JP5762225B2 - Analysis method using silver shell gold nanorods - Google Patents
Analysis method using silver shell gold nanorods Download PDFInfo
- Publication number
- JP5762225B2 JP5762225B2 JP2011196528A JP2011196528A JP5762225B2 JP 5762225 B2 JP5762225 B2 JP 5762225B2 JP 2011196528 A JP2011196528 A JP 2011196528A JP 2011196528 A JP2011196528 A JP 2011196528A JP 5762225 B2 JP5762225 B2 JP 5762225B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- silver
- silver shell
- substrate
- hydrogen peroxide
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
本発明は、銀シェル金ナノロッドを用いる分析方法に関する。本発明の分析方法は、ELISA分析方法に適用することができる。本発明は、医療、飲食品、及びライフサイエンスの分野で有用である。 The present invention relates to an analysis method using silver shell gold nanorods. The analysis method of the present invention can be applied to an ELISA analysis method. The present invention is useful in the fields of medicine, food and drink, and life science.
金ナノロッドは、棒状の金ナノ粒子であり、長軸方向に由来する800〜900 nm 付近（近赤外域）の光を吸収し、吸収した光を熱に変換する性質を有する。近赤外光は組織透過性が高いため、金ナノロッドはバイオイメージングのような医療技術を支える材料として期待されている（特許文献1）。 Gold nanorods are rod-shaped gold nanoparticles and have the property of absorbing light in the vicinity of 800 to 900 nm (near infrared region) derived from the long axis direction and converting the absorbed light into heat. Since near-infrared light has high tissue permeability, gold nanorods are expected as materials that support medical technologies such as bioimaging (Patent Document 1).
一方コア-シェル構造を有する金属ナノ材料が知られている。この材料は、コアの形状を制御できることに加えてシェルの生成プロセスを制御することにより、より多様なサイズ・形状の金属ナノ材料を均一に作製し、幅広い分光特性を実現することが可能である。このような金属ナノ材料として、例えば、球状の金ナノ粒子からなるコアと銀からなるシェルとを有する金属ナノ材料(非特許文献1〜9)、金ナノロッドからなるコアと銀からなるシェルとを有する金属ナノ材料(非特許文献10〜17)等が報告されている。最近、本発明者らは、銀シェル生成速度を著しく向上させ、均一なシェルを付与するための新たな銀シェル金ナノロッドの製造方法について報告した（特許文献2、及び非特許文献18）。 On the other hand, metal nanomaterials having a core-shell structure are known. In addition to being able to control the shape of the core, this material can uniformly produce metal nanomaterials of various sizes and shapes, and achieve a wide range of spectral characteristics by controlling the shell generation process. . Examples of such metal nanomaterials include metal nanomaterials having a core made of spherical gold nanoparticles and a shell made of silver (Non-Patent Documents 1 to 9), a core made of gold nanorods, and a shell made of silver. Metal nanomaterials (Non-Patent Documents 10 to 17) and the like have been reported. Recently, the present inventors have reported a new method for producing silver shell gold nanorods for significantly improving the silver shell formation rate and imparting a uniform shell (Patent Document 2 and Non-Patent Document 18).
一方、金ナノ粒子は、抗体を標識するためにも用いられ、細胞内動態解析、免疫診断のためのイムノクロマト法に利用されている。イムノクロマト法においては、テストストリップ上のテストラインと言われる部分に測定対象と金ナノ粒子で標識された抗体が集積することによって金ナノ粒子が発色し、測定対象を検出する。イムノクロマト法は、現在、インフルエンザや妊娠の迅速診断キットとして利用されているが、この方法は、一般に感度が悪く、測定できる対象が限られる。 On the other hand, gold nanoparticles are also used for labeling antibodies, and are used in immunochromatography for intracellular kinetic analysis and immunodiagnosis. In the immunochromatography method, gold nanoparticles are colored by collecting the measurement target and the antibody labeled with the gold nanoparticles in a portion called a test line on the test strip, and the measurement target is detected. The immunochromatography method is currently used as a rapid diagnostic kit for influenza and pregnancy, but this method is generally insensitive and the objects that can be measured are limited.
ウェスタンブロッティング法やELISA法など、高感度な免疫定量を必要とする場合には、蛍光や化学発光を検出のために利用することが多い。蛍光は退色や消光によって定量性が損なわれることがあり、また化学発光によれば極めて高感度な検出が可能ではあるものの、発光強度の時間依存性が大きく、定量性が蛍光法よりも劣る。そのため、蛍光／化学発光法に劣らない高い感度と、再現性・定量性を示す、簡便な検出手段の開発が望まれている。 When sensitive immunoassay is required, such as Western blotting and ELISA, fluorescence and chemiluminescence are often used for detection. Fluorescence may lose its quantitativeness due to fading or quenching, and chemiluminescence can be detected with extremely high sensitivity, but the emission intensity is time-dependent and the quantitativeness is inferior to that of the fluorescence method. Therefore, it is desired to develop a simple detection means that exhibits high sensitivity that is not inferior to fluorescence / chemiluminescence methods, and exhibits reproducibility and quantitativeness.
本発明者らは、金ナノ粒子、及び金ナノロッドを用いた分析方法の開発を試みてきた。銀は、溶液中ではどちらかというと不安定な金属であり、酸化剤によって比較的容易に溶解する。そして、銀シェル金ナノロッドの銀シェルを溶解させると、銀シェルに特徴的な表面プラズモンバンドは失われ、近赤外域に金ナノロッドに由来する表面プラズモンバンドが観察されるようになる。そこで本発明者らは、銀シェル金ナノロッドが1011オーダーのモル吸光係数を有するのに対して、金ナノロッドのモル吸光係数は1010オーダーであるという吸収強度の大きな差に着目した。銀シェルの溶解は消失スペクトルの変化として定量可能である。吸光度の測定は安価な装置で再現性良く行えるため、現在一般的に用いられている発色試薬や化学発光を利用した検出法に代替する新しい抗体定量法として期待される。下に、本発明の概念図を示す。 The present inventors have attempted to develop an analysis method using gold nanoparticles and gold nanorods. Silver is a rather unstable metal in solution and dissolves relatively easily with an oxidizing agent. When the silver shell of the silver shell gold nanorod is dissolved, the surface plasmon band characteristic of the silver shell is lost, and the surface plasmon band derived from the gold nanorod is observed in the near infrared region. Therefore, the present inventors paid attention to the large difference in absorption intensity that the silver shell gold nanorods have a molar extinction coefficient on the order of 10 11 , whereas the molar extinction coefficient of the gold nanorods is on the order of 10 10 . The dissolution of the silver shell can be quantified as a change in the disappearance spectrum. Absorbance can be measured with an inexpensive device with good reproducibility, and is expected as a new antibody quantification method that can be used in place of detection methods using currently used chromogenic reagents and chemiluminescence. A conceptual diagram of the present invention is shown below.
本発明者らは、グルコースオキシダーゼ（GOD）酵素反応で発生する過酸化水素で、銀シェルを溶解させ、銀シェル金ナノロッドと金ナノロッドとの分光特性の差異を評価してみた。その結果、銀シェルの表面プラズモンバンドの消失係数は非常に大きく、検出に用いるとすると、蛍光法に匹敵する高い検出感度が実現できることを見出した。また、過酸化水素を分解する酵素、ペルオキシダーゼを基板表面に固定し、このペルオキシダーゼよって溶液中に添加した過酸化水素を分解し、銀シェルの溶解を抑制することに成功した。そして基板に固定した銀シェルが溶解しないことによって、銀シェル金ナノロッドに特異な表面プラズモンバンドが維持され、これを検出に用いるとすると、蛍光法に匹敵する高い検出感度が実現できることも見いだし、本発明を完成した。 The inventors of the present invention evaluated the difference in spectral characteristics between silver shell gold nanorods and gold nanorods by dissolving the silver shell with hydrogen peroxide generated by the glucose oxidase (GOD) enzyme reaction. As a result, it was found that the extinction coefficient of the surface plasmon band of the silver shell is very large, and that when used for detection, a high detection sensitivity comparable to the fluorescence method can be realized. In addition, an enzyme that decomposes hydrogen peroxide, peroxidase, was immobilized on the surface of the substrate, and the hydrogen peroxide added to the solution was decomposed by this peroxidase, thereby succeeding in suppressing dissolution of the silver shell. And since the surface shell plasmon band peculiar to silver shell gold nanorods is maintained because the silver shell fixed to the substrate does not dissolve, when this is used for detection, it has been found that high detection sensitivity comparable to the fluorescence method can be realized. Completed the invention.
本発明は、以下を提供する：
[1] 銀からなるシェルと金ナノロッドからなるコアとを有する、銀シェル金ナノロッド、及び 銀溶解性物質を用い；対象物質の存在又は量に相関して、銀溶解性物質を発生させ又は銀溶解性物質を消失させ、そして銀シェルの溶解に関連する粒子の分光特性の変化の有無又は程度を指標に、対象物質の存在及び／又は量を検出する工程を含む、物質の検出方法。
［2］ 銀溶解性物質が、過酸化水素、酸素、アンモニア、アミン化合物、又はシアン化合物である、[1]に記載の方法。
［3］ 対象物質の存在又は量に相関して銀溶解性物質を発生させる工程を含み、銀溶解性物質が過酸化水素であり、過酸化水素の発生が、グルコースオキシダーゼによるものである、[1]又は[2]に記載の方法。
［4］ 対象物質の存在又は量に相関して銀溶解性物質を消失させる工程を含み、銀溶解性物質が過酸化水素であり、過酸化水素の消失がペルオキシダーゼ又はカタラーゼによるものである、[1]又は[2]に記載の方法。
［5］ 銀シェル金ナノロッドが、基板に固定されている、[1]〜[4]のいずれか一に記載の方法。
［6］ 指標とする分光特性の変化の有無又は程度が、500〜700 nmに見られるプラズモンピークのいずれか、500〜700nmから選択されるいずれかの波長における吸光度、850〜950 nmに見られるプラズモンピークのいずれか、又は850〜950 nmから選択される何れかの波長における吸光度に係るものである、[1]〜[5]のいずれか一に記載の方法。
［7］ 銀シェル金ナノロッドが、直径15〜40 nm、長さ60〜80 nmである、[1]〜[6]のいずれか一に記載の方法。
［8］ 金ナノロッドが、直径5〜20 nm、長さ20〜100 nmである、[7]に記載の方法。
［9］ 金ナノロッドからなるコアと銀からなるシェルとを有する、銀シェル金ナノロッドが固定された、酵素結合免疫吸着アッセイ (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 法用基板。
The present invention provides the following:
[1] Using a silver shell gold nanorod having a silver shell and a gold nanorod core, and a silver soluble substance; generating a silver soluble substance or silver depending on the presence or amount of the target substance A method for detecting a substance, the method comprising the step of detecting the presence and / or amount of a target substance by using the presence or absence or degree of change in the spectral characteristics of particles related to dissolution of a silver shell as an index.
[2] The method according to [1], wherein the silver-soluble substance is hydrogen peroxide, oxygen, ammonia, an amine compound, or a cyanide compound.
[3] including a step of generating a silver-soluble substance in correlation with the presence or amount of the target substance, wherein the silver-soluble substance is hydrogen peroxide, and the generation of hydrogen peroxide is due to glucose oxidase, [ The method according to [1] or [2].
[4] including a step of eliminating the silver-soluble substance in correlation with the presence or amount of the target substance, wherein the silver-soluble substance is hydrogen peroxide, and the disappearance of hydrogen peroxide is caused by peroxidase or catalase. The method according to [1] or [2].
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the silver shell gold nanorods are fixed to a substrate.
[6] The presence / absence or degree of change in spectral characteristics as an index is observed at 850-950 nm, at any wavelength selected from 500-700 nm, at any of the plasmon peaks observed at 500-700 nm. The method according to any one of [1] to [5], which relates to absorbance at any wavelength selected from any of the plasmon peaks or from 850 to 950 nm.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the silver shell gold nanorod has a diameter of 15 to 40 nm and a length of 60 to 80 nm.
