JP5764216B2

JP5764216B2 - ポリ−γ−グルタミン酸と光学映像ダイの複合体を含有するセンチネルリンパ節検出用光学映像プローブ

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Publication number: JP5764216B2
Application number: JP2013539766A
Authority: JP
Inventors: ムンヒソン; ヨンテクイム; ヨンウクノ; イルハンイ
Original assignee: BioLeaders Corp
Current assignee: BioLeaders Corp
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2031-11-18
Also published as: JP2013544358A; WO2012067458A2; CN103430014A; CN103430014B; US20140161727A1; WO2012067458A3; KR20120053682A; US9623121B2; KR101297815B1

Description

本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸と光学映像ダイの複合体を含有するセンチネルリンパ節検出用光学映像プローブに関し、より詳しくは生体皮下注入時センチネルリンパ節で比較的長時間留まりながら、他のリンパ節への移動が少ないポリ−γ−グルタミン酸と光学蛍光ダイの複合体を含有するセンチネルリンパ節検出用光学映像プローブに関するものである。

センチネルリンパ節とは、解剖学的には一次癌組織からリンパ管に沿って最初に流入するリンパ節と定義できるが、センチネルリンパ節を検査して、癌細胞を検査して陽性または、悪性を判定すると、その他のリンパ節への移転の有無を知ることができる。従って、センチネルリンパ節に癌細胞が転移しているかを分かると、残っている他のリンパ節状態も予見することができる。

即ち、センチネルリンパ節に癌細胞がないとすると、残りのリンパ節にも癌細胞がないと見なせる。このようなセンチネルリンパ節を捜し出す方法として、手術時視覚的な助けを受けるために、イソスルファンブルーダイ（isosulfan blue dye, Lymphazurin 1%, Ben Venue Lab., Inc., USA）を利用する方法と手術前にテクネチウム９９ｍコロイドアルブミン（technetium-99m colloid albumin）を患者に注入後、Ｎｅｏｐｒｏｂｅ１５００（Neoprobe Corp, USA）と放射線核を探索するｈａｎｄ−ｈｅｌｄｇａｍｍａｐｒｏｂｅを利用する方法が挙げられるが、この二種類を併用すればセンチネルリンパ節を略１００％まで探すことができ、センチネルリンパ節を探してこれを持って他のリンパ節への移転を予測する手術的技法が益々普遍化されている。

黒色腫や乳癌のような表在性癌の場合で、センチネルリンパ節を探して、これに手術を適用することになれば、不要なリンパ節切除を避けることができる。一側、または両側リンパ腺切除手術を含む、局所広範囲切除術、または根治的外陰切除術の施行は、外陰部癌患者で施行されている一時しのぎの手術法であり、これは手術後創傷破壊（wound breakdown）、リンパ浮腫、又はリンパ種等の後遺症を伴いやすく、たとえ手術が成功しても、患者の生活の質の観点からは好ましくない。

しかし、センチネルリンパ節を探し、この凍結生検（frozen biopsy）によって他のリンパ節への移転の有無を予測した後に、凍結生検結果が良性（benign）であれば、センチネルリンパ節の切除だけで手術を終結できる。これは外陰部癌の手術に取って非常に進歩的な方法といえる。

ところが、従来用いられている放射線医薬品を利用したセンチネルリンパ節検出法は、多くの問題点を抱いている。放射線医薬品でラベルされたンリンパ節の病理学的検査時における、検査者及び検査室の汚染の問題、及び病理学的検査済みのサンプルの処理の問題等が深刻な問題となっている。何よりも、患者の放射線による曝露を最小化できるように、核医学的方法以外の他の分子映像方法を利用する、センチネルリンパ節の感知方法の開発が切に求められている。

本発明者等は、このような問題点を解決するための方法として、生体親和性高分子及び生体親和性光学映像プローブの複合体を利用して、効果的にセンチネルリンパ節を検出できる新しい方法を開発しようと鋭意努力した。

インドシアニングリーン（Indocyanine Green、ＩＣＧ）は、近赤外線領域（７００〜１３００ｎｍ）で蛍光特性を示す代表的な生体光学映像用プローブであり、ＦＤＡからヒトに使用が許可された唯一の近赤外線蛍光プローブである。近赤外線は、可視光線に比べて皮膚透過度が良く、皮下層の血管、または臓器等を見るための分子映像イメージを獲得したり、手術過程中に、神経または血管といった敏感な部位に対する誘導（guidance）に適用できる長所を持っている。

