JP5746507B2 - 全ゲノム分析方法 - Google Patents
全ゲノム分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5746507B2 JP5746507B2 JP2010530140A JP2010530140A JP5746507B2 JP 5746507 B2 JP5746507 B2 JP 5746507B2 JP 2010530140 A JP2010530140 A JP 2010530140A JP 2010530140 A JP2010530140 A JP 2010530140A JP 5746507 B2 JP5746507 B2 JP 5746507B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- dna molecule
- dna
- nick
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 109
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 92
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 83
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 16
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 claims description 4
- -1 propyl-dimethyl- [3- [4-[(Z)-(3-methyl-1,3-benzoxazol-2-ylidene) methyl] quinolin-1-ium-1-yl] propyl] Chemical class 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- 125000000656 azaniumyl group Chemical group [H][N+]([H])([H])[*] 0.000 claims 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 13
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 6
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 2
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- ZLSOONVQLWLPMF-UHFFFAOYSA-M 3-(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium-5-yl)propyl-diethyl-methylazanium;dibromide Chemical compound [Br-].[Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZLSOONVQLWLPMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071230 GCGC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 description 1
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710204212 Neocarzinostatin Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 101100244535 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) POP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100244540 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) pop7 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006095 Schwartz hydrozirconation reaction Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000007728 cost analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N neocarzinostatin chromophore Chemical compound O1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC)[C@H]1O[C@@H]1C/2=C/C#C[C@H]3O[C@@]3([C@@H]3OC(=O)OC3)C#CC\2=C[C@H]1OC(=O)C1=C(O)C=CC2=C(C)C=C(OC)C=C12 QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 229950009268 zinostatin Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
本出願は米国仮特許出願60/980,639号(2007年10月17日出願)の優先権を主張する。前記出願はあたかもその全体が説明されたかのように参照により本明細書に含まれる。
連邦政府の研究開発援助に関する記載
本発明は、以下の政府機関(NIH RO1 HG000225)により提供された合衆国政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は一般的に全ゲノムを分析する方法に関し、より具体的には、ニック部位と終止部位とによって仕切られたDNA分子の領域のヌクレオチド組成についての情報を確認する方法に関する。前記確認したヌクレオチド組成を参照ゲノムのヌクレオチド組成データと比較し、それによって、前記領域の配列を再度決定することなく、参照ゲノムの対応する領域との相違(存在するとしたら)を識別することができる。
