JP7162830B2 - Substance detection method using glycine oxidase - Google Patents
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Description
本発明は、グリシンオキシダーゼを用いた物質検出方法に関し、特に、グリシンそのものを検出するのではなく、出発物質の化学反応により主生成物とともに副生したグリシンを検出することにより、出発物質の存在または主生成物の生成を検出する物質検出方法に関する。 The present invention relates to a substance detection method using glycine oxidase, and in particular, by detecting glycine that is a by-product of the chemical reaction of the starting material together with the main product, instead of detecting glycine itself, it is possible to detect the presence or absence of the starting material. The present invention relates to a substance detection method for detecting production of a main product.
グリシンは、Ｄ体またはＬ体の立体異性を持たない最も単純な構造を有するアミノ酸であり、タンパク質を構成するアミノ酸の１種であるとともに、種々の生体物質を生合成する際の原料（出発物質）としても知られている。グリシンを測定する方法の一つとしては、質量分析法（ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アミノ酸分析装置等を用いた機械測定法が知られている。ただし、機械測定法では一般に、測定機器が高価かつ維持費用が高コストであるとともに、操作にも熟練を要する。 Glycine is an amino acid with the simplest structure that does not have D- or L-stereoisomerism, and is one of the amino acids that constitute proteins. ) is also known as As one of methods for measuring glycine, a mechanical measurement method using mass spectrometry (MS), high performance liquid chromatography (HPLC), an amino acid analyzer, or the like is known. However, the mechanical measurement method generally requires expensive measuring equipment, high maintenance costs, and requires skill to operate.
そこで、より低コストかつ簡便な測定方法として、グリシンに作用するグリシンオキシダーゼを用いた酵素測定法等も提案されている。例えば、非特許文献１には、グリシンオキシダーゼが分析用酵素として利用可能性があることが報告されている。ただし、グリシンオキシダーゼは、一般的には、タンパク質に対して活性が低い、基質阻害がある、Ｋｍ値が低い等の問題があるといわれている。また、特許文献１には、アミノ酸残基の少なくとも１つを変位させて、グリシンオキシダーゼの酵素活性、熱安定性、基質特異性等の特性を改変した改変グリシン酸化酵素と、これを用いたグリシンの分析方法が開示されている。
Therefore, an enzymatic measurement method using glycine oxidase acting on glycine has been proposed as a simpler and lower-cost measurement method. For example, Non-Patent
ところで、グリシンは、種々の生体物質の原料となるだけでなく、種々の化学反応において副生成物として生成することがある。また、化学反応によっては、当該化学反応における主生成物を直接測定することが難しい場合もある。そこで、副生したグリシンを検出することで、任意の試料の中に出発物質が存在するか否か、もしくは、出発物質を化学反応させて主生成物が生成しているか否か、を間接的に判定することが可能となる。しかしながら、副生したグリシンの検出を出発物質または主生成物の検出の指標にするような物質検出方法は、今のところ、ほとんど知られていない。 By the way, glycine not only serves as a raw material for various biological substances, but may also be produced as a by-product in various chemical reactions. Moreover, depending on the chemical reaction, it may be difficult to directly measure the main product in the chemical reaction. Therefore, by detecting the by-product glycine, it is possible to indirectly determine whether or not the starting material is present in an arbitrary sample, or whether or not the starting material is chemically reacted to produce the main product. can be determined. However, at present, there are almost no substance detection methods that use the detection of glycine as a by-product as an index for the detection of the starting material or the main product.
例えば、非特許文献１では、生物試料中のグリシンの測定、サイクリングアッセイの構築によるサルコシン（Ｎ－メチルグリシン）等の増幅測定、基質特異性の違いによるグリシン以外のＤ－アミノ酸の測定等について可能性が示唆されている。また、特許文献１でも、改変グリシン酸化酵素を用いたグリシンの測定、グリシン以外のＬ－α－アミノ酸の測定について開示されている。しかしながら、これら文献では、副生成物であるグリシンをグリシンオキシダーゼで酸化することにより、出発物質または主生成物を検出することに関しては全く開示も示唆もない。
For example, in
本発明はこのような課題を解決するためになされたものであって、グリシンオキシダーゼを用いてグリシンを酸化することにより、グリシンを副生する化学反応における出発物質または主生成物を検出することが可能な、物質検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve such problems, and it is possible to detect a starting material or a main product in a chemical reaction that produces glycine as a by-product by oxidizing glycine using glycine oxidase. It is an object of the present invention to provide a possible substance detection method.
本発明者らは、前記課題に鑑み鋭意検討した結果、酵素サイクリング反応系を構築せずに、グリシンをダイレクトに反応させて過酸化水素を生成させることで、出発物質の存在または主生成物の生成を検出できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that by directly reacting glycine to generate hydrogen peroxide without constructing an enzymatic cycling reaction system, the existence of the starting material or the main product The present inventors have independently found that generation can be detected, and have completed the present invention.
すなわち、本発明に係る物質検出法は、前記の課題を解決するために、出発物質の化学反応により生成する主生成物とともに副生したグリシンを、グリシンオキシダーゼの触媒作用により、酵素サイクリング反応を構成しないダイレクト反応により酸化して、生成する過酸化水素を測定することにより、前記出発物質の存在または前記主生成物の生成を検出する構成である。 That is, in order to solve the above-mentioned problems, the substance detection method according to the present invention constitutes an enzymatic cycling reaction by catalyzing glycine, which is a by-product together with the main product produced by the chemical reaction of the starting materials, by the catalytic action of glycine oxidase. It is configured to detect the presence of the starting material or the production of the main product by measuring the hydrogen peroxide produced by oxidation by a direct reaction that does not occur.
