JP5832801B2 - う食原性細菌による酸の産生を検出するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、唾液サンプルおよび/またはプラークサンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法に関し、ここで、プラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物を、炭素源と接触させる。この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される。次に、この微生物を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする。次に、この酸の形成を、上記炭素源の添加後、12時間の期間内で少なくとも一回pHを決定することによって検出し、ここで、上記サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定は、上記pHと少なくとも1つの参照値とを比較することによって実行される。さらに、本発明は、このような方法を実行するためのキットを提供する。
ヒトの口腔には、通常、互いに天然の平衡状態にある800種超の異なる微生物が集落形成している。しかしながら、実質的に細菌からなるこの微生物叢はまた、歯の健康に損傷を与え得る生物を含む。これは、特に、食事由来の炭水化物を有機酸に代謝することができる細菌に関する。この酸(特に、乳酸)は歯のエナメル質を攻撃し、このことは、まず歯の表面の鉱物質消失をもたらす。鉱物質消失した部位の連続的な集落形成のために、やがては、歯のエナメル質からぞうげ質および歯髄まで攻撃し得る病変をもたらす。
(a)プラークサンプルまたは唾液サンプルに含まれる微生物を必要に応じて濃縮する;
(b)上記微生物を炭素源と接触させ、ここで、この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される;
(c)上記微生物および上記炭素源を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする;
(d)上記炭素源の添加後、12時間の期間内で少なくとも一回pHを決定する;
ここで、上記サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定は、工程(d)で決定されたpHと1つまたはそれより多くの参照値とを比較することによって実行される。この参照値またはこれらの複数の参照値を、対応するう食原性細菌の既知濃度を使用することによって前もって決定した。
(a)う食原性細菌の群によって酸へ発酵される炭素源;
(b)酸の形成の際に色が変化するpH指示薬;
(c)サンプル中のう食原性細菌の濃度の半定量的な測定を容易にする色の標準、
を備える。
(項目1)
プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法であって、
(a)プラークサンプルまたは唾液サンプル中に含まれる微生物を、必要に応じて濃縮する;
(b)該微生物を、該う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源と接触させる;
(c)該微生物と該炭素源とを、該う食原性細菌による選択的な酸の形成を促進する条件下でインキュベートする;
(d)該炭素源の添加後、12時間の期間内で少なくとも1回、pHを決定する;
ここで、該サンプル中の該う食原性細菌の該半定量的な測定は、工程(d)において決定されたpHと少なくとも1つの参照値とを比較することによって実行される、方法。
(項目2)
上記pHが、pH電極を使用して工程(d)で決定される、上記項目に記載の方法。
(項目3)
上記pHが、酸の形成の際にその色が変化するpH指示薬を使用して工程(d)で決定される、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目4)
上記pH指示薬が、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、m−クレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッドおよびクロロフェノールレッドからなる群より選択される、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目5)
工程(c)が、上記う食原性細菌の増殖および/または酸の形成を有意には損ねない1つまたはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目6)
工程(b)および/または工程(c)が、1つもしくはそれより多くのアミノ酸および/または1つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマーの存在下で進行する、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目7)
工程(b)および/または工程(c)が、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびセリンからなる群より選択される1つもしくはそれより多くのアミノ酸の存在下で進行する、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目8)
工程(b)および/または工程(c)が、アルギニンの存在下で進行する、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目9)
上記う食原性細菌がミュータンス連鎖球菌である、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目10)
上記ミュータンス連鎖球菌によって酸へ発酵される上記炭素源が、スクロース、マルトースおよびマルトトリオースからなる群より選択される、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目11)
上記う食原性細菌が乳酸杆菌属である、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目12)