ＩＣＧ検査は、主に肝機能検査に用いられており、これはＩＣＧを静脈内に注射して一定時間過ぎた後、血液中に残っているかを調べる検査である。ＩＣＧは血清蛋白と結合して、肝により選択的に吸収され、腎臓から排泄されず胆汁として排泄されるため、血液内にこの色素が留まる程度（停滞率）や消失率を測定することによって、肝機能を検査できる方法である。停滞率は、１５分に５％以下が正常値であり、１０％以上が残っている場合は、肝硬変等により肝機能が著しく低下されたことを意味する。

ＩＣＧは、センチネルリンパ節検出に研究レベルで用いられたりもするが、その大きさが小さすぎるため、生体内に注入された場合、ＩＣＧがセンチネルリンパ節に長く留まることなく、周辺の他のリンパ節に移動してしまうという問題点がある。このため、実際手術過程で癌組織の周りにおいて、どのリンパ節がセンチネルリンパ節であるかを区分しにくくさせる短所がある。

最近の研究で、高分子有機溶液に近赤外線蛍光ダイであるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）水溶液を分散させた後、前記混合水溶液が分散した高分子有機溶液を乳化剤水溶液に分散させて、近赤外線蛍光ダイを含有する高分子粒子に関する特許出願（韓国公開特許第２００９−００２６６４２号）がある。このような高分子粒子は、１００ｎｍを超える粒径を持つナノ／マイクロ粒子で製造されて、主に血管投与及び経口投与に用いられるが、１０〜２５ｎｍの粒径が求められるセンチネルリンパ節の検出には適していなかった。

また、生体適合性陰イオン高分子物質であるアルギン酸ナトリウムと多重陽イオン重合体であるポリ−Ｌ−リジン溶液の連鎖イオン反応によって、インドシアニングリーンと細胞封入されたマイクロカプセルを製造した特許出願（韓国公開特許第２００９−０００８８３８号）がある。このような高分子粒子は細胞封入のために１０μｍを超える粒径を持つため、センチネルリンパ節の検出には適していなかった。

また、陽電荷を帯びたポリアリルアミンヒドロクロライド（Poly allylamine hydrochloride）電解質高分子と、二塩酸ナトリウム陰イオンのイオン交差結合反応によって、インドシアニングリーンが封合した後、シリカナノパーティクルでコーティングされたマイクロカプセルを製造した特許出願（米国公開特許第２０１０−００４７３５６号）があるが、このような高分子マイクロカプセルは、０．６〜２μｍの粒径を持っており、インドシアニングリーンの光力学特性を利用した光治療に用いられるだけであり、センチネルリンパ節の検出に適していなかった。

そこで、本発明者等は、血液を通じて注入した時、センチネルリンパ節でより長時間留まりながら、他のリンパ節への移動が少ない分子映像用プローブを開発しようと鋭意努力した結果、γ−ＰＧＡとインドシアニングリーン複合体を製造し、これを分子映像用プローブとして用いる場合、センチネルリンパ節をより容易にかつ、正確に検出できることを確認して本発明を完成するようになった。

本発明の目的は、分子映像用プローブがセンチネルリンパ節で長時間留まるようにして、他のリンパ節へ移動する傾向を減らすことによって、より容易にかつ効果的にセンチネルリンパ節を検出できるようにするポリ−γ−グルタミン酸と光学映像ダイの複合体を含有するセンチネルリンパ節検出用光学映像プローブを提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸と光学映像ダイの複合体を含有するセンチネルリンパ節検出用光学映像プローブを提供する。

本発明の他の特徴及び実施態様は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。

インドシアニングリーン（ＩＣＧ）（左）及びγ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体（右）の近赤外線蛍光スペクトル（右）を示している。０．０１％ＩＣＧとγ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体溶液を１．５ｍＬチューブに５０μＬ分注した後、室温で３日間放置した場合、光安定性を示したものである。本発明で用いられた近赤外線映像測定装置の概略図である。 γ−ＰＧＡ（分子量５０ｋＤａ）／ＩＣＧ複合体をマウス左側前足底に注射した後、５〜３０分後に近赤外線光学映像装置から得られるｉｎｖｉｖｏセンチネルリンパ節映像を示したものである。 γ−ＰＧＡ（分子量７０００ＫＤａ）／ＩＣＧ複合体をマウス左側前足底に注射した後、５〜３０分後に近赤外線光学映像装置から得られるｉｎｖｉｖｏセンチネルリンパ節映像を示したものである。