前記構成によれば、副生成物であるグリシンを、グリシンオキシダーゼによりダイレクトに酸化して過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を測定する。これにより、複数の酵素を利用したサイクリング反応系を構築することなく、酵素としてグリシンオキシダーゼのみを用いた簡素なダイレクト反応系によりグリシンから過酸化水素を生成させることができる。そのため、過酸化水素の測定からグリシンを有効に定量できるとともに、グリシンを副生する化学反応において、グリシンを定量化すれば出発物質または主生成物を定量的に検出することが可能となる。 According to the above configuration, glycine, which is a by-product, is directly oxidized by glycine oxidase to generate hydrogen peroxide, and this hydrogen peroxide is measured. Thereby, hydrogen peroxide can be produced from glycine by a simple direct reaction system using only glycine oxidase as an enzyme without constructing a cycling reaction system using a plurality of enzymes. Therefore, it is possible to effectively quantify glycine from the measurement of hydrogen peroxide, and to quantitatively detect the starting material or the main product by quantifying glycine in a chemical reaction that produces glycine as a by-product.
しかも、副生したグリシンをダイレクト反応により酸化して過酸化水素を生成させるため、グリシンの定量化にはエンドポイント法による機械測定を有効に利用することができる。これにより、グリシンの自動測定システムを構築し、グリシンの測定量を自動的に測定することで、化学反応比に基づいて出発物質または主生成物の定量を決定することができる。それゆえ、出発物質または主生成物の自動測定による検出も可能になる。 Moreover, since the glycine produced as a by-product is oxidized by a direct reaction to generate hydrogen peroxide, mechanical measurement by the endpoint method can be effectively used for quantification of glycine. Thus, by constructing an automatic measurement system for glycine and automatically measuring the measured amount of glycine, it is possible to determine the quantification of the starting material or the main product based on the chemical reaction ratio. Therefore, automatic measurement detection of starting materials or main products is also possible.
前記構成の物質検出方法においては、前記過酸化水素の測定は、当該過酸化水素とアミノアンチピリンとトリンダー試薬とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、生成するキノン系色素による呈色度を測定することにより行われる構成であってもよい。 In the substance detection method having the above configuration, the hydrogen peroxide is measured by allowing the hydrogen peroxide, aminoantipyrine, and Trinder's reagent to react with the catalytic action of peroxidase, and measuring the degree of coloration of the resulting quinone dye. It may be a configuration performed by.
また、前記構成の物質検出方法においては、前記化学反応が、酵素により触媒される反応である構成であってもよい。 Further, in the substance detection method having the above configuration, the chemical reaction may be a reaction catalyzed by an enzyme.
また、前記構成の物質検出方法においては、前記酵素が、アミノアシラーゼまたはペプチターゼである構成であってもよい。 Further, in the substance detection method having the above configuration, the enzyme may be an aminoacylase or a peptidase.
また、前記構成の物質検出方法においては、前記出発物質が、馬尿酸またはメチル馬尿酸であり、前記主生成物が、安息香酸またはメチル安息香酸である構成であってもよい。 Further, in the substance detection method having the above configuration, the starting material may be hippuric acid or methylhippuric acid, and the main product may be benzoic acid or methylbenzoic acid.
本発明では、以上の構成により、グリシンオキシダーゼを用いてグリシンを酸化することにより、グリシンを副生する化学反応における出発物質または主生成物を検出することが可能な、物質検出方法を提供することができる、という効果を奏する。 The present invention provides a substance detection method capable of detecting a starting material or a main product in a chemical reaction in which glycine is by-produced by oxidizing glycine using glycine oxidase. It has the effect of being able to
本開示に係る物質検出方法は、出発物質の化学反応により生成する主生成物とともに副生したグリシンを、グリシンオキシダーゼの触媒作用により、酵素サイクリング反応を構成しないダイレクト反応により酸化して、生成する過酸化水素を測定することにより、出発物質の存在または主生成物の生成を検出する方法である。 The substance detection method according to the present disclosure oxidizes glycine, which is a by-product together with the main product produced by the chemical reaction of the starting materials, by the catalytic action of glycine oxidase in a direct reaction that does not constitute an enzymatic cycling reaction. It is a method of detecting the presence of a starting material or the production of a major product by measuring hydrogen oxide.
グリシンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１９）は、グリシンの酸化による脱アミノ化を触媒する。下記（１）に示すように、グリシンの酸化により、グリシンからアンモニアが遊離してグリオキシル酸が生成するとともに過酸化水素も生成する。そのため、過酸化水素を検出することによりグリシンの酸化を判定することができる。また、下記式（１）から明らかなように、１モルのグリシンが酸化されることにより１モルの過酸化水素が生じるので、過酸化水素の生成量を定量することにより酸化されたグリシンの量（グリオキシル酸の生成量）を定量することができる。 Glycine oxidase (EC 1.4.3.19) catalyzes the oxidative deamination of glycine. As shown in (1) below, the oxidation of glycine liberates ammonia from glycine to produce glyoxylic acid and hydrogen peroxide. Therefore, glycine oxidation can be determined by detecting hydrogen peroxide. In addition, as is clear from the following formula (1), 1 mol of hydrogen peroxide is generated by oxidizing 1 mol of glycine, so the amount of oxidized glycine can be determined by quantifying the amount of hydrogen peroxide produced. (the amount of glyoxylic acid produced) can be quantified.
