produced as a by-product together with the main product produced by the chemical reaction of the starting material by a direct reaction that does not constitute an enzyme cycling reaction by the catalytic action of glycine oxidase, and measuring the generated hydrogen peroxide, Detecting the presence of starting material or the formation of said main product,
Substance detection method.
請求項１に記載の物質検出方法。 The measurement of the hydrogen peroxide is performed by reacting the hydrogen peroxide, aminoantipyrine, and a Trinder reagent by the catalytic action of peroxidase, and measuring the coloration degree by the quinone dye that is generated,
The method for detecting a substance according to claim 1.
請求項１または２に記載の物質検出方法。 The chemical reaction is an enzyme-catalyzed reaction,
The substance detection method according to claim 1 or 2.
請求項３に記載の物質検出方法。 The enzyme is an aminoacylase or a peptidase,
The method for detecting a substance according to claim 3.
請求項４に記載の物質検出方法。
The starting material is hippuric acid or methylhippuric acid, and the main product is benzoic acid or methylbenzoic acid,
The substance detection method according to claim 4.
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