ヒトのゲノムは多くのタイプの遺伝的異常、例えば多形性を保有する。多形性は、単一ヌクレオチドレベルおよび構造的レベルで発現されるとともに、大規模事象(特に癌に付随する事象)で発現される。いくつかの異常、例えば単一ヌクレオチド多形性(SNP)は単一ヌクレオチドにのみに関与し、遺伝子のエキソンまたはイントロン内に存在するか、または遺伝子と遺伝子の間の異質染色質領域内に存在する。コード配列内のSNPは、遺伝暗号の縮退のために、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させない。しかしながら、SNPはDNA内の変異であるので、それらは疾患に関するマーカーおよびヌクレオチドの位置に関するマーカーとして役立つ。さらにまた、遺伝子間の異質染色質領域に存在するSNPもやはり遺伝子スプライシングまたは転写因子結合について重要であり得る。
他の遺伝的異常は2つ以上のヌクレオチドを含み、したがってDNAの中間構造物に影響を及ぼし得る。これらの遺伝的異常には増幅、挿入、欠失、倒置および再編成が含まれるが、ただしこれらに限定されない。典型的には、これらの異常は、古典的な細胞遺伝学により分析され、さらに最近は高密度オリゴヌクレオチドアレイから入手されるデータを用いて分析される。しかしながら、新しい配列決定システムで効力を発揮するか、または前記システムを補完する、全ゲノムの迅速簡便で包括的な低コスト分析方法が引き続き希求されている。
第一の特徴では、DNA分子から配列組成情報を入手する方法は以下の工程を含む:配列特異的一本鎖ニック部位を前記分子に導入する工程、ニック部位から終止部位に及ぶDNA領域(region of DNA extending from nick site to termination site)に標識ヌクレオチドを組み入れる工程、前記領域に組み入れたヌクレオチドを定量してそのヌクレオチド組成を確認(ascertain)する工程、および参照ゲノム(reference genome)のヌクレオチド組成データと前記確認したヌクレオチド組成を比較して、前記領域の組成が参照ゲノムと同じであるかまたは相違するかを決定する工程。
第一の特徴のいくつかの実施態様では、本発明はさらに、本方法で標識する領域の外側の1つまたは2つ以上の位置でDNA分子にタグを付加する工程(tagging DNA molecule)を含む。第一の特徴の他の実施態様では、本方法は場合によって、標識組み入れ工程でDNA分子の非配列特異的内因性ニック部位から標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程を含む。標識組み入れ工程を実施する前に、内因性ニック部位を修復(連結)するか、または封鎖してもよい。第一の特徴のさらに他の実施態様では、本方法は場合によって、DNAからタンパク質を除去する(すなわちヒストンまたはDNA(特にゲノムDNA)と結合することがある任意の他の天然のタンパク質を除去する)工程を含む。
本発明のこれらおよび他の特色、特徴並びに利点は以下の説明からいっそう容易に理解されるであろう。この説明では、添付の図面が参照され、これら図面は本明細書の部分を構成し、さらにこれら図面では本発明の実施態様が限定ではなく例示として示されている。好ましい実施態様の説明は、本発明を限定して全ての改変、等価物および変型をカバーしようとするものではない。したがって、本発明の範囲の解釈には本明細書に列挙した特許請求の範囲が考慮されなければならない。
ニック翻訳では、標識ヌクレオチドはニック部位から反応中に導入され、ニック部位から終止部位へ向かって伸張する。標識領域は、本明細書では時に‘近傍部分’と称される。ニック部位の下流領域において2つ以上のヌクレオチドの内容についての情報が所望される場合、複数の別個の翻訳反応を実施することができ、この場合各反応は1つの標識ヌクレオチド(A、C、GまたはT)を含む。これらヌクレオチドを例えば蛍光色素で標識することができる(例えばAlexa Fluor-標識ヌクレオチド)。また別には、ヌクレオチドを改変して、組み入れ後に観察可能な標識の結合を促進する部分を組み入れることができる。例えばチオール化ヌクレオチドまたはα-Sヌクレオチドトリホスフェートは金ナノ粒子または金ナノクリスタルに直接結合することができよう。例えば以下を参照されたい:米国特許6,979,729号;Gelles J, et al., "Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision," Nature 1988, 331:450-453(前記文献の各々は参照によりあたかもその全体を説明したかのように本明細書に含まれる)。同様に、量子ドット、結晶および粒子もまた用いることができる。
特段の指定がなければ、本明細書で使用される全ての技術的および学術的用語は、当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載した方法および材料と同様のまたは等価のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料を本明細書で述べる。
本発明は以下の非限定的な実施例を熟考するときにより完全に理解されるであろう。
直鎖状または直鎖化ゲノムDNA分子(ただし任意のDNA分子を用いることができる)を調製するために開示した本明細書の方法によって、多重蛍光標識を有するDNA分子の作製が単純化される。1つの蛍光物質(すなわちドナー、例えばYOYO-1)が他の物質(すなわちアクセプター、例えば蛍光色素標識ヌクレオチド)を励起する光を発生させる蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の使用によって二色画像化が可能になり、組み入れられていない色素の影響が、前記影響の範囲が限定されるために減少する。上記に特記したように、DNA分子内の各々画像化された標識領域上の蛍光標識プロフィルは前記DNA分子の“シグナチャー”である。標識領域内の標識の量を定量することによって、下記で説明するように参照ゲノムとの比較により標識領域の配列を容易に確認することができる。参照ゲノムとのアラインメントを実施したとき、ゲノム内のマッピングしたニック部位における単一ヌクレオチドまたは2つ以上のヌクレオチドレベルにおける変異を検出することができる。