工程(c)が、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびナイシンからなる群より選択される1つもしくはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目13)
上記乳酸杆菌属によって酸へ発酵される上記炭素源が、マンノース、ラクトースおよびN−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、上記項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目14)
上記項目のいずれか1つに記載の方法を実行するための試験ストリップであって、ここで、
う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源、および酸の形成の際に色が変化するpH指示薬が、該試験ストリップと細菌の懸濁物とが接触した際に、該炭素源と該pH指示薬とが該試験ストリップから放出されるような様式で、該試験ストリップの表面上に固定化されている、試験ストリップ。
(項目15)
上記試験ストリップが、20μm未満の孔径を有するフィルター材料を備え、該フィルター材料上に、上記炭素源および上記pH指示薬が固定化される、上記項目のいずれか1つに記載の試験ストリップ。
(項目16)
上記炭素源および/または上記pH指示薬が、ポリマーラッカーによって上記試験ストリップ上に固定化されている、上記項目のいずれか1つに記載の試験ストリップ。
(項目17)
上記項目のいずれか1つに記載の方法を実行するための試験キットであって、該試験キットは:
(a)う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源;
(b)酸の形成の際に色が変化するpH指示薬;
(c)サンプル中の該う食原性細菌の濃度の半定量的な測定を可能にする色の標準
を備える、試験キット。
(項目18)
上記色の標準が多段階の標準である、上記項目のいずれか1つに記載の試験キット。
(項目19)
上記キットは、上記項目のいずれか1つに記載の少なくとも1つの試験ストリップを備える、上記項目のいずれか1つに記載の試験キット。
細菌株
この実験のために選択された株の保存培養物を、−80℃の温度でCRYOBANK(Mast Diagnostica,CRYO/M)セラミック支持体で保存した。培養のために、セラミックリングを、10mlの栄養培地に入れ、14時間〜72時間インキュベートした。この培養物を、継代0(P0)と指定した。次に、100μlの培養物を、10mlの新鮮な培地に接種し、24時間インキュベートした。継代2の培養物を、酸の産生についての続いての実験のために使用した。この場合において、この培養物を、650nmでの吸収が約0.6〜1.0になるまで希釈した。この細菌の懸濁物を、8000rpmで5分間、遠心分離した。培養上清を除去し、ペレットを、同じ容積の水(10ml、脱イオンした、滅菌)に再懸濁した。サンプルを、再度遠心分離し(8000rpm、5分間)、上清を除去した。続いて、ペレットを、1ml(これは、元の容積の1/10に相当する)の脱イオン水に再懸濁した。
酸の産生を測定するために、40μlの細菌の懸濁物を、96ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートまたは1.5ml 微小遠心分離チューブ内の100μlの試験溶液に添加した。この試験溶液は、適切なpH指示薬(例えば、フェノールレッドおよびブロモクレゾールパープル)の他に、発酵可能な炭素源、5mMのホスフェートまたは5 mMのトリス−HCl、および必要に応じて抗生物質またはアルギニンのようなアミノ酸を含んだ。使用した試験溶液を、規定の開始pHに調整した。試験溶液の作製において、成分を、所望の最終容積の75%の容積の脱イオン水に溶解させた。次に、適切なpHに調整し、この混合物を、脱イオン水を使用して計算された容積まで満たした。作製された溶液を冷蔵庫で保存し、2週間以内に使用した。
本発明の方法にしたがう、唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定が、証明されたう食リスク試験CRT(登録商標)バクテリアの結果と相関するか否かを調査するために、およそ80個の唾液サンプルを、CRT(登録商標)バクテリア試験、ならびに本発明の試験溶液136および試験溶液98(表3を参照のこと)を使用して、並行して研究した。
1.サンプルチューブから寒天培地の支持体を取り外す。
2.このチューブの底にNaHCO3錠剤をおく。
3.寒天培地の両方の表面から保護フィルムを注意深く取り外す;この過程で、寒天培地の表面を触らない。
4.寒天培地の表面を引っ掻かずに、ピペットを使用して、各々の寒天培地の表面を50μlの唾液で完全に湿らす。
5.滴らせることによって過剰な唾液を排出する。
6.上記寒天培地の支持体をこのチューブに戻し、しっかりと閉める。
7.インキュベーションキャビネット(例えば、Cultura/Ivoclar Vivadent)内で、37℃、48時間〜72時間、このチューブを直立させて保管する。
8.インキュベーションキャビネットからこのチューブを取り出した後、各々の場合におけるミュータンス連鎖球菌または乳酸杆菌属のコロニー密度を、添付の標準の対応する写真と比較する。
1回の試験に必要とされる時間を受動的濾過(passive filtration)によって唾液サンプルを濃縮することによって短くすることができるか否かを確認するために、9つの濃縮した唾液サンプルおよび9つの濃縮していない唾液サンプル中のミュータンス連鎖球菌の検出を比較した。この目的のために、直径5mmの孔を、プラスチックディスクに穿孔した。これらの孔を、下からフィルター材料(ガラスファイバー)で密封した。ディスクとフィルターとを、このプラスチックディスクと吸引フリース(セルロース)との間にこのフィルターが配置されるような様式でこの吸引フリースの上においた。60μlの唾液サンプルを、孔のうちの1つを通してこのフィルター上に添加した。続いて、20μlの試験溶液136を、このフィルターに添加した。濾過の完了後に、この吸引フリースを、このディスクおよびこのフィルターから分離し、このプラスチックディスクとこのフィルターを、37℃で最長4時間インキュベートした。
