JP5754026B2

JP5754026B2 - 霊長類胚幹細胞または胚様状態細胞から臨床的使用のための霊長類心血管前駆細胞を作製するための方法、およびそれらの応用

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Publication number: JP5754026B2
Application number: JP2010550178A
Authority: JP
Inventors: フィリップ、メナシュ; ミシェル、ピュスア; ジェローム、ラルゲロ; ギョーム、ブラン; ダビド、ヌリー; ソニア、ステファノビク
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes; Universite Paris Diderot Paris 7
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes; Universite Paris Diderot Paris 7
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2029-03-10
Also published as: WO2009112496A1; EP2268795A1; EP2100954A1; IL208082A; US8361796B2; CA2718032C; JP2011512855A; IL208082A0; EP2268795B1; AU2009224684B2; AU2009224684A1; DK2268795T3; US20110014691A1; CA2718032A1

Description

発明の背景

本発明は、哺乳類胚幹細胞（ＥＳ細胞）または哺乳類胚様状態細胞から、好ましくは霊長類のものからの心血管前駆細胞のin vitro調製のための方法であって、陽性心血管前駆細胞分化マーカーとしてＣＤ１５（ＳＳＥＡＩ）マーカーを使用することを含む方法に関する。本発明はまた、所望の分化の効率を高めるためにＢＭＰ２を伴って受容体チロシンキナーゼ阻害剤、特にＳＵ５４０２またはＳＵ１１２４８を使用することも特許請求した。本発明はまた、多能性を維持する霊長類ＥＳ細胞増殖または繁殖を目的とする培養培地において動物胎児血清代用品として血小板溶解液を使用することにも関する。主張した方法に関連して派生した組成物もしくはキットまたは主張した方法によって得ることができる産物も本発明の一部を形成する。

心不全は、重要な疾患になりつつあり、先進国の大部分において死亡原因の第１位である。心筋障害の原因（すなわち、虚血性または遺伝性）に関わらず、その臨床症状は、主として、繊維性の非収縮組織によって置き換えられた心筋細胞の死から起こる。心不全を治癒または軽減する薬理学的アプローチは限界に直面している。心臓の限られた再生能力［１］と心臓移植のためのドナーの不足から、外部の細胞源が、病的心筋に機能の増加をもたらすための治療的解決法として考えられた。ここ数年、造血幹細胞は、病的心筋を修復するための潜在的自己細胞源として多くの希望を抱かせた。しかしながら、初期の非対照第１相試験によって起こった意欲は、心筋梗塞直後に骨髄由来細胞の冠動脈内注入を伴う４つの無作為化対照トライアルのうち、３つのトライアルでそれらの主要エンドポイント、すなわち、左心室駆出率の改善を満たしていなかったという最近の評価によって削がれた［２−５］。これらの細胞の心臓形成能に反証する基礎研究［６−７］と合わせて考えると、これらのトライアルの結果は、これらの細胞は病的心筋を全く再生せず、それらの傍分泌作用は瘢痕が広範囲に生じた心筋の機能を回復させるのに十分であるという可能性は低い［８］ということを実証している。同じ限界が骨格筋芽細胞にも当てはまる［９］。そのため、これらの研究結果から心筋再生を達成するためのもう１つの幹細胞源が必要である。他の様々な細胞種の間では、胚幹（ＥＳ）細胞［１０−１２］またはＥＳ細胞由来心筋細胞［１３−１４］は、新しい収縮要素によって瘢痕の繊維化を置き換えるための最も有望なものにまでなった。しかしながら、梗塞後のヒト心筋を再生するのに必要な細胞の数（すなわち、数億）は多すぎてＥＳ細胞由来心筋細胞のin vitro操作では合理的に達成することはできない。ここ数年、本発明者らは、病的心筋に生着した増殖マウスＥＳ細胞は心臓形成のモルフォゲンＢＭＰ２を用いたin-vitroでの委任を受けて機能的な心筋細胞へとさらに分化することを示してきた［１０−１２］。心臓特異的細胞は、その後、瘢痕に存在する局所刺激に反応してそれらの分化を完了し、腫瘍を全く発生させない。

霊長類胚幹（ＥＳ）細胞は、自己再生し３つの胚葉（すなわち、外胚葉、内胚葉および中胚葉）のいずれの細胞系譜にも分化する能力を特徴とする［３５］。しかしながら、ＥＳ細胞の特定の細胞系譜への自然分化は、特に霊長類ＥＳ細胞では、効率は低い。ヒトＥＳ細胞は自己再生または自然分化能力についてマウスＥＳ細胞と同じ分子機構を共有しない［１５］。この１０年の間に、研究所はマウスおよびヒトＥＳ（ＨＥＳ）細胞を好みの細胞種へと向けるプロトコールを開発してきた。これらのプロトコールは、（ｉ）ＥＳ細胞分化の基礎にある遺伝的機構および後成的機構をさらに多く調査しそれにより理解すること、（ｉｉ）毒性学モデルとしてＥＳ細胞由来分化細胞を用いること（ｉｉｉ）新規心臓形成分子、心臓遺伝性疾患マーカーまたは新規治療薬を発見することを目的としてＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング(High Throughput Screening)）を実施すること［３６−３７］（ｉｖ）心不全の細胞療法のプロトコールを設計すること［３８］：を必要とする。

従って、多数の霊長類ＥＳ細胞または胚様状態細胞を心血管系へと特異的にin vitro分化させることができる方法により、梗塞を起こした心筋への移植後、全く過剰増殖の様子もなく、その後in situで心筋細胞に分化することができる臨床用の細胞を提供する明確な必要性がある。

これに関連して、霊長類ＥＳ細胞または胚様状態細胞を心血管系に委任し、梗塞後瘢痕を増殖させ、再配置する能力を保持している初期心血管前駆細胞集団を選別させるための、自由に使える簡単で再現性のあるプロトコールをさらに有することは価値があるであろう。

これが本発明の目的である。

本明細書において、本発明者らは、霊長類ＥＳ細胞、例えば、ヒトＥＳ細胞または胚様状態細胞も、モルフォゲンＢＭＰ２を、受容体チロシンキナーゼ阻害剤を伴って用いて心臓形成および血管の運命へと向けることができ、そしてこのようにして得られたこれらの心血管前駆細胞を、陽性ＣＤ１５（ＳＳＥＡ１）バイオマーカーを用いることによって選択的に集めることができるという概念実証を提示する。さらに、これらの細胞は、心筋の瘢痕への生着後、全く過剰増殖の様子なく心筋細胞に分化する。これらのデータは、梗塞後瘢痕を増殖させ、再配置する能力を保持する初期心血管前駆細胞の使用のための道を開く。

よって、本発明は、霊長類心血管前駆細胞の実質的に純粋な集団を得るための方法、ならびにこれらの細胞集団を含む、治療組成物のような組成物およびこれらの細胞集団を使用する方法に関する。

第一の態様において、本発明は、哺乳類ＥＳ細胞からまたは哺乳類胚様状態細胞からの心血管前駆細胞の製造のための、好ましくは実質的に精製された心血管前駆細胞集団の製造のためのin vitro法であって、次の工程：
ａ）哺乳類ＥＳ細胞または胚様状態細胞を、それらの増殖を可能にし、それらの多能性を維持する好適な薬剤を含有する培地中で培養する工程；
ｂ）工程ａ）において得られた哺乳類多能性ＥＳ細胞または胚様状態細胞を、前記多能性ＥＳ細胞または胚様状態細胞をＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）含有培地中に懸濁することにより、心血管前駆細胞へと分化させる工程；および
ｃ）ＣＤ１５マーカーを膜表面において表示する、工程ｂ）において得られた分化した哺乳類ＥＳ細胞または哺乳類胚様状態細胞を、心血管前駆細胞として選択し、回収する工程
を含んでなる方法を提供する。

好ましい実施態様において、前記胚様状態細胞は、好ましくは成体体細胞から、特に成体繊維芽細胞からの人工多能性幹細胞（一般的にはｉＰＳ細胞と略される）である。

より好ましい実施態様において、前記ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４およびＮａｎｏｇをコードするｃＤＮＡを有するレンチウイルスに感染しているヒト皮膚繊維芽細胞を用い、好ましくはＥＳ細胞培養条件下で、得られる［４９］。

「多能性」とは、本明細書において、全能性を有する胚幹細胞の子孫であり、３つの胚葉（外胚葉、内胚葉および中胚葉）のいずれもから得られる細胞へと分化することができる多能性ＥＳ細胞由来細胞を示すことを意図している。

「ｉＰＳ細胞」とは、ある特定の遺伝子の発現を誘導することによって、非多能性細胞、一般には成体体細胞から人工的に誘導した多能性幹細胞を示すことを意図している。

哺乳類細胞から、特にマウス細胞からまたはヒト細胞からのｉＰＳ細胞の調製は当業者に周知である［４６−４９］。

好ましい実施態様において、本発明は、前記哺乳類細胞が霊長類、マウスまたはラット細胞、好ましくは霊長類細胞、より好ましくはヒト細胞である本発明によるin vitro法を提供する。

霊長類胚幹細胞は、霊長類種の構成員の胚盤胞から単離することができる（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号; Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995参照）。ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞は、Thomson et al.（米国特許第６，２００，８０６号; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998）およびReubinoff et al., Nature Biotech., 18:399, 2000によって記載された技術を用いてヒト胚盤胞細胞から調製することができる。

細胞培養方法は、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (R. I. Freshney ed., Wiley & Sons); General Techniques of Cell Culture (M. A. Harrison & I. F. Rae, Cambridge Univ. Press)の最新版、およびEmbryonic Stem Cells: Methods and Protocols (K. Turksen ed., Humana Press)に一般的に記載されている。組織培養用品および試薬は、Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.、およびICN Biomedicalsのような民間の製造供給元から入手可能である。

好ましい実施態様において、前記ＢＭＰ２タンパク質（ＢＭＰ−２とも名付けられている）はヒトＢＭＰ２、より好ましくは組換えｈＢＭＰ２、より好ましくはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ２１６４６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＢＭＰ２タンパク質である。

好ましい実施態様において、前記ＣＤ−１５マーカーはヒトＣＤ−１５（「ＳＳＥＡ１」マーカーとも名付けられており、「ＳＳＥＡ１」は「ステージ特異的胚抗原１(Stage Specific Embryonic Antigen 1)」にちなんでいる）である。

繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のような脈管形成増殖因子は、現在、癌などの疾患における無秩序な血管形成を抑制するための大きな試みの対象である。ＦＧＦおよびＶＥＧＦは、チロシンキナーゼ活性を備えている細胞表面発現受容体と特異的に結合することによってそれらの効果を発揮する。受容体キナーゼ活性の活性化により、内皮細胞の増殖、移動および分化を調節する下流のシグナル変換経路とのカップリングが可能になる。ＦＧＦおよび／またはＶＧＲ受容体のチロシンキナーゼ活性のようなチロシンキナーゼ活性の阻害剤は、現在臨床試験中である。