直鎖化が要求されるか否かにかかわらず、DNAリガーゼを用いてDNA内の固有のニックを除去することができる。T4 DNAリガーゼによるDNAリガーゼ反応を室温で一晩実施する。一晩の反応により完全な連結が担保され、残留DNAリガーゼ活性を最少にすることができる。全ての固有のニックが除去されたことをさらに担保するために、大腸菌のポリメラーゼI(10単位)を、ddNTP(各々0.2μM)とともに37℃で30分添加する。ニックに組み入れられたddNTPはさらに別のポリメラーゼ反応を封鎖しランダム標識を回避する。
またはNt.SapI、20単位、
をデオキシヌクレオチドトリホスフェート(dNTP)およびddNTP(例えばAlexa Fluor 647-aha-dCTP(2μM)、Alexa Fluor 647-aha-dUTP(2μM)、dATP(20μM)、dCTP(1μM)、dGTP(20μM)またはdTTP(1μM)(いずれもInvitrogen(Carlsbad, CA)から入手可能な標識ヌクレオチド))とともに添加する。ニック付加制限酵素は一本鎖断裂を導入するだけであり、したがっていずれの切断フラグメントもそれらの順序を維持することを可能にする。ニック効率(したがって再現性)は、酵素およびDNA濃度、消化時間、緩衝液組成、温度、並びに酵素およびDNA調製物の純度を最適化することによって達成される。DNAポリメラーゼは内因性ニックの封鎖中に添加されるので、新たなDNAポリメラーゼはニック翻訳中には添加されない。ニック翻訳反応は37℃で30分間実施される。ニック翻訳の終了は近傍部分の他方の境界を規定し、蛍光色素-蛍光色素立体反応によって決定される。また別には、ニック翻訳は、特にニック部位の間隙が密であるときはddNTPの組み入れによって終了させることができる。一般的には、2つの連続的に組み入れられた蛍光色素標識ヌクレオチドによって仕切られたDNAの領域(すなわち近傍部分)の平均長は64塩基であり、一方、ddNTPによる終了時のDNAの仕切られた領域の平均長は4塩基である。
反応の停止のためにEDTA(pH8.0、20μM)を添加し、さらにプロテイナーゼK(100ng/mL)およびラウロイルサルコシン(0.1% w/v)を添加して全ての酵素を除去する。ゲノムDNAは表面と共有結合していないので、これらの反応のために前記に生化学的に接近することができる。ニック翻訳に続いて、DNAをYOYO-1(25μM;Molecular Probes, Eugene, OR)で対比染色する。DNA塩基対:YOYO-1の比はλDNAについては6:1であり、T4 DNAについては5:1である。
有利には、上記に記載の方法は単一反応チャンバーで実施され、これは工程が単純に付加されることを意味し、これによって、DNAを破壊するかまたは処理量に影響を及ぼす可能性がある移動が最小限にされる。目覚しいことには、続いて分析される標識領域の情報内容は再配列決定による情報内容に匹敵し、1つのヌクレオチドタイプをアッセイするときは使用に適した情報が得られる。
DNAの標識領域に組み入れられた標識ヌクレオチドを定量する。DNA(1ng/mLのλDNAまたは0.78ng/mLのT4 DNA)、トリス-EDTA(TE)緩衝液(pH8.0)、β-メルカプトエタノールおよびPOP6(0.1% w/v;Applied Biosystems, FosterCity, CA)を含むDNAサンプルを表面、例えば米国特許公開2007/0161028(前記文献は参照によりあたかもその全体が説明されたかのように本明細書に含まれる)に開示された表面にローディングする。TE緩衝液の濃度は1xTE(10mMトリスおよび1mMのEDTA)から0.01xTE(100μMトリスおよび10μMのEDTA)まで変動する。緩衝液のイオン強度は当該表面への添加の前および後の両方で変化させて、DNAの伸張に影響を与えることができる。
表面を定量のために顕微鏡スキャナーに置く。そのような顕微鏡スキャナーの1つはGenome Zephyrであり、前記は蛍光顕微鏡、載物台自動制御装置およびソフトウェアを含む画像化システムである。以下を参照されたい:Zhou S, et al., "A single molecule system for whole genome analysis," in New Methods for DNA Sequencing (K Mitchelson, ed. 2007);およびDimalanta E, et al., "A microfluidic system for large DNA molecule arrays," Anal. Chem. 2004, 76:5293-5301(前記文献はあたかもその全体が説明されたかのように参照により本明細書に含まれる)。前記システムはアルゴンイオン、レーザー照射倒立Zeiss 135M顕微鏡を用いてDNA分子を画像化する。前記顕微鏡には、63xのZeiss Plan-Neofluar油浸対物レンズ、Dage SIT68GL低光量レベルビデオカメラ(DNA分子のビジュアル精査のためにソニーのモニターに連結されている)、並びに焦点および高解析画像を得るためのCCD(charge-couple device)カメラが搭載されている。Ludl Electronicsのx-yステージおよび0.1-m解像の焦点モーターをx-y-z平行移動のために用いる。2つの発光フィルター(YOYO-1発光フィルターXF3086およびAlexa Fluor 647発光フィルター)を前記顕微鏡に取り付ける。YOYO-1フィルターを用いてDNA骨格の画像を撮影し、一方、Alexa Fluor 647フィルターを用いて蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)画像を撮影する。完全なスキャニングシステムは例えばChannelCollectのソフトウェアの制御下にある(Zhouら(上掲書)およびDiamalantaら(上掲書)を参照されたい)。