グリシン＋Ｈ2Ｏ ＋Ｏ2 → グリオキシル酸＋ＮＨ3 ＋Ｈ2Ｏ2 ・・・（１）
前記式（１）のダイレクト反応に発生した過酸化水素を検出する方法（過酸化水素の測定方法）は特に限定されないが、一般的には、過酸化水素とアミノアンチピリンとトリンダー試薬とをペルオキシダーゼの触媒作用により反応させ、生成するキノン系色素による呈色度を測定する方法、いわゆるトリンダー（Trinder）反応を好適に用いることができる。
Glycine + H 2 O + O 2 → glyoxylic acid + NH 3 + H 2 O 2 (1)
The method for detecting hydrogen peroxide generated in the direct reaction of formula (1) (method for measuring hydrogen peroxide) is not particularly limited, but in general, hydrogen peroxide, aminoantipyrine, and Trinder's reagent are combined with peroxidase. A so-called Trinder reaction, which is a method of measuring the degree of coloration of a quinone dye produced by reacting with a catalytic action, can be preferably used.
トリンダー反応では、試料中の過酸化水素を酸化剤とし、トリンダー試薬を水素供与体として、４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）を酸化酵素の触媒反応により反応させる。これにより、試料中に酸化縮合によりキノン系色素が発生するので、当該試料が呈色する。そこで、呈色の程度を吸光度装置等により測定することで、試料中の過酸化水素の量、延いては、酵素反応前に存在するグリシンの量を定量することができる。 In the Trinder reaction, hydrogen peroxide in the sample is used as an oxidizing agent, 4-aminoantipyrine (4-AA) is reacted by using a Trinder reagent as a hydrogen donor, and is catalyzed by an oxidase. As a result, a quinone dye is generated in the sample by oxidative condensation, so that the sample develops color. Therefore, by measuring the degree of coloration with an absorbance device or the like, it is possible to quantify the amount of hydrogen peroxide in the sample, and thus the amount of glycine present before the enzymatic reaction.
なお、トリンダー試薬の具体的な種類は特に限定されず、公知の化合物を好適に用いることができる。具体的には、例えば、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）等のアニリン誘導体；フェノール、４－クロロフェノール、２，４－ジクロロフェノール、２，６－ジクロロフェノール、３，５－ジクロロフェノール、２，４－ジブロモフェノール、２，４，６－トリクロロフェノール、２，４，６－トリブロモフェノール、３，５－ジクロロ－２－ヒドロキシベンゼンスルホン酸、または３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨードベンゾイル酸等のフェノール誘導体；トルイジン誘導体；等を挙げることができる。本開示では、特にＴＯＯＳが好適に用いられる。 The specific type of Trinder's reagent is not particularly limited, and known compounds can be suitably used. Specifically, for example, N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline (TOOS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (ADPS), N -ethyl-N-sulfopropylaniline (ALPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methylaniline (TOPS), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline (ADOS), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline (MAOS); phenol, 4-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2 ,6-dichlorophenol, 3,5-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, 2,4,6-trichlorophenol, 2,4,6-tribromophenol, 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfone acids, or phenol derivatives such as 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoyl acid; toluidine derivatives; TOOS is particularly preferably used in the present disclosure.
グリシンを副生する化学反応とは、例えば、下記式（２）に模式的に示すように、１種以上の出発物質から１種以上の主生成物とともにグリシンが副生成物として生成する反応である。このような化学反応では、出発物質、主生成物、およびグリシンの生成量のモル比が一定になる。そこで、グリシンを定量することで、化学反応比（モル比）から、主生成物の生成量または出発物質の存在量（試料中の含有量または濃度）を容易に定量することができる。 A chemical reaction that produces glycine as a by-product is, for example, a reaction in which glycine is produced as a by-product from one or more starting materials together with one or more main products, as schematically shown in the following formula (2). be. In such a chemical reaction, the molar ratio of starting material, main product, and glycine production is constant. Therefore, by quantifying glycine, the production amount of the main product or the amount of the starting material (content or concentration in the sample) can be easily quantified from the chemical reaction ratio (molar ratio).
出発物質 → 主生成物＋グリシン（副生成物） ・・・（２）
前記式（１）に示すように、グリシンオキシダーゼの触媒作用によりグリシンからダイレクトに過酸化水素が生成するので、反応前のグリシンの量と反応後に生成した過酸化水素の量とは等モルである。それゆえ、過酸化水素を検出（定量）することにより、グリシンを検出（定量）することができ、その結果、主生成物の生成または出発物質の存在も検出（定量）することが可能になる。
Starting material → main product + glycine (by-product) (2)
As shown in the above formula (1), since hydrogen peroxide is directly produced from glycine by the catalytic action of glycine oxidase, the amount of glycine before the reaction and the amount of hydrogen peroxide produced after the reaction are equimolar. . Therefore, by detecting (quantifying) hydrogen peroxide, it is possible to detect (quantitate) glycine and, consequently, to detect (quantitate) the formation of the main product or the presence of the starting material. .
