JP5821447B2 - カルジオリピンを用いた疲労の判定方法 - Google Patents
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Description
また、血漿中のtHODEは、短時間睡眠を伴う連続デスクワーク作業により増加し、精神的疲労評価指標であるフリッカー値と関係することが知られているが、アルツハイマー患者、血管性痴呆患者の血漿においても、著しい上昇が認められている。
さらに、これら多くの疲労の判定方法は精神機能に大きく影響され、単にエネルギー代謝を反映している場合もあり、疲労の程度を客観的に判定していないと考えられる。
従って、疲労の程度の判定などに有用な方法は、国民の健康維持・増進のためにも重要なものであり、医薬品などの疲労に対する有効性を判定するためにも必要である。
しかしながら、上述のように、疲労の程度の判定方法は提案されているが、客観的な判定方法としては極めて不十分であり、真に疲労の程度の判定に用いることが可能な判定方法は開発されていない。また、疲労状態を確実に治療できる医薬品も依然として開発途上にあり、学問上も大きな問題である。
即ち、本発明に係る疲労の程度の判定方法は、上記の課題を解決するために、被験体より容易に入手し得る生体試料を用い、カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量の変動(発現変動)を指標として疲労の程度を判定することを特徴とする。
(2)被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料におけるカルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量を分析及び/又は比較することを含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
(3)被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料におけるカルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量を分析及び/又は比較し、当該カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量を変動させる物質を、疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することを含む、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法。
(5)疲労が生理的疲労である、(1)から(4)のいずれか1項に記載の方法。
(7)被験物質の疲労に対する有効性を判定するにおいて、被験物質の投与に伴って被験体由来の生体試料におけるカルジオリピンが増加及び/又はその代謝物の発現量が減少している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することを特徴とする、(1)から(6)のいずれか1項に記載の方法。
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
<疲労>
「末梢性疲労」とは、脳が主体となって疲労を感じている中枢性疲労の状態でなく、脳以外の末梢組織に起因する疲労を示す。
「病的疲労」とは、慢性疲労症候群、悪性腫瘍、細菌又はウイルス感染、糖尿病、うつ病などの疾病に伴う疲労を示す。
「薬剤由来の疲労」とは、抗ガン剤、免疫抑制剤、向精神剤などの薬剤の使用によって引き起こされる疲労を示す。
「肉体疲労」、「身体疲労」、「筋肉疲労」、「運動疲労」などは、日常生活における生理的疲労及び末梢性疲労に含まれる疲労を示す。
従って、「非疲労の状態」とは、十分な睡眠や休息が確保されており、栄養摂取量を満たしており、精神あるいは身体などへの負荷が少なく、日常的に適度な運動を行い、さらに、生理的疲労、中枢性疲労、末梢性疲労、病的疲労又は薬剤由来の疲労を呈していない状態を意味する。
<被験体、及び生体試料>
「非ヒト哺乳動物」とは、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど)、霊長類(例えば、サルなど)、並びにイヌなど、医薬品、食品又は被験物質などの薬理試験や毒性試験などに汎用される動物が好ましく、上記の中でもマウス及びラットが特に好ましい。
生体試料としては、血液、唾液、精液などの体液、肝臓、心筋、骨格筋などの組織や細胞が挙げられる。これらの試料は、倫理的な問題が生じないように採血、採取又はバイオプシーなどにより、被験体から分離されることが望ましい。好ましくは、生体試料は、血液、精液、肝臓、心筋又は骨格筋であり、より好ましくは血液又は骨格筋であり、さらに好ましくは血液である。
細胞としては、例えば、血液細胞、肝細胞、筋細胞、神経細胞、グリア細胞、骨髄細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞は、好ましくは、筋細胞、肝細胞、血液細胞、又はそれらの前駆細胞もしくは幹細胞であり、ヒト由来の細胞であることがより好ましい。
<カルジオリピン>
<カルジオリピンの代謝物>
<カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量の測定>
他に公知の質量分析(MS)法、核磁気共鳴分光法、免疫沈降法、ELISAなどの方法でもよく、特に限定されない。
カルジオリピン及び/又はその代謝物を認識する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらでもよい。抗体が市販されている場合には、市販の抗体を用いてもよい。ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法によって作製することができる。これらの抗体は修飾されていてもよい。
<カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量の補正>
測定値の補正は、内部標準試料を用いて補正する方法、疲労の状態の有無において発現量などが大きく変動しない脂質などの測定値に基づいて、カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量などの測定値を補正することにより行われる方法などがあり、その他にも公知の方法がある。
<疲労の程度の判定方法>
具体的には、被験体由来の生体試料におけるカルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量が非疲労の状態の被験体(健常対照体)における当該カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量と比較して増加又は減少している場合に、被験体は疲労の状態であると判定することができる。
また、本発明にかかる疲労の程度の判定方法の一部あるいは全部をコンピューター等の従来公知の演算装置(情報処置装置)を利用して用いることも可能であることは、当業者には明らかである。
<被験物質の疲労に対する有効性の判定方法>
また、被験物質を投与する前に、疲労の状態である被験体を被験物質投与群と被験物質非投与群に分け、これらの群におけるカルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量を比較し、被験物質を投与した群の発現量が、被験物質を投与しなかった群の発現量より非疲労の状態の被験体における発現量に近い場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することができる。
ここで、被験物質投与群においては、複数の投与用量又は複数の被験物質の疲労に対する有効性を判定するために、群の数を適宜増減してもよい。
ヒト又は非ヒト哺乳動物への被験物質の投与は、経口投与又は非経口投与のいずれでもよく、身体作業による身体への負荷と組み合わせる場合は、被験物質の特性に応じて、身体作業の前でも後でもよく、前後でもよく、投与の時期は特に限定されない。細胞培養培地への被験物質の添加においても、カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量を変動させる処置の前でも後でもよく、前後に添加してもよい。
<疲労を回復、改善又は予防し得る物質又はこれを含む製剤の探索方法>
ヒト又は非ヒト哺乳動物への被験物質の投与は、経口投与又は非経口投与のいずれでもよく、身体作業による身体への負荷と組み合わせる場合は、被験物質の特性に応じて、身体作業の前でも後でもよく、前後でもよく、投与の時期は特に限定されない。細胞培養培地への被験物質の添加においても、カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量を変動させる処置の前でも後でもよく、前後に添加してもよい。
<疲労判定試薬及び疲労判定キット>
本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、カルジオリピン及び/又はその代謝物に特異的な抗体、標識、標識二次抗体、担体、サンプル希釈液、酵素基質、反応停止液、標準物質、カルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量や特徴などから疲労の程度を判定するための資料などを含めてもよい。さらに必要に応じて、洗浄バッファー、保存剤、防腐剤などを加えることもできる。
本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットに含まれる抗体などは、1種のみでもよいし、2種以上を組み合わせてもよい。これらは、固体でも液体でもよく、単一又複数の固相上に固定されているもの、例えば、マイクロタイタープレートのようなプレートに個別に分注された状態となっていてもよい。
また、疲労判定キットの包装材に付されたラベル又は添付された文書に、生体試料におけるカルジオリピン及び/又はその代謝物の発現量を指標として被験体の疲労の程度を判定するために使用できることを表示していてもよい。
さらに、本発明にかかる疲労判定キットは、コンピューターなどの従来公知の演算装置を用いてなるキットとなっていてもよい。
<疲労のバイオマーカー>
バイオマーカーは、疾患にかかった後の治療効果の判定だけでなく、疾患を未然に防ぐための日常的な指標として疾患の予防にも用いることができる。
身体作業による肉体疲労の状態としたマウス由来の骨格筋におけるカルジオリピンの発現量を分析及び比較し、疲労の程度の判定方法を開発した。