これらの想定の下で、2台のカメラで撮影される画像間の画像座標のマッピングは類似性変換(すなわち平行移動、回転およびスケール変化)によって記載することができる。2台のカメラによって捕捉される、多数の固有で詳細な特色を有する標的サンプルの画像ペアセットを採集することによりこれらの値を計算する。各画像ペアについて、一方の画像を固定し、他方の画像を回転させさらに種々の角度および倍率係数により縮尺を増減させて、一連の相関性を調べる。通例では、これによって放物線と適合し得る滑らかな二次元(回転対倍率)スペースが作られる。この曲線の頂点の座標は要求される回転およびスケーリングを決定する。平均的、全体的な画像ペアを用いてこれらの数字の精度を高める。いったん回転および倍率を計算したら、各画像ペアを相関させて、X/Yピクセルオフセットを見出すことができ、これらをまた平均してより正確な値を得る。
Cn=(x,y,l)をnth未変換部分画像の中心の均質な座標とすると、Dn=(x+dX, y+dY, l)は対応する変換部分画像の中心の均質な座標である。さらに解は、D=M*Cである。
直線回帰技術を用いる行列等式として、前記行列を続いて類似性変換と結合させて所望の適合する変換が得られる。
回転およびスケーリングは、画像の1つを回転させ、一方で相対する画像をスケーリングしさらに一連の角度および倍率にわたってこれら画像の相関性を計算することによって計算する。相関性がその最大値に近い角度および倍率を用い、最良の回転角度およびスケール係数を概算する。ピクセルオフセットを計算するためのこの最良の角度およびスケールにより変換した画像で最終的な相関性を調べる。
潜在的な誤差発生源である時間経過による機械的アラインメントのいくらかの移動が発生する。十分な相関性を有する情報を含む部分画像のみが用いられたことを担保するために適切なチェックが実施されることを条件に、未加工画像群で部分画像アラインメント技術を用いてアラインメントが正確であることを立証することが可能である。
画像がいったん記録されたら、次の工程は、使用したフィルターのバンドパスのために赤色(FRET)画像に存在する緑色(YOYO-1)シグナルを除去することである。アルゴリズムを介して閾値を緑色画像で計算し、このレベルよりも明るい全てのピクセルがDNA骨格に存在することを明らかにする。赤色画像内の対応するピクセルを用いて、各点における緑色から赤色へのブリードスルー比を計算する。これらの値の平均を画像セットのためのブリードスルー係数として用いる。赤色画像の各ピクセルを、ブリードスルー係数(〜0.025)×一致する緑色画像の対応するピクセルの値を差し引くことによって調整する。
最終工程として、句読点の強度が計算される。各句読点周囲の面積を用いて存在する骨格シグナルを決定する。続いてシステムノイズを含むモデルを用いて、各句読点を構成するピクセルにガウスピークをフィットさせる。ガウスフィットの高さおよび変動を用い、光学的配列決定のために開発されたソフトウェアおよび分析により句読点の強度を計算する。上掲書(Ramanathan et al., 2004)を参照されたい。
マップは2つの方法のうち1つで読み取る。例えば、コンピュータで構築した参照ゲノムのマップ(すなわちin silicoマップ)に対してマップをアラインメントする。また別には、de novoでマップを作製し、同じデータセットの他の単一分子マップまたはバーコードに対して前記マップをアラインメントする。しかしながら、第一のタイプのアラインメントは、参照ゲノムに対してもっとも“蓋然性”の高い配置を考えるアラインメントアルゴリズムを必要とする。
ソフトウェアプログラムに組み入れられているアルゴリズムは、DNAまたはタンパク質配列のアラインメントと完全に類似する態様で、参照マップに対する可能なアラインメントの各々に付随する蓋然性に由来するスコア機能に依存する。この蓋然性の機能はそれ自体光学的マッピング誤差モデルに由来し、誤差削除のための条件を含む。アラインメントおよびアッセンブリー工程の両方のためのその後のコンピュータ作業は、したがってクラスターを形成するワークステーションの大きなネットワークに分配される。
したがって、アラインメントプロセスは各分子の実体を明らかにするだけでなく、通常の制限マップの特色により特徴付けられる構造的変異(制限部位の存在不明または欠失、ゲノムの挿入および欠失を含む)もまた明らかにする。
一緒に局在する標識ヌクレオチドの数を数える必要があるので、同じ近傍部分の配列を再度完全に決定したら入手し得る情報と比較してこのデータの情報内容を評価することができる。この情報の比較は、カウント(すなわち蛍光色素カウント)が完全な配列の代わりに基礎となる配列の特徴を明らかにするという概念を定量化し、配列の読みと等価であって一定のより短い長さを有するものを提供する。
統計的エントロピーを利用する以下の情報比較が用いられた:
H=Σx p(x) log p(x)、式中xはデータ(ある事例では再配列決定によるデータおよび他の事例ではフラッシュ配列決定によるデータ)であり、p(x)はデータxに付随する確率であってその合計はデータ全体の可能な認識であり、さらにlog p(x)は底が2の対数である。情報理論は、Jはデータの情報内容に関して直接的な解釈を有することを予測する。情報の量はHの増加とともに増加する。
本発明はまた、未だ配列が決定されていないゲノムにも適用される。本方法は、認識部位の各々および各認識部位の近傍部分の配列情報の入手を可能にする。分子が認識部位を有し、前記認識部位がmの塩基を含む場合、標識の存在は、m*n塩基対の配列情報を提供する。各近隣部分の蛍光色素のカウントはさらに追加される情報を含むデータを生じ、前記情報は、de novoの配列決定から得られる情報の重要な部分に等しい。前記追加される情報はIUPAC多義性コードを含む塩基対情報の提示に類似する。
ヒトゲノムの全ゲノムスキャン(光学マップとも称される)はほぼ100,000画像を生じる。上記に記載した画像加工および分析方法は、そのようなギガバイトサイズのファイルをコンパクトなマップデータファイルに縮小する。
これまで本発明をもっとも実際的で好ましい実施態様と考えられるものに関連して説明してきた。しかしながら本発明は例示として提示されてきたのであり、開示の実施態様に限定する意図はない。したがって、本発明が、添付の特許請求の範囲で示された本発明の範囲内の全ての改変および代替編成物を包含しようとすることは当業者には理解されよう。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔1〕以下の工程を含む、DNA分子からヌクレオチド配列組成情報を入手する方法:
