JP5767759B1 - ヘパリン含有組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
ここで、前記プロタミン溶液のプロタミン濃度が、10μg/ml〜1000μg/mlであってもよい。
また、前記剤における低分子量ヘパリン/プロタミン(重量比)が、1/1〜5/1であってもよい。
また、前記プロタミンの数平均分子量が、500〜5000であってもよい。
また、前記ナノ粒子の平均粒子径が、20〜200nmであってもよい。
また、前記剤が、ヘパリン結合性成分を更に含んでいてもよい。
また、前記ヘパリン結合性成分が、ヒト多血小板血漿(hPRP)、ヒトの脂肪組織由来間葉系細胞から分泌される増殖因子、ヘパリン結合性増殖因子及びサイトカインからなる群から選択される一種以上であってもよい。
また、前記剤が、外用剤又は注射用剤であってもよい。
また、前記剤が、発毛剤、育毛剤又は養毛剤であってもよい。
また、前記剤が、アンチエージング剤であってもよい。
本発明は、生理食塩水を用いた希釈LMWH溶液にプロタミン溶液を添加し撹拌する工程を含む、LMWHとプロタミンとを含むナノ粒子(LMWH/P NPs)を含有する剤の製造方法である。以下、当該製造方法について、原料及びプロセスの順で説明する。
(LMWH)
本発明で用いるLMWHは、一般に天然ヘパリン(分子量15000〜20000Da程度)を解重合して得られる低分子量のヘパリンである。その数平均分子量の上限は、プロタミンと混合することによりナノ粒子を形成できる程度のものであればよく、一般的には10000、好ましくは9000、より好ましくは8000、更に好ましくは6000であり、数平均分子量の下限は、通常は1000、好ましくは3000、より好ましくは4000である。なお、数平均分子量において通常(天然)のヘパリンと区別できれば十分であり、例えば、10000以上、あるいは20000以上の分子量を持つ分画を含んでいても、全体として平均分子量が約10000未満であれば本発明における低分子ヘパリンとして使用できる。本発明では、ヘパリンの平均分子量として、分子量が既知の標準物質を用いたゲル浸透クロマトグラフィー法によって測定される数平均分子量を用いる。
本発明で用いるプロタミンは、動物の精子の核中でDNAと結合して存在する塩基性の高いタンパク質として知られている。一般的には、27〜65残基からなる低分子量タンパク質であり、アミノ酸の40〜70%をアルギニンが占めると言われている。プロタミンも医薬品として市販されており、本発明では市販のプロタミンをそのまま使用することができる。プロタミンの数平均分子量は、好適には500〜5000である。
LMWH溶液(原液)を希釈する溶媒は、生理食塩水である。他方、プロタミン溶液における溶媒は特に限定されないが、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等から任意に選択することができる。
本発明では他の成分を添加してもよい。例えば、ヘパリン結合性成分を挙げることができる。具体的には、ヘパリン結合性成分が、ヒト多血小板血漿(hPRP)、ヒトの脂肪組織由来間葉系細胞から分泌されるヘパリン結合性増殖因子(血小板由来増殖因子(PDGFs)、FGFs、トランスフォーミング増殖因子(TGFs)、HGF、血管内皮増殖因子(VEGFs)から選択される一種以上である。LMWHとプロタミンとを含むナノ粒子(LMWH/P NPs)に当該ヘパリン結合性成分を担持させた場合、担持成分子を熱やトリプシン等たんぱく質分解酵素による不活化要因から保護して活性を維持延長することが確認されている。これは、ヘパリン結合性増殖因子と結合することによって発揮される天然のヘパリン様分子(ヘパラン硫酸等)が有する特徴的な機能と同等である。尚、ナノ粒子形成や安定性に影響するものでなければ、ヘパリンと結合しない分子を包接できるものと考えられる。LMWH/P NPsの形成は、相互の陰性電荷と陽性電荷による多重電解質複合体によるものであるため、例えば、著しく高分子量の物質でなければ、陰性電荷や陽性電荷を帯びた医薬品や化粧品用成分として保湿剤、育毛剤、アンチエージング剤、機能性食品成分としてビタミン剤や抗酸化剤なども包接することも可能である。