実験には、安静(非疲労)マウス(3匹)、運動負荷直後マウス(3匹)、及び運動負荷1時間後マウス(3匹)を用いた。
運動の負荷は、マウス・ラット用トレッドミル走行装置(バイオリサーチセンター(株))を用いて行った。走行条件は、傾斜角度10度、走行開始速度9メートル/分、漸増ステップ3メートル/4分とし、高強度(高速)走行での運動を負荷した。
走行の訓練のための運動の負荷時間は20分間とし、疲労を惹起させるための運動の負荷時間は40分間とした。
尚、訓練を3から4日間隔で4回実施し、疲労を惹起させる運動の負荷は最終訓練の3から4日後に実施した。訓練は全てのマウスに行った。
運動負荷終了の直後又は1時間後にマウスを安楽死させ、後肢骨格筋(速筋及び遅筋より構成されているヒフク筋部位)を採取した。安静(非疲労)マウスは運動の負荷をすることなく安楽死させ、同様の方法を行った。
骨格筋からの脂質の抽出は、BlighとDyerらの方法に従い行った。
骨格筋にメタノール、水、クロロホルムを順次添加し、粉砕撹拌した後に遠心分離し、下層のクロロホルム層を回収し、カルジオリピンを含む脂質の抽出を行った。
脂質からのカルジオリピンの分離は、二次元TLCを用いて行った。TLCプレートシリカゲル60に一次元展開溶媒(クロロホルム:メタノール:酢酸=65:25:13)をしみこませながら展開層に入れ、展開溶媒が上がった後に、冷風にて乾燥させた。次に、一次元と垂直な方向から二次元展開溶媒(クロロホルム:メタノール:ギ酸:精製水=65:25:8.8:1.2)を用いて展開し、展開溶媒が上がった後に、冷風にて乾燥させた。乾燥後、カルジオリピンのスポットのシリカゲルをかき取り、BlighとDyerらの方法に従いシリカゲルよりカルジオリピンを抽出した。
内部標準試料としては、4つの脂肪酸の全てが飽和脂肪酸のミリスチン酸であるカルジオリピンを用いた。
カルジオリピンを含む抽出溶媒を窒素で除去し、70%過塩素酸を0.2mlを加え、約1時間、200℃で分解させた。冷却後、精製水1.4ml、2.5%モリブデン酸アンモニウム0.2ml、10%アスコルビン酸0.2mlを加えた。5分間、加温した後、820nmの吸光度を測定し、カルジオリピン量とした。
カルジオリピンのスポットの同定は、予めカルジオリピンのスポットの移動距離を溶媒の移動距離で割った指標であるRf(rate of flow)値より行った(Rf値は溶離液組成、温度、担体、チャンバーの溶媒蒸気の飽和度、スポット量を管理すれば再現性がある指標であるので、サンプル同定にも使用できる)。
走行運動負荷後のマウス骨格筋におけるカルジオリピンの発現量の変動は、安静(非疲労)マウスと比較して、直後:−32.22%、1時間後:−24.13%であり、有意に減少していた。
骨格筋におけるカルジオリピンは、運動による疲労時において著しく減少し、運動負荷1時間後においても減少していることが認められた。これらより、運動負荷1時間後のマウスは疲労の状態であると判定することができた。
上記のカルジオリピンは、生理的疲労であり、末梢性疲労であり、運動などの身体作業に伴う、いわゆる肉体疲労の状態において、発現量が減少することから、被験体の生体試料を用いて、これらのカルジオリピンを分析及び/又は比較することによって、疲労の程度を判定することが可能であり、疲労の程度を客観的に判定する方法を開発することができた。
Claims (8)
- 被験体由来の骨格筋におけるカルジオリピンの発現量を分析及び/又は比較することを含む、運動負荷による疲労の程度を判定する方法。
- 被験体由来の骨格筋におけるカルジオリピンの発現量を分析及び/又は比較することを含む、被験物質の運動負荷による疲労に対する有効性を判定する方法。
- 被験体由来の骨格筋におけるカルジオリピンの発現量を分析及び/又は比較し、当該カルジオリピンの発現量を変動させる物質を、運動負荷による疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することを含む、運動負荷による疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法。
- 被験体由来の骨格筋におけるカルジオリピンが非疲労状態の被験体と比較して減少している場合に、被験体は疲労の状態であると判定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 被験物質の疲労に対する有効性を判定するにおいて、被験物質により被験体由来の骨格筋におけるカルジオリピンが増加している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することを特徴とする、請求項2又は3に記載の方法。
- 被験体が、ヒト又は非ヒト哺乳動物である、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 疲労が生理的疲労である、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載の方法において上記カルジオリピンの発現量を分析及び/又は比較するための試薬又はキット。
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