JP5763900B2 - 糸状菌形質転換用プラスミド及びこれを用いた糸状菌の形質転換方法 - Google Patents

Description

本発明は、糸状菌形質転換用プラスミド、及びこのプラスミドから大腸菌由来の核酸を取り除いて糸状菌に挿入し、糸状菌を形質転換する方法に関するものである。

糸状菌は、多種多様の酵素タンパク質を生産することで知られており、中でもアスペルギルス（Aspergillus）属には産業的に重要な種が多く含まれ、我が国の伝統的な醸造産業や食品用、工業用酵素剤の製造等に広く利用されている。

特に麹菌アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）は、歴史的に食品として安全に食べられてきたことから、アメリカ合衆国ではＧＲＡＳ（Generally Recognized As Safe）グレードとしてその安全性が認められている。

一方、アスペルギルス属糸状菌は、その高いタンパク質生産能を利用すべく遺伝子組換えによる育種が盛んに行われており、多くの遺伝子組換え菌が酵素剤の生産に利用されている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。

しかし、これまで酵素剤の生産に利用されてきた遺伝子組換え菌の多くは、その育種の過程で異種生物由来の核酸を染色体に取り込んでおり、我が国では遺伝子組換え体を食品に利用することへの反発が強いことから、遺伝子組換え麹菌によって生産された酵素はそのほとんどが食品用途以外の分野に利用されているのが現状である。

ところで、遺伝子組換え技術によって育種を行った場合でも、最終的に宿主に導入された核酸が宿主と同一の種由来の核酸のみの場合には、その育種株はセルフクローニング株とみなされ、遺伝子組換え体には該当しない（非特許文献２）。

セルフクローニング株の育種方法はいくつか報告されている。例えば、一旦挿入した異種生物由来の核酸を除去する方法や（特許文献２）、初めから異種生物由来の核酸を含まないように合成した目的遺伝子のみを宿主に挿入する方法等がある（特許文献３）。

しかし、大腸菌や酵母と異なり、形質転換効率、特に相同組換え頻度が低い糸状菌の育種においては、一旦染色体に挿入された異種生物由来の核酸を除去することは困難であるし、挿入遺伝子断片のみをＰＣＲ等の技術によって大量合成しようとすればコストもかかり、また合成の過程で遺伝子に変異が入る可能性も高い。このため、糸状菌においては、より安価に簡便に形質転換用プラスミドを作製でき、且つ育種株からの核酸除去という後工程を必要としないセルフクローニング株の育種方法が求められている。

非特許文献３には、糸状菌において、コートランスフォーメーション（cotransformation）という手法を用いて、遺伝子断片からセルフクローニング株を育種する方法が開示されている。

特許文献４には、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）において、セルフクローニング用の遺伝子発現カセットを適当なプラスミドに挿入し、プラスミドとして増幅した後に、発現カセットを制限酵素で切断して形質転換に用い、二重交叉相同組換えによってセルフクローニング株を作製する方法が開示されている。

特開平６−６２８６８号公報（１９９４年３月８日公開） 特開２００３−１４４１６４号公報（２００３年５月２０日公開） 特開２００４−３２９１４３号公報（２００４年１１月２５日公開） 特開平１０−２３４３６８号公報（１９９８年９月８日公開）

van Hartingsveldt W, van Zeijl CM, Harteveld GM, Gouka RJ, Suykerbuyk ME, Luiten RG, van Paridon PA, Selten GC, Veenstra AE, van Gorcom RF, er al., Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger. Gene. 1993 May 15;127(1):87-94 遺伝子組換え食品（微生物）の安全性評価基準２００８（http://www.fsc.go.jp/senmon/idensi/gm_shokuhin_biseibutu_kijun.pdf） C. Nowak, R. Radzio, U. Kuck, DNA-mediated transformation of a fungus employing a vector devoid of bacterial DNA sequences. Appl Microbiol Biotechnol. 1995 43:1077-1081

しかしながら、非特許文献３に開示された方法では、挿入遺伝子は染色体上の任意の箇所に組み込まれることが予想され、挿入位置を明らかにできないことから育種方法としてあまり望ましいとは言えない。

また、特許文献４に開示された方法では、挿入遺伝子の位置は明らかになるものの、酵母と比べてはるかに相同組換え頻度が低い糸状菌では、この方法によってセルフクローニング株を作製することは困難である。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便且つ大量に調製することができ、且つ糸状菌において効率よく相同組換えを起こさせることができる形質転換用プラスミドであって、糸状菌のセルフクローニング株取得にも用いることができる形質転換用プラスミドと、このプラスミドを用いた糸状菌の形質転換方法を提供することにある。

上記目的を達成するために本発明者は鋭意研究を重ねた。その結果、大腸菌を利用して簡便且つ大量に調製することができ、且つ糸状菌の染色体内における目的の部位において効率良く相同組換えを起こさせることができる形質転換用プラスミドを構築することに成功し、ここに開示するものである。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。

本発明に係る形質転換用プラスミドは、糸状菌を形質転換するためのプラスミドであって、形質転換用遺伝子断片と、大腸菌由来のプラスミド断片とを含み、上記形質転換用遺伝子断片は、糸状菌由来ポリヌクレオチドと、目的遺伝子発現カセットとを含み、上記大腸菌由来のプラスミド断片は、上記糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に挿入されるように連結されていることを特徴としている。

本発明に係る形質転換用プラスミドでは、上記形質転換用遺伝子断片は、同一生物種由来のポリヌクレオチドからなることが好ましい。

本発明に係る形質転換用プラスミドでは、上記糸状菌由来ポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子であることが好ましい。

本発明に係る糸状菌の形質転換方法は、上述した形質転換用プラスミドから上記大腸菌由来のプラスミド断片を除去し、上記形質転換用遺伝子断片を取得する工程（Ａ）と、上記工程（Ａ）で得られた形質転換用遺伝子断片を、宿主糸状菌に導入する工程（Ｂ）とを含むことを特徴としている。

本発明に係る形質転換用プラスミドは、大腸菌由来のプラスミド断片を有している。このため、当該形質転換用プラスミドを大腸菌を用いて簡便且つ大量に調製することができる。また、本発明に係る形質転換用プラスミドを用いれば、一重交叉相同組換えによって、目的遺伝子発現カセットを、糸状菌の染色体内における目的の部分に効率良く相同組換えを起こさせることができるという効果を奏する。