配列特異的一本鎖ニック部位をDNA分子に導入する工程;
前記DNA分子の前記ニック部位から終止部位に及ぶ領域に標識したヌクレオチドを組み入れる工程;
前記DNA分子の前記領域に組み入れたヌクレオチドを定量して、前記領域付近のヌクレオチド配列組成情報を確認する工程;および
参照ゲノムの対応する領域のヌクレオチド配列組成情報と前記確認したヌクレオチド配列組成情報を比較して、前記DNA分子の領域の前記確認した配列ヌクレオチド組成情報が参照ゲノムの対応する領域のヌクレオチド配列組成情報と同じであるかまたは前記と相違するかを決定する工程。
〔2〕ニック部位がニック付加制限酵素によってDNAへ導入される、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕ニック付加制限酵素がNb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.SapIおよびNt.CviPIIから成る群から選択される、前記〔2〕に記載の方法。
〔4〕標識ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み入れられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔5〕標識ヌクレオチドがニック翻訳によって組み入れられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔6〕終止部位が少なくとも1つの組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔7〕終止部位が少なくとも2つの組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔8〕終止部位がターミネーターによって特徴付けられる、前記〔1〕に記載の方法。
〔9〕ターミネーターが組み入れたジデオキシヌクレオチドから選択されるか、または組み入れたジデオキシヌクレオチドおよび色素によって選択される、前記〔8〕に記載の方法。
〔10〕導入工程の前にDNA分子の非配列特異的内因性ニック部位からの標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程をさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔11〕標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程が、DNA分子の内因性ニックを修復する工程およびDNA分子の内因性ニックを封鎖する工程から成る工程群から選択される、前記〔10〕に記載の方法。
〔12〕DNA分子の前記領域の外側で標識分子タグをDNA分子に付加する工程をさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔13〕標識分子が包括的染色性蛍光色素である、前記〔12〕に記載の方法。
〔14〕包括的染色性蛍光色素がYOYO-1である、前記〔13〕に記載の方法
〔15〕さらにDNA分子からタンパク質を除去する工程を含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔16〕標識ヌクレオチドがAlexa-標識ヌクレオチドおよびCy5-標識ヌクレオチドから選択される、前記〔1〕に記載の方法。
〔17〕以下の工程を含む、DNA分子のヌクレオチド配列組成情報を評価する方法:
配列特異的一本鎖ニック部位をDNA分子に導入する工程;
前記DNA分子の前記ニック部位から終止部位に及ぶ領域に標識したヌクレオチドを組み入れる工程;
前記領域に組み入れたヌクレオチドを定量して、前記領域付近のヌクレオチド配列組成情報を評価する工程。
〔18〕ニック部位がニック付加制限酵素によってDNAへ導入される、前記〔17〕に記載の方法。
〔19〕ニック付加制限酵素がNb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.SapIおよびNt.CviPIIから成る群から選択される、前記〔18〕に記載の方法。
〔20〕標識ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み入れられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔21〕標識ヌクレオチドがニック翻訳によって組み入れられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔22〕終止部位が少なくとも1つの組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔23〕終止部位が少なくとも2つの組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔24〕終止部位がターミネーターによって特徴付けられる、前記〔17〕に記載の方法。
〔25〕ターミネーターが組み入れたジデオキシヌクレオチドから選択されるか、または組み入れたジデオキシヌクレオチドおよび色素によって選択される、前記〔24〕に記載の方法。
〔26〕導入工程の前にDNA分子の非配列特異的内因性ニック部位からの標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程をさらに含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔27〕標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程が、DNA分子の内因性ニックを修復する工程およびDNA分子の内因性ニックを封鎖する工程から成る工程群から選択される、前記〔26〕に記載の方法。
〔28〕DNA分子の前記領域の外側で標識分子タグを前記DNA分子に付加する工程をさらに含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔29〕標識分子が包括的染色性蛍光色素である、前記〔28〕に記載の方法。
〔30〕包括的染色性蛍光色素がYOYO-1である、前記〔29〕に記載の方法
〔31〕さらにDNA分子からタンパク質を除去する工程を含む、前記〔17〕に記載の方法。