本発明者らは、驚くべきことに、そのような受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤、特にＦＧＦＲ阻害剤あるいは、特に、ＶＥＧＦ受容体（Ｒ−１および／またはＲ−２）、および／または胎児肝臓チロシンキナーゼ受容体３（ＦＬＴ３）、および／またはＫＩＴ（幹細胞因子［ＳＣＦ］受容体）、および／またはＰＤＧＦＲα、および／またはＰＤＧＦＲβのチロシンキナーゼ活性の阻害をもたらす多標的チロシンキナーゼ受容体阻害剤を工程ｂ）に用いて、霊長類ＥＳ細胞または胚様状態細胞の心血管前駆細胞への分化を、恐らくＢＭＰ２との相乗効果により向上させることができるということを実証した。

好ましい実施態様において、前記ＲＴＫ阻害剤は、ＳＵ５４０２およびＳＵ１１２４８からなる群から選択される。

ＳＵ５４０２化合物は、次式：
３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン(3-[3-(2-Carboxyethyl)-4-methylpyrrol-2-methylidenyl]-2-indolinone)
を有する。

ＳＵ５４０２は、繊維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）のチロシンキナーゼ活性を阻害する；（１ｍＭＡＴＰの存在下でＩＣ５０＝１０〜２０μＭ）。また、ＳＵ５４０２は、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のａＦＧＦによるチロシンリン酸化も阻害する（ＩＣ５０＝１０〜２０μＭ）。ＳＵ５４０２は、ＰＤＧＦ受容体のチロシンリン酸化の弱い阻害剤としか考えられず、インスリン受容体のリン酸化を阻害しない。ＳＵ５４０２は、ＥＧＦ受容体のキナーゼ活性を阻害しない(Mohammadi M. et al., 1997, Science 276, 955)。

ＳＵ１１２４８化合物（「リンゴ酸スニチニブ」または「Ｓｕｔｅｎｔ」とも称されるは、次式：
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリジン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド(N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(Z)-(5-fluoro-l,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidine)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide)
を有する。

スニチニブ（リンゴ酸スニチニブ；ＳＵ１１２４８；ＳＵＴＥＮＴ；Pfizer Inc, New York, NY）は、抗腫瘍活性および抗血管形成活性を有する多標的ＲＴＫ阻害剤である。スニチニブは、生物学的アッセイと細胞アッセイの両方によりＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、胎児肝臓チロシンキナーゼ受容体３（ＦＬＴ３）、ＫＩＴ（幹細胞因子［ＳＣＦ］受容体）、ＰＤＧＦＲ、およびＰＤＧＦＲβの強力な阻害剤であることが確認された(Faivre et al., Journal of Clinical Oncology, Vol. 24, N° 1, 2006: pp. 25-35)。

工程ｂ）においてＳＵ５４０２化合物をＦＧＦ阻害剤として用いる場合には、前記霊長類ＥＳ細胞または胚様状態細胞、特に前記ヒトＥＳ細胞（ＨＥＳ）またはヒト胚様状態細胞は、工程ｂ）において、１μＭＳＵ５４０２（±０．５μＭ）の存在下でＢＭＰ２濃度１０ｎｇ／ｍｌの培地（±５ｎｇ／ｍｌ）によりそれぞれ４８時間および６日間処理することが好ましい。１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２と１ｕＭＳＵ５４０２による６日の処理後に、前記胚様状態細胞（ｉＰＳ細胞）はトリプシン処理され得る。

これに関連して解決すべき問題の１つは、治療細胞の生産が、霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞を心臓系に委任することを望む場合に、治療化合物としてすでに使用されている、ＲＴＫ阻害剤などの、その製造方法に用いられる自由に使える化合物をさらに有することである。実際、これらの化合物は、関連する副作用はないことが分かっており、一般的に、臨床用化合物として利用可能である。

前記霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞を心臓前駆細胞（または患者への投与後、梗塞後瘢痕を増殖させ、再配置する能力を有する初期心血管前駆細胞）に分化させるための工程ｂ）におけるＦＧＦ阻害剤の相乗効果の実証後、本発明者らは、驚くべきことに、工程ｂ）においてＦＧＦ阻害剤の代わりに相乗化合物として、臨床用として入手可能な多標的ＲＴＫ阻害剤、例えば、ＳＵ１１２４８を用いることができるということを実証した。

好ましくは、ＦＧＦ阻害剤の代わりに多標的ＲＴＫ阻害剤、例えば、ＳＵ１１２４８を用いる場合には、前記霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞、特にヒトのものは、工程ｂ）において、上記の約５倍多い量を用い、５μＭＳＵ（±２μＭ）の存在下でＢＭＰ２濃度１０ｎｇ／ｍｌの培地（±５ｎｇ／ｍｌ）により４８時間で処理することが好ましい。

好ましい実施態様において、本発明は、実質的に純粋な前駆細胞集団を調製するための方法を提供し、この実質的に純粋な前駆細胞集団は、それらの細胞表面において前記マーカーＣＤ−１５を表示し、好ましくは患者への投与後に梗塞後瘢痕を増殖させ、再配置するそれらの能力を保持している、少なくとも約８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、９７％、９８％および９９％純粋な心臓前駆細胞群である。

本発明による方法の工程ａ）において、霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞を培養するための、それらの増殖を可能にし、かつ、それらの多能性を維持する培地は、当業者ならば周知である。

例えば、霊長類ＥＳ細胞は、それらの多能性を維持するためにそれらの培養のための支持細胞（例えば、マウス胎児繊維芽細胞）と、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）を必要とすることは分かっている。

「支持細胞」とは、前記霊長類ＥＳ細胞と共培養される細胞を示すことを意図している。支持細胞は、前記霊長類ＥＳ細胞型が増殖することができる環境を提供する。前記霊長類ＥＳ細胞の培養は、例示する初代マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）または初代ヒト包皮繊維芽細胞によって支持され得る。また、不死化マウス胎児繊維芽細胞またはヒト包皮繊維芽細胞も支持細胞として用いることができる。

霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞を培養するために用いることができる基礎培地の例については、Invitrogen社製（またはGibco社(Rockville, MD, USA)製）のＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ培地を挙げることができる。

ＦＧＦ２（繊維芽細胞増殖因子２、ｂＦＧＦとも名付けられている）は、支持細胞層上でＦＧＦ２を含まないＥＳ細胞または胚様状態細胞基礎培地を用いて少なくとも一晩の後に基礎培地に添加することが好ましい。

前記培養培地は、毎日交換することが好ましい。

一般的には、霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞の起源（サルまたはヒト起源）によってトリプシンまたはコラゲナーゼを用いて、前記細胞コロニーを４〜５日おきに単細胞または小細胞群に解離する。

前記ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞のコロニーがディッシュ内でコンフルエント状態に達しないようにすることが好ましい。

本発明による方法の工程ａ）において、霊長類ＥＳまたは霊長類胚様状態細胞を培養するための培地は、霊長類血液から、好ましくはヒト血液から得られる血小板溶解液を添加した、ＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ培地などの基礎培地を含んだ。

好ましくは、前記血小板溶解液は、完全ヒト凍結融解血小板溶解液であり、より好ましくは前記基礎培地中５％〜１５％（Ｖ／Ｖ）の濃度範囲にあり、最も好ましいのは７．５％（Ｖ／Ｖ）±２．５％の濃度にあることである。

本発明者らは、霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞のこの培養段階の基礎培地中に通常存在するＦＢＳ（ウシ胎児血清）内容物の代わりに血小板溶解液を使用することで、非分化霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞の増殖を得ることが可能になり、そのような血小板溶解液の使用により、この増殖または繁殖工程後に得られる霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞の多能性の維持が可能になるということを実証した。

ＦＢＳの代わりに用いる血小板溶解液の利益の１つは、感染性の微生物、ウイルスまたはプリオンによって起こり得るＦＢＳ汚染の問題が解消することであり、それゆえ、より安全性の高い治療細胞組成物が製造されることである。

前記血小板溶解液により細胞培養のウシ胎児血清を完全にまたは部分的に交換することができる。

そのような血小板溶解液を得るためには、全血を、例えば、好適には約＋４℃での、遠心分離により赤血球と多血小板血漿に分離する。

続いて、その多血小板血漿は限外濾過により濃縮することができ、その後、濃縮した多血小板血漿は、所望により、保存および／または分析ならびに含まれる血小板のさらなる溶解のために凍結する。任意選択の凍結後、凍結した血漿を、好ましくは３７℃より低い温度（２０℃より低いことがより好ましい）で、融解する。

濃縮多血小板血漿の融解後またはその前に、必要に応じて、含まれる血小板の完全溶解を促進するために水を添加することができる。

ＰＲＰは、治療細胞を受ける患者自身の血漿および／または血小板を用いてよい。血小板は、血漿またはＰＲＰ中に血小板約２００，０００〜２，０００，０００個／ｃｍ^３の範囲で、またはそれより多く存在し得る。ＰＲＰは、自己由来供給源だけでなく同種供給源、または様々な霊長類由来の血小板および／または血漿（ヒト由来のものを含む）のプール供給源を用いて得てよい。

本発明による方法の工程ｂ）において、霊長類ＥＳ細胞または霊長類胚様状態細胞を分化させるための基礎培地は、例えば、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ培地からなる群の中で選択することができる。

好ましい実施態様において、前記霊長類幹細胞または胚様状態細胞は、２％Ｂ２７と、１μＭＳＵ５４０２（研究用）または５μＭＳＵ１１５４８、ＳＵＴＥＮＴ（臨床用）とを添加したＲＰＭＩ中で１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２によりそれぞれ９６時間および６日間処理され得る。

ＢＭＰ２処理終了時に前記細胞がコンフルエント状態に達していないことが好ましい。また、ＥＳ細胞の小さなコロニーが現われたらすぐにＢＭＰ２を添加することも好ましい。

本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる実質的に精製された心臓前駆細胞集団を含み、この際、前記心臓前駆細胞群は、それらの膜表面において前記ＣＤ１５マーカーを表示し、好ましくはそれを必要とする患者に投与したときに梗塞後瘢痕を増殖させ、再配置するそれらの能力を保持している。

ある特定の実施態様において、本発明による心臓前駆細胞集団の細胞は、初期中胚葉のＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＴｂｘ６マーカー、心臓のＴｂｘ２０およびＭｅｆ２ｃマーカー、ＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５、Ｉｓｌ１、Ｔｂｘ１８マーカーならびにＯｃｔ−４Ａマーカーを発現する。

好ましくは、実質的に精製された集団とは、心臓前駆細胞が前記細胞群の約８０％より多い、好ましくは約９０％より多い、より好ましくは約９５％より多い、より好ましくは約９８％よりさらに多い、最も好ましくは約９９％より多いことを意味する。