本発明に係る形質転換方法によれば、大腸菌由来のプラスミド断片が染色体内に挿入されていない形質転換体を容易に且つ効率よく取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態を示すものであり、形質転換体選択用マーカー遺伝子の内部に挿入されるように大腸菌由来のプラスミド断片が配置された形質転換用プラスミドを概略的に表す図である。 大腸菌由来のプラスミド断片を取り除いた形質転換用遺伝子断片が糸状菌染色体上のマーカー遺伝子部位に相同組換えによって挿入されることを模式的に示した図である。 実施例１におけるｐＮＥＮｓｅｌｆプラスミドの構築手順を示す図である。 実施例１におけるｐＮＥＮｓｅｌｆ−ａｇｄＡプラスミドの概略図である。 実施例１において得られた形質転換体がα−グルコシダーゼを発現していることを示す図である。 実施例１において得られた形質転換体の染色体上にα−グルコシダーゼ発現カセットが組み込まれていることを示す図である。図６の（ａ）はｎｉａＤをプローブとした場合、（ｂ）はｐＵＣ１１８をプローブとした場合の結果を表している。 実施例２におけるｐＳＥＮｓｅｌｆプラスミドの構築手順を示す図である。 実施例２において得られた形質転換体がα−グルコシダーゼを発現していることを示す図である。 実施例２において得られた形質転換体の染色体上にα−グルコシダーゼ発現カセットが組み込まれていることを示す図である。図９の（ａ）はｓＣをプローブとした場合、（ｂ）はｐＵＣ１１８をプローブとした場合の結果を表している。 本発明に係る形質転換用プラスミドおよび従来の形質転換用プラスミドを用いた相同組換えの機構を概略的に表した図である。（ａ）は本発明に係る形質転換用プラスミドを用いた相同組換えの機構を表し、（ｂ）は従来の形質転換用プラスミドを用いた相同組換えの機構を表している。図１０において、破線は大腸菌由来のプラスミド断片、を表している。 実施例３におけるｐＡＮＮｓｅｌｆプラスミドの構築手順を示す図である。 実施例３におけるｐＡＮＮｓｅｌｆ−ＢＧＬプラスミドの概略図である。 実施例３において得られた形質転換体がβ−グルコシダーゼを発現していることを示す図である。 実施例３において得られた形質転換体の染色体上にβ−グルコシダーゼ発現カセットが組み込まれていることを示す図である。図１４の（ａ）はｎｉａＤをプローブとした場合、（ｂ）はｐＵＣ１１８をプローブとした場合の結果を表している。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。但し、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」であることを示す。

〔１．形質転換用プラスミド〕
本発明に係る形質転換用プラスミドは、糸状菌を形質転換するためのプラスミドであって、形質転換用遺伝子断片と、大腸菌由来のプラスミド断片とを含み、上記形質転換用遺伝子断片は、糸状菌由来ポリヌクレオチドと、目的遺伝子発現カセットとを含み、上記大腸菌由来のプラスミド断片は、上記糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に挿入されるように連結されている。

本明細書において、上記「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと省略される）の配列として示される。

ここで、本発明の実施形態である形質転換用プラスミドの構成の一例を図１に基づき説明する。図１は、本発明の一実施形態を示すものであり、形質転換体選択用マーカー遺伝子の内部に挿入されるように大腸菌由来のプラスミド断片が配置された形質転換用プラスミドを概略的に表す図である。

図１に示すように、本発明に係る形質転換用プラスミドは、形質転換用遺伝子断片と、大腸菌由来のプラスミド断片（図１中「大腸菌由来プラスミド骨格」と表記された実線部分。）を備え、上記形質転換用遺伝子断片は、糸状菌由来ポリヌクレオチドとしてのマーカー遺伝子（例えばｎｉａＤ遺伝子。図１中「マーカー前半」および「マーカー後半」と表記された灰色部分。）と、目的遺伝子発現カセット（図１中「発現カセット」と表記された黒色部分。）とを備えている。また、上記大腸菌由来のプラスミド断片（大腸菌由来プラスミド骨格）は、上記マーカー遺伝子の内部に挿入されるように連結されている。換言すれば大腸菌由来のプラスミド断片（「大腸菌由来プラスミド骨格」）は、両端にマーカー遺伝子（「マーカー前半」および「マーカー後半」）が連結されている。

図１０は、本発明に係る形質転換用プラスミドおよび従来の形質転換用プラスミドを用いた相同組換えの機構を概略的に表した図である。（ａ）は本発明に係る形質転換用プラスミドを用いた相同組換えの機構を表し、（ｂ）は従来の形質転換用プラスミドを用いた相同組換えの機構を表している。図１０において、破線は大腸菌由来のプラスミド断片、を表している。

図１０の（ａ）に示すように、一実施形態において、本発明に係る形質転換用プラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌由来のプラスミド断片（大腸菌由来配列）と、糸状菌由来ポリヌクレオチドとしてのｎｉａＤマーカー遺伝子（図１０中「niaD-F」および「niaD-L」で表記）と、目的遺伝子発現カセット（図１０中「発現カセット」で表記）とを含んでいる。本発明に係る形質転換用プラスミドでは、大腸菌由来のプラスミド断片は、上記糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に挿入されるように連結されている。言い換えれば、上記大腸菌由来のプラスミド断片は、分断された糸状菌由来ポリヌクレオチドの２つの断片によって挟まれている。

ここで、上記「糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に挿入されるように連結されている」とは、「糸状菌由来ポリヌクレオチド」におけるヌクレオチドの順序を変えることなく、当該「糸状菌由来ポリヌクレオチド」のヌクレオチド鎖の内部に大腸菌由来のプラスミド断片が連結されていることを意図している。上記「ヌクレオチドの順序」とは、上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」の供与体の染色体ＤＮＡにおけるヌクレオチドの順序（塩基配列）を意図している。

具体的には、糸状菌由来ポリヌクレオチドの一方の末端をａ、他方の末端をｃとし、大腸菌由来のプラスミド断片が連結される位置をｂとする。糸状菌由来ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序がａ…ｂ…ｃであるとすると、本発明に係る形質転換用プラスミドでは、このヌクレオチドの順序を変えることなく、ｂの位置に大腸菌由来のプラスミド断片が挿入されるように連結されている。

また、形質転換用遺伝子断片に関して説明すれば、目的遺伝子発現カセットは、糸状菌由来ポリヌクレオチドの末端ａおよび末端ｃと連結されている。つまり、本発明に係る形質転換用プラスミドにおいては、ｎｉａＤ遺伝子の転写方向に対する、糸状菌由来ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序はｂ…ｃａ…ｂとなっている。

相同組換えを目的とする場合、相同組換え頻度を高めるために、形質転換用プラスミドは、糸状菌由来ポリヌクレオチドの任意の位置において切断され、鎖状化されて用いられる。本発明に係る形質転換用プラスミドでは、大腸菌由来のプラスミド断片は、上記糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に挿入されるように連結されている。このため、糸状菌由来ポリヌクレオチドと大腸菌由来のプラスミド断片との連結部を、制限酵素消化等によって切断すれば、相同組換えに用いるための鎖状の形質転換用遺伝子断片を容易に取得することができ、且つ形質転換用遺伝子断片から大腸菌由来のプラスミド断片を容易に除去することができる。このようにして得られた形質転換用遺伝子断片を用いれば、相同組換えによって大腸菌由来のプラスミド断片が染色体内に組み込まれることがない。尚、糸状菌に導入される形質転換用遺伝子断片としては、大腸菌由来のプラスミド断片が除去されて鎖状化されたものに限定されない。鎖状化された形質転換用遺伝子断片をライゲーション等によって環状化した形質転換用遺伝子断片を糸状菌に導入してもよい。