本発明は、唾液および/またはプラークのサンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定するための方法に関し、ここで、プラークまたは唾液のサンプルに含まれる微生物を、炭素源と接触させる。この炭素源は、上記う食原性細菌によって酸に発酵される。次に、この微生物を、上記う食原性細菌による選択的な酸の形成を可能にする条件下でインキュベートする。次に、この酸の形成を、この炭素源の添加後、12時間の期間内で少なくとも一回pHを決定することによって検出し、ここで、上記pHと少なくとも1つの参照値とを比較することによって、上記サンプル中のう食原性細菌を半定量的に測定する。さらに、本発明は、このような方法を実行するためのキットを提供する。
Claims (17)
- プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法であって、
(a)該微生物を、該う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源と接触させる;
(b)該微生物と該炭素源とを、該う食原性細菌による選択的な酸の形成を促進する条件下でインキュベートする;
(c)該炭素源の添加後、12時間の期間内で少なくとも1回、pHを決定する;
ここで、該サンプル中の該う食原性細菌の該半定量的な測定は、工程(c)において決定されたpHと少なくとも1つの参照値とを比較することによって実行され、該う食原性細菌がミュータンス連鎖球菌であり、該炭素源がマルトトリオースであり、そして、該参照値が、反応の同じ時点において、かつ、同じ条件下で、既知の数の該う食原性細菌を有するサンプルに基づいて事前に取得される、方法。 - プラークサンプルまたは唾液サンプル中のう食原性細菌の半定量的な測定のための方法であって、
(a)該微生物を、該う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源と接触させる;
(b)該微生物と該炭素源とを、該う食原性細菌による選択的な酸の形成を促進する条件下でインキュベートする;
(c)該炭素源の添加後、12時間の期間内で少なくとも1回、pHを決定する;
ここで、該サンプル中の該う食原性細菌の該半定量的な測定は、工程(c)において決定されたpHと少なくとも1つの参照値とを比較することによって実行され、該う食原性細菌が乳酸桿菌属であり、該炭素源がマンノースまたはN−アセチルグルコサミンであり、そして、該参照値が、反応の同じ時点において、かつ、同じ条件下で、既知の数の該う食原性細菌を有するサンプルに基づいて事前に取得される、方法。 - 前記プラークサンプルまたは唾液サンプル中に含まれる前記微生物が、前記炭素源と接触させる前に濃縮される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記pHが、pH電極を使用して工程(c)で決定される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記pHが、酸の形成の際にその色が変化するpH指示薬を使用して工程(c)で決定される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記pH指示薬が、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、m−クレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッドおよびクロロフェノールレッドからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 工程(b)が、前記う食原性細菌の増殖および/または酸の形成を有意には損ねない1つまたはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記う食原性細菌がミュータンス連鎖球菌であり、そして、工程(a)および/または工程(b)が、1つもしくはそれより多くのアミノ酸および/または1つもしくはそれより多くのアミノ酸含有ポリマーの存在下で進行し、該アミノ酸がアルギニンを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アミノ酸が、アスパラギン、グルタミン、リジンおよび/またはセリンをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 工程(a)および/または工程(b)が、アルギニンの存在下で進行する、請求項8に記載の方法。
- 工程(b)が、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびナイシンからなる群より選択される1つもしくはそれより多くの抗生物質の存在下で進行する、請求項7に記載の方法。
- 請求項5〜11のいずれか一項に記載の方法を実行するための試験ストリップであって、ここで、
う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源、および酸の形成の際に色が変化するpH指示薬が、該試験ストリップと細菌の懸濁物とが接触した際に、該炭素源と該pH指示薬とが該試験ストリップから放出されるような様式で、該試験ストリップの表面上に固定化されている、試験ストリップ。 - 前記試験ストリップが、20μm未満の孔径を有するフィルター材料を備え、該フィルター材料上に、前記炭素源および前記pH指示薬が固定化される、請求項12に記載の試験ストリップ。
- 前記炭素源および/または前記pH指示薬が、ポリマーラッカーによって前記試験ストリップ上に固定化されている、請求項12または13に記載の試験ストリップ。
- 請求項5〜11のいずれか一項に記載の方法を実行するための試験キットであって、該試験キットは:
(a)う食原性細菌によって酸へ発酵される炭素源;
(b)酸の形成の際に色が変化するpH指示薬;
(c)サンプル中の該う食原性細菌の濃度の半定量的な測定を可能にする色の標準
を備える、試験キット。 - 前記色の標準が多段階の標準である、請求項15に記載の試験キット。
- 前記キットは、請求項12〜14のいずれか一項に記載の少なくとも1つの試験ストリップを備える、請求項15または16に記載の試験キット。
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