本発明の実質的に精製された心臓前駆細胞集団は、数多くの臨床的応用に、好ましくは治療組成物または医薬として、有用である。

本発明は特に、霊長類における細胞または組織、特に心臓細胞の置換または再生のための治療組成物を調製するための、本発明の精製霊長類心臓前駆細胞集団、好ましくはヒト細胞集団の使用に関する。特に、本発明は、ヒトにおいて心不全を治療するためのヒト胚幹細胞から分化した本発明のヒト心臓前駆細胞集団の使用に関する。

本発明は、非分化（多能性）ＥＳ細胞または（非分化）胚様状態細胞および心臓前駆細胞を含む霊長類細胞集団から心臓前駆細胞を選択的に分離するための方法、あるいは霊長類細胞集団の細胞を心臓前駆細胞で富化するための方法であって、次の工程：
Ａ）前記細胞集団を抗ＣＤ１５抗体と接触させる工程；および
Ｂ）前記ＣＤ１５抗体と特異的に結合する細胞を選択する工程、または前記抗ＣＤ１５抗体と結合していない細胞を除去する工程において、前記ＣＤ１５抗体を特異的に認識し、該抗体と結合する能力を有する前記細胞が前記細胞集団中に維持することが望ましい霊長類心臓前駆細胞である工程、
を含んでなる方法をさらに含む。

好ましくは、工程Ａ）において、前記抗ＣＤ１５抗体は、抗ヒトＣＤ１５抗体、最も好ましくはモノクローナル抗体である。

好ましい実施態様において、前記抗ＣＤ１５抗体は、より好ましくは、細胞集団から、好ましくは、本発明による霊長類ＥＳ細胞または胚様状態細胞からの心血管前駆細胞集団の製造のための方法の工程ａ）およびｂ）によって得られる、または得ることができる細胞集団から、前記ＣＤ１５マーカーを表示している細胞を選択するためおよび分離するために用いることができるマーカーで標識される。

より好ましくは、前記抗体マーカーは、ＦＩＴＣなどの蛍光マーカーである。

もう１つの好ましい実施態様において、前記抗ＣＤ１５抗体は、磁性ビーズもしくは物品の表面に結合するかまたは磁性化合物と結合する。

磁性ビーズまたは粒子を用いる方法は、通常細胞選別のために実行される。対象となる特定細胞に特異的な抗体を磁性粒子と共有結合する。その後、磁性抗体を含む溶液中で細胞混合物をインキュベートする。全反応混合物を磁場に曝し、磁場ににより対象となる細胞を保持する。これらの粒子の一部は、細胞機能に悪影響を与えずに自然分解する材料からなることもある。特定細胞の集団を分離または富化するようなシステムは当業者から周知である(BD Biosciencesのシステム(San Jose, CA USA); Miltenyi Biotech社(Bergisch Gladbach, Germany)製ＭｉｄｉＭＡＣＳ（商標）分離システムによる陽性細胞の選択、Polysciences社またはDynal Biotech社)参照)。

細胞分離の代替法として、十分に確立された蛍光活性化細胞選別(fluorescence-activated cells sorting)（ＦＡＣＳ）技術を用いることもできる（フローサイトメーターは１分間当たり最大５００，０００細胞を測定し分離することができる）。

本発明は、非分化霊長類ＥＳ細胞または（非分化）胚様状態細胞、および心臓前駆細胞を含む細胞集団から心臓前駆細胞について富化するのに有用なキットをさらに含む。このキットは、抗ＣＤ１５抗体、好ましくは抗ヒトＣＤ１５抗体を含む。

好ましくは、モノクローナル抗体を用いる。

好ましくは、前記抗ＣＤ１５抗体は、より好ましくは、細胞集団から、好ましくは本発明による方法の工程ａ）およびｂ）によって得られるまたは得ることができる細胞集団から、前記ＣＤ１５マーカーを表示している細胞を選択するためおよび分離するために用いることができるマーカーで標識される。

もう１つの好ましい実施態様において、前記抗ＣＤ１５抗体は、磁性ビーズの表面に結合するかまたは磁性化合物と結合する。

好ましくは、前記細胞集団から心臓前駆細胞について富化するための抗体の使用に関する使用者への情報を含む使用説明書を提供する。

ある特定の実施態様において、前記キットは、磁性ビーズ、例えば、超常磁性微粒子も含む。このような磁性ビーズは、前記抗ＣＤ１５抗体と複合体形成してよいし、または単独であってもよい。また、前記キットは、磁場の生成に用いる電磁石も含み得る。

別の態様において、本発明は、霊長類ＥＳ細胞または胚様状態細胞、特にヒト細胞を増殖または繁殖させるための方法であって、この増殖または繁殖工程中にそれらの多能性が維持され、前記霊長類ＥＳ細胞または胚様状態細胞がＦＢＳなどの哺乳類胎児血清を添加した基礎培地で通常培養されるところ、該胎児血清が、好ましくは７．５％（Ｖ／Ｖ）±２．５％の濃度の、霊長類由来の血小板溶解液、好ましくはヒト血小板溶解液に交換されることを特徴とする方法を提供する。

細胞、好ましくは霊長類ＥＳ細胞を培養するために用いられる組成物または培養培地は、ＢＭＰ２およびＲＴＫ阻害剤を含んでなる。

好ましくは、前記ＲＴＫ阻害剤は、ＦＧＦ阻害剤、あるいはＶＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、ＫＩＴおよび／またはＰＤＧＦＲを阻害することができる多標的ＲＴＫ阻害剤である。

より好ましくは、前記ＲＴＫ阻害剤は、ＳＵ５４０２およびＳＵ１１２４８からなる群から選択される。

好ましくは、前記組成物または前記培地は、１μＭＳＵ５４０２（±０．２μＭ）に対して１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２（±５ｎｇ／ｍｌ）を含有する。

好ましくは、前記組成物または前記培地は、５μＭＳＵ１１２４８（±２μＭ）に対して１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２（±５ｎｇ／ｍｌ）を含有する。

本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかであろう。

実施例１〜３についての材料と方法
Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）−ＤＭＥＭ（Invitrogenカタログ番号１０８２９０１８）
Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）ＳＲ血清代替添加物（カタログ番号１０８２８０２８ Invitrogen）使用前にテストバッチ処理する：
トリプシン０．０５％／０．５ｍＭＥＤＴＡ４Ｎａ１Ｘ（Invitrogenカタログ番号２５３０００５４）
グルタマックス(Glutamax) ２００ｍＭ（Invitrogenカタログ番号３５０５００３８）
ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（２００ｍＭ）（Invitrogenカタログ番号１１１４００３５）
メルカプトエタノール（Invitrogenカタログ番号３１３５００１０）（ＰＢＳ中１０^−７Ｍで溶液を作製し、１ヶ月間使用する）
グルタマックス含有ＲＰＭＩ１６４０（Invitrogenカタログ番号６１８７０−０１０）
グルタミン含有Ｆ１２栄養添加物（Invitrogenカタログ番号２１７６５−０２９）
ダルベッコリン酸バッファー（Ｄ−ＰＢＳ）ＣａおよびＭｇ不含（Invitrogenカタログ番号１４２０００６７）
Ｂ２７５０ＸビタミンＡ不含添加物（Invitrogenカタログ番号１２５８７０１０）
ウシ皮膚細胞由来ゼラチン２％溶液（Invitrogenカタログ番号Ｇ１３９３−１００ｍｌ）
マイトマイシン２ｍｇ Sigmaカタログ番号Ｍ４２８７）
ＦＧＦ２（ヒト組換え体、preprotechカタログ番号１００−１８Ｂ）
ＢＭＰ２（ヒト組換え体 R&D system）
ディスパーゼ(dispase)（Invitrogenカタログ番号１７１０５０４１）
コラゲナーゼＣＬＳ２（Invitrogenカタログ番号１７１０４−０１９）
ＳＵ５４０２（calbiochemカタログ番号５７２６３０）
ＣＤ１５マイクロビーズ（ＭＡＣＳソーター Miltenyiカタログ番号１３０−０４６−６０１）
抗ＳＳＥＡ４および抗ＴＲＡ１−６０（それぞれChemiconカタログ番号９０２３１および９０２３２）
抗Ｏｃｔ−４（Santa Cruz、カタログ番号ｓｃ−９０８１）
BD Bioscience社製抗ＣＤ１５−ＦＩＴＣ抗体（ＩｇＭ clone MMAカタログ番号３４０７０３）
ＲＮＡ抽出キット（ＭｉｎｉＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＩＩＫｉｔ（商標） Zymo Research、カタログ番号Ｒ１０３３）
リアルタイムＰＣＲ試薬：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔＤＮＡＭａｓｔｅｒＰＬＵＳＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Rocheカタログ番号３５１５８８５）

装置
低付着性ディッシュ（ＮＵＮＣ（商標）ＬｏｗＣｅｌｌＢｉｎｄｉｎｇＰｌａｔｅｓカタログ番号１４５３）
滅菌済細胞培養ディッシュおよびピペット
５００ｍｌ濾過ユニット０．２μｍ Nalgeneカタログ番号１６２−００２０
リアルタイムＱＰＣＲサーモサイクラー（Roche ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ１．５）

実施例１：霊長類ＥＳ細胞の培養
霊長類ＥＳ細胞系統は、それらの多能性を維持するために支持細胞（Ｅ１４マウス胎児から調製したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ））とＦＧＦ２を必要とする。

１−ＭＥＦを３代または４代継代培養し、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンにより２時間処理する；細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５分間トリプシン処理し、ゼラチン（０．１％）コーティングしたプレートに４０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種する。

２−霊長類胚幹細胞を温かい繁殖培地中で急速解凍し、８００ｒｐｍで４分間遠沈し、再懸濁して、ＦＧＦ２を含まないＥＳ細胞培地で一晩培養した支持細胞上に播種する。そのプレートにＦＧＦ２を添加する。

３−次いで、アカゲザルＥＳ細胞（Dr S Mitalipov, Dr Wolf’s laboratoryより提供のＯＲＭＥＳ−２）とヒトＥＳ細胞系統 D Melton's laboratoryからのＨＥＳ細胞系統［３９］およびTechnion InstituteからのＩ６細胞系統［４０］（ＮＩＨ認可）を、メルカプトエタノール、グルタミン、非必須アミノ酸、１５％ＫＯＳＲおよび１０ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２それぞれを添加したＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ培地を用いてＭＥＦ上で培養する（表１参照）。アカゲザルＥＳ細胞［４１］については、Ｆ１２培地添加物２０％のＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ。

４−培地を毎日交換する。

５−トリプシン（ＨＵＥＳ）またはコラゲナーゼ（Ｉ６、ＯＲＭＥＳ−２、６、９、１８）それぞれを用いて、細胞コロニーを４〜５日おきに単細胞または小細胞群に解離する（パラグラフ「ＢＯＸ１」参照）。