[8] The method according to [7], wherein the gold nanorod has a diameter of 5 to 20 nm and a length of 20 to 100 nm.
[9] A substrate for an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, having a core made of gold nanorods and a shell made of silver, to which silver-shell gold nanorods are fixed.
本発明の特定の態様においては、10-16 molの抗原を、約17分の酵素反応で0.1の吸光係数変化として検出することが期待できる。 In a particular embodiment of the present invention, 10 -16 mol of antigen can be expected to be detected as an extinction coefficient change of 0.1 in an enzyme reaction of about 17 minutes.
金ナノロッドの形状を直径10 nm長さ50 nmと仮定すると、これを1 nmの銀シェルで覆う場合には105個の銀原子が必要である（下図）。1 mol の過酸化水素は10-5 molの銀シェル金ナノロッドの銀シェルを溶解できる。銀シェル金ナノロッドのプラズモンピークは400〜800 nmの間に存在し、銀シェル金ナノロッドの粒子あたりの消失係数は1011〜1012 M-1cm-1と非常に大きい。金ナノロッドのプラズモンピークは900 nm付近で1010程度である。したがって、銀シェルの溶解は400〜800 nmのプラズモンピークの消失として観察される。すなわち、1 Mの過酸化水素は銀シェル金ナノロッド分散液の消失係数を106-107 M-1 cm-1減少させることができる。これはポルフィリンの全吸光係数に匹敵する大きさである。たとえば、5 mm × 5 mmのガラス表面に吸光度0.1 になるように銀シェル金ナノロッドを固定すると、必要な銀シェル金ナノロッドは2.5 × 10-16 molである。銀シェル金ナノロッド1個に1つの抗原が固定化されたとして、105個の銀原子からなる銀シェルを全て溶解できる過酸化水素を得るには、GODが105回Turn Overする必要がある。GODのTurn Over Frequencyを100と仮定すると、銀シェルの溶解に必要な時間は1000秒=16.7分である。 Assuming that the shape of the gold nanorod is 10 nm in diameter and 50 nm in length, if it is covered with a 1 nm silver shell, 10 5 silver atoms are required (see below). 1 mol hydrogen peroxide can dissolve the silver shell of 10 -5 mol silver shell gold nanorods. The plasmon peak of the silver shell gold nanorods exists between 400 and 800 nm, and the extinction coefficient per particle of the silver shell gold nanorods is as large as 10 11 to 10 12 M −1 cm −1 . The plasmon peak of gold nanorods is about 10 10 around 900 nm. Thus, dissolution of the silver shell is observed as the disappearance of the 400-800 nm plasmon peak. That is, 1 M hydrogen peroxide can reduce the disappearance coefficient of the silver shell gold nanorod dispersion by 10 6 -10 7 M −1 cm −1 . This is comparable to the total extinction coefficient of porphyrin. For example, when a silver shell gold nanorod is fixed to a glass surface of 5 mm × 5 mm so as to have an absorbance of 0.1, the required silver shell gold nanorod is 2.5 × 10 −16 mol. Assuming that one antigen is immobilized on one silver shell gold nanorod, in order to obtain hydrogen peroxide that can dissolve all silver shells consisting of 10 5 silver atoms, the GOD must be turned over 10 5 times. . Assuming that the GOD Turn Over Frequency is 100, the time required for dissolution of the silver shell is 1000 seconds = 16.7 minutes.
1サイクル毎に過酸化水素水を含む溶液に基板を20秒浸漬した。(a)HRPあり、フェノールあり (b)HRPなし、フェノールあり (c)HRPあり、フェノールなし
本発明は、銀からなるシェルと金ナノロッドからなるコアとを有する、銀シェル金ナノロッド、及び銀溶解性物質を用い；対象物質の存在又は量に相関して、銀溶解性物質を発生させ又は銀溶解性物質を消失させ、そして銀シェルの溶解に関連する粒子の分光特性の変化の有無又は程度を指標に、対象物質の存在及び／又は量を検出する工程を含む、物質の検出方法を提供する。以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention uses a silver shell gold nanorod having a shell made of silver and a core made of gold nanorod, and a silver-soluble substance; generating a silver-soluble substance in correlation with the presence or amount of the target substance or Disclosed is a method for detecting a substance, the method comprising the step of detecting the presence and / or amount of a target substance by using the presence or absence or degree of change in spectral characteristics of particles related to dissolution of a silver shell as an index, eliminating the silver-soluble substance. provide. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明において「金ナノロッド」というときは、特に記載した場合を除き、金のナノサイズの粒子であって、そのアスペクト比（短軸方向の長さに対する長軸方向の長さの比）が1よりも大きい棒状の粒子をいう。本発明において使用される金ナノロッドは、長軸方向の長さが、20nm〜300nmであり、分散安定性や形状均一性の観点から、好ましくは20nm〜190nm、より好ましくは20nm〜80nmであり、短軸方向の長さが、3nm〜20nmであり、分散安定性や形状均一性の観点から、好ましくは4nm〜200nm、より好ましくは5nm〜20nmである。典型的な例は、長軸方向の長さが50nmであり、短軸方向の長さが10nmのものである。 In the present invention, the term “gold nanorod” refers to gold nano-sized particles, unless otherwise specified, and the aspect ratio (ratio of the length in the major axis direction to the length in the minor axis direction) is 1. Larger rod-like particles. The gold nanorod used in the present invention has a length in the major axis direction of 20 nm to 300 nm, and preferably 20 nm to 190 nm, more preferably 20 nm to 80 nm, from the viewpoint of dispersion stability and shape uniformity. The length in the minor axis direction is 3 nm to 20 nm, and preferably 4 nm to 200 nm, more preferably 5 nm to 20 nm, from the viewpoint of dispersion stability and shape uniformity. A typical example is one having a major axis length of 50 nm and a minor axis length of 10 nm.
本発明においては、金ナノロッドとして、市販品を用いることもできる。また、公知の方法（例えば、特開2004-292627、特開2005-97718、特開2006-169544、特開2006-118036）に従って合成することもできる。 In the present invention, a commercially available product can be used as the gold nanorod. Moreover, it can also synthesize | combine according to a well-known method (For example, Unexamined-Japanese-Patent No. 2004-292627, Unexamined-Japanese-Patent No. 2005-97718, Unexamined-Japanese-Patent No. 2006-169544, Unexamined-Japanese-Patent No. 2006-118036).
典型的には、に金ナノロッドは、例えば、カチオン性界面活性剤として第4級アンモニウム塩であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）を含有する水溶液中、金イオン（金イオン源として、例えば、塩化金酸などのハロゲン化金酸を用いる）を化学還元、電気還元、光還元などによって還元することにより、合成することが可能である。合成した金ナノロッドは、CTABの保護作用により、水中で安定に分散させることができる。 Typically, gold nanorods are used, for example, in a water solution containing hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), which is a quaternary ammonium salt as a cationic surfactant, as a gold ion (for example, chloride as a source of gold ions). It is possible to synthesize it by reducing (using a halogenated gold acid such as gold acid) by chemical reduction, electroreduction, photoreduction or the like. The synthesized gold nanorods can be stably dispersed in water by the protective action of CTAB.
本発明において使用される、銀シェル構造を有する、銀シェル金ナノロッドとしては、長軸方向の長さが、40nm〜320nmであり、分散安定性や形状均一性の観点から、好ましくは40nm〜160nm、より好ましくは40nm〜80nmであり、短軸方向の長さが、3nm〜20nmであり、分散安定性や形状均一性の観点から、好ましくは4nm〜200nm、より好ましくは15nm〜40nmである。典型的な例は、長軸方向の長さが60nmであり、短軸方向の長さが30nmのものである。 The silver shell gold nanorod having a silver shell structure used in the present invention has a major axis length of 40 nm to 320 nm, and preferably 40 nm to 160 nm from the viewpoint of dispersion stability and shape uniformity. More preferably, it is 40 nm to 80 nm, the length in the minor axis direction is 3 nm to 20 nm, and from the viewpoint of dispersion stability and shape uniformity, it is preferably 4 nm to 200 nm, more preferably 15 nm to 40 nm. A typical example is one having a length in the major axis direction of 60 nm and a length in the minor axis direction of 30 nm.
本発明に用いる銀シェル金ナノロッドは、典型的には、無機銀塩および塩化物イオンを含有する金ナノロッドの水分散液中で、還元剤を用いて銀イオンを還元することにより、製造することができる。より詳細には、塩化物イオンを含有する金ナノロッドの水分散液に、還元剤を添加し、次いで塩化物イオンを含有する水溶液中に分散させた無機銀塩を添加することによる。このような製造方法のためには、前掲特許文献2を参照することができる。このような還元工程によって、銀からなるシェルを、コアとなる金ナノロッドの表面全体を覆って制御性よく形成することができる。形成されるシェルの厚さは、金ナノロッドの水分散液中の銀イオン濃度、金ナノロッドのアスペクト比、還元を行う温度等にも依存するが、通常、長軸方向において1nm〜50nm、短軸方向において1nm〜100nmである。還元工程を経た水分散液は、遠心分離やゲルろ過等の後処理に供することにより、未反応ナノロッドと銀のみからなる副生成物を分離し、目的のコア−シェル構造のもののみを単離することができる。 Silver shell gold nanorods used in the present invention are typically produced by reducing silver ions using a reducing agent in an aqueous dispersion of gold nanorods containing inorganic silver salt and chloride ions. Can do. More specifically, by adding a reducing agent to an aqueous dispersion of gold nanorods containing chloride ions, and then adding an inorganic silver salt dispersed in an aqueous solution containing chloride ions. For such a manufacturing method, the aforementioned Patent Document 2 can be referred to. By such a reduction process, the shell made of silver can be formed with good controllability covering the entire surface of the gold nanorod as the core. The thickness of the shell to be formed depends on the silver ion concentration in the gold nanorod aqueous dispersion, the aspect ratio of the gold nanorod, the temperature at which the reduction is performed, etc., but usually 1 nm to 50 nm in the major axis direction, the minor axis 1 nm to 100 nm in the direction. The aqueous dispersion that has undergone the reduction process is subjected to post-treatment such as centrifugation and gel filtration, thereby separating by-products consisting only of unreacted nanorods and silver, and isolating only the target core-shell structure. can do.
本発明においては、銀溶解性物質が使用される。銀溶解性物質とは、銀シェル金ナノロッドの銀シェル部分を溶解することができる物質をいう。銀シェルは、酸化力を有する物質によって比較的容易に溶解する。 In the present invention, a silver-soluble substance is used. The silver-soluble substance refers to a substance that can dissolve the silver shell portion of the silver shell gold nanorods. The silver shell is relatively easily dissolved by a substance having an oxidizing power.
銀溶解性物質は、過酸化水素、各種酸素、アンモニア、アミン化合物、又はシアン化合物のいずれかであり得る。本発明の一態様においては、銀溶解性物質として、過酸化水素が好適に使用される。銀溶解性物質の本発明の分析系における終濃度は、典型的には、40〜2000μMであり、好ましくは100〜1000μMとすることができる。 The silver-soluble substance can be any of hydrogen peroxide, various oxygens, ammonia, an amine compound, or a cyanide compound. In one embodiment of the present invention, hydrogen peroxide is preferably used as the silver-soluble substance. The final concentration of the silver-soluble substance in the analysis system of the present invention is typically 40 to 2000 μM, preferably 100 to 1000 μM.