本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸と光学映像ダイの複合体を含有するセンチネルリンパ節検出用光学映像プローブに関する。

蛍光ダイとして用いられるインドシアニンは、陰電荷を帯びる両親媒性（疎水性及び親水性）物質で、水溶液内でインドシアニンの陰電荷とγ−ＰＧＡの疎水性の部分が疎水性結合（非共有結合）により複合体を形成することになる。

本発明において光学映像ダイは、可視光線及び近赤外線波長領域で蛍光特性を示す蛍光ダイで、特に光に対する皮膚浸透度が最大になる近赤外線領域において蛍光特性を示す近赤外線光学ダイを利用した映像プローブは、Ｓ／Ｎが高い信号を検出することができる。

本発明において、前記光学映像ダイは、近赤外線、または可視光線領域の蛍光ダイであることを特徴とし、前記近赤外線蛍光ダイは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７８０、ｃｙ５、ｃｙ５．５、ｃｙ７、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ｃｙｐａｔｅ、ＩＴＣＣ、ＮＩＲ８２０、ＮＩＲ２、ＩＲＤｙｅ６８０、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、ＤｉＤ、ＤｉＲ、ＣｒｅｓｙＶｉｏｌｅｔ、ナイルブルー（Nile Blue）、Ｏｘａｚｉｎｅ７５０、及びローダミン８００（Rhodamine 800）で構成された群から選択されることを特徴とし、前記可視光線蛍光ダイは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ３．５、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）、ＮＢＤ、ナイルレッド（Nile Red）、ローダミンＢ（Rhodamine B）、テトラメチルローダミン（Tetramethylrhodamine；ＴＲＩＴＣ）、及びテキサスレッド（Texas Red）で構成された群から選択されることを特徴とする。

好ましくは、前記光学映像ダイは、近赤外線蛍光ダイであってもよく、さらに好ましくはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）であってもよい。

本発明において、前記光学映像プローブは、センチネルリンパ節検出用であることを特徴とする。

本発明において、γ−ＰＧＡは、微生物によって産生される様式によって区分されるが、構成アミノ酸であるグルタミン酸の二つの異性体（Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）の構成比により、１００％Ｌ−グルタミン酸のポリ−γ−グルタミン酸を産生するナトリアルバ・エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）と１００％Ｄ−グルタミン酸で構成されたポリ−γ−グルタミン酸を産生する炭疽菌（Bacillus anthracis）、及びＤ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸が全て混合されているポリ−γ−グルタミン酸を産生するバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・マガテリウム（Bacillus magaterium）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）等が報告されている。本発明において用いられるポリ−γ−グルタミン酸は、前記Ｄ／Ｌポリ−γ−グルタミン酸の種類に限定されることなく使用可能であり、本発明で用いられたポリ−γ−グルタミン酸は、１０〜１５０００ｋＤａであることが好ましい。

本発明において、近赤外線蛍光ダイは、シアニン系列であるｃｙ３．５、ｃｙ５、ｃｙ５．５、ｃｙ７、ＩＣＧを含む。本発明に用いられる他の近赤外線蛍光ダイとしては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７８０、Ｃｙｐａｔｅ、ＩＴＣＣ、ＮＩＲ８２０、ＮＩＲ２、ＩＲＤｙｅ６８０、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、ＤｉＤ、ＤｉＲ、ＣｒｅｓｙＶｉｏｌｅｔ、ナイルブルーとＯｘａｉｎｅｓ系列のＣｒｅｓｙＶｉｏｌｅｔ、ナイルブルー、Ｏｘａｚｉｎｅ７５０及びローダミン系列のローダミン８００、テキサスレッドで構成された群から選択される有機物であることを特徴とするが、これに限定されない。

前述したようにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、ＦＤＡから人体適用可能が許容された数少ない蛍光染料の一つであり、近赤外線領域で蛍光を出すため、種々の分野に活用されているが、物質自らの光安定性が低いため、より多くの分野への活用が限定されている。