前記ＥＳ細胞のコロニーがディッシュ内でコンフルエント状態に達しないようにすることが好ましい。それらを約７０％コンフルエント状態で分割する。

実施例２：運命を支配するためおよび霊長類ＥＳ細胞を心臓系へと分化させるためのプロトコール
１−継代の１日または２日後に霊長類ＥＳ細胞をＫＯ（商標）−ＳＲＤＭＥＭ中１μＭＳＵ５４０２（ＦＧＦ受容体阻害剤）の存在下で１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２により４８時間処理する。処理終了時に前記細胞が過剰なコンフルエント状態にならないことが極めて重要である。ｐＨ５以下でのバイアルへの吸着を防ぐために（中性ｐＨにおいてその溶解度は低いため）少なくとも０．１％ＢＳＡを含有する水性バッファー中にＢＭＰ２を１ｍｇ／ｍｌで再懸濁することが好ましく、それをアリコートとして−２０℃で保存する。ＰＢＳにより１０μｇ／ｍｌの凍結ストックをさらに作製することができる。凍結／融解しない。

２−ＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ、５％ＳＲの入った低付着性ディッシュ中のＨＵＥＳ細胞コロニーおよび細胞凝集体の、１ｍｇ／ｍｌにおいて３７℃で１５分間用いるディスパーゼ（ＨＵＥＳ１、９、２４、２６）またはコラゲナーゼＣＬＳ２（Ｉ６）による解離後に胚様体が形成される。ＥＢの形成を可能にするためには低付着性Ｂ６プレートに６．１０^６〜１０^７細胞を充填する必要がある。

小（２０〜５０細胞）細胞群を作製するために５ｍｌピペットを用いてディスパーゼまたはコラゲナーゼ工程後に機械的細胞解離を用いることが好ましい。細胞を遠沈し、それらを５％ＳＲ−ＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ（分化培地）中に再懸濁する。

３−in vitro心臓分化の機能的指標は３〜４週間後に観察される拍動しているＥＢのスコアである（図１）。より早い日に、心臓転写因子のリアルタイムＰＣＲによりＨＥＳ細胞分化動態をモニタリングする［４２］。in vivo試験（すなわち、心筋梗塞後免疫不全ラットにおける細胞異種移植）は、このプロトコールにより得られた心筋細胞の機能的指標にもなる［４２］。

心血管前駆細胞の作製および選択
１−霊長類幹細胞を、２％Ｂ２７と、（１μＭＳＵ５４０２（研究用）または５μＭＳＵ１１５４８、ＳＵＴＥＮＴ（臨床用））とを添加したＲＰＭＩ中で１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２によりそれぞれ９６時間処理する。

２−ＳＳＥＡ−１（ＣＤ１５）陽性細胞を視覚化するために抗ＣＤ１５−ＦＩＴＣ抗体を用いるＦＡＣＳ分析を用いる（図２）。よって、細胞はＣＤ１５コーティングＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ（キット）を用いて以下のように選別することができる。

３−細胞をトリプシン処理し、７０μｍメッシュナイロンフィルターで濾過する。

４−０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭＥＤＴＡを添加したＰＢＳ中で抗ＣＤ１５抗体コーティングＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ（１００μｌ／５．１０^６細胞）とともに、時々穏やかに攪拌しながら４℃で３０分間細胞をインキュベートする。

５−磁石上に用意したＬ５０Ｍｉｌｔｅｎｙｉカートリッジに細胞を移す。

６−細胞を３ｍｌＤ−ＰＢＳ−ＢＳＡ／ＥＤＴＡで３回洗浄し、３ｍｌのＤ−ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＥＤＴＡを用いて磁石から外したカラムから溶出させた。通り抜けた細胞は磁石上のカートリッジに戻し、もう一度溶出させる。この手順を３回繰り返す。細胞の計数によりＣＤ１５陽性細胞が５０〜６０％であることが分かった。

７−ＲＴ−リアルタイムＱ−ＰＣＲにより遺伝子発現プロファイルを行う（パラグラフ「ＢＯＸ２」参照）。ＣＤ１５陽性細胞の表現型分析によりそれらが初期中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｔｂｘ６）ならびに心臓および心血管（Ｔｂｘ２０、Ｍｅｆ２ｃ、ＧＡＴＡ４、Ｉｓｌ１、Ｔｂｘ１８、Ｆｌｋ１）のマーカーを発現することが分かった（図３Ａ〜図３Ｄ）Ｎｋｘ２．５はＣＤ１５陰性細胞集団では存在しなかった一方で、ＣＤ１５陽性細胞集団では検出された。ＣＤ１５陽性細胞集団では多能性遺伝子（Ｌｅｆｔｙ、Ｎａｎｏｇ、Ｃｒｙｐｔｏ）の発現はない。しかしながら、この細胞集団はＯｃｔ−４Ａをなお過剰発現する［４３，４４］。

ＭＥＦ上で培養すると、ＣＤ１５陽性細胞は心血管前駆細胞の表現型（心血管マーカー免疫染色によりモニタリングした）を保持した；ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ）またはＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ）により処理すると、ＣＤ１５＋はそれぞれ内皮細胞および平滑筋細胞となる。ヒト心臓の繊維芽細胞で培養すると、ＣＤ１５＋細胞はアクチニン陽性心筋細胞へと分化する。

実施例３：臨床用培地での霊長類ＥＳ細胞の培養
胚幹細胞を、
７．５％の完全ヒト凍結融解血小板溶解液、
ヘパリン（１０００ＵＩ／ｍｌ）
１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２およびインスリン
を添加したＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ中、照射成体ヒト皮膚繊維芽細胞（Dr O. Damour, H?pital E Herriot, LyonからのＦＳＢＴ）上で培養する

上記培地での１０代継代は多能性マーカーの発現に影響を及ぼさない（図４Ａ〜図４Ｂ）。

ＦＳＢＴは、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭグルタミン（ＡＦＳＳＡＰＳにより認可されたバッチ）中で培養する。

ヒトＰＣＲプライマー配列（表２および表３、実施例４参照）

ＢＯＸ１：細胞継代
総ての培地、酵素、ＰＢＳは３７℃まで温める必要があることが好ましい。霊長類ＥＳ細胞は温度変化に非常に敏感であり、可能な限り３７℃で維持する必要がある。

ＯＲＭＥＳの分割：培養培地を、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（６ウェルディッシュの１ウェルの場合またはＢ１０プレートの場合には５００μｌまたは２．５ｍｌで十分である）を含むＫＯ（商標）−ＤＭＥＭに交換する。プレートを３７℃で５分間インキュベートする。１ｍｌまたは５ｍｌＦＧＦ２不含繁殖培地を添加し、５ｍｌピペットを用いて細胞を擦り取る。細胞を１５ｍｌｆａｌｃｏｎチューブへ移し、それらをＲＴで８００ｒｐｍにて４分間遠沈する。この上清を吸引し、ＦＧＦ２含有繁殖培地を用いて細胞を再懸濁する。均質な細胞懸濁液となるまでそれらを３〜５回ピペッティングすることによりＥＳ細胞コロニーを破壊する。１／６の細胞を播種する。

Ｉ６細胞系統の分割：上記と同じプロトコールを用いるが、コラゲナーゼの存在下で細胞を４５〜６０分間インキュベートする。

ＨＵＥＳ細胞の分割：温かいＰＢＳで１回細胞を洗浄し、トリプシン（６ウェルディッシュの１ウェルの場合またはＢ１０プレートの場合には５００μｌまたは２．５ｍｌで十分である）を添加する。細胞をドラフト中で正確に３分間インキュベートする。トリプシンを洗い流し、わずかに支持細胞層を洗い流すことにより繁殖培地を用いて細胞を再懸濁する。１／６の細胞を播種する。

ＢＯＸ２：ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＰＣＲ
キット(Zymo research)を用いて細胞溶解後に全ＲＮＡを調製する。製造業者の使用説明書に従って逆転写酵素スーパースクリプト２(SuperScript 2)(Invitrogen)を用いて逆転写した後、一連の遺伝子特異的プライマー（表２および表３参照）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施する。リアルタイム定量ＰＣＲでは２〜６ｎｇｃＤＮＡを使用し、ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ１．５およびＳＹＢＲＧｒｅｅｎｆａｓｔｓｔａｒｔｋｉｔ(Roche, Germany)を用いて行う。１２μｌの反応混合物には、１μｌのＭａｓｔｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩミックス（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、デオキシヌクレオシド三リン酸ミックス、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ色素、３ｍＭＭｇＣｌ_２を含む）と０．５μＭの各プライマーを含めた。この混合物に２μｌの１０倍希釈したｃＤＮＡを添加する。データは、逆転写後のヒトｃＤＮＡ含量の指標としてＧＡＰＤＨｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを用いてノーマライズする。増幅では、９５℃で８分間の初期変性と、４５サイクルの、９５℃で３秒間の変性、６５℃で８〜１０秒間のアニーリングおよび７２℃で７〜１０秒間の伸長とを行う。温度遷移速度は２０℃／秒である。各伸長工程の終了時に蛍光を測定する。増幅後、その産物を２０℃／秒で９５℃まで加熱した後、２０℃／秒で７０℃まで冷却することにより融解曲線を得る。この反応物を７０℃で２０秒維持し、続いて０．３℃／秒で９５℃までゆっくりと加熱を行った。融解曲線を用いてＰＣＲ産物の特異性を決定し、それらをゲル電気泳動によりさらに確認する。

実施例４：心筋梗塞後ラットにおける心臓委任ヒト胚幹細胞へのin vivo分化
Ａ）材料と方法
ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ検出によるリアルタイム定量ＰＣＲ
Quiagen社製キットを用いてラット心筋のＨＥＳ細胞またはスライスからＲＮＡを抽出した。Ｍｕ−ＭＬＶ逆転写酵素(Invitrogen, Cergy, France)およびオリゴ（１６）ｄＴを用いて１μｇのＲＮＡを逆転写した。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(Roche Diagnostic)またはＣｈｒｏｍｏ４サーマルサイクラー(Biorad)を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを行った。増幅は、製造業者の推奨のとおり実施した。１２μｌまたは２２μｌの反応混合物には、１０μｌまたは２０μｌそれぞれのRoche社製またはAbgene社製ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩミックス（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、デオキシヌクレオシド三リン酸ミックス、およびＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ色素、３ｍＭＭｇＣｌ２を含む）、０．２５μＭ濃度の適当なプライマーおよび２μｌのｃＤＮＡを含めた。増幅プログラムでは、９５℃で１５分間または８分間の初期変性工程と、４０サイクルの、９５℃で１０秒間の変性、６５℃で８秒間（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）または２０秒間（Ｃｈｒｏｍｏ４）のアニーリング、および７２℃で８秒間または３０秒間の伸長とを行った。温度遷移速度は２０℃／秒（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）または４℃／秒(Biorad)であった。各伸長工程の終了時に蛍光を測定した。増幅後、その産物を２０℃／秒または４℃／秒で９５℃まで加熱し、それを２０℃／秒または４℃／秒で７０℃まで冷却し、それを７０℃で２０秒維持した後、２０℃／秒または４℃／秒で９５℃までゆっくりと加熱することにより融解曲線を得た。ゆっくりと加熱した段階を通して蛍光を測定した。融解曲線を用いてＰＣＲ産物の特異性を決定し、それらを通常のゲル電気泳動を用いて確認した。データは、Pfafll et al.に従って分析した［１６］。ヒト遺伝子に特異的なプライマーを表２および表３に記載する。