本開示に係る物質検出方法に用いられるグリシンオキシダーゼは特に限定されず、公知のものを好適に用いることができる。具体的には、例えば、Bacillus cereus由来、Bacillus subtilis由来、Geobacillus kaustophilus由来のもの等を挙げることができる。 Glycine oxidase used in the substance detection method according to the present disclosure is not particularly limited, and known ones can be suitably used. Specific examples include those derived from Bacillus cereus, Bacillus subtilis, and Geobacillus kaustophilus.
グリシンを副生する化学反応としては特に限定されないが、例えば、酵素により触媒される反応が挙げられる。出発物質からグリシンが副生されるということは、１種以上の出発物質にグリシン構造が含まれていることになる。このような出発物質は、生体中に存在して酵素による触媒作用で代謝されるものであったり、生体由来ではなく化学合成された物質であっても、酵素反応によりグリシンを脱離することが可能な物質であったりすると考えられる。 A chemical reaction that produces glycine as a by-product is not particularly limited, but includes, for example, a reaction catalyzed by an enzyme. By-production of glycine from a starting material means that at least one kind of starting material contains a glycine structure. Such starting materials exist in living organisms and are metabolized by the catalytic action of enzymes, and even if they are chemically synthesized substances that are not derived from living organisms, glycine can be eliminated by enzymatic reactions. It is thought that it may be a possible substance.
より具体的な化学反応の一例としては、例えば、図１または図２に示す、馬尿酸またはメチル馬尿酸のアミノアシラーゼによる加水分解反応が挙げられる。馬尿酸はトルエンの代謝産物として知られ、メチル馬尿酸はキシレンの代謝産物として知られる。つまり、本開示の代表的な具体例としては、出発物質が、馬尿酸またはメチル馬尿酸であり、主生成物が、安息香酸またはメチル安息香酸である化学反応を挙げることができる。 A more specific example of the chemical reaction is the hydrolysis reaction of hippuric acid or methylhippuric acid by aminoacylase shown in FIG. 1 or FIG. Hippuric acid is known as a metabolite of toluene, and methylhippuric acid is known as a metabolite of xylene. That is, a representative example of the present disclosure is a chemical reaction in which the starting material is hippuric acid or methylhippuric acid and the main product is benzoic acid or methylbenzoic acid.
馬尿酸は、ＩＵＰＡＣ名としては、ベンゾイルアミノ酢酸（Benzoylaminoacetic acid）が挙げられ、別名としてＮ－ベンゾイルグリシン（N-benzoylglycine）等も知られている。メチル馬尿酸は、馬尿酸のベンゼン環構造のオルト位、メタ位またはパラ位がメチル基で修飾された構造を有する。ＩＵＰＡＣ名では、オルト位を例に挙げると、（２－メチルベンゾイルアミノ）酢酸（(2-methylbenzoylamino)acetic acid）が挙げられ、別名としては、Ｎ－（ｏ－トルオイル）グリシン（N-(o-Toluoyl)glycine）等も知られている。 Hippuric acid has an IUPAC name of benzoylaminoacetic acid, and is also known as N-benzoylglycine as another name. Methylhippuric acid has a structure in which the ortho-, meta- or para-position of the benzene ring structure of hippuric acid is modified with a methyl group. An IUPAC name for the ortho position is (2-methylbenzoylamino)acetic acid, also known as N-(o-toluoyl)glycine (N-(o -Toluoyl)glycine) and the like are also known.
アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１４）は、馬尿酸またはメチル馬尿酸を、安息香酸またはメチル安息香酸とグリシンとに分解する反応を触媒する。なお、この反応を触媒する酵素（アミノアシラーゼの類縁酵素）としては、馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）またはＮ－アシル－Ｄ－アミノ酸デアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．８１）等も知られている。アミノアシラーゼまたはその類縁酵素の具体的な種類は特に限定されず、市販されている種々の酵素試薬を好適に用いることができる。また、種々の生体由来のもので、生体組織等から精製可能なものを用いることができる。アミノアシラーゼまたはその類縁酵素を用いた場合の反応条件等についても特に限定されない。 Aminoacylase (EC 3.5.1.14) catalyzes the decomposition of hippuric acid or methylhippuric acid into benzoic acid or methylbenzoic acid and glycine. Examples of enzymes (analogous enzymes of aminoacylase) that catalyze this reaction include hippuric acid hydrolase (EC 3.5.1.32) and N-acyl-D-amino acid deacylase (EC 3.5.1.81). Are known. The specific type of aminoacylase or its analogous enzyme is not particularly limited, and various commercially available enzymatic reagents can be suitably used. In addition, those derived from various living organisms and which can be purified from living tissue or the like can be used. There are no particular restrictions on the reaction conditions and the like when aminoacylase or an analogous enzyme thereof is used.
前記の通り、馬尿酸はトルエンの代謝産物であり、メチル馬尿酸はキシレンの代謝産物である。トルエンまたはキシレンは、これら有機溶媒を取り扱う作業者が吸入すると、大部分が体内で安息香酸またはメチル安息香酸に代謝され、その後にグリシン抱合を受けて、馬尿酸またはメチル馬尿酸となり、尿中に排泄される。それゆえ、馬尿酸またはメチル馬尿酸（以下、適宜「馬尿酸等」と略す。）は、トルエンまたはキシレンの曝露指標として用いられる。したがって、本開示において、グリシンを副生する化学反応の試料としては、馬尿酸等を含む（可能性がある）尿等の生体試料が挙げられる。 As mentioned above, hippuric acid is a metabolite of toluene and methylhippuric acid is a metabolite of xylene. When toluene or xylene is inhaled by workers who handle these organic solvents, most of it is metabolized to benzoic acid or methylbenzoic acid in the body, then undergoes glycine conjugation to hippuric acid or methylhippuric acid, and is released into the urine. Excreted. Therefore, hippuric acid or methylhippuric acid (hereinafter abbreviated as “hippuric acid, etc.” as appropriate) is used as an exposure index for toluene or xylene. Therefore, in the present disclosure, a sample of a chemical reaction that produces glycine as a by-product includes a biological sample such as urine that (possibly) contains hippuric acid or the like.