本発明は、対象物質の存在又は量に相関して銀溶解性物質を発生させる工程を含むように構成してもよい。この場合、銀溶解性物質として過酸化水素を用いるのであれば、過酸化水素の発生のために、グルコースオキシダーゼ（GOD）を利用することができる。GODとしては、分析分野で汎用な、クロコウジカビ（Aspergillus niger）から得られたものを、本発明においても好適に用いることができる。GODはまた、抗体と結合させ、抗体を標識した形態として、本発明においても用いることができる。 The present invention may include a step of generating a silver-soluble substance in correlation with the presence or amount of the target substance. In this case, if hydrogen peroxide is used as the silver-soluble substance, glucose oxidase (GOD) can be used for the generation of hydrogen peroxide. As GOD, those obtained from Aspergillus niger , which is widely used in the analysis field, can be suitably used in the present invention. GOD can also be used in the present invention as a form in which an antibody is bound and labeled.
本発明はまた、対象物質の存在又は量に相関して銀溶解性物質を消失させる工程を含むように構成してもよい。この場合、銀溶解性物質として過酸化水素を用いるのであれば、過酸化水素の消失のために、ペルオキシダーゼ又はカタラーゼを利用することができる。本発明の好ましい態様の一つにおいては、ペルオキシダーゼ、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いる。は、HRPは、ELISAなどの分析方法において、標識物質として用いられている。HRPは分子量が比較的小さく、抗体に結合させて利用でき、また基板に固定するのにも適している。HRPを用いた系として本発明を構成する場合は、過酸化水素が銀シェルを溶解する速度とHRPによる過酸化水素の分解速度に留意するとよい。当業者であれば、過酸化水素の濃度を調節すること等により、両速度を適宜バランスすることができる。 The present invention may also be configured to include a step of eliminating the silver-soluble substance in correlation with the presence or amount of the target substance. In this case, if hydrogen peroxide is used as the silver-soluble substance, peroxidase or catalase can be used for the disappearance of hydrogen peroxide. In one preferred embodiment of the present invention, peroxidase, particularly horseradish peroxidase (HRP) is used. HRP is used as a labeling substance in analytical methods such as ELISA. HRP has a relatively low molecular weight, can be used by binding to an antibody, and is also suitable for immobilization on a substrate. When the present invention is configured as a system using HRP, it is advisable to pay attention to the rate at which hydrogen peroxide dissolves the silver shell and the rate of decomposition of hydrogen peroxide by HRP. A person skilled in the art can appropriately balance both speeds by adjusting the concentration of hydrogen peroxide.
銀シェル金ナノロッドの銀シェルを溶解させると、銀シェルに特徴的な表面プラズモンバンドは失われ、近赤外域に金ナノロッドに由来する表面プラズモンバンドが観察されるようになる。すなわち銀シェルの溶解は、消失スペクトルの変化として定量可能である。 When the silver shell of the silver shell gold nanorod is dissolved, the surface plasmon band characteristic of the silver shell is lost, and the surface plasmon band derived from the gold nanorod is observed in the near infrared region. That is, the dissolution of the silver shell can be quantified as a change in the disappearance spectrum.
本発明においては、指標とする分光特性の変化の有無又は程度は、用いられる銀シェル金ナノロッドのサイズにも拠るが、本明細書の実施例で用いたサイズのものを用いる場合は、典型的には500〜700 nmに見られるプラズモンピークのいずれか、500〜700nmから選択されるいずれかの波長における吸光度、850〜950 nmに見られるプラズモンピークのいずれか、又は850〜950 nmから選択される何れかの波長における吸光度に係るものとすることができる。なお、後述するように、銀シェル金ナノロッドを基板に固定した場合、ピーク位置がずれることがある。そのような場合には、典型的には460〜660 nmに見られるプラズモンピークのいずれか、460〜660nmから選択されるいずれかの波長における吸光度、810〜910 nmに見られるプラズモンピークのいずれか、又は810〜910 nmから選択される何れかの波長における吸光度に係るものとすることができる。当業者であれば、分析に適したピーク位置を適宜決定し、本発明の分析に適用することができる。適切な波長における吸光度の測定は、安価な装置で再現性良く行える。したがって、吸光度変化を指標に分析する系とした本発明の態様は、現在一般的に用いられている発色試薬や化学発光を利用した検出法に代替する新しい定量法として期待できるものである。 In the present invention, the presence / absence or degree of change in spectral characteristics as an index depends on the size of the silver shell gold nanorod used, but when using the size of the silver shell gold nanorod used in the present specification, Selected from any of the plasmon peaks found at 500-700 nm, absorbance at any wavelength selected from 500-700 nm, any of the plasmon peaks seen at 850-950 nm, or 850-950 nm It can be related to absorbance at any wavelength. As will be described later, when the silver shell gold nanorod is fixed to the substrate, the peak position may be shifted. In such cases, typically one of the plasmon peaks found at 460-660 nm, the absorbance at any wavelength selected from 460-660 nm, any of the plasmon peaks seen at 810-910 nm Or an absorbance at any wavelength selected from 810 to 910 nm. A person skilled in the art can appropriately determine a peak position suitable for analysis and apply it to the analysis of the present invention. Absorbance measurement at an appropriate wavelength can be performed with low cost and good reproducibility. Therefore, the embodiment of the present invention, which is a system for analyzing changes in absorbance as an index, can be expected as a new quantification method that replaces a detection method using a chromogenic reagent or chemiluminescence which is generally used at present.
本発明においては、消失ピークや吸光度の変化以外に、肉眼での色の変化を観察することにより評価可能な系としても、構成することができる。 In the present invention, a system that can be evaluated by observing a color change with the naked eye in addition to a disappearance peak and a change in absorbance can also be configured.
本発明の分析方法においては、銀シェル金ナノロッドを基板に固定して用いることができる。基板の材質は、目的の分析に支障がない限り、ガラス、樹脂、金属などの種々の中から選択しうる。 In the analysis method of the present invention, silver shell gold nanorods can be fixed to a substrate and used. The material of the substrate can be selected from various materials such as glass, resin, and metal as long as there is no hindrance to the target analysis.
基板への固定方法は、各種の手段を採りうる。例えば、ガラス基板をAPTES処理し、一方銀シェル金ナノロッドをPSS修飾し、そして基板をPSS修飾銀シェル金ナノロッド含有液に一晩浸漬させることにより、銀シェル金ナノロッドを基板に固定することができる。このための詳細な条件は、本明細書の実施例の項を参照することができる。この方法で得られた銀シェル金ナノロッド固定化基板は、肉眼で緑色の着色を確認することができ、また、銀シェル金ナノロッド由来の消失スペクトルが得られるが、溶液中のピークに比べて基板に固定したもののピークは40 nm程度短波長側にシフトしうる。これは銀シェル金ナノロッドの表面が、近傍の屈折率が変化するためである。 Various methods can be used for fixing to the substrate. For example, the silver shell gold nanorods can be fixed to the substrate by APTES treatment of the glass substrate while the silver shell gold nanorods are PSS modified and the substrate is immersed in a PSS modified silver shell gold nanorod containing solution overnight. . The detailed conditions for this can be referred to the Examples section of this specification. The silver shell gold nanorod-immobilized substrate obtained by this method can confirm green coloration with the naked eye, and an disappearance spectrum derived from the silver shell gold nanorod can be obtained. The peak of those fixed to can shift to the short wavelength side by about 40 nm. This is because the surface refractive index of the silver shell gold nanorod changes.
銀シェル金ナノロッドの固定化密度は、当業者であれば、適宜設計することができる。 A person skilled in the art can appropriately design the immobilization density of the silver shell gold nanorods.
基板へは、銀シェル金ナノロッドのみならず、本発明の検出を行うために必要な他の要素、例えば、銀溶解性物質を発生又は消失させるための酵素等を固定することができる。 Not only the silver shell gold nanorods but also other elements necessary for performing the detection of the present invention, such as an enzyme for generating or disappearing a silver-soluble substance, can be immobilized on the substrate.
銀シェル金ナノロッドが固定された基板は、酵素結合免疫吸着アッセイ (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 法用の基板とすることができる。 The substrate on which the silver shell gold nanorods are immobilized can be used as a substrate for an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method.
本発明は、銀シェル金ナノロッドを用いる分析用組成物、キット、又は製品として、構成することができる。このようなものは、検出対象、及び／又は検出手順等の情報を記載したパッケージ、ラベル、文書、及び／又はそのような情報を電子的に記録した記録媒体を含んで構成することができる。 The present invention can be configured as an analytical composition, kit or product using silver shell gold nanorods. Such a thing can be comprised including the recording medium which recorded information, such as a detection object and / or a detection procedure, a label, a document, and / or such information electronically.
本発明は、各種のウイルスや腫瘍マーカーの検出のために用いることができる。ウイルスの例として、インフルエンザウイルス、新型肺炎ウイルス、狂牛病ウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス等がある。腫瘍マーカーの例としては、PSA（前立腺特異抗原）、PIVKA-II、SP1（妊娠特異蛋白）、γ-Sm（γ-セミノプロテイン）、フェリチン、AFP（α-フェトプロテイン）、AFP-L3%（AFPレクチン分画）、BFP（塩基性フェトプロテイン）、尿中BFP、CEA（癌胎児性抗原）、乳汁中CEA、BCA225、CA 15-3、CA 19-9、CA 50、CA 54/61 (CA546)、CA 72-4、CA 125、CA 130、CA 602、CSLEX（シアリルLex抗原）、DUPAN-2（膵癌関連糖蛋白抗原）、KMO-1、NCC-ST-439、SLX（シアリルLex-i抗原）、SPan-1、STN（シアリルTn抗原）、CYFRA（サイトケラチン19フラグメント）、SCC抗原（扁平上皮癌関連抗原）、TPA（組織ポリペプチド抗原）、IAP（免疫抑制酸性蛋白）、ICTP（I型コラーゲンC-テロペプチド）、CTx（I型コラーゲン架橋C-テロペプチド）、尿中BTA（膀胱腫瘍抗原）、尿中NMP22（核マトリックスプロテイン22）、hCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）、ProGRP（ガストリン放出ペプチド前駆体）、カテコールアミン、HVA（ホモバニリン酸）、VMA（バニリルマンデル酸）、カルシトニン (CT)、ALP（アルカリフォスファターゼ）、PL-ALP（胎盤性ALP）、GAT（癌関連ガラクトース転移酵素）、LDH（乳酸脱水素酵素）、NSE（神経特異エノラーゼ）、PAP（前立腺酸性フォスファターゼ）、ペプシノゲン (PG) I/II比、erbB-2、
本発明の方法では、10-16 molの抗原を、約17分の酵素反応で0.1の吸光係数変化として検出することが期待できる。
The present invention can be used for detection of various viruses and tumor markers. Examples of viruses include influenza virus, new pneumonia virus, mad cow disease virus, rotavirus, norovirus and the like. Examples of tumor markers include PSA (prostate specific antigen), PIVKA-II, SP1 (pregnancy specific protein), γ-Sm (γ-seminoprotein), ferritin, AFP (α-fetoprotein), AFP-L3% ( AFP lectin fraction), BFP (basic fetoprotein), urine BFP, CEA (carcinoembryonic antigen), milk CEA, BCA225, CA 15-3, CA 19-9, CA 50, CA 54/61 (CA546 ), CA 72-4, CA 125, CA 130, CA 602, CSLEX (sialyl Lex antigen), DUPAN-2 (pancreatic cancer-related glycoprotein antigen), KMO-1, NCC-ST-439, SLX (sialyl Lex-i Antigen), SPan-1, STN (sialyl Tn antigen), CYFRA (cytokeratin 19 fragment), SCC antigen (squamous cell carcinoma associated antigen), TPA (tissue polypeptide antigen), IAP (immunosuppressive acidic protein), ICTP ( Type I collagen C-telopeptide), CTx (type I collagen cross-linked C-telopeptide), urinary BTA (bladder tumor antigen), urinary NMP22 (nuclear matrix protein 22), h CG (human chorionic gonadotropin), ProGRP (gastrin-releasing peptide precursor), catecholamine, HVA (homovanillic acid), VMA (vanillylmandelic acid), calcitonin (CT), ALP (alkaline phosphatase), PL-ALP (placental ALP) , GAT (cancer-related galactose transferase), LDH (lactate dehydrogenase), NSE (nerve specific enolase), PAP (prostatic acid phosphatase), pepsinogen (PG) I / II ratio, erbB-2,
In the method of the present invention, 10 -16 mol of antigen can be expected to be detected as an absorbance coefficient change of 0.1 in an enzyme reaction of about 17 minutes.