本発明においては、このようなＩＣＧをセンチネルリンパ節検出に用いるに当たり、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を構成することによって、ＩＣＧの低い光安定性を画期的に向上させる方法を提供する（図１）。図１において、一般的なＩＣＧは３日後に蛍光強度が急激に減少することが分かるが、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体はその蛍光強度が略一定に維持されることが分かる。

また、本発明においては、このようなＩＣＧをセンチネルリンパ節検出に用いるに当たり、ＩＣＧ分子の大きさが小さすぎて生体内に注入された場合、ＩＣＧがセンチネルリンパ節に長時間留まることなく、周辺の他のリンパ節へ移動してしまう問題点を解決できる方法を提供することを特徴とする。このような点は、実際に手術の過程で癌組織の周りにおいてどのリンパ節がセンチネルリンパ節であるかを区分しにくくさせる短所がある。本発明では、このような効果を検証するために、分子量が大きい生体親和性高分子素材と複合体を構成することによって、このような問題を解決しよう試みた。

本発明の一実施例では、分子量が各々５０ｋＤａ及び７０００ｋＤａであるγ−ＰＧＡとＩＣＧの複合体を製造して、センチネルリンパ節検出に応用した（図３及び図４）。

図３から分かるように、一般的なＩＣＧを皮膚に注入した場合、時間経過に伴って、センチネルリンパ節方向にＩＣＧが移動する傾向が把握できるが、３０分経過した後には、ＩＣＧがセンチネルリンパ節に留まることなく、他のリンパ節へ移動するため、センチネルリンパ節における蛍光強度が非常に弱いことが分かる。これに比べて、分子量が５０ｋＤａであるγ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０.０１％濃度で皮膚に注入した場合、３０分経過した後にも、センチネルリンパ節から放出される蛍光強度が非常に強いことが確認できる。

また、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０．１％濃度に増加させた場合には、５分後からセンチネルリンパ節で強い蛍光信号が検出され始め、２０、３０分後には非常に強い蛍光強度を検出することができる。それに対して、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を１％濃度で注入した場合には、２０分経過する時まで信号が弱いままであるが、３０分経過した後には、センチネルリンパ節で強い蛍光信号を検出することができた。

図４では、分子量が７０００ｋＤａであるγ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０．０１％、０．１％、１％濃度で皮膚に注入した後に、センチネルリンパ節で検出される蛍光強度を調べて見た。

図４から分かるように、分子量が７０００ｋＤａであるγ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０．０１％で用いた場合、２０分後にセンチネルリンパ節で強い蛍光信号が検出され始め、３０分後には信号がさらに強くなることが分かる。これに対して、分子量が７０００ｋＤａであるγ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０．１％と１％濃度で用いた場合には、センチネルリンパ節で検出される信号が弱くなることを確認することができる。

このような実験結果は、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を利用したセンチネルリンパ節検出方法で、γ−ＰＧＡの分子量に応じた適切な濃度を選択することが大変重要であるということが示唆している。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当分野において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１:ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体の製造
蛍光ダイとして用いられるＩＣＧは、陰電荷を帯びる両親媒性（疎水性及び親水性）物質で、ＩＣＧの水溶液内で陰電荷を帯びるγ−ＰＧＡの疎水性の部分と疎水性結合（非共有結合）により複合体が形成される。

インドシアニングリーン（ＩＣＧ）とγ−ＰＧＡの複合体を下記の通り作製した。
ＩＣＧ（ＤＯＮＧＩＮＤＡＮＧＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ）０．０１ｍｇとγ−ＰＧＡ（（株）バイオリーダーズ）０．１、１、１０ｍｇを三次蒸溜水１ｍＬに順次溶解させて複合体を製造した。

作製されたＩＣＧ／γ−ＰＧＡ複合体溶液を１．５ｍＬチューブに５０μＬずつ分注した後、蛍光分光計（Fluorescence Spectrophotometer; FluoroMate FS-2）を利用して近赤外線蛍光スペクトルを測定した（図１）。
図１に示されたように、ＩＣＧは時間経過に伴って急激に減少することが分かるが、ＩＣＧ／γ−ＰＧＡ複合体は３日過ぎても蛍光強度が略一定に維持されることが分かる。