化学反応の試料としては、尿に限定されず、血液、唾液、骨髄液、細胞間質液等であってもよい。また、試料の由来は、有機溶剤を取り扱う作業者すなわちヒトが挙げられる。それゆえ、本開示に係る物質検出方法は、有機溶媒を取り扱うヒトにおいて、トルエンまたはキシレンの曝露を評価する健康診断等に好適に用いることができる。なお、試料の由来はヒトに限定されず、他の動物（イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ラット、マウス等の哺乳類、もしくは哺乳類以外の脊椎動物等）であってもよい。 The chemical reaction sample is not limited to urine, and may be blood, saliva, bone marrow fluid, interstitial fluid, or the like. Moreover, the origin of the sample includes workers who handle organic solvents, that is, humans. Therefore, the substance detection method according to the present disclosure can be suitably used for health examinations and the like for evaluating exposure to toluene or xylene in humans who handle organic solvents. The origin of the sample is not limited to humans, and may be other animals (mammals such as dogs, cats, pigs, cows, rats, and mice, or vertebrates other than mammals).
ここで、馬尿酸等の従来の測定方法としては、図２の上段に示すように、まず、馬尿酸等を含む（可能性のある）試料を一定量採取し、アミノアシラーゼを添加混合して馬尿酸等を加水分解する。これにより、安息香酸またはメチル安息香酸（安息香酸等）とグリシンとが生成する。さらに、図２の中段に示すように、当該試料に対して、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン、グリシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼおよびサルコシンオキシダーゼを添加混合すると、酵素サイクリング反応が生じる。このサイクリング反応では、グリシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼの触媒作用により、グリシンおよびＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンからサルコシンが生成し、サルコシンオキシダーゼの触媒作用により、サルコシンからグリシンおよび過酸化水素が生成する。 Here, as a conventional method for measuring hippuric acid or the like, as shown in the upper part of FIG. Hydrolyzes hippuric acid, etc. This produces benzoic acid or methylbenzoic acid (such as benzoic acid) and glycine. Furthermore, as shown in the middle part of FIG. 2, when S-adenosyl-L-methionine, glycine-N-methyltransferase and sarcosine oxidase are added and mixed to the sample, an enzymatic cycling reaction occurs. In this cycling reaction, glycine-N-methyltransferase catalyzes the production of sarcosine from glycine and S-adenosyl-L-methionine, and sarcosine oxidase catalyzes the production of glycine and hydrogen peroxide from sarcosine.
そこで、図２の下段に示すように、サルコシンから生成した過酸化水素に対して、４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、トリンダー試薬（例えば、ＴＯＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン）、およびペルオキシダーゼを添加混合する。これにより、キノン系色素が生じるので、例えば、５００～５５０ｎｍの吸光度でキノン系色素の呈色度を測定すれば、過酸化水素の生成量を定量できる。過酸化水素が定量できれば、グリシンを定量することができる。このようにグリシンを定量することで、馬尿酸等を定量することができる。なお、馬尿酸とメチル馬尿酸とを区別して測定する手法については、公知の手法を適宜用いることができ、特に限定されない。 Therefore, as shown in the lower part of FIG. 2, 4-aminoantipyrine (4-AA), a Trinder reagent (eg, TOOS (N-ethyl-N-(2-hydroxy- 3-Sulfopropyl)-3-methoxyaniline), and peroxidase are added and mixed.This produces a quinone dye, so for example, if the color development of the quinone dye is measured at an absorbance of 500 to 550 nm, excess The amount of hydrogen oxide produced can be quantified.If hydrogen peroxide can be quantified, then glycine can be quantified.By quantifying glycine in this way, it is possible to quantify hippuric acid, etc.Hippuric acid and methyl A known method can be used as appropriate for the method of distinguishing from hippuric acid and is not particularly limited.
ただし、図２に示す従来の方法では、グリシン－サルコシンのサイクリング反応により、グリシンが増幅測定されるので、レート法によりグリシンを定量する必要がある。 However, in the conventional method shown in FIG. 2, since glycine is amplified and measured by the cycling reaction of glycine-sarcosine, it is necessary to quantify glycine by the rate method.
酵素反応を利用して物質を検出（測定）する方法としては、分析手法の違いから、レート法とエンドポイント法との２種類に分類することができる。 Methods for detecting (measuring) a substance using an enzymatic reaction can be classified into two types, a rate method and an end-point method, depending on the difference in analytical techniques.
レート法は、酵素の触媒作用により基質を化学反応させたときに、反応進行中の速度（レート）を測定することにより、物質を定量的に検出する方法である。この方法では、例えば、酵素により触媒される反応が進行している間の速度を、吸光度または濁度等の変化として測定する。 The rate method is a method for quantitatively detecting a substance by measuring the rate during the progress of a chemical reaction of a substrate by the catalytic action of an enzyme. In this method, for example, the rate during which an enzyme-catalyzed reaction proceeds is measured as a change in absorbance or turbidity, or the like.
エンドポイント法は、酵素の触媒作用により基質を化学反応させ、基質を十分に反応させた後（エンドポイントに達した後）に、反応前後の総変化量を測定することにより、物質を定量的に検出する方法である。この方法では、例えば、基質である出発物質の減少もしくは出発物質から生成物の増加が実質的に停止するまで反応を進行させ、吸光度または濁度等により生成物の生成量を測定する。エンドポイント法では、化学反応による生成物の生成が飽和に漸近するため、レート法に比べて機械測定による自動化に適用させやすいという利点がある。 In the endpoint method, the substrate is chemically reacted by the catalytic action of the enzyme, and after the substrate has sufficiently reacted (after the endpoint is reached), the total amount of change before and after the reaction is measured to determine the substance quantitatively. It is a method to detect In this method, for example, the reaction is allowed to proceed until the starting material, which is a substrate, decreases or the increase in the product from the starting material substantially stops, and the amount of product produced is measured by absorbance, turbidity, or the like. The end-point method has the advantage of being easier to apply to automation by machine measurement than the rate method, because the production of products by chemical reaction approaches saturation asymptotically.
本開示に係る方法では、図１の中段に示すように、グリシンオキシダーゼを用いてグリシンを酸化することにより、グリオキシル酸およびアンモニアとともに、過酸化水素をダイレクトに生成させる。 In the method according to the present disclosure, as shown in the middle of FIG. 1, glycine is oxidized using glycine oxidase to directly produce glyoxylic acid and ammonia as well as hydrogen peroxide.
本開示では、馬尿酸等を含む（可能性のある）試料においてアミノアシラーゼにより安息香酸等とグリシンとを生成させる点、並びに、生成した過酸化水素を酸化剤としてペルオキシダーゼによりキノン系色素を生成させる点は、従来と同様である。しかしながら、図１の上段、中段および下段の各化学反応式からも明らかなように、馬尿酸等から等モルのグリシンが副生し、グリシンから等モルの過酸化水素が生成し、過酸化水素を酸化剤として、過酸化水素に等モルのキノン系色素を生成することになる。 In the present disclosure, in a sample containing (possible) hippuric acid etc., benzoic acid etc. and glycine are produced by aminoacylase, and a quinone dye is produced by peroxidase using the produced hydrogen peroxide as an oxidizing agent. The point is the same as the conventional one. However, as is clear from the chemical reaction formulas in the upper, middle, and lower stages of FIG. is used as an oxidizing agent, a quinone dye is produced in an equimolar amount to hydrogen peroxide.
これにより、馬尿酸等から等モルのキノン系色素を生成させることになるので、レート法ではなくエンドポイント法を好適に用いることが可能になる。前記のように、エンドポイント法は、機械測定に適用させやすいため、本開示に係る物質検出方法を用いることで、馬尿酸等の検出（定量）を自動測定することが可能となる。 As a result, an equimolar amount of quinone dye is produced from hippuric acid or the like, so that the endpoint method can be suitably used instead of the rate method. As described above, the endpoint method can be easily applied to mechanical measurement, so that the detection (quantification) of hippuric acid and the like can be automatically measured by using the substance detection method according to the present disclosure.
なお、過酸化水素からキノン系色素を生成させる際に用いられるペルオキシダーゼの具体的な種類は特に限定されず、公知のものを好適に用いることができる。また、生成するキノン系色素は、トリンダー試薬となる化合物の種類によりその構造が異なるので、特に限定されない。 The specific type of peroxidase used for generating a quinone-based dye from hydrogen peroxide is not particularly limited, and known peroxidases can be suitably used. Moreover, the quinone dye to be produced is not particularly limited, since its structure varies depending on the type of compound that becomes the Trinder reagent.
ここで、本開示に係る物質検出方法が適用可能な化学反応、出発物質、主生成物については、前述した馬尿酸等を安息香酸等およびグリシンに加水分解する反応に限定されない。例えば、出発物質がタンパク質またはペプチドであり、酵素としてペプチターゼを用いて加水分解して、主生成物として新たなペプチドを生成する際にグリシンが副生するような化学反応であってもよい。 Here, the chemical reaction, starting material, and main product to which the substance detection method according to the present disclosure can be applied are not limited to the above-described reaction of hydrolyzing hippuric acid or the like into benzoic acid or the like and glycine. For example, it may be a chemical reaction in which the starting material is a protein or peptide, hydrolyzed using a peptidase as an enzyme, and glycine is produced as a by-product when a new peptide is produced as the main product.
他にも、例えば、Ｌ－スレオニンアルドラーゼは、Ｌ－スレオニンからグリシンとアセトアルデヒドとを生成する反応を触媒するので、本開示に係る物質検出方法は、このような化学反応にも適用できる。なお、この化学反応では、出発物質がＬ－スレオニンであるが、グリシンを副生成物と見なした場合に、アセトアルデヒドが主生成物に相当する。ただし、化学反応における「主生成物」と「副生成物」との関係は相対的なものであり、グリシン以外の物質が生成する場合であれば、グリシンを便宜上「副生成物」と見なし、他の生成物を「主生成物」と見なすことができる。 In addition, for example, L-threonine aldolase catalyzes a reaction that produces glycine and acetaldehyde from L-threonine, so the substance detection method according to the present disclosure can also be applied to such chemical reactions. In this chemical reaction, the starting material is L-threonine, but acetaldehyde corresponds to the main product when glycine is regarded as a by-product. However, the relationship between the "main product" and "by-product" in a chemical reaction is relative, and if a substance other than glycine is produced, glycine is regarded as a "by-product" for convenience, Other products can be considered "main products".
このように、本開示によれば、副生成物であるグリシンを、グリシンオキシダーゼによりダイレクトに酸化して過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を測定する。これにより、複数の酵素を利用したサイクリング反応系を構築することなく、酵素としてグリシンオキシダーゼのみを用いた簡素なダイレクト反応系によりグリシンから過酸化水素を生成させることができる。そのため、過酸化水素の測定からグリシンを有効に定量できるとともに、グリシンを副生する化学反応において、グリシンを定量化すれば出発物質または主生成物を定量的に検出することが可能となる。 Thus, according to the present disclosure, the by-product glycine is directly oxidized by glycine oxidase to produce hydrogen peroxide, which is measured. Thereby, hydrogen peroxide can be produced from glycine by a simple direct reaction system using only glycine oxidase as an enzyme without constructing a cycling reaction system using a plurality of enzymes. Therefore, it is possible to effectively quantify glycine from the measurement of hydrogen peroxide, and to quantitatively detect the starting material or the main product by quantifying glycine in a chemical reaction that produces glycine as a by-product.
しかも、副生したグリシンをダイレクト反応により酸化して過酸化水素を生成させるため、グリシンの定量化にはエンドポイント法による機械測定を有効に利用することができる。これにより、グリシンの自動測定システムを構築し、グリシンの測定量を自動的に測定することで、化学反応比に基づいて出発物質または主生成物の定量を決定することができる。それゆえ、出発物質または主生成物の自動測定による検出も可能になる。 Moreover, since the glycine produced as a by-product is oxidized by a direct reaction to generate hydrogen peroxide, mechanical measurement by the endpoint method can be effectively used for quantification of glycine. Thus, by constructing an automatic measurement system for glycine and automatically measuring the measured amount of glycine, it is possible to determine the quantification of the starting material or the main product based on the chemical reaction ratio. Therefore, automatic measurement detection of starting materials or main products is also possible.
本発明について、実施例および比較例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。 The present invention will be described in more detail based on Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited to these. Various changes, modifications and alterations can be made by those skilled in the art without departing from the scope of the invention.
（実施例）
１ユニット／ｍＬのグリシンオキシダーゼ、０．０２質量％の４－アミノアンチピリン、および５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）を含有する第一試薬と、５ユニット／ｍＬの馬尿酸加水分解酵素、１０ユニット／ｍＬのペルオキシダーゼ、０．０６質量％のＮ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、および５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）を含有する第二試薬とを準備した。
(Example)
a first reagent containing 1 unit/mL glycine oxidase, 0.02% by weight 4-aminoantipyrine, and 50 mM phosphate buffer (pH 9.0); and 5 units/mL hippuric acid hydrolase; 10 units/mL peroxidase, 0.06 wt% N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline (TOOS), and 50 mM phosphate buffer (pH 9.0) and a second reagent containing
また、測定用試料（検体）として、馬尿酸の含有量が０ｍＭ（すなわち馬尿酸を含有しないネガティブコントロール）、１ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭの４種類を準備した。 In addition, four types of samples (specimens) for measurement were prepared, each having a hippuric acid content of 0 mM (that is, a negative control containing no hippuric acid), 1 mM, 5 mM and 10 mM.
これら４種類の測定用試料それぞれに対して、第一試薬５４０μＬを混合して３７℃で５分間インキュベーションした後に、さらに第二試薬１８０μＬを添加して混合して３７℃で１５分間（９００秒）反応させた。この１５分の反応期間中、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果を図３に示す。 For each of these four types of measurement samples, 540 μL of the first reagent was mixed and incubated at 37° C. for 5 minutes, and then 180 μL of the second reagent was added and mixed and mixed at 37° C. for 15 minutes (900 seconds). reacted. Absorbance was measured at a wavelength of 550 nm during this 15 minute reaction period. The results are shown in FIG.
（比較例）
第一試薬として、８ユニット／ｍＬのペルオキシダーゼ、５ユニット／ｍＬの馬尿酸加水分解酵素、０．０２質量％のＴＯＯＳ、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含有するものを用いるとともに、第二試薬として、４ｍＭのＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン、４０ユニット／ｍＬのサルコシンオキシダーゼ、０．０６質量％の４－アミノアンチピリン、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含有するものを用い、さらに、４種類の測定用試料（検体）の量を６μＬとした以外は、実施例と同様にして、３７℃で３３分間反応させた。この３３分の反応期間中、５５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果を図４に示す。
(Comparative example)
As the first reagent, 8 units/mL of peroxidase, 5 units/mL of hippuric acid hydrolase, 0.02% by mass of TOOS, and 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) are used, A second reagent containing 4 mM S-adenosyl-L-methionine, 40 units/mL sarcosine oxidase, 0.06 mass% 4-aminoantipyrine, and 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). Furthermore, the reaction was carried out at 37° C. for 33 minutes in the same manner as in Example except that the amount of the four types of measurement samples (specimens) was changed to 6 μL. Absorbance was measured at a wavelength of 550 nm during this 33 minute reaction period. The results are shown in FIG.
（実施例および比較例の対比）
実施例は、図１に示す馬尿酸の検出方法すなわち本開示に係る物質検出方法の一例であり、比較例は、図２に示す馬尿酸の検出方法すなわち従来の検出方法の一例である。図３および図４のいずれも、図中菱型のマーカーで示すネガティブコントロール（０ｍＭ）では、５５０ｎｍの吸光度はほぼ０で変化が見られなかった。
(Comparison of Examples and Comparative Examples)
The example is an example of the hippuric acid detection method shown in FIG. 1, that is, the substance detection method according to the present disclosure, and the comparative example is an example of the hippuric acid detection method shown in FIG. 2, that is, an example of a conventional detection method. In both FIGS. 3 and 4, the absorbance at 550 nm was almost 0 in the negative control (0 mM) indicated by the diamond-shaped marker in the figure, showing no change.
図３に示すように、本開示に係る検出方法では、図中正方形のマーカーで示す１ｍＭ、図中三角形のマーカーで示す５ｍＭ、図中Ｘのマーカーで示す１０ｍＭの結果のいずれも、副生したグリシンの生成量の増加はそれぞれ飽和値に漸近した。また、いずれの結果も、グリシンの生成量は、３００秒経過する前から増加し始め、６００秒（１０分）経過すれば飽和値に達していた。 As shown in FIG. 3, in the detection method according to the present disclosure, all of the results of 1 mM indicated by the square marker in the figure, 5 mM indicated by the triangular marker in the figure, and 10 mM indicated by the X marker in the figure were by-products. The increase in glycine production approached the saturation value respectively. Moreover, in both results, the amount of glycine produced began to increase before 300 seconds passed, and reached a saturation value after 600 seconds (10 minutes) passed.
これに対して、図４に示すように、従来の検出方法では、図中正方形のマーカーで示す１ｍＭ、図中三角形のマーカーで示す５ｍＭ、図中Ｘのマーカーで示す１０ｍＭの結果のいずれも、副生したグリシンの生成量は、反応時間の進行に伴い比例的に増加した。また、いずれの結果も、グリシンの生成量は１７分頃から増加し始めた。 On the other hand, as shown in FIG. 4, in the conventional detection method, all of the results of 1 mM indicated by the square marker in the figure, 5 mM indicated by the triangular marker in the figure, and 10 mM indicated by the X marker in the figure The amount of glycine produced as a by-product increased proportionally as the reaction time progressed. Moreover, in both results, the amount of glycine produced began to increase from about 17 minutes.
このように、本開示に係る検出方法であれば、副生したグリシンをダイレクト反応により酸化して過酸化水素を生成させるため、エンドポイント法による機械測定を有効に利用することが可能であることがわかる。それゆえ、グリシンの自動測定システムを構築し、グリシンの測定量を自動的に測定することで、出発物質または主生成物の自動測定による検出が可能になると判断される。 As described above, the detection method according to the present disclosure oxidizes the by-produced glycine through a direct reaction to generate hydrogen peroxide, so that mechanical measurement by the endpoint method can be effectively used. I understand. Therefore, by constructing an automatic measurement system for glycine and automatically measuring the measured amount of glycine, it is judged that the detection of the starting material or the main product by automatic measurement becomes possible.
なお、本発明は前記実施の形態の記載に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態や複数の変形例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 It should be noted that the present invention is not limited to the description of the above embodiments, and various modifications are possible within the scope of the claims, and different embodiments and multiple modifications are disclosed respectively. Embodiments obtained by appropriately combining the above technical means are also included in the technical scope of the present invention.
本発明は、グリシンオキシダーゼを用いて、副生したグリシンを検出することにより、出発物質の存在または主生成物の生成を検出する物質検出方法の分野に好適に用いることができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be suitably used in the field of substance detection methods for detecting the presence of a starting material or the production of a main product by detecting by-produced glycine using glycine oxidase.
Claims (2)
１種類以上の前記出発物質は、グリシン構造が含まれる馬尿酸またはメチル馬尿酸であるとともに、前記副生成物がグリシンであり、
前記主生成物が、安息香酸またはメチル安息香酸であり、
前記酵素が、アミノアシラーゼまたはペプチダーゼであり、
副生した前記グリシンを、グリシンオキシダーゼの触媒作用により、酵素サイクリング反応を構成しないダイレクト反応により酸化して、生成する過酸化水素を測定することにより、前記出発物質の存在または前記主生成物の生成を検出することを特徴とする、
物質検出方法。 the starting material to be detected, catalyzed by an enzymeChemical reactionreact byA method for quantitatively detecting a substance by measuring a by-product produced together with a main product by allowing
one or more of said starting materialsteeth,Contains glycine structuresis hippuric acid or methyl hippuric acidand the by-product is glycine,
the main product is benzoic acid or methylbenzoic acid,
the enzyme is an aminoacylase or a peptidase,
The presence of the starting material or the production of the main product is determined by oxidizing the by-produced glycine through a direct reaction that does not constitute an enzymatic cycling reaction by the catalytic action of glycine oxidase and measuring the hydrogen peroxide produced. characterized by detecting
Substance detection method.
請求項１に記載の物質検出方法。 The measurement of the hydrogen peroxide is carried out by reacting the hydrogen peroxide, aminoantipyrine and Trinder's reagent with the catalytic action of peroxidase and measuring the degree of coloration by the resulting quinone dye.
The substance detection method according to claim 1 .
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