〔32〕標識ヌクレオチドがAlexa-標識ヌクレオチドおよびCy5-標識ヌクレオチドから選択される、前記〔17〕に記載の方法。
Claims (13)
- 以下の工程を含む、DNA分子からヌクレオチド配列組成情報を入手する方法:
配列特異的一本鎖ニック部位をDNA分子に導入する工程;
前記DNA分子の前記ニック部位から終止部位に及ぶ領域に標識したヌクレオチドを組み入れる工程であって、ddNTP又は少なくとも2つの連続標識ヌクレオチドのいずれかが該終止部位に組み入れられる工程;
前記領域にすべてのヌクレオチドが組み入れられた後に前記DNA分子の前記領域に組み入れられた標識の量を定量して、前記領域についてのヌクレオチド配列組成情報を確認する工程;および
参照ゲノムから予想される標識の量と前記領域に組み込まれた標識の量とを比較して、前記DNA分子の領域の前記ヌクレオチド配列組成情報が参照ゲノムの対応する領域のヌクレオチド配列組成情報と同じであるかまたは前記と相違するかを決定する工程。 - 以下の工程を含む、DNA分子の配列決定をすることなくDNA分子のヌクレオチド配列組成情報を評価する方法:
配列特異的一本鎖ニック部位をDNA分子に導入する工程;
前記DNA分子の前記ニック部位から終止部位に及ぶ領域に標識したヌクレオチドを組み入れる工程;
前記領域にすべてのヌクレオチドが組み入れられた後に前記領域に組み入れられた標識の量を定量して、前記領域についてのヌクレオチド配列組成情報を評価する工程。 - ニック部位がニック付加制限酵素によってDNAへ導入される、請求項1又は2に記載の方法。
- ニック付加制限酵素がNb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.SapIおよびNt.CviPIIから成る群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 標識ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み入れられる、請求項1又は2に記載の方法。
- 標識ヌクレオチドがニック翻訳によって組み入れられる、請求項1又は2に記載の方法。
- 終止部位が少なくとも2つの連続して組み入れた標識ヌクレオチドによって特徴付けられる、請求項1又は2に記載の方法。
- 終止部位がターミネーターによって特徴付けられる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記方法が、更に
(a)導入工程の前にDNA分子の非配列特異的内因性ニック部位からの標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程、
(b)DNA分子の前記領域の外側で標識分子タグを前記DNA分子に付加する工程、又は
(c)DNA分子からタンパク質を除去する工程
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - (a)の標識の組み入れを低下させるかまたは防止する工程が、DNA分子の内因性ニックを修復する工程およびDNA分子の内因性ニックを封鎖する工程から成る工程群から選択される、請求項9に記載の方法。
- (b)の標識分子が蛍光DNA染色剤である、請求項9に記載の方法。
- 蛍光DNA染色剤が3−[ジメチル−[3−[4−[(E)−(3−メチル−1,3−ベンゾキサゾール−2−イリデン)メチル]キノリン−1−イウム−1−イル]プロピル]アザニウムイル]プロピル−ジメチル−[3−[4−[(Z)−(3−メチル−1,3−ベンゾキサゾール−2−イリデン)メチル]キノリン−1−イウム−1−イル]プロピル]アザニウム;テトライオジド(YOYO-1)である、請求項11に記載の方法。
- 標識ヌクレオチドがAlexa Fluor(登録商標)-標識ヌクレオチドおよびCy(登録商標)5-標識ヌクレオチドから選択される、請求項1又は2に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US98063907P | 2007-10-17 | 2007-10-17 | |
US60/980,639 | 2007-10-17 | ||
PCT/US2008/080294 WO2009052366A1 (en) | 2007-10-17 | 2008-10-17 | Methods of whole genome analysis |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011500061A JP2011500061A (ja) | 2011-01-06 |
JP2011500061A5 JP2011500061A5 (ja) | 2011-12-08 |
JP5746507B2 true JP5746507B2 (ja) | 2015-07-08 |
Family
ID=40194117
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010530140A Active JP5746507B2 (ja) | 2007-10-17 | 2008-10-17 | 全ゲノム分析方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8221973B2 (ja) |
EP (1) | EP2207901B1 (ja) |
JP (1) | JP5746507B2 (ja) |
KR (1) | KR101573414B1 (ja) |
WO (1) | WO2009052366A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9061901B2 (en) | 2006-07-19 | 2015-06-23 | Bionano Genomics, Inc. | Nanonozzle device arrays: their preparation and use for macromolecular analysis |
AU2008232616B2 (en) | 2007-03-28 | 2014-08-07 | Bionano Genomics, Inc. | Methods of macromolecular analysis using nanochannel arrays |