金ナノロッドの形状を直径10 nm長さ50 nmと仮定すると、これを1 nmの銀シェルで覆う場合には105個の銀原子が必要である（下図）。1 mol の過酸化水素は10-5 molの銀シェル金ナノロッドの銀シェルを溶解できる。銀シェル金ナノロッドのプラズモンピークは400〜800 nmの間に存在し、銀シェル金ナノロッドの粒子あたりの消失係数は1011〜1012 M-1cm-1と非常に大きい。金ナノロッドのプラズモンピークは900 nm付近で1010程度である。したがって、銀シェルの溶解は400〜800 nmのプラズモンピークの消失として観察される。すなわち、1 Mの過酸化水素は銀シェル金ナノロッド分散液の消失係数を106-107 M-1 cm-1減少させることができる。これはポルフィリンの全吸光係数に匹敵する大きさである。たとえば、5 mm × 5 mmのガラス表面に吸光度0.1 になるように銀シェル金ナノロッドを固定すると、必要な銀シェル金ナノロッドは2.5 × 10-16 molである。銀シェル金ナノロッド1個に1つの抗原が固定化されたとして、105個の銀原子からなる銀シェルを全て溶解できる過酸化水素を得るには、GODが105回Turn Overする必要がある。GODのTurn Over Frequencyを100と仮定すると、銀シェルの溶解に必要な時間は1000秒=16.7分である。 Assuming that the shape of the gold nanorod is 10 nm in diameter and 50 nm in length, if it is covered with a 1 nm silver shell, 10 5 silver atoms are required (see below). 1 mol hydrogen peroxide can dissolve the silver shell of 10 -5 mol silver shell gold nanorods. The plasmon peak of the silver shell gold nanorods exists between 400 and 800 nm, and the extinction coefficient per particle of the silver shell gold nanorods is as large as 10 11 to 10 12 M −1 cm −1 . The plasmon peak of gold nanorods is about 10 10 around 900 nm. Thus, dissolution of the silver shell is observed as the disappearance of the 400-800 nm plasmon peak. That is, 1 M hydrogen peroxide can reduce the disappearance coefficient of the silver shell gold nanorod dispersion by 10 6 -10 7 M −1 cm −1 . This is comparable to the total extinction coefficient of porphyrin. For example, when a silver shell gold nanorod is fixed to a glass surface of 5 mm × 5 mm so as to have an absorbance of 0.1, the required silver shell gold nanorod is 2.5 × 10 −16 mol. Assuming that one antigen is immobilized on one silver shell gold nanorod, in order to obtain hydrogen peroxide that can dissolve all silver shells consisting of 10 5 silver atoms, the GOD must be turned over 10 5 times. . Assuming that the GOD Turn Over Frequency is 100, the time required for dissolution of the silver shell is 1000 seconds = 16.7 minutes.
HRPを用いた系では、過酸化水素が銀シェルを溶解する速度とHRPによる過酸化水素の分解速度がバランスする必要がある場合がある。適切な界面構造を設計することで、銀シェルの溶解を制御し、GODを用いた系と同等の検出感度が得られる。 In a system using HRP, the rate at which hydrogen peroxide dissolves the silver shell and the rate of hydrogen peroxide decomposition by HRP may need to be balanced. By designing an appropriate interface structure, the dissolution of the silver shell can be controlled, and detection sensitivity equivalent to the system using GOD can be obtained.
1-1では、過酸化水素水の濃度による銀シェル溶解の挙動の違いを調べた。1-2では、銀シェル溶解に伴う消失スペクトルの経時変化を追った。1-3では、GOD酵素反応にて発生する過酸化水素による、銀シェル溶解溶液の分光特性の変化を、消失スペクトルにて評価した。 In 1-1, the difference in the dissolution behavior of the silver shell depending on the hydrogen peroxide concentration was investigated. In 1-2, the time course of the disappearance spectrum accompanying dissolution of the silver shell was followed. In 1-3, the change in the spectral characteristics of the silver shell solution due to hydrogen peroxide generated by the GOD enzyme reaction was evaluated by the disappearance spectrum.
［実験方法］
使用試薬、装置、溶液：
CTAC分散銀シェル金ナノロッド分散液（銀シェル金ナノロッドとして、直径約30nm、長さ約60nm、金ナノロッド部分は、直径約10nm、長さ約60nmを含む。特に記載した場合を除き、実施例で用いた銀シェル金ナノロッドについて、同じ。）
過酸化水素水 (30 %)（Wako 特級）
Glucose Oxidase From Aspergillus niger（GOD）（SIGMA）
D(+) - glucose（Wako）
遠心分離機（TOMY MX-300）
並列スターラー（ADVANTEC SRS266PA）
UV-Vis-NIR分光光度計（JASCO V-570）
グルコース溶液（溶媒：リン酸緩衝生理食塩水）360 mg/mL（2 M）
GOD溶液（溶媒：リン酸緩衝生理食塩水）60 μg/mL（8.178 unit/mL）
（特に示した場合を除き、下記の濃度のものを用いた。）
1-1. 過酸化水素水による銀シェル溶解の濃度依存性
銀シェル金ナノロッド分散液を遠心分離（15000 × g, 10 min, 30 ℃）し、純水に再分散させた後、さらに遠心分離（6000 × g, 7 min, 30 ℃）し、純水に再分散させた。純水分散銀シェル金ナノロッド分散液1 mLに溶液中の最終濃度がYH2O2 μMとなるように過酸化水素水を100 μLを加えた。
[experimental method]
Reagents, equipment and solutions used:
CTAC-dispersed silver shell gold nanorod dispersion (as silver shell gold nanorod, diameter about 30 nm, length about 60 nm, gold nanorod portion includes diameter about 10 nm, length about 60 nm. The same applies to the silver shell gold nanorods used.)
Hydrogen peroxide solution (30%) (Wako special grade)
Glucose Oxidase From Aspergillus niger (GOD) (SIGMA)
D (+)-glucose (Wako)
Centrifuge (TOMY MX-300)
Parallel stirrer (ADVANTEC SRS266PA)
UV-Vis-NIR spectrophotometer (JASCO V-570)
Glucose solution (solvent: phosphate buffered saline) 360 mg / mL (2 M)
GOD solution (solvent: phosphate buffered saline) 60 μg / mL (8.178 unit / mL)
(Unless otherwise indicated, the following concentrations were used.)
1-1. Concentration dependence of silver shell dissolution with hydrogen peroxide solution The silver shell gold nanorod dispersion is centrifuged (15000 × g, 10 min, 30 ℃), redispersed in pure water, and then centrifuged. (6000 × g, 7 min, 30 ° C.) and redispersed in pure water. 100 μL of hydrogen peroxide was added to 1 mL of pure water-dispersed silver shell gold nanorod dispersion so that the final concentration in the solution was Y H2O2 μM.
1-2. 過酸化水素水による銀シェル溶解の経時変化
CTAC分散銀シェル金ナノロッド分散液を15000 × g, 10 min, 30 ℃で遠心分離し、純水で再分散しさらに6000 × g, 10 min, 30 ℃で遠心分離後、再度純水に再分散させ純水で10倍に希釈した。溶液中の過酸化水素の濃度が84 μMとなるようにして撹拌しながら25 ℃に保って 10分毎に1 cmディスポセルにて吸光度を測定した。
1-2. Time-dependent change of silver shell dissolution by hydrogen peroxide solution
CTAC-dispersed silver shell gold nanorod dispersion is centrifuged at 15000 × g, 10 min, 30 ℃, re-dispersed with pure water, further centrifuged at 6000 × g, 10 min, 30 ℃, and then re-dispersed in pure water And diluted 10 times with pure water. Absorbance was measured with a 1 cm disposable cell every 10 minutes while maintaining the temperature at 25 ° C. with stirring so that the concentration of hydrogen peroxide in the solution was 84 μM.
1-3. 溶液中でのGOD酵素反応による銀シェル溶解
銀シェル金ナノロッド分散液を遠心分離（15000 × g, 10 min, 30 ℃）し、上澄みのCTAC溶液を取り除き、純水に再分散させた後さらに遠心分離し（6000 × g, 7 min, 30 ℃）、今度は濃厚溶液をPBSに再分散させた。PBS分散銀シェル金ナノロッド分散液を0.5 mLずつエッペンチューブにとりそれぞれに360 mg/mLのグルコース溶液を50 μLずつ入れた。60 μg/mL（8.178 unit/mL）のグルコースオキシダーゼ溶液を任意量（ZGODμL）加え、経時変化を消失スペクトルにて評価した。
1-3. Dispersion of silver shell gold nanorod dispersion by GOD enzyme reaction in solution is centrifuged (15000 × g, 10 min, 30 ℃) to remove the supernatant CTAC solution and redispersed in pure water After that, it was further centrifuged (6000 × g, 7 min, 30 ° C.), and this time, the concentrated solution was redispersed in PBS. Each 0.5 mL of PBS-dispersed silver shell gold nanorod dispersion was placed in an Eppendorf tube, and 50 μL of 360 mg / mL glucose solution was added to each. An arbitrary amount (Z GOD μL) of 60 μg / mL (8.178 unit / mL) glucose oxidase solution was added, and the change with time was evaluated by the disappearance spectrum.
［結果］
1-1. 過酸化水素水による銀シェル溶解の濃度依存性
純水分散時の銀シェル金ナノロッドの長軸由来消失ピーク波長がそれぞれ625, 631, 641, 652 nmである純水分散銀シェル金ナノロッド分散液に、溶液中の過酸化水素の最終濃度がYH2O2= 0, 80, 160, 240, 280, 320（μM）となるようにそれぞれ過酸化水素を加え30 min静置した後の各サンプルの消失スペクトルを図1に示す。
[result]
1-1. Concentration dependence of silver shell dissolution by hydrogen peroxide solution Pure water-dispersed silver shell gold with disappearance peak wavelengths derived from the major axis of silver shell gold nanorods at 625, 631, 641, and 652 nm, respectively, when pure water is dispersed Hydrogen peroxide is added to the nanorod dispersion so that the final concentration of hydrogen peroxide in the solution is Y H2O2 = 0, 80, 160, 240, 280, 320 (μM). The disappearance spectrum of the sample is shown in FIG.
(a)〜(d)の四つのいずれの実験においても過酸化水素の濃度を高くすると、銀シェル金ナノロッド由来の消失ピークが減少していることがわかった。また、900 nm付近の吸光度が増大していることも確認できた。これは金ナノロッドの長軸由来の消失ピークの立ち上がりであり、銀シェル金ナノロッドの銀シェルが溶解して金ナノロッドが表れた結果であることを示している。 In any of the four experiments (a) to (d), it was found that the disappearance peak derived from the silver shell gold nanorods decreased when the hydrogen peroxide concentration was increased. It was also confirmed that the absorbance near 900 nm was increased. This is the rise of the disappearance peak derived from the long axis of the gold nanorods, indicating that the silver shells of the silver shell gold nanorods dissolved and the gold nanorods appeared.
また、純水分散銀シェル金ナノロッドの長軸由来の消失ピーク波長における吸光度変化と過酸化水素のモル濃度の関係、及び金ナノロッドの長軸由来の消失ピーク波長である900 nmにおける吸光度変化と過酸化水素モル濃度の関係を図2に示す。どのサンプルも過酸化水素濃度の増加と溶解が進むことがわかった。 In addition, the relationship between the change in absorbance at the disappearance peak wavelength derived from the long axis of pure water-dispersed silver shell gold nanorods and the molar concentration of hydrogen peroxide, and the change in absorbance at 900 nm, which is the disappearance peak wavelength derived from the long axis of gold nanorods. Fig. 2 shows the relationship between the molar concentrations of hydrogen oxide. All samples were found to increase in hydrogen peroxide concentration and dissolve.
1-2. 過酸化水素による銀シェル溶解の経時変化
銀シェル金ナノロッド分散液中に過酸化水素水を加えた後、撹拌しながら10分毎に測定した消失スペクトルを図3に示す。
1-2. Change with time of dissolution of silver shell by hydrogen peroxide Fig. 3 shows the disappearance spectrum measured every 10 minutes with stirring after adding hydrogen peroxide water into the silver shell gold nanorod dispersion.
銀シェル金ナノロッドの長軸由来の消失ピークが経時変化に伴って小さくなっていることが確認できた。 It was confirmed that the disappearance peak derived from the long axis of the silver shell gold nanorods became smaller with time.
1-3. 溶液中でのGOD酵素反応による銀シェル溶解
グルコースオキシダーゼの添加量をZGOD = 10, 30, 50, 70, 90（μL）としたときの消失スペクトル経時変化を図4に示す。1-1.で過酸化水素水を用いたときと同様に銀シェル由来のピークが減少していることがわかった。また、銀シェル溶解前後の溶液の写真を図5に示す。目視でも明らかに溶液の色が変化していることが確認できた。
1-3. Silver shell dissolution by GOD enzyme reaction in solution Figure 4 shows the time course of disappearance spectrum when the amount of glucose oxidase added is Z GOD = 10, 30, 50, 70, 90 (μL). In 1-1, it was found that the peak derived from the silver shell decreased as in the case of using the hydrogen peroxide solution. In addition, photographs of the solution before and after dissolution of the silver shell are shown in FIG. It was also confirmed visually that the color of the solution was clearly changed.
ここで、銀シェル金ナノロッドの長軸由来のピーク波長である648 nmにおける吸光度変化を示したものが図6である。いずれのGOD濃度においても、吸光度が減少していることがわかる。しかし、100 min以降の吸光度変化がほぼない。これは系中の銀イオンがGODの酵素活性を阻害し、銀シェル溶解に必要な過酸化水素が不足したためであると考えられる。 Here, FIG. 6 shows the change in absorbance at 648 nm, which is the peak wavelength derived from the long axis of the silver shell gold nanorods. It can be seen that the absorbance decreases at any GOD concentration. However, there is almost no change in absorbance after 100 min. This is thought to be because the silver ions in the system inhibited the enzyme activity of GOD and the hydrogen peroxide necessary for dissolution of the silver shell was insufficient.
また、648 nmにおける反応開始後一分間の吸光度変化をGODの濃度に対してプロットしたものを図7に示す。反応開始後一分間の吸光度変化がGODの濃度にほぼ比例していることがわかる。この結果は、GOD濃度を銀シェルの溶解に伴う吸光度変化によって測定できることを強く示唆している。 In addition, FIG. 7 shows a plot of the change in absorbance at 648 nm for one minute after the start of the reaction against the concentration of GOD. It can be seen that the change in absorbance for one minute after the start of the reaction is almost proportional to the concentration of GOD. This result strongly suggests that the GOD concentration can be measured by the change in absorbance accompanying dissolution of the silver shell.
この実施例では、銀シェル金ナノロッドのガラス基板への固定を報告する。ガラス基板をAPTESで処理し（2-1）、PSS修飾した後純水に再分散させた銀シェル金ナノロッド分散液に浸漬させ、銀シェル金ナノロッドを基板に固定した（2-2、2-3）。またこの固定化基板を過酸化水素水に浸漬させることで銀シェルを溶解させること（2-4）、基板をグルコース及びグルコースオキシダーゼの存在する溶液中に浸漬させて、酵素反応により銀シェル溶解させること（2-5）、また基板にグルコースオキシダーゼも固定して酵素反応にて銀シェル溶解させること（2-6、下図）をそれぞれ試みた。 In this example, the fixation of silver shell gold nanorods to a glass substrate is reported. The glass substrate was treated with APTES (2-1), immersed in a silver shell gold nanorod dispersion liquid that was PSS modified and redispersed in pure water, and the silver shell gold nanorod was fixed to the substrate (2-2, 2- 3). In addition, the silver shell is dissolved by immersing this immobilized substrate in hydrogen peroxide water (2-4), and the substrate is immersed in a solution containing glucose and glucose oxidase to dissolve the silver shell by enzymatic reaction. (2-5), and fixing the glucose oxidase to the substrate and dissolving the silver shell by enzymatic reaction (2-6, below).
[実験方法]
使用試薬：
CTAC分散銀シェル金ナノロッド分散液
Polystyrene sulfonate, sodium salt（PSS）（Scientific Polymer Products, INC）
（Mw 70000）
アンモニア水（25 %）（Wako 特級）
過酸化水素水（30 %）（Wako 特級）
Aminopropyltriethoxysilane（APTES）（Aldrich）
2-Propanol（Aldrich 99.9%）
Poly (allylamine hydrochloride)（PAH）（Aldrich）（Mw 15000）
DE-030AS（両末端スクシンイミドPEGエステル）（日本油脂）
Glucose oxidase from Aspergillus niger（GOD）（SIGMA）
D(+) - glucose（Wako）
リン酸緩衝液
Glass Slides for MALDI Imaging（BRUKER）
調製した溶液：
PSS水溶液 2 mg/mL
PAH水溶液 1 mg/mL
DE-030AS水溶液 100 mg/mL
GOD溶液（溶媒：リン酸緩衝液） 1 mg/mL（136.3 unit/mL）
グルコース溶液（溶媒：リン酸緩衝液） 180 mg/mL（1 M）
使用した装置：
並列スターラー（ADVANTEC SRS266PA）
遠心機（TOMY MX-300）
UV-Vis-NIR分光光度計（JASCO V-570）
ゼータ電位測定（大塚電子 ELSZ-2）
走査型電子顕微鏡（SEM） （SHIMADZU SS-550）
2-1. APTES処理基板の準備
ガラス基板を9等分にカットし、アンモニア水：過酸化水素水 = 1 : 1（溶液のVolume比）とした混合液に入れ数分間沸騰させ、表面を洗浄し親水化処理を施した。0.3 mLのAminopropyltriethoxysilane (APTES) と30 mLの2-Propanolの混合液に親水化した基板を浸し、スターラーで撹拌しながら一晩反応させた。純水で洗浄後、エアーで乾燥させた。
[experimental method]
Reagents used :
CTAC dispersed silver shell gold nanorod dispersion
Polystyrene sulfonate, sodium salt (PSS) (Scientific Polymer Products, INC)
(Mw 70000)
Ammonia water (25%) (Wako special grade)
Hydrogen peroxide solution (30%) (Wako special grade)
Aminopropyltriethoxysilane (APTES) (Aldrich)
2-Propanol (Aldrich 99.9%)
Poly (allylamine hydrochloride) (PAH) (Aldrich) (Mw 15000)
DE-030AS (both ends succinimide PEG ester) (Nippon Yushi)
Glucose oxidase from Aspergillus niger (GOD) (SIGMA)
D (+)-glucose (Wako)
Phosphate buffer
Glass Slides for MALDI Imaging (BRUKER)
Prepared solution:
PSS aqueous solution 2 mg / mL
PAH aqueous solution 1 mg / mL
DE-030AS aqueous solution 100 mg / mL
GOD solution (solvent: phosphate buffer) 1 mg / mL (136.3 unit / mL)
Glucose solution (solvent: phosphate buffer) 180 mg / mL (1 M)
Equipment used:
Parallel stirrer (ADVANTEC SRS266PA)
Centrifuge (TOMY MX-300)
UV-Vis-NIR spectrophotometer (JASCO V-570)
Zeta potential measurement (Otsuka Electronics ELSZ-2)
Scanning electron microscope (SEM) (SHIMADZU SS-550)
2-1. Preparation of APTES-treated substrate Cut the glass substrate into 9 equal parts, put it in a mixed solution of ammonia water: hydrogen peroxide = 1: 1 (Volume ratio of the solution), boil for several minutes, and clean the surface And hydrophilized. The hydrophilized substrate was immersed in a mixed solution of 0.3 mL of Aminopropyltriethoxysilane (APTES) and 30 mL of 2-Propanol, and reacted overnight while stirring with a stirrer. After washing with pure water, it was dried with air.
2-2. PSS修飾銀シェル金ナノロッドの作製
CTAC分散銀シェル金ナノロッドを15000 × g, 10 min, 30 ℃で遠心分離し、純水で再分散した後、さらに6000 × g, 10 min, 30 ℃で遠心分離した。上澄みを除き、銀シェル金ナノロッド濃厚分散液を2 mg/mLのPolystyrene sulfonate (PSS) 溶液に撹拌しながら滴下して一晩撹拌した。得られた溶液を6000 × g, 7 min, 30 ℃で遠心分離し、上澄みはさらに6000 × g, 7 min, 30 ℃で遠心した後この上澄みは除去し、二つの濃厚分散液を合わせて1 mLの純水で再分散した。この操作を一セットとして遠心条件、再分散する純水の量をそれぞれ変えさらに二セット行った。（二セット目：6000 × g, 5 min, 30 ℃、0.9 mL、三セット目：4500 × g, 5 min, 30 ℃、0.8 mL）この三セットの純水再分散操作を行った後の溶液を純水分散PSS修飾銀シェル金ナノロッド分散液とする。この溶液を消失スペクトル、ゼータ電位測定にて評価した。
2-2. Fabrication of PSS-modified silver shell gold nanorods
CTAC-dispersed silver shell gold nanorods were centrifuged at 15000 × g, 10 min, 30 ° C., redispersed with pure water, and further centrifuged at 6000 × g, 10 min, 30 ° C. The supernatant was removed, and the concentrated silver shell gold nanorod dispersion was added dropwise to a 2 mg / mL Polystyrene sulfonate (PSS) solution while stirring and stirred overnight. The resulting solution is centrifuged at 6000 × g, 7 min, 30 ° C., the supernatant is further centrifuged at 6000 × g, 7 min, 30 ° C., the supernatant is removed, and the two concentrated dispersions are combined. Redispersed with mL of pure water. This operation was performed as one set, and the centrifugal conditions and the amount of pure water to be redispersed were changed, and two more sets were performed. (The second set: 6000 × g, 5 min, 30 ° C, 0.9 mL, the third set: 4500 × g, 5 min, 30 ° C, 0.8 mL) The solution after performing these three sets of pure water redispersion operations Is a pure water dispersion PSS-modified silver shell gold nanorod dispersion. This solution was evaluated by disappearance spectrum and zeta potential measurement.
[結果］
得られた純水分散PSS修飾銀シェル金ナノロッド分散液の消失スペクトルを図7に示す。銀シェル金ナノロッドの短軸由来のピークはほぼ見えなくなっているが、残りのピークは明確に表れており、粒子が凝集せずに分散していることが確認できた。またこの溶液のゼータ電位を測定したところ、未修飾CTAC分散銀シェル金ナノロッドでは+45.6 mVであったのに対して-56.0 mVであった。このことから、CTACを界面活性剤として分散していた銀シェル金ナノロッドがPSSによって修飾され、孤立分散したことが示唆された。
[result]
FIG. 7 shows the disappearance spectrum of the obtained pure water-dispersed PSS-modified silver shell gold nanorod dispersion. Although the peak derived from the short axis of the silver shell gold nanorod almost disappeared, the remaining peaks were clearly shown, and it was confirmed that the particles were dispersed without being aggregated. The zeta potential of this solution was measured and found to be -56.0 mV compared to +45.6 mV for the unmodified CTAC-dispersed silver shell gold nanorods. This suggested that the silver shell gold nanorods dispersed with CTAC as a surfactant were modified by PSS and dispersed in isolation.