本発明は、生理食塩水を用いた希釈LMWH溶液にプロタミン溶液を添加し撹拌する工程を含む。より詳細には、生理食塩水を用いた希釈LMWH溶液に希釈プロタミン溶液を滴下して撹拌することでLMWH/P NPsを生成させる。例えば、本製造方法は、ダルテパリン等のLMWHの水溶液に、プロタミン水溶液を滴下し、ボルテックスなどで更に攪拌することによって粒子を得る工程である。
LMWH及びプロタミンの濃度は、好適にはそれぞれ10μg/ml〜1000μg/mlであり、より好適には50μg/ml〜500μg/mlである。尚、LMWH及びプロタミンの濃度を調節することによって、得られる粒子のサイズを制御することができる。例えば、LMWH及びプロタミンの濃度がそれぞれ50〜500μg/ml程度の溶液を用いると、20〜200nm程度の平均粒子径をもつ粒子を得ることができる。
LMWHとプロタミンとの混合重量比については、プロタミンに対するLMWHの重量を等量あるいはやや過剰することが、粒子の収率向上の点で好ましく、過剰なプロタミンの存在は不溶性のペースト状沈殿物が生成する懸念がある。したがって、LMWHの溶液にプロタミンの溶液を滴下する場合には、滴下後の溶液内におけるLMWH/プロタミンの重量比は、好ましくは1/1〜5/1であり、より好ましくは1/1〜2/1である。すなわち、上記LMWH溶液に含まれるLMWH1重量部に対して、好ましくは0.2〜1重量部、より好ましくは0.5〜1重量部のプロタミンが添加されるようにプロタミン溶液が滴下される。
前記のように、より一層の安定を図るため、デキストランを添加してもよい。この場合、デキストランの濃度は0.05〜1質量%であることが好適である。また、デキストランは、低分子ヘパリンとプロタミンとを含む粒子が生成した後に溶液に添加することが好ましい。
本発明に係る剤は、LMWHとプロタミンとからなるLMWH/P NPsを含む。また、前記のように、本発明に係る剤は、ヘパリン結合性成分やデキストラン等を含有していてもよい。ここで、ナノ粒子の平均粒径は、好ましくは10nm〜500nmであり、より好ましくは20nm〜200nmである。また、ナノ粒子の粒度分布は、好ましくは10nm〜500nmであり、より好ましくは20nm〜200nmである。ここで、平均粒径及び粒度分布は、電子顕微鏡写真から粒子径解析ソフト(LabVIEW (Ver 8.5)with the Vision Development/Module (National Instrument Co.、Austin、Tx、USA)を使って計測した値である。
≪本発明に係る剤の用途≫
剤型は、好適には外用剤及び注射用剤であることが好適である。以下、その理由を述べる。
本発明に係わる剤をヒト用外用剤として用いる場合、1日2回(朝・夕)、1回当たり1〜2mLを頭皮あるいは皮膚に塗布し、擦りこむようにマッサージすることが効果的である。また、本発明に係わる剤をヒト用注射用剤として用いる場合、10mLの剤を10か所{1mL(1か所)×10}に2週間毎に6回(計12週間)、皮内注射投与することが好適である。
低分子化ヘパリン/プロタミンナノ粒子(LMWH/P NPs)の作製と安定性
LMWHとして、市販のダルテパリンであるフラグミン注射液(商品名)(6.4mg/ml、1000IU/ml、ヘパリンの数平均分子量は約5000、キッセイ薬品工業株式会社)を使用した。この5mlのLMWH注射液を100mlの生理食塩水(大塚製薬)に滴下し、2.3mlの市販のプロタミン注射液(10mg/ml;持田製薬株式会社) をLMWH溶液のボルテックスで撹拌しながら混合した。得られた微粒子分散物の電子顕微鏡外観を図1(A)に示す。粒子径分布のF/P MPs(図1)は、電子顕微鏡写真から粒子径解析ソフト(LabVIEW (Ver 8.5)with the Vision Development/Module (National Instrument Co.、Austin、Tx、USA)を使って計測した。その結果、生じたLMWH/P NPsは82±40.1nmであった。このF/P NPs懸濁液は、室温で一か月の長期にわたってデキストラン添加なしで融合することなく安定化し、粒子径を維持した(図1B)。