US8628919B2 (en) | 2008-06-30 | 2014-01-14 | Bionano Genomics, Inc. | Methods and devices for single-molecule whole genome analysis |
AU2009316628B2 (en) | 2008-11-18 | 2016-06-16 | Bionano Genomics, Inc. | Polynucleotide mapping and sequencing |
JP6556705B2 (ja) * | 2013-06-10 | 2019-08-07 | バイオナノ ジェノミクス、 インコーポレイテッド | ポリヌクレオチドの分析 |
KR101371510B1 (ko) * | 2013-12-27 | 2014-03-11 | 한국과학기술정보연구원 | 유전체 분석 방법 및 장치 |
KR101738596B1 (ko) * | 2014-05-28 | 2017-05-22 | (주)진매트릭스 | 유전자 표적부위 염기서열분석방법 및 그 분석용 조성물 |
US11198910B2 (en) * | 2016-09-02 | 2021-12-14 | New England Biolabs, Inc. | Analysis of chromatin using a nicking enzyme |
EP3710596B1 (en) * | 2017-11-16 | 2023-08-02 | New England Biolabs, Inc. | Mapping the location, type and strand of damaged nucleotides in double-stranded dna |
KR20200092378A (ko) | 2017-12-04 | 2020-08-03 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 단일 핵산 분자 측정들로부터 서열 정보를 식별하기 위한 시스템들 및 방법들 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6197557B1 (en) * | 1997-03-05 | 2001-03-06 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for analysis of nucleic acids |
US6221592B1 (en) * | 1998-10-20 | 2001-04-24 | Wisconsin Alumi Research Foundation | Computer-based methods and systems for sequencing of individual nucleic acid molecules |
JP2005517382A (ja) * | 2001-06-08 | 2005-06-16 | ユー.エス. ジェノミクス, インコーポレイテッド | ニックトランスレーションを使用する、核酸を分析するための方法および生成物 |
ES2292270B1 (es) * | 2004-04-14 | 2009-02-16 | Oryzon Genomics, S.A. | Procedimiento para detectar selectivamente acidos nucleicos con estructuras atipicas convertibles en muescas. |
US7960105B2 (en) * | 2005-11-29 | 2011-06-14 | National Institutes Of Health | Method of DNA analysis using micro/nanochannel |
-
2008
- 2008-10-17 JP JP2010530140A patent/JP5746507B2/ja active Active
- 2008-10-17 EP EP08839468.9A patent/EP2207901B1/en active Active
- 2008-10-17 WO PCT/US2008/080294 patent/WO2009052366A1/en active Application Filing
- 2008-10-17 KR KR1020107010554A patent/KR101573414B1/ko active IP Right Grant
- 2008-10-17 US US12/253,625 patent/US8221973B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011500061A (ja) | 2011-01-06 |
KR20100093526A (ko) | 2010-08-25 |
EP2207901A1 (en) | 2010-07-21 |
WO2009052366A1 (en) | 2009-04-23 |
US20090104611A1 (en) | 2009-04-23 |
EP2207901B1 (en) | 2018-07-25 |
KR101573414B1 (ko) | 2015-12-01 |
US8221973B2 (en) | 2012-07-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5746507B2 (ja) | 全ゲノム分析方法 | |
Lam et al. | Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly | |
US6607888B2 (en) | Method for analyzing nucleic acid reactions | |
Müller et al. | Optical DNA mapping in nanofluidic devices: principles and applications | |