実施例２：ＩＣＧ／γ−ＰＧＡ複合体のｉｎｖｉｖｏ映像化
動物実験用のマウスは、特定病原菌フリーの６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（SLC Inc., Japan）を用い、全ての動物実験は、忠南（チュンナム）大学校共同動物実験センターで承認を受けた後行った。

データ獲得及び分析のために自体製作された近赤外線光学映像測定装置（home made NIR optical imaging system）（図２）を利用して映像を得た（図３）。ここで、前記近赤外線映像測定装置は、５００ｍＷファイバー状のレーザーで構成された光源（light source）、放出フィルター（emission filter）、マクロズームが取り付けられたレンズシステム、近赤外線検出器（ＮＩＲＣＣＤｄｅｔｅｃｔｏｒ）で構成される（図２）。前記近赤外線映像測定装置において、蛍光の強度は、類似カラー（pseudo color）として示され、赤い蛍光を示すほど蛍光強度が強いことを示す。

映像化に先立ち、体重ｇ当たり０．０１ｍＬの２．５％アベルチン（avertin）（2,2,2-tribromoethanol-tert-amyl alcohol, Sigma）溶液をマウスの腹腔に注入して、マウスを麻酔させた。５０μＬのＩＣＧ溶液（０．０１％）、ＩＣＧ／γ−ＰＧＡ（５０ｋＤａ）複合体溶液（０．０１％、０．１％及び１％）及びＩＣＧ／γ−ＰＧＡ（７０００ｋＤａ）複合体溶液（０．０１％、０．１％及び１％）を各々のヌードマウスの左側前足底に注入（footpad, subcutaneous injection）して、５分、２０分及び３０分後に、センチネルリンパ節の蛍光を測定した。全ての近赤外線蛍光映像は、７６０ｎｍレーザーと８３５／５５ｎｍ（８１０〜８６０ｎｍ励起波長測定）フィルターセットを利用して測定した。

その結果、図３に示された通り、一般的なＩＣＧを皮膚に注入した場合、時間経過に伴って、センチネルリンパ節方向にＩＣＧが移動する傾向が把握でき、３０分経過した後には、ＩＣＧがセンチネルリンパ節に留まることなく、他のリンパ節へ移動するために、センチネルリンパ節における蛍光強度が非常に弱いことが分かる。それに対して、分子量が５０ＫＤａであるγ−ＰＧＡを用いたＩＣＧ／γ−ＰＧＡ複合体の場合、３０分経過した後にセンチネルリンパ節から放出される蛍光強度がＩＣＧ単独に比べて非常に強いことを確認することができた。

また、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０．１％濃度に増加させた場合には、５分後からセンチネルリンパ節において強い蛍光信号が検出され始め、２０分後及び３０分後には非常に強い蛍光強度を検出することができる。一方、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を１％濃度で注入した場合には、２０分経過する時までは信号が弱いが、３０分経過した後には、センチネルリンパ節において強い蛍光信号を検出することができた。

また、分子量が７０００ｋＤａであるγ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０．０１％、０．１％、１％濃度で皮膚に注入した後に、センチネルリンパ節で検出される蛍光強度は、図４に示された通り、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０．０１％で用いた場合、２０分過ぎた後にセンチネルリンパ節において強い蛍光信号が検出され始め、３０分過ぎた後には信号がさらに強くなることが分かる。それに対して、分子量が７０００ＫＤａであるγ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を０．１％と１％濃度で用いた場合にはセンチネルリンパ節において検出される信号が弱くなることを確認することができる。

このような実験結果は、γ−ＰＧＡ／ＩＣＧ複合体を利用したセンチネルリンパ節検出方法において、γ−ＰＧＡの分子量に応じた適切な濃度を選択することが大変重要であることを示唆している。

以上、説明した通り、本発明によると、既存の放射能医薬品を用いず、生体に安全なポリ−γ−グルタミン酸と蛍光ダイの複合体を用いるため、放射能汚染の心配がなく、センチネルリンパ節の位置をリアルタイムで正確に検出することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims

ポリ−γ−グルタミン酸及びインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の複合体を含有するセンチネルリンパ節検出用光学映像プローブであって、前記インドシアニングリーンの陰電荷が、前記ポリ−γ−グルタミン酸の疎水性部分と、疎水性結合又は非共有結合により結合する、前記光学映像プローブ。
前記ポリ−γ−グルタミン酸は、１０〜１５０００ｋＤａである請求項１に記載の光学映像プローブ。