一方、図１０の（ｂ）に示すように、従来の形質転換用プラスミドでは、大腸菌由来のプラスミド断片が上記糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に挿入されるように連結されていない。このため、相同組換え頻度を高めるために、従来の形質転換用プラスミドを糸状菌由来ポリヌクレオチドのｂの位置において制限酵素消化して鎖状化すると、発現カセットのみならず、大腸菌由来のプラスミド断片も糸状菌由来ポリヌクレオチドの断片によって挟まれた形質転換用プラスミド断片が得られる。このような形質転換用プラスミド断片を用いた場合には、相同組換えによって大腸菌由来のプラスミド断片も染色体内に組み込まれることになる。

本発明に係る形質転換用プラスミドは、宿主染色体の染色体ＤＮＡ内の、上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」と相同な領域（Ａ…Ｂ…Ｃ）において、容易に一重交叉相同組換えを起こし、染色体内に取り込まれる。このため、糸状菌においても、効率良く相同組換えを起こさせることができる。

尚、糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に、実際に大腸菌由来のプラスミド断片を挿入して作製された以外の形質転換用プラスミドであっても、糸状菌由来ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を変えることなく、糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に大腸菌由来のプラスミド断片が連結されている限り、本発明の範囲に含まれる。

本明細書では、本発明に係る形質転換用プラスミドのうち、糸状菌の形質転換に用いる断片、すなわち上記大腸菌由来のプラスミド断片を除いた断片を「形質転換用遺伝子断片」と称している。

本明細書において、上記「目的遺伝子発現カセット」とは、宿主糸状菌細胞内で目的遺伝子を発現させるための遺伝子群（以下「発現単位」と称する）を含むポリヌクレオチドを意図している。上記「目的遺伝子」は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ヌクレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ等の酵素遺伝子や、リボソーム遺伝子、トランスポーター遺伝子、シャペロン遺伝子、転写調節因子遺伝子などの酵素以外のタンパク質をコードする遺伝子からも自由に選択することができ、また機能未知の遺伝子も選択することができる。

上記「発現単位」には、宿主糸状菌細胞内で目的遺伝子を発現させるために、例えば、プロモーター領域、目的遺伝子のオープンリーディングフレーム、ターミネーター領域等が含まれている。上記「目的遺伝子発現カセット」には、上記「発現単位」が１つ含まれていてもよいし、複数個含まれていてもよい。上記「目的遺伝子発現カセット」に複数の発現単位が含まれる場合の一例として、形質転換体選択用に、ｎｉａＤ遺伝子等のマーカー遺伝子の発現単位を含む構成とすることによって、形質転換用遺伝子断片が糸状菌の染色体内に導入された形質転換体を容易に選択することができる。

上記「目的遺伝子発現カセット」を構成するプロモーター領域、目的遺伝子のオープンリーディングフレーム、ターミネーター領域等の由来は特に限定されない。しかし、本発明に係る形質転換用プラスミドを用いてセルフクローニングを行うことを考慮すると、上記「目的遺伝子発現カセット」は、同一生物種由来であることが好ましい。目的遺伝子発現カセットを構成するポリヌクレオチドを提供する供与体を宿主糸状菌として形質転換を行えば、宿主糸状菌に導入される核酸は宿主と同一生物種由来の核酸のみとなるため、セルフクローニング株を取得することができる。

上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」は、宿主糸状菌の染色体内において形質転換用遺伝子断片に相同組換えを起こさせるための相同領域として設けられている。このため、宿主糸状菌の染色体ＤＮＡと相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドであれば特に限定されない。例えば、染色体内において目的遺伝子発現カセットを挿入したい位置の前後の染色体ＤＮＡと相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドを、上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」として用いることができる。

上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」の長さは、特に限定されないが、相同組換えの効率を考えると、２００ｂｐ〜２００００ｂｐであることが好ましく、５００ｂｐ〜１００００ｂｐであることがより好ましい。上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」の長さが２００ｂｐ以上であれば、相同組換えを効率よく起こさせることができる。上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」の長さが２００００ｂｐ以下であれば、糸状菌の菌体内に効率よく取り込ませることができる。

図１に示すように、上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」として糸状菌由来のマーカー遺伝子を用いれば、相同組換えを起こした形質転換体を、栄養選択等によって容易に選択することができるため好ましい。上記「マーカー遺伝子」としては、一般に糸状菌形質転換体の選択に使用されているマーカーであれば特に限定されない。例えば、ｎｉａＤ、ｓＣ、ａｒｇＢ、ａｄｅＡ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ等を使用することができる。

上記「形質転換用遺伝子断片」を構成する、それぞれのポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではなく、公知の技術によって取得することができる。例えば、公知の糸状菌の配列情報に基づいて、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法によって取得することもできるし、糸状菌の染色体ＤＮＡライブラリーからクローニングする方法によって取得することもできる。

上記「形質転換用遺伝子断片」には、上記「目的遺伝子発現カセット」および上記「糸状菌由来ポリヌクレオチド」の他に、これらのポリヌクレオチドを連結させるために人工的に挿入した制限酵素認識配列が含まれていてもよい。

本発明に係る形質転換用プラスミドを用いてセルフクローニングを行うことを考慮すると、上記「形質転換用遺伝子断片」は、同一生物種由来のポリヌクレオチドからなるものであることが好ましい。形質転換用遺伝子断片を構成するポリヌクレオチドを提供する供与体を宿主糸状菌として形質転換を行えば、宿主糸状菌に導入される核酸は宿主と同一生物種由来の核酸のみとなるため、セルフクローニング株を取得することができる。

本明細書において、上記「大腸菌由来のプラスミド断片」とは、本発明に係る形質転換用プラスミドが大腸菌内で安定に増幅し存在するために必要な構成を含むポリヌクレオチドを意図している。例えば、上記「大腸菌由来のプラスミド断片」には、プラスミドが大腸菌内で複製されるための複製起点、プラスミドを保持する大腸菌を選択するための抗生物質耐性遺伝子等が含まれているが、本発明はこれに限定されない。上記「大腸菌由来のプラスミド断片」は、大腸菌内において複製可能で、且つ選択マーカーを有するプラスミドから取得することができる。このようなプラスミドとしては、例えば、通常用いられる、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ５７、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１７７等を挙げることができる。

糸状菌由来ポリヌクレオチドと大腸菌由来のプラスミド断片との連結方法は、特に限定されないが、制限酵素認識配列を介して連結されていることが好ましい。このような構成であれば、糸状菌由来ポリヌクレオチドと大腸菌由来のプラスミド断片との連結部を、制限酵素を用いて切断することができる。それゆえ、本発明に係る形質転換用プラスミドから大腸菌由来のプラスミド断片を容易に除去することができる。

連結部に用いる制限酵素認識配列としては、糸状菌由来ポリヌクレオチドにもともと存在する制限酵素認識配列を利用してもよいし、所望の制限酵素認識配列を人工的に挿入して作製してもよい。形質転換用プラスミドを制限酵素消化して大腸菌由来のプラスミド断片を除去する際に形質転換用遺伝子断片の内部が切断されないように、形質転換用遺伝子断片の内部に存在しない制限酵素認識配列であれば、連結部の制限酵素認識配列として選択することができる。汎用性を考慮すると、認識部位の出現頻度が少ない６塩基以上を認識する制限酵素の認識配列とすることが好ましく、８塩基以上を認識する制限酵素の認識配列とすることがより好ましい。６塩基を認識する制限酵素の認識配列としては、例えばＧＧＧＣＣＣ（ＡｐａＩ）、ＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ）、ＡＴＣＧＡＴ（ＣｌａＩ）、ＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、ＣＣＡＴＧＧ（ＮｃｏＩ）、ＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩ）、ＣＡＣＧＴＧ（ＰｍｌＩ）、ＧＣＡＴＧＣ（ＳｐｈＩ）、ＴＣＴＡＧＡ（ＸｂａＩ）、ＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ）等が挙げられる。８塩基以上を認識する制限酵素の認識配列としては、例えばＧＧＣＧＣＧＣＣ（ＡｓｃＩ）、ＧＣＧＡＴＣＧＣ（ＡｓｉＳＩ）、ＧＧＣＣＧＧＣＣ（ＦｓｅＩ）、ＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ）、ＴＴＡＡＴＴＡＡ（ＰａｃＩ）、ＧＴＴＴＡＡＡＣ（ＰｍｅＩ）、ＣＣＴＧＣＡＧＧ（ＳｂｆＩ）、ＧＣＣＣＧＧＧＣ（ＳｒｆＩ）、ＡＴＴＴＡＡＡＴ（ＳｗａＩ）等が挙げられる。

糸状菌由来ポリヌクレオチドと大腸菌由来のプラスミド断片との２箇所の連結部は、それぞれ別の制限酵素によって認識される制限酵素認識配列であってもよいが、制限酵素処理の効率を考慮すると、同一の制限酵素によって認識される制限酵素認識配列であることが好ましい。

糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部にもともと存在する制限酵素認識配列を、大腸菌由来のプラスミド断片との連結部として用いる場合には、大腸菌由来のプラスミド断片を挿入する場所は特に限定されない。一方、糸状菌由来ポリヌクレオチドの内部に人工的に制限酵素認識配列を設けて大腸菌由来のプラスミド断片を挿入する場合は、糸状菌由来ポリヌクレオチドの翻訳産物に影響を与えないように、イントロン、又はオープンリーディングフレームの上流若しくは下流の非翻訳領域に大腸菌由来のプラスミド断片を挿入することが好ましい。

上記「糸状菌」としては、例えば、アスペルギルス属糸状菌、ペニシリウム属糸状菌、トリコデルマ属、リゾプス属、ムコール属、モナスカス属、フザリウム属等を挙げることができる。

上記「アスペルギルス属糸状菌」としては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usami）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・フォエニシス（Aspergillus phoenicis）等を挙げることができる。

上記「ペニシリウム属糸状菌」としては、例えば、ペニシリウム・カマンベルチ（Penicillium camamberti）、ペニシリウム・ノタトウム（Penicillium notatum）、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）、ペニシリウム・パルロゼナム（penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）等を挙げることができる。

上記「トリコデルマ属糸状菌」としては、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）等を挙げることができる。

上記「リゾプス属糸状菌」としては、例えば、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）等を挙げることができる。

上記「ムコール属糸状菌」としては、例えば、ムコール・エスピー（Mucor sp.）等を挙げることができる。

上記「モナスカス属糸状菌」としては、例えば、モナスカス・パープレウス（Monascus purpureus）等を挙げることができる。

上記「フザリウム属糸状菌」としては、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）等を挙げることができる。

本発明に係る形質転換用プラスミドを用いれば、大腸菌由来のプラスミド断片が染色体内に挿入されていない糸状菌の形質転換体を容易に且つ効率よく取得することができる。

〔２．形質転換体の作製方法〕
本発明に係る形質転換体の作製方法は、本発明に係る形質転換用プラスミドから上記大腸菌由来のプラスミド断片を除去し、上記形質転換用遺伝子断片を取得する工程（Ａ）と、上記工程（Ａ）で得られた形質転換用遺伝子断片を、宿主糸状菌に導入する工程（Ｂ）とを含む。

本発明に係る形質転換用プラスミドについては、上記「１．形質転換用プラスミド」の項で説明したとおりであるので、ここでは省略する。以下に、それぞれの工程について説明する。

（２−１．工程（Ａ））
工程（Ａ）は、糸状菌の形質転換を行う前工程として、本発明に係る形質転換用プラスミドから上記大腸菌由来のプラスミド断片を除去し、上記形質転換用遺伝子断片を取得する工程である。

形質転換用プラスミドから大腸菌由来のプラスミド断片を除去する方法としては、特に限定されない。例えば、形質転換用遺伝子断片を増幅させることができるようなプライマーペアを用いて、本発明に係る形質転換用プラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換用遺伝子断片のみを増幅させる方法や、制限酵素消化によって、形質転換用プラスミドから大腸菌由来のプラスミド断片を切断する方法等を挙げることができる。

上記「１．形質転換用プラスミド」の項において説明したように、本発明に係る形質転換用プラスミドは、糸状菌由来ポリヌクレオチドと大腸菌由来のプラスミド断片とが連結部に設けられた制限酵素認識配列によって連結されていてもよい。形質転換用遺伝子断片中には存在しない制限酵素認識配列を連結部に用いれば、係る制限酵素認識配列を認識する制限酵素を用いて消化することによって、形質転換用遺伝子断片を切断することなく、大腸菌由来のプラスミド断片と糸状菌由来ポリヌクレオチドとの連結部分を容易に切断することができる。

形質転換用遺伝子断片を取得する方法としては、特に限定されないが、例えば、ＰＣＲまたは制限酵素消化を行った反応液を、アガロースゲル電気泳動による単離、精製操作等の通常行われる操作に供することによって大腸菌由来のプラスミド断片を除去し、糸状菌由来ポリヌクレオチドと目的遺伝子発現カセットを含む形質転換用遺伝子断片のみを取得することができる。

尚、工程（Ａ）で取得される形質転換用遺伝子断片は、大腸菌由来のプラスミド断片が除去されて鎖状化されたものに限定されない。大腸菌由来のプラスミド断片が除去されたて鎖状化された形質転換用遺伝子断片を、ライゲーション等によって環状化した形質転換用遺伝子断片としても用いることができる。

（２−２．工程（Ｂ））
工程（Ｂ）は、上記工程（Ａ）で得られた形質転換用遺伝子断片を、宿主糸状菌に導入する工程である。

上記工程（Ａ）で得られた形質転換用遺伝子断片を、宿主糸状菌に導入する方法は特に限定されない。例えば、カルシウム−ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を用いることができる。

図２は、大腸菌由来のプラスミド断片を取り除いた形質転換用遺伝子断片が糸状菌染色体上のマーカー遺伝子部位に相同組換えによって挿入されることを模式的に示した図である。図２に示すように、この形質転換用遺伝子断片は、糸状菌由来ポリヌクレオチドとしてのマーカー遺伝子を目的遺伝子発現カセットによって１箇所分断した形となっている。このような構成の形質転換用遺伝子断片は、宿主染色体上のマーカー遺伝子内の同一箇所との間に容易に一重交叉相同組換えを起こし、染色体内に取り込まれる。

宿主となる「糸状菌」については、上記「１．形質転換用プラスミド」の項で説明したとおりであるので、ここでは省略する。セルフクローニング株を取得する観点から、形質転換に用いられる上記形質転換用遺伝子断片は、上記宿主糸状菌と同一生物種由来のポリヌクレオチドからなるものであることが好ましい。換言すればセルフクローニングを行うためには、形質転換用遺伝子断片の供与体である糸状菌を宿主として遺伝子導入すればいよい。

宿主糸状菌の染色体内の目的の位置に形質転換用遺伝子断片が挿入されたことは、サザンブロット、ＰＣＲ等の従来公知の方法によって確認することができる。

本発明に係る形質転換方法によれば、大腸菌由来のプラスミド断片が染色体内に挿入されていない糸状菌の形質転換体を容易に且つ効率よく取得することができる。また、宿主糸状菌と同一生物種由来の形質転換用遺伝子断片を導入することによって、セルフクローニング株を容易に取得することができる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

〔実施例１：ｎｉａＤマーカーを用いたα−グルコシダーゼ生産アスペルギルス・オリゼセルフクローニング株の作製〕
（１．ｐＮＥＮｓｅｌｆプラスミドの作製）
ｐＮＥＮｓｅｌｆプラスミドの構築手順を、図３に基づいて説明する。図３は、実施例１におけるｐＮＥＮｓｅｌｆプラスミドの構築手順を示す図である。図３に示すように、まず、アスペルギルス・オリゼ由来の改良プロモーターであるＰ−ｅｎｏＡ１４２は、ｐＮＥＮＧ１４２−ｆプラスミド（Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(1), 206-208, 2005）を制限酵素ＰｓｔＩ及びＳａｌＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により単離、精製して得られた。ｐＵＣ１１８プラスミドは、制限酵素ＰｓｔＩ及びＳａｌＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により単離、精製して取得された。その後アルカリフォスファターゼでｐＵＣ１１８プラスミドの脱リン酸化を行った。

このようにして調製したｐＵＣ１１８プラスミドと、プロモーター（Ｐ−ｅｎｏＡ１４２）とをライゲーションし、ｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２プラスミドを得た。

次いで、アスペルギルス・オリゼ由来のα−グルコシダーゼターミネーター（配列番号１）を、ＳａｌＩ−ＳｍａＩ断片となるようにプライマーＡ（配列番号２）とプライマーＢ（配列番号３）とを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型としてＰＣＲ法により取得した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により単離、精製した。ｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２プラスミドは、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により単離、精製された。

このようにして調製したｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２プラスミドと、α―グルコシダーゼターミネーターとをライゲーションし、ｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡプラスミドを得た。

次いで、アスペルギルス・オリゼ由来ｎｉａＤマーカー（配列番号４）の６番イントロン中間部から３’非翻訳領域及びターミネーター部分を含む後半領域（niaD-F)を、ＡｓｃＩ−ＳｍａＩ断片となるようにプライマーＣ（配列番号５）とプライマーＤ（配列番号６）とを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型としてＰＣＲ法により取得した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｍａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により単離、精製した。その後Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにてリン酸化を行った。ｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡプラスミドは、制限酵素ＳａｐＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて末端平滑化した。その後さらにＳｍａＩ消化を行い、アガロースゲル電気泳動により単離、精製した後、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化を行った。

このようにして調製したｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡプラスミドと、ｎｉａＤマーカーの後半領域（niaD-F)とをライゲーションした。得られたプラスミドにおけるｎｉａＤマーカーの後半領域（niaD-F)の挿入方向を確認し、ｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤＦプラスミドを得た。

次いで、アスペルギルス・オリゼ由来ｎｉａＤマーカーのプロモーター領域から６番イントロン中間部までを含む前半領域（niaD-L)を、ＰｓｔＩ−ＡｓｃＩ断片となるようにプライマーＥ（配列番号７）とプライマーＦ（配列番号８）とを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型としてＰＣＲ法により取得した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｓｔＩで消化後、アガロースゲル電気泳動で単離、精製した。ｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤＦプラスミドは、制限酵素ＤｒａＩＩＩで消化後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにて末端平滑化された。その後、ＰｓｔＩ消化を行って、アガロースゲル電気泳動により単離、精製した。

このようにして調製したｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡ−ｎｉａＤＦプラスミドと、ｎｉａＤマーカーの前半領域（niaD-L)とをライゲーションしてｐＮＥＮｓｅｌｆプラスミドを得た。

（２．ｐＮＥＮｓｅｌｆ−ａｇｄＡプラスミドの作製）
図４は、実施例１において使用したｐＮＥＮｓｅｌｆ−ａｇｄＡプラスミドを示す図である。アスペルギルス・オリゼ由来のα−グルコシダーゼ遺伝子（配列番号９）を、ＳａｌＩ−ＳａｌＩ断片となるようにプライマーＧ（配列番号１０）とプライマーＨ（配列番号１１）とを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型としてＰＣＲ法により取得した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩで消化後、アガロースゲル電気泳動で単離、精製した。ｐＮＥＮｓｅｌｆプラスミドは、制限酵素ＳａｌＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により単離、精製された。ｐＮＥＮｓｅｌｆプラスミドは、その後アルカリフォスファターゼで脱リン酸化された。

このようにして調製したｐＮＥＮｓｅｌｆプラスミドと、α−グルコシダーゼ遺伝子とをライゲーションした。得られたプラスミドにおけるα−グルコシダーゼ遺伝子の挿入方向を確認し、ｐＮＥＮｓｅｌｆ−ａｇｄＡプラスミドを得た。

（３．形質転換用遺伝子断片の調製）
ｐＮＥＮｓｅｌｆ−ａｇｄＡプラスミドを保持した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地１００ｍｌにて３７℃、一晩培養した。培養後、遠心操作で菌体を集めた。市販のプラスミド抽出キットを用いてこの菌体よりプラスミドを抽出した。次にこのプラスミド約１００μｇを制限酵素ＡｓｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で約９．２ｋｂｐの、分断されたｎｉａＤマーカーとα−グルコシダーゼ発現カセットからなる形質転換用遺伝子断片を単離、精製した。

（４．形質転換体の取得とα−グルコシダーゼ発現量の確認）
上述のように取得した形質転換用遺伝子断片２０μｇを用いて、プロトプラスト−ＰＥＧ法によりアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００株を形質転換し、９株の形質転換体を得た。これら形質転換体をデキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）で３０℃、３日間振とう培養し、その後、培養液と菌体を分離した。

培養液のうち４００μｌを分画分子量１０，０００のウルトラフリー（ミリポア社製）にて濃縮し、培養液２００μｌ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図５に示す。図５は、実施例１において得られた形質転換体がα−グルコシダーゼを発現していることを示す図である。図５に示すように、９株の形質転換体は全てα−グルコシダーゼを発現していた。

また、デキストリン・ペプトン培地に小麦ふすまを１％（ｗ/ｖ）加えた培地で形質転換体を３０℃、３日間振とう培養した培養液中のα−グルコシダーゼ活性を、４−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシドを基質として測定したところ、形質転換体のα−グルコシダーゼ活性は比活性で１ｍｇタンパク質あたり３．１Ｕであり、親株である宿主（アスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００株）のα−グルコシダーゼ活性０．２Ｕと比べて１０倍以上高かった。

（５．形質転換体のサザンブロット解析）
上述の形質転換体のうち３株を選び、定法によりゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡをＳａｌＩ及びＳｍａＩを用いて消化し、ｎｉａＤ及びｐＵＣ１１８をプローブとしてサザンブロット解析を行った。

結果を図６に示す。図６は、実施例１において得られた形質転換体の染色体上にα−グルコシダーゼ発現カセットが組み込まれていることを示す図である。図６の（ａ）はｎｉａＤをプローブとした場合、（ｂ）はｐＵＣ１１８をプローブとした場合の結果を表している。図６に示すように、ｎｉａＤをプローブとした場合には、いずれの株も、ｎｉａＤ遺伝子座に相同的に１コピー挿入されたことを示す、７．６ｋｂｐ及び５．９ｋｂｐの２本のバンドが検出された。ｐＵＣ１１８をプローブとした場合には、いずれの株も、いかなるバンドも検出されなかった。この結果から、形質転換体のいずれの株にも、大腸菌由来のプラスミド断片はゲノムに挿入されておらず、形質転換体はいずれもセルフクローニング株であることが確認できた。

〔実施例２：ｓＣマーカーを用いたα−グルコシダーゼ生産アスペルギルス・オリゼセルフクローニング株の作製〕
（１．ｐＳＥＮｓｅｌｆプラスミドの作製）
ｐＳＥＮｓｅｌｆプラスミドの構築手順を、図７に基づいて説明する。図７は、実施例２におけるｐＳＥＮｓｅｌｆプラスミドの構築手順を示す図である。図７に示すように、まず、アスペルギルス・オリゼ由来ｓＣマーカー（配列番号１２）のプロモーター領域から３’非翻訳領域中間部までの前半領域（ｓＣ−Ｆ）を、ＳｍａＩ−ＳｗａＩ断片となるようにプライマーＩ（配列番号１３）とプライマーＪ（配列番号１４）とを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型としてＰＣＲ法により取得した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｍａＩで消化後、アガロースゲル電気泳動で単離、精製した。その後、得られたＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにてリン酸化を行った。

実施例１にて作製したｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡプラスミドを、制限酵素ＳａｐＩで消化後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにて末端平滑化した。その後、さらにＳｍａＩで消化を行い、アガロースゲル電気泳動により単離、精製した後、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化を行った。

このようにして調製したｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡプラスミドと、ｓＣマーカーの前半領域（ｓＣ−Ｆ）とをライゲーションした。得られたプラスミドにおけるｓＣマーカーの前半領域（ｓＣ−Ｆ）の挿入方向を確認し、ｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡ−ｓＣＦプラスミドを得た。

次いで、アスペルギルス・オリゼ由来ｓＣマーカーの後半領域（ｓＣ−Ｌ）を、ＳｗａＩ−ＰｓｈＡＩ断片となるようにプライマーＫ（配列番号１５）とプライマーＬ（配列番号１６）とを用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株ゲノムを鋳型としてＰＣＲ法により取得した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で単離、精製した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにてリン酸化を行った。ｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡ−ｓＣＦプラスミドを、制限酵素ＰｓｈＡＩで消化後、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化を行い、アガロースゲル電気泳動により単離、精製した。このようにして調製したｐＵＣ−ｅｎｏＡ１４２−ＴａｇｄＡ−ｓＣＦプラスミドと、ｓＣマーカーの後半領域（ｓＣ−Ｌ）とをライゲーションした。得られたプラスミドにおけるｓＣマーカーの後半領域（ｓＣ−Ｌ）の挿入方向を確認し、ｐＳＥＮｓｅｌｆプラスミドを得た。

（２．ｐＳＥＮｓｅｌｆ−ａｇｄＡプラスミドの作製）
ｐＳＥＮｓｅｌｆプラスミドを、制限酵素ＳａｌＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により単離、精製した。その後、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化を行い、実施例１で調製したα−グルコシダーゼ遺伝子とライゲーションを行った。得られたプラスミドにおけるα−グルコシダーゼ遺伝子の挿入方向を確認し、ｐＳＥＮｓｅｌｆ−ａｇｄＡプラスミドを得た。

（３．形質転換用遺伝子断片の調製）
ｐＳＥＮｓｅｌｆ−ａｇｄＡプラスミドを保持した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地１００ｍｌにて３７℃、一晩培養し、遠心操作で菌体を集めた。市販のプラスミド抽出キット（キアゲン社製ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を用いてこの菌体よりプラスミドを抽出した。次にこのプラスミド約１００μｇを制限酵素ＳｗａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で約８．６ｋｂｐの、分断されたｓＣマーカーとα−グルコシダーゼ発現カセットからなる形質転換用遺伝子断片を単離、精製した。

（４．形質転換体の取得とα−グルコシダーゼ発現量の確認）
上述のように取得した形質転換用遺伝子断片２０μｇを用いて、プロトプラスト−ＰＥＧ法によりアスペルギルス・オリゼＮＳ４株を形質転換し、５株の形質転換体を得た。これら形質転換体をデキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）で３０℃、３日間振とう培養し、その後、培養液と菌体を分離した。培養液のうち４００μｌを分画分子量１０，０００のウルトラフリー（ミリポア社製）にて濃縮し、培養液２００μｌ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図８に示す。図８は、実施例２において得られた形質転換体がα−グルコシダーゼを発現していることを示す図である。図８に示すように、５株の形質転換体は全てα−グルコシダーゼを発現していた。