2-3. 基板への銀シェル金ナノロッド固定
2-1で作製したAPTES処理基板を2-2で調製した純水分散PSS修飾銀シェル金ナノロッド分散液に一晩浸漬させることにより、銀シェル金ナノロッドを基板に固定した（模式図を下に示す。）。浸漬後純水で洗浄しエアーで乾燥させた後、得られた基板の吸光度、ゼータ電位を測定し評価した。また基板を白金スパッタ処理した後SEM観察をおこなった。
2-3. Fixing silver shell gold nanorods to the substrate
The silver shell gold nanorods were fixed to the substrate by immersing the APTES-treated substrate prepared in 2-1 overnight in the pure water-dispersed PSS-modified silver shell gold nanorod dispersion prepared in 2-2 (schematic diagram below) Show.) After immersion, the substrate was washed with pure water and dried with air, and then the absorbance and zeta potential of the obtained substrate were measured and evaluated. Moreover, SEM observation was performed after carrying out the platinum sputtering process of the board | substrate.
得られた銀シェル金ナノロッド固定化基板の写真、及びその消失スペクトルを図8に示す。基板に肉眼で緑色の着色を確認することができ、また、銀シェル金ナノロッド由来の消失スペクトルが得られた。また、溶液中のピークに比べて基板に固定したもののピークは40 nm程度短波長側にシフトした。これは銀シェル金ナノロッドの表面が、近傍の屈折率が変化したためである。 A photograph of the obtained silver shell gold nanorod fixed substrate and its disappearance spectrum are shown in FIG. Green coloration could be confirmed on the substrate with the naked eye, and disappearance spectra derived from silver shell gold nanorods were obtained. Moreover, the peak of what was fixed to the substrate compared with the peak in the solution shifted to the short wavelength side by about 40 nm. This is because the refractive index in the vicinity of the surface of the silver shell gold nanorods has changed.
また、得られた銀シェル金ナノロッド固定化基板のSEM像を図9に示す。 Further, FIG. 9 shows an SEM image of the obtained silver shell gold nanorod fixed substrate.
基板に銀シェル金ナノロッドが固定できていることは確認できたが、銀シェル金ナノロッドは基板に疎についていることが分かった。また銀シェル金ナノロッド固定化基板のゼータ電位を測定したところ+1.18 mVとほぼニュートラルだったことからも密には付いていないことが言える。 Although it was confirmed that the silver shell gold nanorods were fixed to the substrate, the silver shell gold nanorods were found to be sparse on the substrate. The zeta potential of the silver-shell gold nanorod-immobilized substrate was measured and found to be +1.18 mV, which is almost neutral.
2-4. 固定化基板の過酸化水素水による銀シェル溶解
2-3で作製した銀シェル金ナノロッド固定化基板2枚を2.65 mM、8.85 mMの過酸化水素水にそれぞれ20秒浸漬し、純水洗浄しエアー乾燥後吸光度を測定した。それぞれの基板で吸光度変化が見られなくなるまで同様の操作を12回、7回それぞれ繰り返した。
2-4. Dissolution of silver shell by hydrogen peroxide solution on immobilized substrate
The two silver shell gold nanorod fixed substrates prepared in 2-3 were immersed in 2.65 mM and 8.85 mM hydrogen peroxide for 20 seconds, washed with pure water, air-dried, and the absorbance was measured. The same operation was repeated 12 times and 7 times until no change in absorbance was observed on each substrate.
また、コントロール実験として過酸化水素水の代わりに純水で20秒浸漬、純水洗浄エアー乾燥後吸光度測定という操作を繰り返し行った。 Further, as a control experiment, an operation of immersion in pure water for 20 seconds instead of hydrogen peroxide water, washing with pure water, air drying, and absorbance measurement was repeated.
2.65 mM、8.85 mMの過酸化水素水にそれぞれ浸漬させたときの吸光度変化を図10に示す。いずれの基板においても過酸化水素水への浸漬回数を重ねるたびに銀シェル金ナノロッド由来の吸光度が小さくなっているのを確認できる。過酸化水素濃度が2.65 mMのときは途中で反応が進まなくなっているため、金ナノロッド由来と思われる吸光度の増加はわずかしか見られない。一方8.85 mMのときは銀シェルが十分に溶解した上、金ナノロッド由来の吸収ピークの増加がみられる。
過酸化水素水の代わりに純水で同様に8回浸漬操作を行ったコントロール実験の結果を図11に示す。
FIG. 10 shows changes in absorbance when immersed in 2.65 mM and 8.85 mM hydrogen peroxide water, respectively. In any substrate, it can be confirmed that the absorbance derived from the silver shell gold nanorods decreases each time the number of immersions in the hydrogen peroxide solution is repeated. When the hydrogen peroxide concentration is 2.65 mM, the reaction does not proceed in the middle, so only a slight increase in absorbance, which seems to be derived from gold nanorods, is observed. On the other hand, when the concentration is 8.85 mM, the silver shell is sufficiently dissolved and an increase in absorption peak derived from the gold nanorods is observed.
FIG. 11 shows the results of a control experiment in which immersion operation was similarly performed 8 times with pure water instead of hydrogen peroxide.
浸漬回数を増やしても消失スペクトルがほとんど変化していないことから、銀シェル金ナノロッド基板は純水に浸漬させても銀シェル溶解は進行しないと言える。よって図10に示した消失スペクトルの変化は過酸化水素水による銀シェル溶解挙動によるものあることが確認できた。 Since the disappearance spectrum hardly changes even when the number of immersions is increased, it can be said that the dissolution of the silver shell does not proceed even when the silver shell gold nanorod substrate is immersed in pure water. Therefore, it was confirmed that the change in the disappearance spectrum shown in FIG. 10 was due to the dissolution behavior of the silver shell by the hydrogen peroxide solution.
2-5. 固定化基板の溶液中でのグルコースオキシダーゼ酵素反応による銀シェル溶解
シャーレに銀シェル金ナノロッド固定化基板を置き、最終的に濃度がグルコース400 μmol、GOD 200 nmolになるようにグルコース溶液、GOD溶液を加え、2時間後に吸光度を測定した。
2-5. Dissolution of silver shell by glucose oxidase enzyme reaction in solution of immobilized substrate Place a silver shell gold nanorod immobilized substrate in a petri dish, and finally a glucose solution so that the concentration is 400 μmol glucose and 200 nmol GOD. The GOD solution was added, and the absorbance was measured after 2 hours.
銀シェル金ナノロッド固定基板のグルコースオキシダーゼ・グルコース溶液浸漬前後の消失スペクトルの変化を図12に示す。 FIG. 12 shows the change in the disappearance spectrum before and after the immersion of the glucose oxidase / glucose solution on the silver shell gold nanorod fixed substrate.
グルコースオキシダーゼ・グルコース溶液に浸漬させることで過酸化水素水に浸漬させたときと同様に、銀シェル金ナノロッドの長軸由来の消失ピークが減少し、900 nm付近の金ナノロッドの長軸由来の消失ピークが増大していることが確認できた。これはグルコースオキシダーゼ酵素反応によって発生した過酸化水素が基板の近傍に十分に存在したため、銀シェルが溶解したものだと考えることができる。 The disappearance peak derived from the long axis of the silver shell gold nanorods is reduced and the disappearance from the long axis of the gold nanorods near 900 nm is reduced in the same manner as when immersed in the hydrogen peroxide solution by dipping in the glucose oxidase / glucose solution. It was confirmed that the peak increased. This can be considered that the hydrogen shell generated by the glucose oxidase enzyme reaction was sufficiently present in the vicinity of the substrate, so that the silver shell was dissolved.
2-6. 基板に固定したグルコースオキシダーゼの酵素反応による銀シェル溶解
銀シェル金ナノロッド固定化基板を1 mg/mL PAH水溶液に浸漬させ表面処理を施した。純水で洗浄しエアーで乾燥させた後、両末端にスクシンイミド基を持つPEGエステルであるDE-030AS水溶液（100 mg/mL）0.1 mL、リン酸緩衝液0.9 mLに浸漬させた。そのあと0.1 mg/mLグルコースオキシダーゼ（GOD）溶液0.5 mLを加え一晩浸漬させ基板にGODを固定した。GODを固定した基板をセミミクロセルに入れた1 Mグルコース溶液2 mLに浸漬させ、その吸光度の変化を測定した。吸光度測定は毎回、基板を純水で洗浄しエアーで乾燥させてから行った。またコントロール実験として三種類の実験を行った。PEGエステル溶液にまで浸漬させた後、GODを加えずに固定しなかった銀シェル金ナノロッド固定化基板を1 Mグルコース溶液に浸漬させて吸光度変化を測定した（コントロール1）。GODまで固定した銀シェル金ナノロッド固定化基板をグルコース溶液の代わりに純水（コントロール2）及びリン酸緩衝液（コントロール3）に浸漬させた時の吸光度変化を測定した。
2-6. A silver shell-dissolved silver shell gold nanorod-immobilized substrate by enzymatic reaction of glucose oxidase immobilized on the substrate was immersed in a 1 mg / mL PAH aqueous solution for surface treatment. After washing with pure water and drying with air, it was immersed in 0.1 mL of DE-030AS aqueous solution (100 mg / mL), which is a PEG ester having succinimide groups at both ends, and 0.9 mL of phosphate buffer. Thereafter, 0.5 mL of a 0.1 mg / mL glucose oxidase (GOD) solution was added and immersed overnight to fix GOD to the substrate. The substrate on which GOD was fixed was immersed in 2 mL of 1 M glucose solution in a semi-micro cell, and the change in absorbance was measured. Absorbance measurement was performed each time after the substrate was washed with pure water and dried with air. Three types of experiments were conducted as control experiments. After immersion in the PEG ester solution, the silver shell gold nanorod-immobilized substrate that was not fixed without adding GOD was immersed in a 1 M glucose solution and the change in absorbance was measured (Control 1). The absorbance change was measured when the silver shell gold nanorod fixed substrate fixed to GOD was immersed in pure water (control 2) and phosphate buffer (control 3) instead of glucose solution.
銀シェル金ナノロッド及びグルコースオキシダーゼを固定した基板をグルコースに浸漬させたときの消失スペクトル経時変化を図13に示す。また、銀シェル金ナノロッドにグルコースオキシダーゼを固定せずに同様の操作を行ったとき（コントロール1）の消失スペクトルを図14に、グルコースオキシダーゼを固定した基板を純水及びリン酸緩衝液に浸漬させたとき（コントロール2，3）の消失スペクトルを図15に示す。銀シェル金ナノロッド由来の吸収が小さくなり長軸由来の吸収ピークが長波長シフトした。また、金ナノロッド由来の吸収ピークは反応時間が長くなると大きくなり、24時間後には金ナノロッドの特徴的な消失スペクトルが見られた。 FIG. 13 shows the time course of the disappearance spectrum when the substrate on which the silver shell gold nanorods and glucose oxidase were fixed was immersed in glucose. The disappearance spectrum when the same operation was performed without fixing glucose oxidase to the silver shell gold nanorod (Control 1) is shown in FIG. 14, and the substrate on which glucose oxidase was fixed was immersed in pure water and phosphate buffer. Fig. 15 shows the disappearance spectrum of the control (controls 2 and 3). The absorption derived from the silver shell gold nanorods became smaller, and the absorption peak derived from the long axis shifted a long wavelength. Further, the absorption peak derived from gold nanorods became larger as the reaction time became longer, and a characteristic disappearance spectrum of gold nanorods was observed after 24 hours.