図2は、活性化血小板から分泌されるヘパリン結合性増殖因子とLMWH/P NPsとの相互作用についての模式図であり、ヘパリン結合性増殖因子含有LMWH/P NPsは細胞外基質や細胞表面に接着して局所に保持され、吸着しているヘパリン結合性増殖因子の活性化、安定化、徐放化させ、それらの活性・機能を大きく促進させる。
インフォームドコンセントを得た薄毛に悩むボランティア36名(男24名、女12名)について、それぞれの採血により自己PRP含有LMWH/P NPs(9名)、自己PRP(9名)、LMWH/P NPs(9名)、生理食塩水(9名)を直接頭皮に皮下注射を行い、増毛・育毛効果について検討した。治療2週間毎3回、その後3週間毎2回(計5回)自己PRP含有LMWH/P NPs、自己PRP、LMWH/P NPs、生理食塩水を直接頭皮に皮下注射し、それぞれの0、6週及び12週目にDermoscopic Degital Camera (Derma Medical、Kanagawa、Japan)を用いて写真撮影を行い、単位表面積あたりの毛のクロス−セクション(直径)と毛の数を測定した。
ヘアレスマウス(日本エスエルシー:Hos:HR−1)に、紫外線(UV)照射(UVB:波長ピーク300nm)ランプを使用し、週5日(5回)照射光度が、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90mJ/cm2になるように毎週5mJ/cm2づつ照射光度を増やすように照射時間を調整して、皮膚老モデルを作成した。このUV照射後、500μlの(100ng/ml)FGF−2含有(30μg/ml)LMWH/P NPs、FGF−2のみ、LMWH/P NPsのみ、そして生理食塩水(コントロール)をUV照射部位に擦りこむように塗布した。
インフォームドコンセントを得た薄毛に悩むボランティア10名(男5名、女5名)について、約0.5μg/mlのLMWH/P NPsを含んだ懸濁液を洗髪後朝・夕2回、約1mlづつ薄毛の部分の頭皮に擦りこむように塗布を行い、増毛・育毛効果について検討した。またコントロールとしてボランティア6名に対して生理食塩水を同様に塗布した。それぞれの0、2、4、8週及び12週目にDermoscopic Degital Camera (Derma Medical、Kanagawa、Japan)を用いて写真撮影を行い、単位表面積あたりの毛のクロス−セクション(直径)と毛の数を測定した。
Claims (10)
- 生理食塩水希釈液であり且つ濃度が10μg/ml〜1000μg/mlである数平均分子量が1000〜10000である低分子量ヘパリン溶液に対し、生理食塩水非希釈液であるプロタミン溶液を添加し撹拌する工程を含む、低分子量ヘパリンとプロタミンとを含むナノ粒子を含有し、且つ、デキストランを含有しない剤の製造方法。
- 前記プロタミン溶液のプロタミン濃度が、10μg/ml〜1000μg/mlである、請求項1記載の製造方法。
- 前記剤における低分子量ヘパリン/プロタミン(重量比)が、1/1〜5/1である、請求項1又は2記載の製造方法。
- 前記プロタミンの数平均分子量が、500〜5000である、請求項1〜3のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記ナノ粒子の平均粒子径が、20〜200nmである、請求項1〜4のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記剤が、ヘパリン結合性成分を更に含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記ヘパリン結合性成分が、ヒト多血小板血漿(hPRP)、ヒトの脂肪組織由来間葉系細胞から分泌される増殖因子、ヘパリン結合性増殖因子及びサイトカインからなる群から選択される一種以上である、請求項6記載の製造方法。
- 前記剤が、外用剤又は注射用剤である、請求項1〜7のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記剤が、発毛剤、育毛剤又は養毛剤である、請求項1〜8のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記剤が、アンチエージング剤である、請求項1〜8のいずれか一項記載の製造方法。
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