（５．形質転換体のサザンブロット解析）
上述の形質転換体のうち２株を選び、定法によりゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡをＳｍａＩ消化し、ｓＣ及びｐＵＣ１１８をプローブとしてサザンブロット解析を行った。

結果を図９に示す。図９は、実施例２において得られた形質転換体の染色体上にα−グルコシダーゼ発現カセットが組み込まれていることを示す図である。図９の（ａ）はｓＣをプローブとした場合、（ｂ）はｐＵＣ１１８をプローブとした場合の結果を表している。図９に示すように、ｓＣをプローブとした場合には、いずれの株も、ｓＣ遺伝子座に相同的に２コピー以上挿入されたことを示す、９．７ｋｂｐ、８．６ｋｂｐ及び４．５ｋｂｐの３本のバンドが検出された。ｐＵＣ１１８をプローブとした場合には、いずれの株も、いかなるバンドも検出されなかった。この結果から、形質転換体のいずれの株にも、大腸菌由来のプラスミド断片はゲノムに挿入されておらず、形質転換体はいずれもセルフクローニング株であることが確認できた。
〔実施例３：アスペルギルス・ニガー由来ｎｉａＤマーカーを用いたβ−グルコシダーゼ生産アスペルギルス・ニガーセルフクローニング株の作製〕
（１．ｒｅｇｉｏｎIII １２タンデムリピートの作製）
アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼ遺伝子の上流−５５８〜−５０３ｂｐ（「ｒｅｇｉｏｎIII」という）を、プライマーＭ（配列番号１７）およびプライマーＮ（配列番号１８）を用いて、アスペルギルス・ニガーＩＦＯ４３４３株のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得した。プライマーＭおよびＮによって増幅を行うと、ＰＣＲ産物にそれぞれＳｍａＩ切断部位、ＥｃｏＲＶ切断部位が含まれるようになる。

このＰＣＲ産物をＳｍａＩ処理したｐＵＣ１１８に導入し、「ｒｅｇｉｏｎ III１個導入プラスミド」を構築した。次いで、前述のＰＣＲ産物をＳｍａＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ＥｃｏＲＶ処理および脱リン酸化したｒｅｇｉｏｎIII１個導入プラスミドに導入して、ｒｅｇｉｏｎIIIが同方向に２個並んだ「ｒｅｇｉｏｎIII２個導入プラスミド」を構築した。次いで、ｒｅｇｉｏｎIII２個導入プラスミドをＳｍａＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ｒｅｇｉｏｎIIIが２個含まれる断片を取り出し、ＥｃｏＲＶ処理および脱リン酸化したｒｅｇｉｏｎIII２個導入プラスミドに導入、ｒｅｇｉｏｎIIIが同方向に４個並んだ「ｒｅｇｉｏｎIII４個導入プラスミド」を構築した。以後、上記操作を繰り返すことにより、ｒｅｇｉｏｎIIIが同方向に８個並んだプラスミド、およびｒｅｇｉｏｎIIIが同方向に１２個並んだプラスミドを作製した。これらプラスミドをＳｍａＩおよびＥｃｏＲＶで処理すると、外来の配列を全く含まずに任意の個数からなるｒｅｇｉｏｎIII断片を取得することができる。

プロモーター領域としてアスペルギルス・ニガーのエノラーゼ遺伝子の上流−９９７〜−１ｂｐ（「ＰｅｎｏＡ」という）を、プライマーＯ（配列番号１９）およびプライマーＰ（配列番号２０）を用いて、アスペルギルス・ニガーＩＦＯ４３４３株のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得した。このＰＣＲ産物をＳｍａＩ処理したｐＵＣ１１８に導入し、「ｐＵＣ−ＰｅｎｏＡ」を構築した（図１１）。次いで、ｐＵＣ−ＰｅｎｏＡをＳｍａＩで消化し、ＳｍａＩ部位に上述したｒｅｇｉｏｎIIIが同方向に１２個並んだ断片を導入して「ｐＵＣ−ＰｅｎｏＡ１２」を構築した（図１１）。このＰｅｎｏＡのＳｍａＩ部位にｒｅｇｉｏｎIIIが同方向に１２個並んだプロモーター断片を「ＰｅｎｏＡ１２」と称する。

（２．ｐＡＮＮＥＮｓｅｌｆプラスミドの作製）
ｐＵＣ１１８プラスミドをＸｍａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した後、プラスミド断片の精製を行った。この断片に以下に示す２つのインサートを導入した。

ターミネーター領域の調製：ターミネーター領域としてアスペルギルス・ニガーのカタラーゼＲ遺伝子の下流７〜７６７塩基からなる断片（ＴｃａｔＲフラグメント）を、プライマーＱ（配列番号２１）およびプライマーＲ（配列番号２２）を用いて、アスペルギルス・ニガーＩＦＯ４３４３株のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ産物を精製後、ＸｍａＩおよびＰｍｌＩで消化を行った。

ｎｉａＤマーカー前半（ｎｉａＤ−Ｌ）の調製：アスペルギルス・ニガー由来ｎｉａＤマーカーの６番イントロン中間部から５’非翻訳領域及びプロモーター部分を含む前半領域（ｎｉａＤ−Ｌ）を、断片となるようにプライマーＳ（配列番号２３）およびプライマーＴ（配列番号２４）を用いてアスペルギルス・ニガーＩＦＯ４３４３株ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ産物を精製後、ＰｍｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化を行った。

上記のようにして調製したｐＵＣ１１８断片、ターミネーター断片、ｎｉａＤマーカー前半断片をライゲーションし、プラスミド１（５６４８ｂｐ）を得た（図１１）。

次いで、プラスミド１をＸｍａＩおよびＢｍｔＩで消化した後、プラスミド断片の精製を行った。この断片に以下に示す２つのインサートを導入した。

プロモーター領域の調製：プロモーター領域を取得するため、プライマーＵ（配列番号２５）およびプライマーＶ（配列番号２６）を用いて、前述したＰｅｎｏＡ１２を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ精製後、ＮｏｔＩおよびＢｍｔＩで消化を行った。なお、このＰＣＲ断片は、ＰｅｎｏＡの３’末端側の１０塩基が欠失している。

ｎｉａＤマーカー後半の調製（ｎｉａＤ−Ｆ)：次いで、アスペルギルス・ニガー由来ｎｉａＤマーカーの６番イントロン中間部から３’非翻訳領域及びターミネーター部分を含む後半領域（ｎｉａＤ−Ｆ）を、断片となるようにプライマーＷ（配列番号２７）およびプライマーＸ（配列番号２８）を用いて、アスペルギルス・ニガーＩＦＯ４３４３株ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ産物を精製後、ＰｍｌＩおよびＨｉｎｄIIIで消化を行った。

調製したプラスミド１断片、プロモーター断片、およびｎｉａＤマーカー後半断片（ｎｉａＤ−Ｆ）をライゲーションし、プラスミドｐＡＮＮｓｅｌｆを得た（図１１）。

（３．β−グルコシダーゼ遺伝子の導入）
アスペルギルス・ニガー由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子（配列番号３１）を、プライマーＹ（配列番号２９）およびプライマーＺ（配列番号３０）を用いて、アスペルギルス・ニガーＩＦＯ４３４３株ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により取得した。なお、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてＢｍｔＩ処理したｐＡＮＮｓｅｌｆに導入するために、プライマーＹおよびＺにはＢｍｔＩ処理したｐＡＮＮｓｅｌｆの末端配列１５塩基の相同な領域を付加した。さらに、β−グルコシダーゼ遺伝子の５‘側にＰｅｎｏＡの欠失した１０塩基が付加され、かつ３’側にカタラーゼＲ遺伝子の下流側で欠失した６塩基が付加されるように、プライマーＹおよびＺは設計された。次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応にてｐＡＮＮｓｅｌｆにβ−グルコシダーゼ遺伝子を導入し、ｐＡＮＮｓｅｌｆ−ＢＧＬ１（図１２）を得た。

（４．形質転換用断片の作製）
ｐＡＮＮｓｅｌｆ−ＢＧＬ１プラスミドを保持した大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地１００ｍｌにて３７℃、一晩培養した。培養後、遠心操作で菌体を集めた。市販のプラスミド抽出キット（キアゲン社製ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）を用いてこの菌体よりｐＡＮＮｓｅｌｆ−ＢＧＬ１プラスミドを抽出した。次にこのプラスミド約１００μｇを制限酵素ＳｗａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で約９．６ｋｂｐの、分断されたｎｉａＤマーカーとβ−グルコシダーゼ発現カセットとからなる形質転換用遺伝子断片を単離し、精製した。

（５．形質転換体の取得とβ−グルコシダーゼ発現量の確認）
上述のように取得した形質転換用遺伝子断片２０μｇを用いて、プロトプラスト−ＰＥＧ法によりアスペルギルス・ニガーＮＳ４８株（ＩＦＯ４３４３株の硝酸還元酵素およびＡＴＰスルフリラーゼ欠損株（Gene, 84, 329-334, 1989））を形質転換し、６株の形質転換体を得た。これら形質転換体をデキストリン・ペプトン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）で３０℃、５日間振とう培養し、その後、培養液と菌体を分離した。

培養液のうち５μｌ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１３に示す。図１３は、実施例３において得られた形質転換体がβ−グルコシダーゼを発現していることを示す図である。図１３に示すように、６株の形質転換体は全てβ−グルコシダーゼを発現していた。

また、培養液中のβ−グルコシダーゼ活性を、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質として測定したところ、形質転換体のβ−グルコシダーゼ活性は４０２．５Ｕ／ｍｌであり、親株である宿主（アスペルギルス・ニガーＮＳ４８株）のβ−グルコシダーゼ活性１．４Ｕ／ｍｌより２５０倍以上高かった。

（６．形質転換体のサザンブロット解析）
上述の形質転換体のうち１株を選び、定法によりゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを、ｐＵＣ１１８を切断しない酵素であるＮｈｅＩを用いて消化し、ｎｉａＤ及びｐＵＣ１１８をプローブとしてサザンブロット解析を行った。

結果を図１４に示す。図１４は、実施例３において得られた形質転換体の染色体上にβ−グルコシダーゼ発現カセットが組み込まれていることを示す図である。図１４の（ａ）はｎｉａＤをプローブとした場合、（ｂ）はｐＵＣ１１８をプローブとした場合の結果を表している。図１４に示すように、ｎｉａＤをプローブとした場合には、いずれの株も、ｎｉａＤ遺伝子座に相同的に１コピー挿入されたことを示す、７．３ｋｂｐ及び１４．０ｋｂｐの２本のバンドが検出された。ｐＵＣ１１８をプローブとした場合には、いかなるバンドも検出されなかった。この結果から、形質転換体のゲノムに大腸菌由来のプラスミド断片は挿入されておらず、形質転換体はセルフクローニング株であることが確認できた。

本発明によれば、大腸菌由来のプラスミド断片が染色体内に挿入されていない形質転換体を容易に且つ効率よく取得することができる。また、糸状菌のセルフクローニング株を容易に且つ効率よく取得することができる。従って、本発明は、糸状菌を用いてタンパク質を産生させる、医薬、検査薬、食品等の産業において利用することができる。

Claims (5)

1. 糸状菌を形質転換するためのプラスミドであって、
   形質転換に用いられる形質転換用遺伝子断片と、形質転換に用いられずに除去される大腸菌由来のプラスミド断片とを含み、
   上記形質転換用遺伝子断片は、糸状菌由来ポリヌクレオチドと、目的遺伝子発現カセットとを含み、
   上記糸状菌由来ポリヌクレオチドは、糸状菌由来マーカー遺伝子であり、
   上記大腸菌由来のプラスミド断片は、分断された上記糸状菌由来マーカー遺伝子の２つの断片に挟まれるように、かつ上記糸状菌由来マーカー遺伝子のヌクレオチドの順序を変えることなく挿入されるように連結されていることを特徴とする形質転換用プラスミド。
2. 上記形質転換用遺伝子断片は、同一生物種由来のポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載の形質転換用プラスミド。
3. 上記糸状菌由来マーカー遺伝子の一方の末端をａ、他方の末端をｃとし、大腸菌由来のプラスミド断片が連結される位置をｂとし、糸状菌由来マーカー遺伝子におけるヌクレオチドの順序がａ、ｂ、ｃであるとすると、
   糸状菌由来マーカー遺伝子のヌクレオチドの順序を変えることなく、ｂの位置に大腸菌由来のプラスミド断片が挿入されるように連結されており、かつ上記目的遺伝子発現カセットは、糸状菌由来マーカー遺伝子の末端ａおよび末端ｃと連結されていることを特徴とする請求項１または２に記載の形質転換用プラスミド。
4. 上記糸状菌由来マーカー遺伝子と上記大腸菌由来のプラスミド断片とが制限酵素認識配列によって連結されており、上記糸状菌由来マーカー遺伝子と上記大腸菌由来のプラスミド断片との２箇所の連結部が同一の制限酵素認識配列であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の形質転換用プラスミド。
5. 請求項１から４のいずれか１項に記載の形質転換用プラスミドから上記大腸菌由来のプラスミド断片を除去し、上記形質転換用遺伝子断片を取得する工程（Ａ）と、
   上記工程（Ａ）で得られた形質転換用遺伝子断片を、宿主糸状菌に導入する工程（Ｂ）とを含むことを特徴とする糸状菌の形質転換方法。