また、GODを固定していない銀シェル金ナノロッド固定化基板をグルコース溶液に浸漬したところ、ほとんど吸光度の変化は見られなかった。銀シェル金ナノロッド固定化基板、及びリンカー分子まで固定した基板はグルコース溶液中では安定であることが分かった。同様にGODを固定した銀シェル金ナノロッド固定化基板を純水、リン酸緩衝液にそれぞれ浸漬させた場合も、吸光度変化はほとんど見られなかった。GODは基質であるグルコースの存在下でないと反応せず、過酸化水素が発生しないために銀シェルが溶解しなかったことがわかる。これらのことから、図13に示した銀シェル金ナノロッド由来のピークの減少及び金ナノロッド由来のピークの増加は固定したGOD酵素反応により発生した過酸化水素によるものであるということが言える。 Moreover, when the silver shell gold | metal | money nanorod fixed board | substrate which is not fixing GOD was immersed in the glucose solution, the change of the absorbance was hardly seen. It was found that the silver shell gold nanorod-immobilized substrate and the substrate immobilized up to the linker molecule are stable in the glucose solution. Similarly, when the silver shell gold nanorod-immobilized substrate on which GOD was immobilized was immersed in pure water and phosphate buffer, almost no change in absorbance was observed. It can be understood that the silver shell did not dissolve because GOD did not react unless the substrate glucose was present, and hydrogen peroxide was not generated. From these facts, it can be said that the decrease in the peak derived from the silver shell gold nanorods and the increase in the peak derived from the gold nanorods shown in FIG. 13 are caused by hydrogen peroxide generated by the immobilized GOD enzyme reaction.
また、図16にGOD固定基板のグルコース溶液浸漬前と浸漬後（24 h後）の基板の写真を示す。肉眼でも基板の消色を確認することができる。 FIG. 16 shows photographs of the GOD-fixed substrate before and after immersion in the glucose solution (after 24 hours). The decoloring of the substrate can be confirmed with the naked eye.
この実施例では、HRPの酵素反応を利用した銀シェル溶解の抑制について報告する。 In this example, the inhibition of silver shell dissolution using the enzymatic reaction of HRP is reported.
ガラス基板を実施例2と同様にAPTESで処理し、銀シェル金ナノロッドを基板に固定した。両末端スクシンイミドPEGエステルをリンカーとして用いて、この銀シェル金ナノロッド固定化基板にHRPを固定した(下図)。基質としてフェノールを用い、HRPの酵素反応によって過酸化水素を分解した。過酸化水素の分解は銀シェルの溶解を抑制する。すなわち、基板上のHRPの存在は、銀シェル金ナノロッドの分光特性変化の抑制によって検出することができる。 The glass substrate was treated with APTES in the same manner as in Example 2 to fix the silver shell gold nanorods to the substrate. HRP was immobilized on the silver shell gold nanorod-immobilized substrate using succinimide PEG ester at both ends as a linker (lower figure). Phenol was used as a substrate, and hydrogen peroxide was decomposed by enzymatic reaction of HRP. The decomposition of hydrogen peroxide suppresses dissolution of the silver shell. That is, the presence of HRP on the substrate can be detected by suppressing the change in spectral characteristics of the silver shell gold nanorods.
(3-1)では各種参照実験を含めてHRPの酵素反応が銀シェルの溶解を抑制する様子を示す。さらに(3-2)ではその場測定で過酸化水素の最適濃度を明らかにし、(3-3)ではHRPの固定密度を増やすと銀シェル溶解の抑制がより効率的に行えることを見いだした。 (3-1) shows how the enzyme reaction of HRP suppresses dissolution of the silver shell, including various reference experiments. Furthermore, in (3-2), the optimum concentration of hydrogen peroxide was clarified by in-situ measurement, and in (3-3), it was found that the silver shell dissolution could be suppressed more efficiently by increasing the fixing density of HRP.
[実験方法]
使用試薬：
Poly (allylamine hydrochloride)（PAH） （Aldrich）
（Mw 15000）
Polystyrene sulfonate, sodium salt（PSS） （創和化学）
（Mw 70000）
DE-030AS（両末端スクシンイミドPEGエステル） （日本油脂）
Peroxidase Type II from Horseradish （HRP） （SIGMA）
Phenol（粒状） （Nacalai tesque）
過酸化水素水 （Wako 特級）
リン酸緩衝液（pH 7.6）
Micro slide glass （MATSUNAMI）
調製した溶液：
PAH溶液 1 mg/mL
PSS溶液 2 mg/mL
DE-030AS水溶液 100 mg/mL
HRP溶液 0.1 mg/mL
Phenol溶液 25 mM、50 mM
リン酸緩衝液（pH 7.6） 20 mM
3-1. HRPを用いた銀シェル溶解の抑制反応
銀シェル金ナノロッド固定化基板をPAH溶液に2時間浸漬させたのち、純水洗浄、air乾燥後PSS溶液に1時間浸漬、純水洗浄、air乾燥後さらにPAH溶液に1時間浸漬し同様に純水洗浄、air乾燥を行い、ポリマー積層を4層に増やした基板を準備した。この基板をDE-030AS溶液（両末端スクシンイミド）10 mg/mL、1 mL（in PB）に浸漬し、15分後1 mg/mL HRP水溶液0.5 mLを添加し浸漬させた。浸漬後再度洗浄、乾燥してHRP固定化基板を二枚作製した。また、コントロールとしてHRPを添加しなかった基板（リンカーのみを固定した基板）も一枚用意した。
[experimental method]
Reagents used:
Poly (allylamine hydrochloride) (PAH) (Aldrich)
(Mw 15000)
Polystyrene sulfonate, sodium salt (PSS) (Sowa Chemical)
(Mw 70000)
DE-030AS (both ends succinimide PEG ester) (Nippon Yushi)
Peroxidase Type II from Horseradish (HRP) (SIGMA)
Phenol (granular) (Nacalai tesque)
Hydrogen peroxide solution (Wako special grade)
Phosphate buffer (pH 7.6)
Micro slide glass (MATSUNAMI)
Prepared solution:
PAH solution 1 mg / mL
PSS solution 2 mg / mL
DE-030AS aqueous solution 100 mg / mL
HRP solution 0.1 mg / mL
Phenol solution 25 mM, 50 mM
Phosphate buffer solution (pH 7.6) 20 mM
3-1. Suppression reaction of silver shell dissolution using HRP After immersing the silver shell gold nanorod fixed substrate in PAH solution for 2 hours, pure water cleaning, air drying and then 1 hour immersion in PSS solution, pure water cleaning, After air drying, the substrate was further immersed in a PAH solution for 1 hour, similarly washed with pure water and air-dried to prepare a substrate in which the polymer laminate was increased to four layers. This substrate was immersed in DE-030AS solution (both ends succinimide) 10 mg / mL, 1 mL (in PB), and after 15 minutes, 0.5 mL of 1 mg / mL HRP aqueous solution was added and immersed. After immersion, the substrate was washed and dried again to produce two HRP-immobilized substrates. In addition, as a control, a single substrate to which HRP was not added (a substrate on which only a linker was fixed) was prepared.
HRP固定基板 （Sample a）とHRPの無いコントロール基板 （Sample b） 8.82 mMの過酸化水素水100 μL、50 mMフェノール溶液0.4 mL、PB 0.6 mLを混合した溶液に20秒浸漬し、純水洗浄しエアー乾燥後吸光度を測定した。それぞれの基板で吸光度変化が見られなくなるまで同様の操作を繰り返した。また、コントロール（Sample c）としてHRPを固定した基板一枚を8.82 mM過酸化水素水100 μL、PB 1.0 mL（フェノールを含まない溶液）に浸漬させ同様の操作を行った。 HRP fixed substrate (Sample a) and HRP-free control substrate (Sample b) 8.82 mM hydrogen peroxide solution 100 μL, 50 mM phenol solution 0.4 mL, PB 0.6 mL mixed for 20 seconds and washed with pure water The absorbance was measured after air drying. The same operation was repeated until no change in absorbance was observed on each substrate. Further, as a control (Sample c), one substrate on which HRP was fixed was immersed in 100 μL of 8.82 mM hydrogen peroxide solution and 1.0 mL of PB (solution not containing phenol), and the same operation was performed.
3-2.銀シェル溶解の抑制反応のその場観察と過酸化水素濃度最適化
(3-1)と同様に銀シェル金ナノロッド固定化基板をPAH溶液に2時間浸漬させたのち、純水洗浄、air乾燥後PSS溶液に1時間浸漬、純水洗浄、air乾燥後さらにPAH溶液に1時間浸漬し同様に純水洗浄、air乾燥を行い、ポリマー積層を4層に増やした基板を準備した。この基板をDE-030AS溶液（両末端スクシンイミド）10 mg/mL、1 mL（in PB）に浸漬し、15分後1 mg/mL HRP水溶液0.5 mLを添加し浸漬させた。浸漬後再度洗浄、乾燥してHRP固定化基板を作製した。また、コントロールとしてHRPを添加しなかった基板（リンカーのみ固定した基板）も用意した。
3-2. In-situ observation of silver shell dissolution inhibition and optimization of hydrogen peroxide concentration
As in (3-1), the silver shell gold nanorod fixed substrate is immersed in a PAH solution for 2 hours, then washed with pure water, air-dried, then immersed in PSS solution for 1 hour, washed with pure water, air-dried, and further PAH solution In the same manner, pure water washing and air drying were carried out for 1 hour to prepare a substrate with a polymer layer increased to four layers. This substrate was immersed in DE-030AS solution (both ends succinimide) 10 mg / mL, 1 mL (in PB), and after 15 minutes, 0.5 mL of 1 mg / mL HRP aqueous solution was added and immersed. After dipping, the substrate was washed and dried again to produce an HRP-immobilized substrate. As a control, a substrate to which HRP was not added (a substrate on which only a linker was fixed) was also prepared.
過酸化水素の最適濃度を明らかにするために3種類の濃度で検討した。8.82 mMの過酸化水素水25、50、75 μLと50 mMフェノール溶液0.4 mL、PB 0.6 mLを混合した溶液に浸漬し、90秒ごとに繰り返し吸光度を測定した。 In order to clarify the optimum concentration of hydrogen peroxide, three concentrations were examined. The sample was immersed in a solution prepared by mixing 25, 50, and 75 μL of 8.82 mM hydrogen peroxide solution with 0.4 mL of 50 mM phenol solution and 0.6 mL of PB, and the absorbance was measured every 90 seconds.
3-3.HRP固定密度と銀シェル溶解の抑制反応
(3-1)と同様に銀シェル金ナノロッド固定化基板をPAH溶液に2時間浸漬させたのち、純水洗浄、air乾燥後PSS溶液に1時間浸漬、純水洗浄、air乾燥後さらにPAH溶液に1時間浸漬し同様に純水洗浄、air乾燥を行い、ポリマー積層を4層に増やした基板を準備した。この基板をDE-030AS溶液（両末端スクシンイミド）20 mg/mL、1 mL（in PB）に浸漬し、15分後1 mg/mL HRP水溶液1 mLを添加し浸漬させた。浸漬後再度洗浄、乾燥してHRP固定化基板を二枚作製した。また、コントロールとしてHRPを添加しなかった基板（リンカーのみ固定した基板）も二枚用意した。
3-3.HRP fixed density and silver shell dissolution inhibition reaction
As in (3-1), the silver shell gold nanorod fixed substrate is immersed in a PAH solution for 2 hours, then washed with pure water, air-dried, then immersed in PSS solution for 1 hour, washed with pure water, air-dried, and further PAH solution In the same manner, pure water washing and air drying were carried out for 1 hour to prepare a substrate with a polymer layer increased to four layers. This substrate was immersed in DE-030AS solution (both ends succinimide) 20 mg / mL, 1 mL (in PB), and after 15 minutes, 1 mL of 1 mg / mL HRP aqueous solution was added and immersed. After immersion, the substrate was washed and dried again to produce two HRP-immobilized substrates. In addition, as a control, two substrates to which HRP was not added (substrate in which only the linker was fixed) were prepared.