US6294336B1 (en) | Method for analyzing the nucleotide sequence of a polynucleotide by oligonucleotide extension on an array | |
US20100028873A1 (en) | Methods and means for nucleic acid sequencing | |
JP2020511966A (ja) | エラーが訂正された核酸配列決定への適用を伴う標的化核酸配列濃縮のための方法 | |
US8795971B2 (en) | Centroid markers for image analysis of high density clusters in complex polynucleotide sequencing | |
US20140129201A1 (en) | Validation of genetic tests | |
KR20180123020A (ko) | 카피수 변이를 판정하기 위한 dna 단편 크기의 사용 | |
US11188778B1 (en) | Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator | |
Kim et al. | Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA-binding proteins | |
EP3004433B1 (en) | Substantially unbiased amplification of genomes | |
US20150344873A1 (en) | Whole Genome Mapping by DNA Sequencing With Linked-Paired-End Library | |
De Carli et al. | High‐throughput optical mapping of replicating DNA | |
US10851411B2 (en) | Molecular identification with subnanometer localization accuracy | |
CN115989544A (zh) | 用于在基因组的重复区域中可视化短读段的方法和系统 | |
US20100330556A1 (en) | Genome analysis using a nicking endonuclease | |
ES2924224T3 (es) | Análisis paralelo multiplexado con enriquecimiento de blancos para la evaluación de muestras de ADN fetal | |
US20030087280A1 (en) | Shot gun optical maps of the whole E. coli O157:H7 | |
Cai | Spatial mapping of single cells in human cerebral cortex using DARTFISH: A highly multiplexed method for in situ quantification of targeted RNA transcripts | |
JP7497879B2 (ja) | 核酸混合物および混合細胞集団を解析するための方法および試薬ならびに関連用途 | |
US12006532B2 (en) | Methods for targeted nucleic acid sequence enrichment with applications to error corrected nucleic acid sequencing | |
WO2022192189A1 (en) | Methods and compositions for analyzing nucleic acid | |
JP2021524736A (ja) | 核酸混合物および混合細胞集団を解析するための方法および試薬ならびに関連用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111014 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111014 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130828 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20131128 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20131205 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20131226 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140109 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140128 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140402 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140702 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140709 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140804 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150317 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150427 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150508 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5746507 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |