JP5833449B2 - グルコシノレート混入が減少した天然物を生成するための植物細胞培養 - Google Patents
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Description
本出願は、いずれも本明細書に全体を参考として組み込んだ2008年12月18日出願の米国仮出願第61/138,884号および2009年4月3日出願の米国仮出願第61/166,438号の特典を請求する。
アブラナ属から天然物(例えば、アントシアニン)を生成するための生細胞培養系には、安定した生理活性分子の選択的生成を促進し、不確実な、変動しやすい、または季節性の供給の問題を回避することを含むいくつかの有望な利点がある。これには、原料植物からの組織培養系の開発および微生物発酵系に類似した大規模な植物懸濁培養物の増殖が関与する。培養による植物細胞の増殖によって、細胞増殖および/または所望する天然物の生成を増強するために栄養素を操作することができる高度に制御された環境を供給する。細胞培養物はまた、所望する化合物の生成を増加させるか、または所望しない化合物の生成を減少させる化学的または物理的誘発などの処理に適している。
本明細書では、グルコシノレート混入の減少した天然物調製物(例えば、アブラナ科天然物、例えば、アブラナ属天然物)およびこのような天然物を含む組成物を得るための方法を開示する。一実施形態では、グルコシノレート混入の減少した天然物を生成するための方法は、植物から植物カルス(例えば、アブラナ科植物カルス、例えばアブラナ属植物カルス)(例えば、子葉、根、胚軸、茎頂、茎、葉または表皮剥片(epidermal peel)から得られたカルス)を培養するステップと、グルコシノレート生成の減少した植物カルスを選択するステップと、選択したカルスを懸濁培地中で培養してグルコシノレート混入の減少した天然物を生成することができる懸濁細胞培養物を得るステップとを含むことができる。いくつかの特定の例では、グルコシノレート生成の減少した植物カルスは、誘導培地中でインビトロ培養して植物カルスの形成を誘導することによって生成される。この方法はまた、培養物からグルコシノレート混入の減少した天然物を回収するステップを含むことができる。
A.略語
2,4−D:2,4−ジクロロフェノキシ酢酸
BA:6−ベンジルアミノプリン
ES:エレクトロスプレー
FCW:新鮮細胞重量
LC−MS:液体クロマトグラフィー−質量分析
MS:ムラシゲおよびスクーグビタミンまたは塩
NAA:α−ナフタレン酢酸
NN:ニッチ&ニッチビタミン
PCV:パック細胞容積
PDA:光ダイオードアレイ
RI:屈折率
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、以下に特定の用語の説明を挙げる。
IV.グルコシノレートの減少した天然物の生成方法
グルコシノレート混入の減少した天然物、例えばアブラナ科天然物(例えば、アブラナ属天然物、例えば、アントシアニン)の生成方法を本明細書で開示する。一実施形態では、これらの方法は、アブラナ科植物カルスなどの植物カルス(例えば、アブラナ属植物カルス、例えばブラッシカ オレラセア(Brassica oleraceae)植物カルス)を培養するステップと、グルコシノレート生成の減少した植物カルスを選択するステップと、選択したカルスを懸濁培地中で培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、細胞培養物からグルコシノレート混入の減少した天然物を回収するステップとを含む。特定の例では、グルコシノレート混入の少ない天然物はアントシアニン(例えば、赤キャベツアントシアニン)である。
V.グルコシノレートの減少したキャベツアントシアニンの生成方法
本明細書では、グルコシノレート混入の減少したキャベツアントシアニンの生成方法を開示する。一例では、グルコシノレート混入の減少したキャベツアントシアニンは、第1の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、第2の懸濁培地中において懸濁細胞培養物を増殖させるステップと、細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップによって生成する。いくつかの例では、第2の懸濁培地は窒素源が欠如している(例えば、添加した窒素源、例えば、外来性アンモニア、または硝酸の形態で添加された窒素を有さない)。他の例では、第2の懸濁培地は、糖を約3〜10%(例えば、スクロースを約3〜10%、例えば、スクロースを約3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%)含む。
グルコシノレート低生成赤キャベツ細胞株の選択
この実施例は、低量のグルコシノレートを生成するか、またはグルコシノレートを生成しない赤キャベツ細胞株の選択について説明する。
キャベツ細胞の懸濁培養およびアントシアニンの生成の至適化
この実施例は、アントシアニン生成の至適化におけるキャベツ細胞懸濁培養物増殖のための培地の選択について説明する。
スクロースを使用したキャベツ懸濁細胞におけるアントシアニン生成の至適化
この実施例は、アントシアニン生成に対するスクロース初期濃度およびスクロース補充添加の効果について説明する。
生成培地開発におけるリン酸の効果
この実施例は、アントシアニン生成に対するリン酸除去の効果を記載する。
Claims (24)
- グルコシノレート混入の減少したアントシアニンを含むアブラナ属天然物調製物を生成
する方法であって、
アブラナ属植物カルスを培養するステップと、
前記培養されたアブラナ属植物カルスから複数のカルスを増殖するステップと、
対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを生成し、および懸濁細胞培養物中の1リットルのパック細胞あたり少なくとも81.9mgのアントシアニンを生成することができるアブラナ属植物カルスを選択するステップと、
前記対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを生成し、および懸濁細胞培養物中の1リットルのパック細胞あたり少なくとも81.9mgのアントシアニンを生成することができる前記選択した前記カルスを、懸濁培地で培養して、懸濁細胞培養物を得るステップと、および、
前記対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを生成し、および1リットルのパック細胞あたり少なくとも81.9mgのアントシアニンを含んでいるアブラナ属植物カルスの前記懸濁細胞培養物からアブラナ属天然物をアントシアニンと共に回収するステップであって、それによってグルコシノレート混入の減少したアントシアニンを含む前記アブラナ属天然物調製物を生成する、ステップと、
を含み、
前記対照は、減少したグルコシノレートの生成において選択されていないアブラナ属植物またはアブラナ属植物カルスである、
ことを特徴とする方法。 - 前記培養されたアブラナ属植物カルスから複数のカルスを増殖するステップは、前記対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを生成し、および懸濁細胞培養物中の1リットルのパック細胞あたり少なくとも81.9mgのアントシアニンを生成することができる植物カルスの形成を誘導培地中におけるインビトロ培養によって誘導することを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記誘導培地は、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、アルファ−ナフタレン酢酸および6−ベンジルアミノプリンを含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記誘導培地は、0〜1mg/Lの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、0〜2mg/Lのアルファ−ナフタレン酢酸および0〜0.1mg/Lの6−ベンジルアミノプリンを含むことを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記懸濁培地は2,4−ジクロロフェノキシ酢酸を含むことを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記懸濁培地は0〜1.5mg/Lの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸を含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記懸濁培地はスクロース3%から6%(重量/体積)をさらに含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記懸濁培地は窒素源を欠如し、添加したリン酸を含まないことを特徴とする請求項5から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グルコシノレート混入の減少したアントシアニンを含むアブラナ属天然物調製物が、100mg/L未満のグルコシノレートの混入を含むことを特徴とする請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを生成し、懸濁細胞培養物中の1リットルのパック細胞あたり少なくとも81.9mgのアントシアニンを生成することができる前記アブラナ属植物カルスは、新鮮細胞重量1グラム当たり全グルコシノレート0.06μgから76.54μgを含むことを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記培養されたアブラナ属植物カルスは、アカキャベツ植物カルスであることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アカキャベツ植物カルスは、ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロまたはカイロ培養品種から得られることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- グルコシノレート混入の減少したアントシアニンを含む前記アブラナ属天然物調製物であることを特徴とする請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カルスは、子葉、根、胚軸、茎頂、茎、葉または表皮剥片から得られることを特徴とする請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- キャベツアントシアニン調製物におけるグルコシノレート混入が100mg/L未満のキャベツアントシアニン調製物の生成方法であって、
第1の懸濁培地中において、対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを有するアカキャベツ植物カルスを培養し、新鮮細胞重量1グラム当たり76.54μg未満の全グルコシノレートを含む懸濁細胞培養物を得るステップと、
窒素源の欠如した第2の懸濁培地中において、前記懸濁細胞培養物を増殖させ、新鮮細胞重量1グラム当たり76.54μg未満の全グルコシノレートおよび懸濁細胞培養物中のパック細胞の1リットル当たり少なくとも81.9mgのアントシアニンを含む懸濁細胞培養物を得るステップと、
新鮮細胞重量1グラム当たり76.54μg未満の全グルコシノレートおよび懸濁細胞培養物中のパック細胞の1リットル当たり少なくとも81.9mgのアントシアニンを含む前記懸濁細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップであって、
それによって、キャベツアントシアニン調製物中のグルコシノレートの混入が100mg/L未満のキャベツアントシアニン調製物を生成する、ステップと、
を含み、
前記対照は、減少したグルコシノレートの生成において選択されていないアカキャベツ植物またはアカキャベツ植物カルスである、
ことを特徴とする方法。 - 前記対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを生成する前記アカキャベツ植物のカルスの培養は、誘導培地中におけるインビトロ培養によって、前記対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを有する前記アカキャベツ植物のカルスの形成を誘導することを含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記誘導培地は、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、アルファ−ナフタレン酢酸および6−ベンジルアミノプリンを含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 前記誘導培地は、0〜1mg/Lまでの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、0〜2mg/Lのアルファ−ナフタレン酢酸および0〜0.1mg/Lの6−ベンジルアミノプリンを含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 前記第2の懸濁培地は、スクロース3%から8%(重量/体積)を含むことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記第2の懸濁培地は、添加したリン酸を含有しないことを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを有する前記アカキャベツ植物カルスは、前記対照とは異なる対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを有するBrassica oleracea ver.capitata f. rubra植物カルスを含み、
前記対照とは異なる対照は、減少したグルコシノレートの生成において選択されていないBrassica oleracea ver.capitata f. rubra植物またはBrassica oleracea ver.capitata f. rubra植物カルスであることを特徴とする請求項15から20のいずれか一項に記載の方法。 - 前記Brassica oleracea ver.capitata f. rubra植物カルスは、ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロまたはカイロを含むことを特徴とする請求項21に記載の方法。
- キャベツアントシアニン調製物におけるグルコシノレート混入が100mg/L未満のキャベツアントシアニン調製物の生成方法であって、
第1の懸濁培地中において対照と比べて少なくとも10%減少したグルコシノレートを有するアカキャベツ植物カルスを培養し、新鮮細胞重量1グラム当たり76.54μg未満の全グルコシノレートおよびパック細胞の1リットル当たり少なくとも81.9mgのアントシアニンを含む懸濁細胞培養物を得るステップと、
初期スクロース濃度がスクロース3〜8%(w/v)である第2の懸濁培地中において、新鮮細胞重量1グラム当たり76.54μg未満の全グルコシノレートおよびパック細胞の1リットル当たり少なくとも81.9mgのアントシアニンを含む前記懸濁細胞培養物を増殖させるステップと、
前記懸濁細胞培養物から新鮮細胞重量1グラム当たり76.54μg未満の全グルコシノレートおよびパック細胞の1リットル当たり少なくとも81.9mgのアントシアニンを含むキャベツアントシアニンを回収するステップであって、
それによって、キャベツアントシアニン調製物中のグルコシノレートの混入が100mg/L未満のキャベツアントシアニン調製物を生成する、ステップと、
を含み、
前記対照は、減少したグルコシノレートの生成において選択されていないアカキャベツ植物またはアカキャベツ植物カルスである、
ことを特徴とする方法。 - 前記第2の懸濁培地は、3〜6%(w/v)のスクロースの初期スクロース濃度を有することを特徴とする請求項23に記載の方法。
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