Ｂ）ヒト胚幹細胞の培養および心臓委任
ＨＵＥＳ−１細胞系統およびＩ６細胞系統を、メルカプトエタノール、グルタミン、非必須アミノ酸、１５％ＫＯ（商標）ＳＲおよび１０ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２それぞれを添加したＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ培地を用いて、Ｅ１４マウス胎児から調製したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養した。培地を毎日交換した。トリプシン（ＨＵＥＳ−１）またはコラゲナーゼ（Ｉ６）それぞれを用いて、細胞コロニーを４〜５日おきに単細胞または細胞群に解離した。梗塞ラットの細胞移植の前に同様の酵素消化を用いた。

ＨＥＳ細胞を低ＫＯ（商標）ＳＲ（５％）含有ＫＯ（商標）−ＤＭＥＭ中１μＭＳＵ５４０２（ＦＧＦ受容体阻害剤）の存在または不在下で１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２により４８時間処理した。ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清の入った低付着性ディッシュ（Ｎｕｎｃ）中のＨＥＳ細胞コロニーおよび細胞凝集体のトリプシン処理（ＨＵＥＳ−１）またはコラゲナーゼ（Ｉ６）解離後に胚様体が形成された。

Ｃ）心筋梗塞モデル
雌Ｗｉｓｔａｒ（平均体重２５０ｇ）において左冠動脈の結紮により心筋梗塞を誘発した。ラットは、イソフラン(Baxter)（導入時に３％、維持に２％）を用いた全身麻酔下で手術を受けた。気管挿管後、機械換気装置(Alphalab, Minerve)を７０／分の速度で０．２ｍｌ平均吸入量(an 0.2 ml average insufflate volume)で設定した。ケトプロフェン(Merial)の１０ｍｇ／ｋｇ皮下注射により麻酔を行った。

左開胸によって心臓を露出し、肺動脈と左心耳との間で左冠動脈を永久結紮した(was permanently snared)。

Ｄ）ラット無作為化および心筋細胞注射
梗塞後第１５日目に、ラットを胸骨正中切開により再手術し、無作為化して、単細胞浮遊状態のＢＭＰ２処理済ＨＵＥＳ−１細胞（３×１０^６ＨＵＥＳ−１細胞、ｎ＝１１匹のラット）、小細胞群浮遊状態のＢＭＰ２処理済Ｉ６ＥＳ細胞（３１０^６Ｉ６細胞、ｎ＝１１匹のラット）または対照培地（ｎ＝９匹のラット）の注射を行った。追加動物（ｎ＝５匹のラット）にはＢＭＰ２とＳＵ５４０２の両方を受けた３１０^６ＨＵＥＳ−１細胞の瘢痕内注射を行った。本発明者らは、中胚葉にまだ委任されていないものであることを理由に、後の実験の場に向けてＨＵＥＳ−１細胞系統を選択した。（ＨＵＥＳ−１細胞およびＩ６細胞を移植した）各群１匹のラットは細胞注射後４８時間内に死亡した。

免疫抑制療法（１日１回、シクロスポリンＡを１０ｍｇ／ｋｇ皮下注射することにある）は同じ日に開始し、犠牲にするまで続けた。

Ｅ）組織病理学
標準的なプロトコールを用いて心筋切片をエオシンおよびヘマトキシリンで染色した。

心筋注射の２ヶ月後、全身麻酔後にラットを安楽死させた。横切断したラット心臓をＯＴＣ(Tissutec)で直ちに固定し、−１８０℃窒素で凍結した。超ミクロトーム(LM 1850, Leica)により８μｍ切片にした。

ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した８μｍ標準切片を用いて潜在的腫瘍増殖を評価した。

心筋凍結切片の免疫蛍光は、パラホルムアルデヒド固定(paraformaldhehyde fixation)およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた透過処理後、抗ヒト心室β−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）抗体(Chemicon)、抗ヒトラミンＡ／Ｃ抗体(Novacastra)抗心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）抗体(Abgent)および抗コネキシン４３（Ｃｘ４３）抗体(SIGMA)抗体を用いて行った。ａｌｅｘａコンジュゲート抗体を用いて前記タンパク質を明らかにした。共焦点顕微鏡(ZEISS LSM-510 meta)で切片を観察した。

加えて、腫瘍検出のために各移植ラットの全身剖検（脳、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、大動脈周囲リンパ節、胸腺、脊椎および卵巣を含む）を組織的に行った。

Ｆ）結果
１）未分化のＩ６細胞系統およびＨＵＥＳ−１細胞系統の表現型
本発明者らは、ＨＵＥＳ−１とＩ６両方のＨＥＳ細胞系統を用いて、in vitroおよびin vivoでのそれらの心臓形成能を検証した。実際には、両細胞系統における中胚葉および心臓の数個の遺伝子のリアルタイムＰＣＲ増幅により、Ｉ６細胞系統は中胚葉（Ｔｂｘ６、ＳＲＦ、Ｍｅｓｐ１、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）および初期心臓（Ｉｓｌ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ２０）の両方の遺伝子の基本的発現がより高いという特徴を示すことが分かった。ＧＡＴＡ４はＩ６細胞では弱く発現したが、ＨＵＥＳ−１細胞では発現しなかった。Ｎｋｘ２．５は、Ｉ６細胞系統またはＨＵＥＳ−１細胞系統のいずれにおいてもほとんど検出されなかった。Ｏｃｔ−４レベルは両細胞系統間において有意な差はなかった（図５）。

２）ＨＥＳ細胞の心臓委任
Ｉ６とＨＵＥＳ−１両方のヒトＥＳ細胞を１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＢＭＰ２により４８時間処理した。リアルタイムＱ−ＰＣＲを用いて遺伝子誘導を検証した。図６Ａおよび図６Ｂは、ＨＵＥＳ−１細胞ではモルフォゲンにより中胚葉（すなわち、ＳＲＦ、Ｔｂｘ６、ＦｏｘＨ１、Ｉｓｌ１）および心臓（Ｍｅｆ２ｃ、Ｎｋｘ２．５、α−アクチン）の両方の遺伝子が誘導されたことを示している。ＦＧＦ−Ｒ阻害剤ＳＵ５４０２の存在下でＢＭＰ２を添加すると、この効果はさらに３〜１０倍増強された。ＢＭＰ２心臓形成応答の程度においては、両細胞系統間に有意な差は認められなかった（図６Ａ）が、ＢＭＰ２誘導後に発現した各遺伝子の全コピー数は、ＨＵＥＳ−１細胞系統よりもＩ６細胞系統においてずっと多かった（すなわち、１０〜１５倍）（データは示していない）。

ＢＭＰ２誘導によるＨＥＳ細胞委任が心臓分化プロセスに移るかどうかを検証するため、そしてin vivoで起こる可能性がある分化のシナリオを描くために、対照またはＢＭＰ２刺激ＨＵＥＳ−１細胞を凝集させて胚様体（ＥＢ）を形成させた。その後、第２日目および第５日目のＥＢにおいて遺伝子発現をモニタリングした。第２日目にＢＭＰ２の効果が観察され（すなわち、２倍の遺伝子発現誘導）、第５日目には顕著になった（図６Ｂ）。その発生段階において、中胚葉および心臓の両方の遺伝子の発現は劇的に３〜１０倍増加した（図６）。これに対し、Ｏｃｔ−４はダウンレギュレートされ、ＢＭＰ２処理ＥＳ細胞から発生したＥＢにはほとんど存在しなかった。Ｉ６細胞系統を用いて同様の結果が得られた。

３）梗塞後ラット心臓における心臓委任細胞の生着
冠動脈結紮から２ヵ月後、移植した心臓においてヒトα−アクチンｍＲＮＡが確認されたが、対照培地を注射したものでは確認されなかった（図７）。これに対し、本発明者らは、Ｏｃｔ−４、Ｐａｘ６（初期外胚葉のマーカー）またはα−胎児タンパク質（初期内胚葉のマーカー）（データは示していない）をコードするｍＲＮＡを全く検出することができなかった。

抗ＡＮＰ抗体および抗ヒトラミン抗体での免疫染色により、ラミン陽性ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の存在が明らかになった（図８Ａ）。

ＥＳ細胞由来心筋細胞の表現型をさらに定義するために、切片を抗ヒトβ−ＭＨＣ抗体で免疫染色した。これらの試験により、ＨＵＥＳ−１およびＩ６それぞれが生着した心臓の検査した凍結切片の４０％および７１％において、そしてＢＭＰ２およびＳＵ５４０２の両方により処理したＨＵＥＳ-１細胞を移植したラットの検査した切片の８５％において分化した心筋細胞の存在が明らかになった（図８Ｂ）。しかしながら、細胞生着は限られた。ＢＭＰ２処理ＨＵＥＳ−１、Ｉ６およびＢＭＰ２／ＳＵ５４０２処理ＨＵＥＳ−１を移植処置したＥＳ細胞由来心筋細胞は、それぞれ、瘢痕の２．４±０．３％、３．１±０．４％および３．６±０．３％に定着した（ｎ＝１０）（図８Ｃ）。これらの切片を慎重に検査することにより、これらの心筋細胞はまだ胎児期にある（筋節の長さが成体ラットにおける２±０．１μｍと比べて短い（１．６±０．１μｍ）ことによりこれは実証された）ことがさらに分かった（図８Ｄ）。

移植２ヶ月後、エオシン−ヘマトキシリン染色した切片は炎症または細胞過剰増殖の様子を全く示さなかった（図９）。さらに、全身剖検では末梢器官において腫瘍は見られなかった。

実施例５：ヒトｉＰＳ細胞系統からのＣＤ１５＋心血管前駆細胞の作製
ヒトｉＰＳ細胞系統１１１を、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４およびＮａｎｏｇをコードするｃＤＮＡを有するレンチウイルスに感染しているヒト皮膚繊維芽細胞を用いて作製した。

１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２および１ｕＭＳＵ５４０２による６日間の処理後、ｉＰＳ細胞をトリプシン処理し、抗ＣＤ１５コンジュゲート磁性ビーズ（Ｍｉｌｅｔｅｎｙｉ）とともに３０分間インキュベートし、Ｍｉｌｔｅｎｙｉカラムを用いて選別した。ＢＭＰ２処理細胞の分画を用いた後、抗ＣＤ１５ＦＩＴＣ抗体および抗心臓マーカー抗体を用いるＦＡＣＳ分析のために選別した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。３８％の細胞がＣＤ１５＋であることが分かった。この割合を用いて、心臓マーカーについて陽性を示す細胞の割合（緑色の数）をノーマライズした。次いで、細胞を、ＫＯＳＲ(invitrogen)、グルタミン、非必須アミノ酸およびメルカプトエタノールを添加したＫＯＤＭＥＭ（ＨＥＳ繁殖培地）中、マウス胎児繊維芽細胞上に播種し、１週間後に抗ｉｓｌ１、抗Ｎｋｘ２．５および抗Ｍｅｆ２ｃで染色した。ＦＡＣＳ分析（図１Ａ）および免疫蛍光（図１０Ｂ）により評価されるように、ＣＤ１５＋細胞由来細胞では、心臓タンパク質（すなわち、Ｎｋｘ２．５、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５およびＩｓｌ１）ならびに内皮マーカーＣＤ３１について同じような発現パターンが見られた。

ここで、本発明者らはまた、ＣＤ１５＋心血管前駆細胞はｉＰＳ細胞からも誘導され得ることも示す。

考察
この研究により、ＨＥＳ細胞または胚様状態細胞（ｉＰＳ細胞）は、心臓形成因子ＢＭＰ２を用いた心臓系への委任後に奇形腫を形成しないで心筋細胞へと分化することができることが明らかになった。ＢＭＰ２は、すでに分化している細胞の後期心臓分化を向上させることが分かった［１７］が、本発明者らの研究では、未分化ＨＥＳ細胞に対するモルフォゲンの強い系統誘導作用を報告する。

ＢＭＰ２は、低濃度で用いると、強力な中胚葉および心臓形成の系統誘導因子(a potent mesodermal and cardiogenic instructor)である。その心臓形成能は、進化を通じてよく保存される特性である。ＢＭＰ２のキイロショウジョウバエ属(drosophila)ホモログであるＤｐｐは、心臓などの中胚葉の形成に有利である［１８］。ゼブラフィッシュ［１９］、アフリカツメガエル(Xenopus)［２０−２１］およびニワトリ［２２］でも同様の効果が観察されている。２つの別の細胞系統で得られた本発明者らのデータにより、ＢＭＰ２の機能がヒト種において保存されることが明らかになった。Ｉ６細胞は中胚葉系を生み出す傾向がある（図５）一方、最大ＢＭＰ２応答はＨＵＥＳ−１細胞で見られる応答と有意な差はなく、遺伝子発現の最大量はＨＵＥＳ−１細胞よりもＩ６細胞において高かった。規定（ＫＯＳＲ）培地において単独で用いたＢＭＰ２の効果は弱かったが、ＦＧＦ受容体阻害剤であるＳＵ５４０２を添加することによりその系統誘導作用は劇的に増強された。実際には、ヒトＥＳ細胞は支持細胞上で増殖させ、この支持細胞によりＢＭＰ２シグナル伝達経路に拮抗することが分かっているＦＧＦ２を含む多くの因子を分泌させる。ＳＵ５４０２は、少なくとも２つの機構を通じて作用して、ＢＭＰ２転写効果を発現させることができる。第一に、ＦＧＦ２はｓｍａｄ２／３をリン酸化し、それによってＢＭＰ２シグナル伝達補因子の核への移行を妨げ、その結果としてその転写作用の発揮を妨げる［２３］。第二に、ＦＧＦ２はＭＥＦおよびＨＥＳ細胞の両方において傍分泌因子として作用して、ＨＥＳ細胞中に多く含まれるＣｅｒｂｅｒｕｓ（ｎｏｄａｌとＢＭＰのアンタゴニスト）の発現を調節することも知られている［２４］。最後に、ＳＵ５４０２は細胞の自己再生を妨げ、非特異的分化を有利にし、この非特異的分化がＢＭＰ２により中胚葉へとさらに向けられるという可能性もある。これらの経路の総てまたはいずれか一方を遮断することによって、ＨＥＳ細胞のＢＭＰ２転写応答を解明するにはＦＧＦ阻害剤が必要である。

マウス［１０，１１，２５］、およびヒト［２６］のＥＳ細胞を移植した心臓において行われた従前の観察結果と一致して、心臓委任ＨＥＳ細胞を注射したラットのいずれにおいても過剰増殖（奇形腫）は観察されなかった。拍動している心臓への心筋内注射はかなり大きな割合の細胞の漏出を引き起こすことも分かっていることから［２７］、本発明者らは心外腫瘍を立証できなかったことにも注目すべきである。実際には、胚組織の移植片は、それらが細胞外シグナル調節キナーゼによってそれらの増殖制御を獲得する分化のごく初期には腫瘍を形成する能力がないことも以前から分かっている［２８］。そのため、ＨＥＳ細胞の心臓委任後に同じようなシナリオが起こるのは驚くことではない。そのようなものとして、本発明者らの発見は、正常免疫の心筋へＨＥＳ細胞を注射することにより奇形腫が形成されるという従前の観察結果［１１］とは矛盾しておらず、それは後の結果が上記の環境はＥＳ細胞の分化に必要な十分な心臓形成因子を提供している可能性が低いということを主に示していることからである。注目すべきは、非特定細胞の排除を目的とした移植前の選別を行わないことに関係なく、本発明者らの試験によってやや安心させる安全性データが得られたことであった。これは、増殖因子が多く含まれる病的心筋（すなわち、瘢痕）の環境は、刺激を受けたＥＳ細胞を心臓の運命へと向かわせるのに十分であるということを示している［２５］。しかしながら、臨床的観点において、そのような選択工程は依然として主要な目標である。

これまでに、ＨＥＳ細胞の心筋内移植の効果は２つの研究によって評価されている。どちらの研究も正常心筋［２６］または急性梗塞心筋［２９］のいずれかへの胚様体由来心筋細胞の使用を必要とした。そのプロトコールをより臨床的に意義のあるものにするために、本発明者らは、心不全の臨床的シナリオを再現する傾向がある瘢痕内移植の時期を遅らせ、心臓特定の、まだ完全には分化していない単層培養心血管前駆細胞を注射することを選択した。要するに、２ヶ月後に見られる生着パターンは目的の瘢痕への移植までのこの心臓委任プロセスの利点を裏づけ、その瘢痕では局所シグナルが移植片の運命を心筋細胞への分化経路のさらに下へと向かわせると予測される。

しかしながら、本発明者らは、in situでのＨＥＳ細胞由来心筋細胞の表現型はむしろ胎児のものに近かったことを指摘する。実際には、前記細胞は心臓分化初期段階の２つの既知マーカーであるβ−ＭＨＣとＡＮＰをなお発現した。筋節の長さが短いことも胎児筋細胞の特徴である。この未成熟な表現型についてはいくつかの理由により説明することができた。ＨＥＳ細胞は、完全に分化するためにより長い時間（２ヶ月より長い）を必要とし得る。また、梗塞瘢痕の傍分泌環境は、完全分化プロセスを確実にするために胚形成において生じる因子（いくつかのＦＧＦ、ニューレグリン、レチノイン酸、ＢＭＰ１０、．．．）［３０］またはシグナルをもたらさない可能性もある。

もう１つの興味深い観察結果は、Ｉ６細胞がＨＵＥＳ−１細胞より広い生着領域を生み出したということである。両細胞系統はＢＭＰ２に対して同じ効率で応答するが、Ｉ６細胞は中胚葉と心臓の遺伝子の基本的発現がより高いという特徴を示す（図５）。これは、その細胞系統はすでに中胚葉に委任されており、そしてそれによりin vivoでのより優れた心臓形成能が説明される可能性が高いことを示している。注目すべきは、ＢＭＰ２とＳＵ５４０２により前処理したＨＵＥＳ−１細胞もＢＭＰ２単独で刺激したＨＵＥＳ−１よりも生着が優れているという特徴を示したことであった。これは、in situでのＥＳ細胞の適切な分化を確実にするために特定化段階が極めて重要であることをさらに強調している。移植細胞による瘢痕再増殖率が全体的に低いという調査結果は、恐らく、最初の細胞注入の不十分さと注射時の心外細胞漏出と残留細胞が死滅している可能性とが複合していることを反映している。明らかに、ＥＳ細胞移植の機能的利益を最適化するには、これらの問題のそれぞれに慎重に取り組む必要がある。

最後に、マウスＥＳ細胞を用いた本発明者らの従前の研究において報告したこと［１０，３１］とは異なり、本発明者らはＨＥＳ細胞由来心筋細胞においてＣｘ４３ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出することはできなかった。ＨＥＳ細胞由来分化心筋細胞［１３］は、損傷左心室へ移植したときもＣｘ４３を発現しなかったが、一方、新生児ラット心筋細胞［３２］と共培養したときにはＣｘ４３を発現した。マウスＥＳ細胞またはex-vivo状況とのこの不一致の理由はまだ明らかではないが、心臓形成能の系統特異的な相違、細胞発生段階が早すぎること、発現レベルが免疫染色による検出閾値に満たないこと、ＨＥＳ細胞が高い感受性を示す可能性がある梗塞ラット心筋の繊維性瘢痕によってもたらされるタンパク質または阻害シグナルの誤標的を含む可能性がある。最後に、ヒトＥＳＣはラット心臓へ移植されたが、心臓特定細胞のＣｘ４３発現心筋細胞への完全分化に必要な役割のいくつかは見つからないかもしれない。この問題は研究室で調査中である。

しかしながら、Ｃｘ４３の発現は真の心臓再生として明確に確立するために依然として極めて重要であり、これはドナー由来心筋細胞が宿主のものとのギャップ結合支援による電気機械的結合を確立することができることを示している。収縮性の増強に極めて重要である、移植片−宿主同調拍動を可能にするようなシンシチウムの形成は、筋原性［３３］であれ骨髄由来［３４］であれ、成体細胞ではまだ達成されていない。ＨＥＳ細胞がこの満たされていない必要性を満たすことができるということの証明は、恐らく、患者の転帰が収縮性細胞の新しいプールの補充に決定的に依存している状況においてそれらの使用を合理化するための大きな歩みとなるであろう。