HRP固定基板 （Sample a）とHRPの無いコントロール基板 （Sample b）を8.82 mMの過酸化水素水75 μL、50 mMフェノール溶液0.4 mL、PB 0.6 mLを混合した溶液に浸漬し、90秒ごとに繰り返し吸光度を測定した。また、別のコントロールとしてHRP固定基板 （Sample c）とHRPの無いコントロール基板 （Sample d）を8.82 mM過酸化水素水75 μL、PB 1.0 mL（フェノールを含まない溶液）に浸漬させ同様の操作を行った
[結果]
3-1. HRPを用いた銀シェル溶解の抑制反応
ポリマー積層数を増やして作製した基板を繰り返し浸漬させた時の消失スペクトルを図17に示す。HRPとフェノールが存在する場合は銀シェルの溶解が抑制されスペクトル変化は小さい（図17(a)）。一方、HRPがない場合は銀シェルの溶解が速やかに進行する（図17(b)）。また、HRPが基板表面に存在していれば、銀シェルの溶解はある程度抑制されることがわかった。図18は長軸由来のピークにおける吸光度変化のプロットである。HRPとフェノールの共存によって銀シェルの溶解が抑制されることが明確に見て取れる。
Immerse the HRP fixed substrate (Sample a) and the HRP-free control substrate (Sample b) in a mixture of 8.82 mM hydrogen peroxide solution 75 μL, 50 mM phenol solution 0.4 mL, and PB 0.6 mL every 90 seconds. Absorbance was measured repeatedly. As another control, immerse the HRP fixed substrate (Sample c) and the HRP-free control substrate (Sample d) in 75 μL of 8.82 mM hydrogen peroxide solution and 1.0 mL of PB (phenol-free solution). went
[result]
3-1. Inhibition of dissolution of silver shell using HRP The disappearance spectrum when a substrate prepared by increasing the number of laminated reaction polymer layers is repeatedly immersed is shown in FIG. When HRP and phenol are present, dissolution of the silver shell is suppressed and the spectral change is small (FIG. 17 (a)). On the other hand, in the absence of HRP, the dissolution of the silver shell proceeds rapidly (FIG. 17 (b)). It was also found that the dissolution of the silver shell was suppressed to some extent if HRP was present on the substrate surface. FIG. 18 is a plot of absorbance change at the peak derived from the long axis. It can be clearly seen that the dissolution of the silver shell is suppressed by the coexistence of HRP and phenol.
3-2.銀シェル溶解の抑制反応のその場観察と過酸化水素濃度最適化
得られたスペクトルを図19に示す。いずれの場合もHRPを基板に固定した基板（(b), (d), (f)）の方が、HRPの無い基板（(a), (c), (e)）よりもスペクトル変化が小さかった。その場測定でも明確にHRPの銀シェル溶解抑制を見て取ることができる。過酸化水素の濃度は0.66 mMのものがHRPの有無によるスペクトル変化が一番はっきりしており、0.66 mMが至適過酸化水素濃度であることがわかった。
3-2. In-Situ Observation of Inhibition Reaction of Silver Shell Dissolution and Optimization of Hydrogen Peroxide Concentration Fig. 19 shows the obtained spectrum. In both cases, the substrate with HRP fixed to the substrate ((b), (d), (f)) has a spectrum change more than the substrate without HRP ((a), (c), (e)). It was small. In-situ measurements can clearly see the inhibition of HRP silver shell dissolution. The hydrogen peroxide concentration of 0.66 mM showed the clearest spectral change with and without HRP, and 0.66 mM was found to be the optimal hydrogen peroxide concentration.
3-3. HRP固定密度と銀シェル溶解の抑制反応
消失スペクトル変化を図20に示す。HRPありフェノールあり(a)に比較して、HRPあるいはフェノールの無い場合のスペクトル変化は(3-1)、(3-2)と比較して明らかに大きく、HRP固定密度の増加が銀シェルの過酸化水素による溶解をより効率良く抑制することに寄与していることがわかった。
3-3. Inhibition reaction of HRP fixed density and dissolution of silver shell Fig. 20 shows the change in disappearance spectrum. Compared to (a) with HRP and phenol (a), the spectral change in the absence of HRP or phenol is clearly larger than in (3-1) and (3-2), and the increase in HRP fixed density is greater in the silver shell. It was found that this contributes to more efficient suppression of dissolution by hydrogen peroxide.
Claims (9)
銀溶解性物質
を用い；
対象物質の存在又は量に相関して、銀溶解性物質を発生させ又は銀溶解性物質を消失させ、そして
銀シェルの溶解に関連する粒子の分光特性の変化の有無又は程度を指標に、対象物質の存在及び／又は量を検出する工程を含む、物質の検出方法。 Using a silver shell gold nanorod having a silver shell and a gold nanorod core, and a silver soluble material;
In relation to the presence or amount of the target substance, the target is based on the presence or absence or degree of change in the spectral characteristics of the particles that are related to the generation or disappearance of the silver-soluble substance and the dissolution of the silver shell. A method for detecting a substance, comprising detecting the presence and / or amount of the substance.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011196528A JP5762225B2 (en) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | Analysis method using silver shell gold nanorods |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011196528A JP5762225B2 (en) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | Analysis method using silver shell gold nanorods |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013057605A JP2013057605A (en) | 2013-03-28 |
| JP5762225B2 true JP5762225B2 (en) | 2015-08-12 |
Family
ID=48133602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011196528A Expired - Fee Related JP5762225B2 (en) | 2011-09-08 | 2011-09-08 | Analysis method using silver shell gold nanorods |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5762225B2 (en) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6241929B2 (en) * | 2013-11-29 | 2017-12-06 | 学校法人東京理科大学 | Preparation method of heterogeneous composite metal nanoparticles |
| JP2017095744A (en) * | 2015-11-19 | 2017-06-01 | 大日本塗料株式会社 | Composition for detecting test substance containing gold nanorod and usage thereof |
| CN105842181B (en) * | 2016-06-03 | 2018-09-18 | 盐城工学院 | A method of detecting cyanide ion based on gold nanorods |
| CN109580563A (en) * | 2018-11-23 | 2019-04-05 | 南方科技大学 | A kind of nano-sensor and its preparation method and application |
| CN110618093B (en) * | 2019-08-16 | 2022-06-17 | 深圳大学 | Application of nano probe complex system in tumor marker detection kit |
| CN111624186B (en) * | 2020-06-24 | 2021-03-16 | 江南大学 | Enterotoxin spectral analysis method based on fluorescence and Raman double-signal enhancement |
| CN112881585B (en) * | 2021-01-12 | 2023-03-31 | 赣南师范大学 | Silver source detection method based on nano-enzyme catalysis driving |
| CN113418915A (en) * | 2021-07-01 | 2021-09-21 | 湖南智享未来生物科技有限公司 | Plasma resonance chromogenic enzyme-linked immunoassay method for detecting serum cancer antigen quantity |
| CN113510239B (en) * | 2021-07-07 | 2022-12-09 | 黄河科技学院 | Gold nanorod based on silver coating, and preparation method and application thereof |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1021554B1 (en) * | 1996-04-25 | 2007-03-21 | Genicon Sciences Corporation | Analyte assay using particulate labels |
| CA2377722A1 (en) * | 1999-07-16 | 2001-01-25 | Wm. Marsh Rice University | Metal nanoshells for biosensing applications |
| US7348182B2 (en) * | 2000-10-03 | 2008-03-25 | Mirari Biosciences, Inc. | Directed microwave chemistry |
| GB0412659D0 (en) * | 2004-06-07 | 2004-07-07 | Inverness Medical Switzerland | Method |
| JP4915741B2 (en) * | 2007-07-31 | 2012-04-11 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | Test substance measurement method |
| JP5055433B2 (en) * | 2007-11-26 | 2012-10-24 | ザ セクレタリー オブ ステイト フォー イノベーション ユニバーシティーズ アンド スキルズ オブ ハー マジェスティズ ブリタニック ガバメント | Electrochemical detection of metal-labeled specimens |
| JP5327877B2 (en) * | 2008-02-01 | 2013-10-30 | 国立大学法人九州大学 | Method for producing metal nanomaterial and metal nanomaterial obtained thereby |
| JP5371302B2 (en) * | 2008-07-15 | 2013-12-18 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | Single probe molecular device and single probe molecule fixed metal fine particle |
| KR101247610B1 (en) * | 2009-12-11 | 2013-03-26 | 서울대학교산학협력단 | Dimeric core-shell nanoparticles labeled with Raman active molecule localized at interparticle junction, use thereof and method for preparing thereof |
| JP5715154B2 (en) * | 2009-12-14 | 2015-05-07 | ユニバーシティ オブ メリーランド，ボルチモア カウンティ | Plasmon Electric |
-
2011
- 2011-09-08 JP JP2011196528A patent/JP5762225B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2013057605A (en) | 2013-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5762225B2 (en) | Analysis method using silver shell gold nanorods | |
| Yaraki et al. | Metal nanoparticles‐enhanced biosensors: synthesis, design and applications in fluorescence enhancement and surface‐enhanced Raman scattering | |
| Krajczewski et al. | Plasmonic nanoparticles in chemical analysis | |
| Babaee et al. | Determination of Hg2+ and Cu2+ ions by dual-emissive Ag/Au nanocluster/carbon dots nanohybrids: switching the selectivity by pH adjustment | |
| Kim et al. | One‐Pot Synthesis of Multifunctional Au@ Graphene Oxide Nanocolloid Core@ Shell Nanoparticles for Raman Bioimaging, Photothermal, and Photodynamic Therapy | |
| Akbari jonous et al. | An electrochemical biosensor for prostate cancer biomarker detection using graphene oxide–gold nanostructures | |
| Cai et al. | Chiral shell core–satellite nanostructures for ultrasensitive detection of mycotoxin | |
| Yaraki et al. | Recent advances in metallic nanobiosensors development: colorimetric, dynamic light scattering and fluorescence detection | |
| Shukla et al. | Optimization of plasmonic U-shaped optical fiber sensor for mercury ions detection using glucose capped silver nanoparticles | |
| Liu et al. | A gold nanorod based colorimetric probe for the rapid and selective detection of Cu 2+ ions | |
| Rossi et al. | Glucose oxidase–magnetite nanoparticle bioconjugate for glucose sensing | |
| Quyen et al. | Self-focusing Au@ SiO 2 nanorods with rhodamine 6G as highly sensitive SERS substrate for carcinoembryonic antigen detection | |
| El Kurdi et al. | Tuning the surface of Au nanoparticles using poly (ethylene glycol)-block-poly (propylene glycol)-block-poly (ethylene glycol): enzyme free and label free sugar sensing in serum samples using resonance Rayleigh scattering spectroscopy | |
| Alizadeh et al. | A review on gold nanoparticles aggregation and its applications | |
| US20120107952A1 (en) | Microwave-accelerated plasmonics | |
| Abdelhamid et al. | Synthesis and multifunctional applications of quantum nanobeads for label-free and selective metal chemosensing | |
| Wang et al. | Hybrid silver nanoparticle/conjugated polyelectrolyte nanocomposites exhibiting controllable metal-enhanced fluorescence | |
| Asselin et al. | Metal-enhanced fluorescence and FRET in multilayer core-shell nanoparticles | |
| JP2009520207A (en) | Switchable radiation detection of nanocrystals | |
| Kha et al. | Improved Raman and photoluminescence sensitivity achieved using bifunctional Ag@ SiO 2 nanocubes | |
| Zhang et al. | Bifunctional quantum dot-decorated Ag@ SiO 2 nanostructures for simultaneous immunoassays of surface-enhanced Raman scattering (SERS) and surface-enhanced fluorescence (SEF) | |
| US20100179075A1 (en) | Particles for use in supported nucleic acid ligation and detection sequencing | |
| Jun et al. | Silica Core‐based Surface‐enhanced Raman Scattering (SERS) Tag: Advances in Multifunctional SERS Nanoprobes for Bioimaging and Targeting of Biomarkers# | |
| Deng et al. | Target-triggered signal turn-on detection of prostate specific antigen based on metal-enhanced fluorescence of Ag@ SiO2@ SiO2-RuBpy composite nanoparticles | |
| Zhang et al. | Multifunctional microspheres encoded with upconverting nanocrystals and magnetic nanoparticles for rapid separation and immunoassays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20140902 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140908 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140909 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20150430 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150511 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150609 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5762225 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |