JP5761028B2

JP5761028B2 - 細胞電位測定容器及びその製造方法

Info

Publication number: JP5761028B2
Application number: JP2011544240A
Authority: JP
Inventors: 慎二森元; 由以萩原
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2030-11-22
Also published as: US20120286762A1; WO2011068057A1; EP2508875A1; JPWO2011068057A1; EP2508875A4; US8957663B2

Description

本発明は、電位測定装置に搭載して細胞の電位を測定するための細胞電位測定容器及びその製造方法に関する。

現代の新規薬物開発においては、薬物が引き起こす毒性について早期に見極めを行うことが求められている。この毒性の一種として、患者が重篤な不整脈を引き起こす疾患である薬物誘発性（後天性）ＱＴ延長症候群が知られている。

薬物誘発性ＱＴ延長症候群は、薬物の投与後に心電図上でのＱＴ間隔の延長がおこり、TdP（Torsades de pointes、トルサード・ド・ポアンツ＝非持続性多形性心室頻脈）から、しばしば心室細動が起こり、失神、突然死をきたす重篤な疾患である。実際、1980年以降に米国市場で販売中止となった25品目の薬物のうち、5品目は薬物誘発性ＱＴ延長症候群を引き起こす疑いが認められた。

このため、薬物が引き起こす毒性を見極めるために、薬物を投与した培養液中の細胞の電位の変化から、薬物がイオンチャネルの活動に与える影響を観察する測定方法が開示されている（非特許文献１）。この測定方法は、細胞電位測定容器を電位測定装置に搭載して行われる。この細胞電位測定容器は、培養液と共に細胞を収容する複数のウェルを備え、かつ、各ウェルの底面には、測定電極及び参照電極が配設されている。

しかしながら、上述の測定システムにおいて、測定対象の細胞が弱体化又は死滅してしまい、正確に細胞電位が測定できないことがあった。

URL:http://www.brck.co.jp/MCS/qtscreencataloguejp1.pdf

本発明は、細胞電位測定容器を用いた細胞の電位測定において、測定対象の細胞が弱体化又は死滅することなく、正確な測定結果を得ることができる細胞電位測定容器を提供することを課題とする。

かかる課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、細胞毒性の強い銅の溶出を抑える方法を発見し、本発明に至った。

本発明は、容器胴体部及び電極基板を含み、前記容器胴体部の下端に前記電極基板を接合して複数のウェルを形成してなり、電位測定装置に搭載して細胞の電位を測定するための容器であって、前記容器胴体部は、上端及び下端が開口した複数の筒状部を備え、前記電極基板は、基板本体と、前記基板本体の片面に配設された複数の測定電極及び複数の参照電極を備え、前記複数の測定電極及び複数の参照電極は、少なくとも銅配線上に金属をメッキしたものであり、前記複数のウェルにそれぞれの底面において、１対の測定電極及び参照電極が配設してなり、前記複数の測定電極及び複数の参照電極は、先メッキ法により形成されたことを特徴とする細胞電位測定容器を提供する。

本発明は、また、電位測定装置に搭載して細胞の電位を測定するための容器の製造方法であって、前記容器は、容器胴体部及び電極基板を含み、前記容器胴体部の下端に前記電極基板を接合して複数のウェルを形成してなり、前記容器胴体部は、上端及び下端が開口した複数の筒状部を備え、前記電極基板は、基板本体と、前記基板本体の片面に配設された複数の測定電極及び複数の参照電極を備え、前記複数の測定電極及び複数の参照電極は、少なくとも銅を含み、前記複数のウェルにそれぞれの底面において、１対の測定電極及び参照電極が配設してなる容器であって、前記複数の測定電極及び複数の参照電極は、先メッキ法により形成されてなることを特徴とする細胞電位測定容器の製造方法を提供する。

本発明の細胞電位測定容器は、各ウェルにおいて複数の新規薬物候補の化合物に対する細胞の電位変化を測定するためのシステムに用いる使い捨ての一部品である。本発明の細胞電位測定容器は、専用の電位測定装置（図示せず）に搭載して用いられる。その構成は、複数のウェルを有する。この複数のウェルは、容器胴体部の下端に電極基板を接合することにより形成される。つまり、容器胴体部は各ウェルの側壁となり、電極基板は各ウェルの底面となる。形成されたウェルは測定時に用いる液体（通常は培養液）を収容することができる程度に液密である。そして、各ウェルの底面にはそれぞれ測定電極及び参照電極が配設されている。これにより、各ウェルにおいて細胞の電位を測定することができる。尚、本発明において、「細胞」とは、１の細胞のみだけではなく、複数の細胞が凝集した細胞塊（スフェロイド）も含むものとして解釈しなければならない。

本発明の細胞電位測定容器は、上述したように使い捨てのものである。したがって、製品を安価とすべく、少なくとも容器胴体部は全て樹脂製であることが望ましい。樹脂は、容器胴体部が成型可能であり、電気絶縁性であれば、本発明においては特に限定されるものではない。樹脂の具体例を挙げるとするならば、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエステル及びポリカーボネート等が挙げられる。特に、材料費が安価であり、かつ透明性が高く、見た目がよい観点から、樹脂はポリスチレンが好ましい。また、容器胴体部の製造方法は、当該容器胴体部の製造が容易であれば必ずしも限定されるものではないが、容器胴体部の構造が複雑であることを考慮すると、通常は射出成型で製造するのが望ましい。

筒状体は、上端及び下端が開口されている。上端が開口しているのは、測定時における細胞や培養液を収容するためであり、下端が開口しているのは、後述する電極基板を底面とするためである。尚、筒状体の形状は、本発明においては特に限定されるものではないが、製造が容易である観点から、円筒形であることが望ましい。

一方、電極基板は、基板本体と、当該基板本体の片面上に複数の測定電極及び複数の参照電極が配設される。

基板本体は、いわゆる電気絶縁性の材料からなる。その材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ポリカーボネート、アクリル樹脂、紙フェノール、紙エポキシ、ガラスエポキシ等を含むガラスコンポジット及びアルミナ等が挙げられるが、測定電極及び参照電極の構築が容易であり、機械的強度があり、コストが安価である観点から、一般的にはガラスエポキシが選定されることが多い。但し、本発明は、これら基板本体の材料に限定されるものではない。

測定電極は、細胞が接触して、細胞のイオンチャネルの活動を電位として測定する電極であり、参照電極は、測定時に用いる液体（通常は培養液）と接触していわゆる基準となる電位を測定する電極である。測定電極及び参照電極は、電極基板が容器胴体部と接合してウェルを形成した際に、各ウェルの底面においてそれぞれ１つずつ存在するような位置に配設される。勿論、各ウェルの底面においても測定電極及び参照電極は電気的に接続されるものではない。測定電極及び参照電極のメッキに使用される材料は、例えば、金、銀、炭素、白金、酸化ルテニウム及びパラジウム等が挙げられる。これらの材料は、基板本体上に形成した銅配線にメッキされる。

本発明においては、測定電極及び参照電極は、いわゆる先メッキ法により形成される。先メッキ法とは、あらかじめ金属めっき処理された銅配線を有する基板本体上に、特定の熱硬化性樹脂ペースト（ソルダーレジスト）を印刷し、当該熱硬化性樹脂を硬化させて保護膜を形成する電極の製造方法をいう。これにより、前記複数の測定電極及び複数の参照電極から前記ウェルに収容される液体への銅の溶出量が抑えられる。ここで、銅の溶出量とは、電極基板１枚を培地中に浸漬して、一定時間経過後の培地の単位体積当たりの銅の増加量をいう。より具体的には、
（Ａ）銅の溶出量を、ウェルに収容前からウェルに収容後２４時間経過時の培地の単位体積当たりの銅の増加量とするならば、０．２ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは、０．１ｍｇ／Ｌ以下、最も好ましくは、０．０５ｍｇ／Ｌ以下となる。
（Ｂ）銅の溶出量を、ウェルに収容前からウェルに収容後４８時間経過時の培地の単位体積当たりの銅の増加量とするならば、０．４ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ以下、最も好ましくは、０．１ｍｇ／Ｌ以下となる。
（Ｃ）銅の溶出量を、ウェルに収容前からウェルに収容後１６８時間経過時の培地の単位体積当たりの銅の増加量とするならば、０．８ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは、０．４ｍｇ／Ｌ以下、最も好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ以下となる。

銅濃度の測定は、従来公知の技術が使用でき、例えば、ＩＣＰ発光分析装置、紫外可視分光光度計、原子吸光分光光度計、イオンクロマトグラフ及び蛍光Ｘ線分析装置などによる測定が挙げられる。ウェルに収容する液体は、特に限定されるものではないが、本発明の細胞電位測定容器等を用いる細胞電位の測定において通常使用される培地を用いればよい。尚、例え、当該培地に多少の銅を含んでいたとしても、上述の銅の溶出量は、銅の増加量（変化量）を測定するものであるため、問題ではない。但し、上述したように銅は細胞電位の測定に影響するものであるから、細胞電位の測定に用いる液体としては、銅を含まない液体を用いることが望ましい。

先メッキ法自体は、基板形成技術における公知な技術である。しかしながら、本発明のような細胞電位測定容器において、ウェルに収容される液体へ銅が溶出することはこれまでに知られていない。ましてや、当該銅が、測定対象の細胞を弱体化又は死滅させ、ひいては細胞電位の測定に影響を及ぼすことは、当業者であっても予測できなかったことである。

尚、容器胴体部及び電極基板の接合は、本発明においては特に限定されるものではない。例えば、従来の細胞電位測定容器と同様に、両面テープ又は接着剤による接合を挙げることができる。

本発明の細胞電位測定容器は、測定電極及び参照電極からウェルに収容される液体へ銅が溶出しないため、正確な測定結果を得ることができる。

本発明の細胞電位測定容器の分解斜視図である。比較例１の細胞電位測定容器を用いて細胞の電位の測定３日後の心筋細胞の様子を示す写真である。

以下、本発明の実施態様について図を用いて説明するが、本発明は、以下に説明する実施態様に限定して解釈してはならない。

［実施例１］
図１は、本発明の細胞電位測定容器の分解斜視図である。本発明の細胞電位測定容器は、主として容器胴体部１、電極基板２により構成される。樹脂製の容器胴体部１は、上端及び下端が開口した複数の円筒形の筒状部１１を備える。各筒状体１１の内腔の構造に関しては後述する。各筒状体１１は、ウェルの側壁を構築する。

一方で、電極基板２は、ウェルの底面を構築する。電極基板２は、電気絶縁性の材料からなる基板本体２１を備え、当該電極基板２１上に複数の測定電極２２及び参照電極２３が配設される。複数の測定電極２２及び参照電極２３は、少なくとも銅を含む。測定電極２２及び参照電極２３は、先メッキ法で製造した。図１における電極基板２における測定電極２２は、Ｃ字型の参照電極２３の略中心に配設されている。そして、全ての測定電極２２及び参照電極２３はそれぞれ独立した測定電極のリード線２２１及び参照電極のリード線２３１により電極基板の一辺に一列に並んだコネクタ２４までリード（ｌｅａｄ）される。参照電極２３の形状がＣ字型であるのは、測定電極２２をコネクタ２４までリード（ｌｅａｄ）するために、測定電極のリード線２２１を配設するためのスペースを確保するためでもある。コネクタ２４は、図示しないが、電極基板２の裏面（測定電極２２及び参照電極２３が配設されていない面）にも配設される。そして、専用の電位測定装置（図示せず）に本発明の細胞電位測定容器を載置した際に、電極基板２の裏面におけるコネクタ２４は、当該専用の電位測定装置と電気的に接続され、細胞の電位の測定を可能とする。