参照文献

第３０日目におけるＩ６ＨＥＳ細胞由来ＥＢの拍動活動。ＥＢの発生前にＢＭＰ２により４８時間細胞を処理する。ＥＢが少なくとも３つの拍動領域を特徴とする場合にはそのＥＢを陽性として評価する。データは平均（青色のバー）±ＳＥＭ（ピンク色のバー）として表している（試験数ｎ＝３）。ＣＤ１５陽性細胞のＦＡＣＳ分析。ＲＰＭＩ／Ｂ２７培地中でＢＭＰ２およびＳＵ５４０２により４日間細胞を処理する。その後、細胞をＤ−ＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンとともに３分間インキュベートする。細胞を遠沈し、抗ＣＤ１５−ＦＩＴＣ抗体（１／１００希釈で用いる）を含む３％ウシ胎児血清添加Ｄ−ＰＢＳ中に再懸濁する。細胞を４℃で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳによりモニタリングする。この図は、ＨＵＥＳ−２４またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた３試験を代表するものである。データは平均±ＳＥＭとして表している。ＣＤ１５陽性心血管前駆細胞の遺伝子発現プロファイル。ＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１５陽性霊長類ＥＳ細胞を選別した後、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出する。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする。図３Ａは、ＨＵＥＳ−２４またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた３試験を代表するものである。データは、平均±ＳＥＭとして表しており、ＣＤ１５細胞集団に対してノーマライズしている。ＰＡＣＳによりＣＤ１５の発現を確認した（図３Ｂ）後にＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１５陽性霊長類ＥＳ細胞を選別した後、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出する。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする。図３Ｃおよび図３Ｄは、ＨＵＥＳ−２４、Ｉ６、ＨＵＥＳ−９またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた５試験を代表するものである。データは、平均±ＳＥＭとして表しており、ＣＤ１５細胞集団に対してノーマライズしている。ＣＤ１５陽性心血管前駆細胞の遺伝子発現プロファイル。ＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１５陽性霊長類ＥＳ細胞を選別した後、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出する。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする。図３Ａは、ＨＵＥＳ−２４またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた３試験を代表するものである。データは、平均±ＳＥＭとして表しており、ＣＤ１５細胞集団に対してノーマライズしている。ＰＡＣＳによりＣＤ１５の発現を確認した（図３Ｂ）後にＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１５陽性霊長類ＥＳ細胞を選別した後、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出する。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする。図３Ｃおよび図３Ｄは、ＨＵＥＳ−２４、Ｉ６、ＨＵＥＳ−９またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた５試験を代表するものである。データは、平均±ＳＥＭとして表しており、ＣＤ１５細胞集団に対してノーマライズしている。ＣＤ１５陽性心血管前駆細胞の遺伝子発現プロファイル。ＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１５陽性霊長類ＥＳ細胞を選別した後、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出する。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする。図３Ａは、ＨＵＥＳ−２４またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた３試験を代表するものである。データは、平均±ＳＥＭとして表しており、ＣＤ１５細胞集団に対してノーマライズしている。ＰＡＣＳによりＣＤ１５の発現を確認した（図３Ｂ）後にＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１５陽性霊長類ＥＳ細胞を選別した後、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出する。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする。図３Ｃおよび図３Ｄは、ＨＵＥＳ−２４、Ｉ６、ＨＵＥＳ−９またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた５試験を代表するものである。データは、平均±ＳＥＭとして表しており、ＣＤ１５細胞集団に対してノーマライズしている。ＣＤ１５陽性心血管前駆細胞の遺伝子発現プロファイル。ＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１５陽性霊長類ＥＳ細胞を選別した後、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出する。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする。図３Ａは、ＨＵＥＳ−２４またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた３試験を代表するものである。データは、平均±ＳＥＭとして表しており、ＣＤ１５細胞集団に対してノーマライズしている。ＰＡＣＳによりＣＤ１５の発現を確認した（図３Ｂ）後にＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１５陽性霊長類ＥＳ細胞を選別した後、細胞を溶解し、ＲＮＡを抽出する。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングする。図３Ｃおよび図３Ｄは、ＨＵＥＳ−２４、Ｉ６、ＨＵＥＳ−９またはＯＲＭＥＳ細胞系統を用いた５試験を代表するものである。データは、平均±ＳＥＭとして表しており、ＣＤ１５細胞集団に対してノーマライズしている。図４Ａ：臨床用培地で１０代継代培養したＨＵＥＳ細胞の免疫蛍光。用いた抗体は：抗Ｏｃｔ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＳＳＥＡ−４である。図４Ｂ：臨床用培地で１０代継代培養したＨＵＥＳ細胞における多能性遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲモニタリング。ＨＵＥＳ−１細胞およびＩ６細胞における中胚葉および心臓遺伝子発現の比較。ＢＭＰ２による刺激の前にＭＥＦ上で解凍後に少なくとも５代継代培養した未分化のＨＵＥＳ−１細胞系統（２２〜２５代継代）およびＩ６細胞系統（２７〜３２代継代）からＲＮＡを抽出し、逆転写した。分化したコロニーをプレートから切り取った後、ＲＮＡを抽出した。遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲにより評価し、Ｉ６における発現とＨＵＥＳ−１における発現との比率として表した。データは、β−チュブリン発現に対してノーマライズし、平均±ＳＥＭとして表している（ｎ＝３）。^＊統計的に有意（ｐ≦０．０１）。図６Ａ：ＨＵＥＳ−１細胞およびＩ６細胞をＦＧＦ阻害剤ＳＵ５４０２の存在または不在下で１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２により４８時間処理し、ＲＮＡを抽出し、逆転写した。リアルタイム定量ＰＣＲにより遺伝子発現をモニタリングした。結果は、未処理ＥＳ細胞と比べたときの遺伝子発現の刺激倍率として表している。図６Ｂ：ＢＭＰ２およびＳＵ５４０２により処理したまたは処理していないＨＵＥＳ−１細胞を凝集させて胚様体（ＥＢ）を形成させた。ＥＢを浮遊状態で５日間維持した後、ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲを行った。データは、β−チュブリン発現に対してノーマライズし、平均±ＳＥＭとして表している（ｎ＝３〜５）。^＊統計的に有意（ｐ≦０．０１）。ＢＭＰ２処理したＨＥＳ細胞を心筋梗塞後ラットに生着させ、２ヶ月後、心筋切片から抽出したｍＲＮＡの逆転写後にα−アクチンｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲによりそれらの運命を調べた。この図は、アンプリコンの融解曲線のプロファイルとゲル上のアンプリコンの両方を示している。ヒトＲＮＡを陽性対照として用いた。^＊統計的に有意（ｐ≦０．０１）。抗ヒトラミン抗体（図８Ａ）（抗ラミン抗体は瘢痕領域内のＨＥＳ由来細胞を染色したが周囲の内因性ラット細胞を染色しなかったことに留意する）および抗ヒトβ−ミオシン抗体（図８Ｂ）を用いた、ＨＥＳ細胞を生着させた心筋の凍結切片の免疫染色。この抗体は、成体ラット内因性β−ＭＨＣを認識しなかった（左のパネルＢ）が、一方ヒトβ−ＭＨＣと結合した。共焦点顕微鏡使用により画像を取得した。（図８Ｃ）ＢＭＰ２によりまたはＢＭＰ２とＳＵ５４０２により処理したＨＵＥＳ−１細胞系統またはＢＭＰ２により処理したＩ６細胞系統を生着させた心筋の瘢痕におけるヒトβ−ＭＨＣ陽性領域の定量（％）：^＊統計的に有意（ｐ≦０．０２５）。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアの閾値関数を用いて瘢痕内のβ−ＭＨＣ陽性領域の面積を計算し（図８Ｄ）、抗βミオシン抗体によって染色した横断切片によりいくつかの筋節構造が明らかになった。共焦点顕微鏡を使用するＺＥＩＳＳソフトウェアのスケーリングシステムを用いてそのサイズを計算した。抗ヒトラミン抗体（図８Ａ）（抗ラミン抗体は瘢痕領域内のＨＥＳ由来細胞を染色したが周囲の内因性ラット細胞を染色しなかったことに留意する）および抗ヒトβ−ミオシン抗体（図８Ｂ）を用いた、ＨＥＳ細胞を生着させた心筋の凍結切片の免疫染色。この抗体は、成体ラット内因性β−ＭＨＣを認識しなかった（左のパネルＢ）が、一方ヒトβ−ＭＨＣと結合した。共焦点顕微鏡使用により画像を取得した。（図８Ｃ）ＢＭＰ２によりまたはＢＭＰ２とＳＵ５４０２により処理したＨＵＥＳ−１細胞系統またはＢＭＰ２により処理したＩ６細胞系統を生着させた心筋の瘢痕におけるヒトβ−ＭＨＣ陽性領域の定量（％）：^＊統計的に有意（ｐ≦０．０２５）。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアの閾値関数を用いて瘢痕内のβ−ＭＨＣ陽性領域の面積を計算し（図８Ｄ）、抗βミオシン抗体によって染色した横断切片によりいくつかの筋節構造が明らかになった。共焦点顕微鏡を使用するＺＥＩＳＳソフトウェアのスケーリングシステムを用いてそのサイズを計算した。抗ヒトラミン抗体（図８Ａ）（抗ラミン抗体は瘢痕領域内のＨＥＳ由来細胞を染色したが周囲の内因性ラット細胞を染色しなかったことに留意する）および抗ヒトβ−ミオシン抗体（図８Ｂ）を用いた、ＨＥＳ細胞を生着させた心筋の凍結切片の免疫染色。この抗体は、成体ラット内因性β−ＭＨＣを認識しなかった（左のパネルＢ）が、一方ヒトβ−ＭＨＣと結合した。共焦点顕微鏡使用により画像を取得した。（図８Ｃ）ＢＭＰ２によりまたはＢＭＰ２とＳＵ５４０２により処理したＨＵＥＳ−１細胞系統またはＢＭＰ２により処理したＩ６細胞系統を生着させた心筋の瘢痕におけるヒトβ−ＭＨＣ陽性領域の定量（％）：^＊統計的に有意（ｐ≦０．０２５）。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアの閾値関数を用いて瘢痕内のβ−ＭＨＣ陽性領域の面積を計算し（図８Ｄ）、抗βミオシン抗体によって染色した横断切片によりいくつかの筋節構造が明らかになった。共焦点顕微鏡を使用するＺＥＩＳＳソフトウェアのスケーリングシステムを用いてそのサイズを計算した。抗ヒトラミン抗体（図８Ａ）（抗ラミン抗体は瘢痕領域内のＨＥＳ由来細胞を染色したが周囲の内因性ラット細胞を染色しなかったことに留意する）および抗ヒトβ−ミオシン抗体（図８Ｂ）を用いた、ＨＥＳ細胞を生着させた心筋の凍結切片の免疫染色。この抗体は、成体ラット内因性β−ＭＨＣを認識しなかった（左のパネルＢ）が、一方ヒトβ−ＭＨＣと結合した。共焦点顕微鏡使用により画像を取得した。（図８Ｃ）ＢＭＰ２によりまたはＢＭＰ２とＳＵ５４０２により処理したＨＵＥＳ−１細胞系統またはＢＭＰ２により処理したＩ６細胞系統を生着させた心筋の瘢痕におけるヒトβ−ＭＨＣ陽性領域の定量（％）：^＊統計的に有意（ｐ≦０．０２５）。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアの閾値関数を用いて瘢痕内のβ−ＭＨＣ陽性領域の面積を計算し（図８Ｄ）、抗βミオシン抗体によって染色した横断切片によりいくつかの筋節構造が明らかになった。共焦点顕微鏡を使用するＺＥＩＳＳソフトウェアのスケーリングシステムを用いてそのサイズを計算した。ＨＥＳ細胞を生着させた心筋のエオシン−ヘマトキシリン染色切片。瘢痕領域は細胞増殖の細胞浸潤の徴候を全く示さなかった。ｉＰＳ細胞はＣＤ１５＋心血管前駆細胞を生み出す、ＣＤ１５＋ｉＰＳ細胞を作製し、ＢＭＰ２処理の６日後に選別した。−図１０Ａ：ＣＤ１５＋細胞における心臓マーカーのＦＡＣＳ分析。ｉＰＳ細胞はＣＤ１５＋心血管前駆細胞を生み出す、ＣＤ１５＋ｉＰＳ細胞を作製し、ＢＭＰ２処理の６日後に選別した。−図１０Ｂ：ＭＥＦ上で５日間培養したＣＤ１５＋細胞の免疫蛍光。スケールバーは１０μｍを示している。ＣＤ１５＋細胞は心臓、内皮および血管のタンパク質マーカーを発現する；ＣＤ１５＋選別細胞をＭＥＦ上で５日間培養し、指示マーカーで免疫染色した；一部の細胞をＶＥＧＦまたはＰＤＧＦにより処理し、抗平滑筋アクチンおよびミオシンまたはＣＤ３１で免疫染色した。他の細胞を心筋から単離したヒト繊維芽細胞とともに培養し、抗アクチニン抗体で染色した。ＣＤ１５＋細胞は心臓、内皮および血管のタンパク質マーカーを発現する；ＣＤ１５＋選別細胞をＭＥＦ上で５日間培養し、指示マーカーで免疫染色した；一部の細胞をＶＥＧＦまたはＰＤＧＦにより処理し、抗平滑筋アクチンおよびミオシンまたはＣＤ３１で免疫染色した。他の細胞を心筋から単離したヒト繊維芽細胞とともに培養し、抗アクチニン抗体で染色した。ＣＤ１５＋細胞は心臓、内皮および血管のタンパク質マーカーを発現する；ＣＤ１５＋選別細胞をＭＥＦ上で５日間培養し、指示マーカーで免疫染色した；一部の細胞をＶＥＧＦまたはＰＤＧＦにより処理し、抗平滑筋アクチンおよびミオシンまたはＣＤ３１で免疫染色した。他の細胞を心筋から単離したヒト繊維芽細胞とともに培養し、抗アクチニン抗体で染色した。ＣＤ１５＋細胞は心臓、内皮および血管のタンパク質マーカーを発現する；ＣＤ１５＋選別細胞をＭＥＦ上で５日間培養し、指示マーカーで免疫染色した；一部の細胞をＶＥＧＦまたはＰＤＧＦにより処理し、抗平滑筋アクチンおよびミオシンまたはＣＤ３１で免疫染色した。他の細胞を心筋から単離したヒト繊維芽細胞とともに培養し、抗アクチニン抗体で染色した。ＣＤ１５＋細胞は心臓、内皮および血管のタンパク質マーカーを発現する；ＣＤ１５＋選別細胞をＭＥＦ上で５日間培養し、指示マーカーで免疫染色した；一部の細胞をＶＥＧＦまたはＰＤＧＦにより処理し、抗平滑筋アクチンおよびミオシンまたはＣＤ３１で免疫染色した。他の細胞を心筋から単離したヒト繊維芽細胞とともに培養し、抗アクチニン抗体で染色した。

Claims

霊長類ＥＳ細胞からの心血管前駆細胞のin vitro調製のための方法であって、次の工程：
ａ）霊長類ＥＳ細胞を、それらの増殖を可能にし、それらの多能性を維持する好適な薬剤を含有する培地中で培養する工程；
ｂ）工程ａ）において得られた霊長類多能性ＥＳ細胞を、前記多能性ＥＳ細胞をＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）含有培地中に懸濁することにより、心血管前駆細胞へと分化させる工程；および
ｃ）ＣＤ１５マーカーを膜表面において表示する、工程ｂ）において得られた分化した霊長類ＥＳ細胞を、心血管前駆細胞として選択し、回収する工程
を含んでなる、方法。
工程ａ）の培地が血小板溶解液を含んでなる、請求項１に記載の方法。
工程ａ）の培地が多血小板血漿（ＰＲＰ）溶解液を含んでなる、請求項２に記載の方法。
前記霊長類細胞がヒト細胞である、請求項３に記載の方法。
工程ｂ）において前記ＢＭＰ２がヒトＢＭＰ２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
工程ｂ）において前記培地が、ＦＧＦＲ（繊維芽細胞増殖因子受容体）からなる群から選択された受容体のチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤をさらに含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＴＫ阻害剤が、ＳＵ５４０２（３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン）およびＳＵ１１２４８（Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリジン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド）およびそれらの塩からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
工程ｂ）において、前記ＥＳ細胞が、１μＭＳＵ５４０２（±０．５μＭ）の存在下で、１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２（±５ｎｇ／ｍｌ）により処理される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
工程ｂ）において、前記ＥＳ細胞が、５μＭＳＵ１１２４８（±２μＭ）の存在下で、１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２（±５ｎｇ／ｍｌ）により処理される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
工程ｂ）において、前記ＥＳ細胞が、２％Ｂ２７と、
１μＭＳＵ５４０２（研究用）；または
５μＭＳＵ１１５４８（ＳＵＴＥＮＴ（商標）、臨床用）：と
を添加したＲＰＭＩ中で、１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２とともに９６時間処理される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
工程ａ）において霊長類ＥＳを培養するための培地が、霊長類血液から得られた血小板溶解液を添加した基礎培地を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記血小板溶解液が前記基礎培地に７．５％（Ｖ／Ｖ）±２，５％の濃度で添加される、請求項１１に記載の方法。
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるまたは得られる実質的に精製された心血管前駆細胞集団であって、前記心血管前駆細胞群が、それらの膜表面においてＣＤ１５マーカーを表示し、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４およびＩｓｌ１から選択された少なくとも１種の心血管の遺伝子の発現が、前記心血管前駆細胞群に誘導されている、実質的に精製された心血管前駆細胞集団。
前記心血管前駆細胞群が、それを必要とする患者にそれらを投与したときに梗塞後瘢痕を増殖させ、再配置するそれらの能力を保持している、請求項１３に記載の実質的に精製された心血管前駆細胞集団。
前記心血管前駆細胞群が、初期中胚葉のＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＴｂｘ６マーカー、心臓のＴｂｘ２０およびＭｅｆ２ｃマーカー、Ｎｋｘ２．５マーカーならびにＯｃｔ−４Ａマーカーを表示する、請求項１３または１４に記載の実質的に精製された心血管前駆細胞集団。
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の実質的に精製された心血管前駆細胞集団を含んでなる医薬。
霊長類において心不全を治療するための、請求項１６に記載の医薬。
ヒトにおいて心不全を治療するための、請求項１６に記載の医薬。
非分化ＥＳ細胞および心血管前駆細胞を含む哺乳類の細胞集団から心血管前駆細胞を選択的に分離するための方法であって、次の工程：
Ａ）前記細胞集団を抗ＣＤ１５抗体と接触させる工程；および
Ｂ）前記ＣＤ１５抗体と特異的に結合する細胞を選択して回収する工程、または前記抗ＣＤ１５抗体と結合していない細胞を除去する工程
を含んでなり、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４およびＩｓｌ１から選択された少なくとも１種の心血管の遺伝子の発現は、工程（Ｂ）において回収された細胞が心血管前駆細胞で富化していることを表す、方法。
Ｃ）工程（Ｂ）で回収された細胞に対して、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４およびＩｓｌ１から選択された少なくとも１種の心血管の遺伝子の遺伝子発現プロファイルを行う工程をさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
霊長類細胞集団の細胞を心血管前駆細胞で富化するための方法であって、次の工程：
Ａ）前記細胞集団を抗ＣＤ１５抗体と接触させる工程；および
Ｂ）前記ＣＤ１５抗体と特異的に結合する細胞を選択して回収する工程、または前記抗ＣＤ１５抗体と結合していない細胞を除去する工程
を含んでなり、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４およびＩｓｌ１から選択された少なくとも１種の心血管の遺伝子の発現は、工程（Ｂ）において回収された細胞が心血管前駆細胞で富化していることを表す、方法。
Ｃ）工程（Ｂ）で回収された細胞に対して、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４およびＩｓｌ１から選択された少なくとも１種の心血管の遺伝子の遺伝子発現プロファイルを行う工程をさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
前記哺乳類細胞集団が霊長類細胞集団である、請求項１９または２０に記載の方法。
前記霊長類細胞集団がヒト細胞集団である、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ＣＤ１５抗体が抗ヒトＣＤ１５抗体である、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ヒトＣＤ１５抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ＣＤ１５抗体が標識されている、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
前記抗ＣＤ１５抗体が、蛍光マーカーで標識されているか、または磁性化合物に結合している、請求項２７に記載の方法。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技術が用いられる、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
非分化霊長類ＥＳ細胞および心血管前駆細胞を含む細胞集団から心血管前駆細胞について富化するのに有用なキットであって、抗ＣＤ１５抗体と、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４およびＩｓｌ１から選択された少なくとも１種の心血管の遺伝子の遺伝子発現プロファイルを行うために用いられる試薬とを含んでなる、キット。
前記抗ＣＤ１５抗体が抗ヒトＣＤ１５抗体である、請求項３０に記載のキット。
前記抗ＣＤ１５抗体が標識される、請求項３０または３１に記載のキット。
前記抗ＣＤ１５抗体が、蛍光マーカーで標識されているか、または磁性化合物に結合している、請求項３２に記載のキット。
前記少なくとも１種の心血管の遺伝子の遺伝子発現プロファイルを行うための前記試薬が、リアルタイムＰＣＲ試薬である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のキット。
哺乳類ＥＳ細胞からin vitroで心血管前駆細胞を製造するために用いられる組成物または培養培地であって、ＢＭＰ２およびＲＴＫ阻害剤を含んでなり、前記組成物または培養培地が、
ＢＭＰ２と、ＦＧＦ受容体阻害剤とを含んでなる組成物または培養培地；
ＢＭＰ２と、ＳＵ５４０２およびＳＵ１１２４８から選択される化合物とを含んでなる組成物または培養培地；
１μＭＳＵ５４０２（±０．５μＭ）の存在下で１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２（±５ｎｇ／ｍｌ）を含んでなる組成物または培養培地；
５μＭＳＵ１１２４８（±２μＭ）の存在下で１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２（±５ｎｇ／ｍｌ）を含んでなる組成物または培養培地
からなる群から選択される、組成物または培養培地。
前記細胞が霊長類細胞である、請求項３５に記載の組成物または培養培地。
前記細胞がヒト細胞である、請求項３５に記載の組成物または培養培地。