［比較例１］
上記実施例１の細胞電位測定容器において、先メッキ法の代わりに後メッキ法で製造したこと以外は、実施例１と同様である。

図２は、比較例１の細胞電位測定容器を用いて心筋細胞（リプロセル社保有）の培養を開始してから３日後の様子を示す写真である。尚、測定時に用いる液体としては霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル）を用いた。また、使用した心筋細胞はカニクイザルＥＳ細胞由来であり、多数の細胞から構成された塊状物質である。比較例における心筋細胞の塊は、時間の経過毎に拍動が弱体化し、３日後には破壊され死滅していた。また、比較例１における霊長類ＥＳ細胞用培地は、変色していた。一方で、実施例１の細胞電位測定容器での心筋細胞は測定から４日経過しても細胞は拍動が弱体化することなく生存していることが確認できた。

表１は、製造ロットが異なる２種類の実施例１の細胞電位測定容器（実施例１−１、実施例１−２）に使用した電極基板と、製造ロットが異なる２種類の比較例１の細胞電位測定容器（比較例１−１、比較例１−２）に使用した電極基板をＲＰＭＩ１６４０培地１００ｍＬに浸漬させ、一定経過時間毎に１０ｍＬサンプリングして、銅濃度（ｍｇ／Ｌ）をＩＣＰ発光分析装置（島津製作所：ＩＣＰＳ−８０００）にて測定した結果である。

実施例において、銅はＲＰＭＩ１６４０培地に全く溶出していないのに対して、比較例において、銅はＲＰＭＩ１６４０培地に溶出していることが明らかとなった。

尚、本発明の細胞電位測定容器を用いた細胞の電位の測定方法は、従来の細胞電位測定容器を用いた方法を参照することができる。

本発明は、測定対象の細胞が弱体化又は死滅することなく、正確に細胞の電位の測定を可能とするため、迅速な薬物のスクリーニングを実現し、新薬開発の一助となるであろう。

１容器胴体部
１１筒状体
２電極基板
２１基板本体
２２測定電極
２２１測定電極のリード線
２３参照電極
２３１参照電極のリード線
２４コネクタ

Claims

容器胴体部及び電極基板を含み、前記容器胴体部の下端に前記電極基板を接合して複数のウェルを形成してなり、電位測定装置に搭載して細胞の電位を測定するための容器であって、
前記容器胴体部は、
上端及び下端が開口した複数の筒状部を備え、
前記電極基板は、
基板本体と、前記基板本体の片面に配設された複数の測定電極及び複数の参照電極を備え、
前記複数の測定電極及び複数の参照電極は、少なくとも銅配線上に金属をメッキしたものであり、
前記複数のウェルにそれぞれの底面において、１対の測定電極及び参照電極が配設してなり、
前記複数の測定電極及び複数の参照電極は、先メッキ法により形成された
ことを特徴とする細胞電位測定容器。
電位測定装置に搭載して細胞の電位を測定するための容器の製造方法であって、
ここで、
前記容器は、容器胴体部及び電極基板を含み、前記容器胴体部の下端に前記電極基板を接合して複数のウェルを形成してなり、
前記容器胴体部は、
上端及び下端が開口した複数の筒状部を備え、
前記電極基板は、
基板本体と、前記基板本体の片面に配設された複数の測定電極及び複数の参照電極を備え、
前記複数のウェルにそれぞれの底面において、１対の測定電極及び参照電極が配設してなり、
少なくとも銅を含む配線を先メッキ法に供することにより前記複数の測定電極及び複数の参照電極を形成する工程
を包含する、方法。