JP5730568B2 - Dna切断点の分析のための方法 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Description
(i)癌-いくつかの形態の癌は転座によって引き起こされる。これは、主に白血病(例えば、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病)において記載されている。
(ii)不妊症-これは、親が無症候性であるが妊娠した胎児が生存可能でない場合、親候補者の片方が平衡型転座を保有する場合に生じ得る。
(iii)ダウン症候群-ある場合には、これは第21染色体の約3分の1の、第14染色体上へのロバートソン転座によって引き起こされる。
・ t(2;5)(p23;q35)-未分化大細胞リンパ腫
・ t(8;14)-バーキットリンパ腫(c-myc)
・ t(9;22)(q34;q11)-フィラデルフィア染色体、CML、ALL
・ t(11;14)-マントル細胞リンパ腫(Bcl-1)
・ t(11;22)(q24;q11.2-12)-ユーイング肉腫
・ t(14;18)(q32;q21)-濾胞性リンパ腫(Bcl-2)
・ t(l7;22)-隆起性皮膚線維肉腫
・ t(15;17)-急性前骨髄急性白血病(pmlおよびレチノイン酸受容体遺伝子)
・ t(1;12)(q21;p13)-急性骨髄性白血病
・ t(9;12)(p24;p13)-CML、ALL(TEL-JAK2)
・ t(X;18)(p11.2;q11.2)-滑膜肉腫
・ t(1;11)(q42.1;q14.3)-統合失調症
・ t(1;19)-急性前駆B細胞白血病(PBX-1およびE2A遺伝子)。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)の他のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと
を含む。
(i)ゲノムDNA試料を、
(a)プライマーがその5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)プライマーがその5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドのタグはリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーに位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点の5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーに位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点の3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、および
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、および
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)の他のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のアンチセンス鎖のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマーであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるプライマー、
(c)ステップ(i)(a)のフォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)ステップ(i)(b)のリバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマー、
(c)ステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、
(d)ステップ(iii)(b)のリバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、BCRまたはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、ABLまたはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、BCRまたはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、ABLまたはその断片に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、BCRまたはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、ABLまたはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマーであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるプライマー、
(c)ステップ(i)(a)のフォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)ステップ(i)(b)のリバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、BCRまたはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、ABLまたはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマー、
(c)ステップ(iii)(a)のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)ステップ(iii)(b)のリバースプライマーオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを単離および配列決定するステップと
を含む。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)の他のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)ゲノムDNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点の5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点の3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)の他のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、および
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、および
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点の3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のアンチセンス鎖のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマーであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるプライマー、
(c)ステップ(i)(a)のフォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)ステップ(i)(b)のリバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して5'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、遺伝子切断点に対して3'に位置する隣接遺伝子またはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマー、
(c)ステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)ステップ(iii)(b)のリバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)プライマーに連結している独特のオリゴヌクレオチドタグをベースにした選択ステップ。それに応じて、タグ自体も増幅され、したがって増幅産物の部分を形成するので、これらを、フォワードプライマーおよびリバースプライマー両方の増幅の結果であり、したがって切断点をまたがなければならない増幅産物の単離を可能にするプローブ部位として用いることができる。あるいは、タグの1つをビオチン化することで、フォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかによる伸長に起因する増幅産物を同定および単離する手段がもたらされる。例えば、増幅産物をビオチン化したプライマーで満たすことにより、プライマーは対象の増幅産物を同定するためのプローブとして作用することができ、ビオチン化はこれらの増幅産物を単離するためのベースを提供することができる。本発明のプライマーグループの各々が独特のタグを含むことを確実にすることによって、かなりの特殊性で、対象の特異的な増幅産物だけを選び出すことは可能である。特に、当業者であれば、フォワードプライマーによって増幅されたがリバースプライマーによって増幅されなかった増幅産物を排除し、それによって対象の増幅産物がおそらく切断点をまたがって伸長しないことを示すことを求める。切断点をまたがる可能性が最もある増幅産物を選び出すことによって、プライマーの固有のクロスハイブリダイゼーションまたは切断点の両側に隣接しない増幅産物の増幅いずれかの結果として、逐次的なラウンドの複製はより特異的に標的にされ、望まない増幅産物が得られる可能性は低くなる。
(ii)ゲル上で産物を泳動し、関連する可能性のあるバンドまたは領域だけを切り出し、その後これらをさらなる増幅ステップにかけることを求めてもよい。第2ラウンドの増幅の後にゲル上にバンドが存在する場合、配列決定において何らかの問題が存在する場合、産物をゲルから切り出し、個々のプライマーおよび/またはより小さいプールのプライマーを用いて一連のPCR反応を行う試みを行うことによってこれをクリーンアップする試みを行うことができる。例えば、個々のフォワードBCRプライマー、およびリバースABLプライマー12個だけを含むプールを用いることができる。
(iii)非特異的な増幅産物に対するネガティブ選択をもたらすために、増幅した産物を1つまたは複数のラウンドのボトルネックPCR(bottleneck PCT)に供してもよい。
・ t(2;5)(p23;q35)-未分化大細胞リンパ腫
・ t(8;14)-バーキットリンパ腫(c-myc)
・ t(9;22)(q34;q11)-フィラデルフィア染色体、CML、ALL(BCR-ABL組換え)
・ t(11;14)-マントル細胞リンパ腫(Bcl-1)
・ t(11;22)(q24;q11.2-12)-ユーイング肉腫
・ t(14;18)(q32;q21)-濾胞性リンパ腫(Bcl-2)
・ t(17;22)-隆起性皮膚線維肉腫
・ t(15;17)-急性前骨髄球性白血病(pmlおよびレチノイン酸受容体遺伝子)
・ t(1;12)(q21;p13)-急性骨髄性白血病
・ t(9;12)(p24;p13)-CML、ALL(TEL-JAK2)
・ t(X;18)(p11.2;q11.2)-滑膜肉腫
・ t(1;11)(q42.1;q14.3)-統合失調症
・ t(1;19)-急性前駆B細胞白血病(PBX-1およびE2A遺伝子)。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、BCRまたはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、ABLまたはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、BCRまたはその断片のDNA領域に対する1つまたは複数のフォワードプライマー、および
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、ABLまたはその断片に対する1つまたは複数のリバースプライマー
と接触させてもよいステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを分析するステップと
を含む。
(i)DNA試料を、
(a)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、BCRまたはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、
(b)その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、ABLまたはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマーであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なるプライマー、
(c)ステップ(i)(a)のフォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)ステップ(i)(b)のリバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)ステップ(i)の1つまたは複数のフォワードプライマーの3'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、BCRまたはその断片のDNA領域に対する1個から30個のフォワードプライマー、
(b)ステップ(i)の1つまたは複数のリバースプライマーの5'に位置するDNA領域に対するものであり、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結していてもよい、ABLまたはその断片のDNA領域に対する24個から400個のリバースプライマー、
(c)ステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)ステップ(iii)(b)のリバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させるステップであって、
フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のリバースプライマーのタグに対して同じであるが、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグはステップ(i)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのタグに対して異なるステップと、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)前記増幅したDNAを単離および配列決定するステップと
を含む。
(i)染色体遺伝子転座を特徴とする疾患状態と診断される患者の継続的なモニターに用いることができる、患者に特異的なプローブをデザインおよび生成を可能にすること。慢性骨髄性白血病に対してこの手段によって得られた結果を図6に示す。
(ii)遺伝子または他のDNA領域を染色体、ベクター、プラスミド、人工染色体などの中に組み込むことを対象とするin vitroおよびin vivoの遺伝子トランスフェクションシステムの分析およびモニター。組換えが起こるべき一般的部位が知られている場合、本発明を適用して組込みの特異的な点および性質(例えば、切断点)を決定することができる。これは、特異的なプライマーの生成を可能にすることによって、遺伝子組換えの事象の継続的な安定性をモニターするのにも用いることができる。
・ t(2;5)(p23;q35)
・ t(8;14)
・ t(9;22)(q34;q11)
・ t(11;14)
・ t(11;22)(q24;q11.2-12)
・ t(14;18)(q32;q21)
・ t(17;22)
・ t(15;17)
・ t(1;12)(q21;p13)
・ t(9;12)(p24;p13)
・ t(X;18)(p11.2;q11.2)
・ t(1;11)(q42.1;q14.3)
・ t(1;19)
などの染色体遺伝子転座切断点である。
・ 未分化大細胞リンパ腫
・ バーキットリンパ腫
・ CML、ALL
・ マントル細胞リンパ腫
・ ユーイング肉腫
・ 濾胞性リンパ腫
・ 隆起性皮膚線維肉腫
・ 急性前骨髄球性白血病
・ 急性骨髄性白血病
・ 滑膜肉腫
・ 統合失調症、または
・ 急性前駆B細胞白血病(acute pre-B cell leukemia)
である。
(患者1のgDNAからのBCR/ABL切断点産物の単離)
・ Qiagen Flexigeneキットによって抽出したゲノムDNA
・ 第1ラウンドのPCR(ゲノムDNA50ng)-反応はすべて2回ずつ行った
フォワードプライマーのプール-FA(各々同じ5'タグ配列(A)を有するフォワードBCRプライマーBCRF1〜BCRF7の7個を含む、全量50ng(各7.14ng))
リバースプライマーのプール-R3/4(各々同じ5'タグ配列(C)を有するオリゴヌクレオチドリバースABLプライマー24個のプール、全量50ng(各2.08ng))
フォワードおよびリバースのタグ配列プライマー(A、C)-各25ng
〈PCR条件〉
1×PCRバッファー、5mM MgCl2、0.75μl dUTP(各300uM)、0.4ul Platinum Taq(2U)
〈サイクル条件〉
95/4分
(97℃/1分、65℃/20分、72℃/1分)×5
(96℃/30秒、65℃/20分、72℃/1分)×5
(92℃/30秒、65℃/20分、72℃/1分)×10
・ 第2ラウンドのPCR(第1ラウンドの反応物を滅菌水で1/200希釈した)
フォワードプライマーのプール-NFA(各々同じ5'タグ配列(B)を有する7個のフォワード内部BCRプライマーBFN1〜BFN7を含む、全量50ng(各7.14ng))
リバースプライマーのプール-RN3/4(各々同じ5'タグ配列(D)を有するオリゴヌクレオチドリバース内部ABLプライマー24個のプール、全量50ng(各2.08ng))
フォワードおよびリバースのタグ(B、D)-各25ng
〈PCR条件〉
1×PCRバッファー、5mM MgCl2、0.75ul dUTP(300uM)、0.4ul Pt Taq(2U)
〈サイクル条件〉
95/4分
(94℃/30秒、65℃/10分、72℃/1分)×10
(94℃/30秒、65℃/5分、72℃/1分)×15
・ PCR産物(7ul)を1.5%(v/v)アガロースゲル12ボルトで分離
・ PCR産物を1.5%(v/v)アガロースゲル120ボルトで分離
バンドを切り出し、Flexigeneキットによって精製
・ PCRによるバンドの再増幅(精製した産物の1/1000希釈)
フォワードプライマー-タグB(25ng)
リバースプライマー-タグD(25ng)
〈PCR条件〉
1×PCRバッファー、5mM MgCl2、0.75ul dUTP(300uM)、0.4ul Pt Taq(2U)
〈サイクル条件〉
95/4分
(94℃/30秒、65℃/30秒、72℃/30秒)×35
・ PCR産物をタグBプライマーで配列決定(Flinders sequencing facility)
・ 切断点を含むgDNA(50ng)に対するPCR
患者1 gDNA対10×正常gDNA(いくつかのプライマーの組合せ)
フォワードプライマー-BCR(患者特異的)(25ng)
リバースプライマー-ABL(患者特異的)(25ng)
〈PCR条件〉
1×PCRバッファー、5mM MgCl2、0.75ul dUTP(300uM)、0.4ul Pt Taq(2U)
〈サイクル条件〉
95/4分
(97℃/1分、65℃/30秒、72℃/3秒)×5
(96℃/30秒、65℃/30秒、72℃/30秒)×5
(92℃/30秒、65℃/30秒、72℃/30秒)×25
・ PCR産物を3%(v/v)アガロースゲル120ボルトで分離
バンドを切り出し、Qiagen minEluteキットによって精製
産物を5'BCR特異的プライマーで配列決定してBCR/ABL切断点を確認した(Flinders sequencing facility)。
- 標準の判定基準を用いてデザインすること;
- 各BCRプライマーとペアを組ませ、BCR鋳型の増幅が行われないことについてPCRによって試験すること(この判定基準に合致しないプライマーは廃棄される);
- 12個または24個のABLプライマーのプールに組み込み、このプールを各BCRプライマーとペアを組ませ、PCR増幅によって以前に生成したBCR鋳型を用いた実験的PCRによる試験を行うこと(増幅を生成し、したがって、この試験に落第するあらゆるプールを、どれが増幅を担うかを決定するために個々のABLプライマーの各々を試験することによってさらに分析する。同定したら、このプライマーを廃棄する)。
(慢性骨髄性白血病におけるBCR-ABL転座切断点の単離に用いるプライマー)
(PML-RARα切断点の同定)
増幅した患者のDNAを、2%アガロースゲル上で電気泳動した。Pは患者のDNAであり、Nは正常DNAであり、Wは水コントロールである。患者のDNAを、複数のRARαプライマーおよび単一のPMLプライマーを用いて増幅した。
a)増幅した患者のDNAを、2%アガロースゲル上で電気泳動し、Pは患者のDNAであり、Nは正常DNAであり、Wは水コントロールである。患者のDNAを、切断点配列を用いてデザインされたRARαプライマーおよびPMLプライマーを用いて、1ラウンドの間増幅した。
b)患者のDNAから得た配列のクロマトグラム。PMLとRARαの間の切断点を示す。
患者2人を試験し、切断点を単離し、両方において配列決定した。用いたプライマーを実施例4に示す。
(急性前骨髄球性白血病におけるPML-RARα転座切断点の単離に用いたプライマー)
- 標準の判定基準を用いてデザインすること;
- 各BCRプライマーとペアを組ませ、BCR鋳型の増幅が行われないことについてPCRによって試験すること(この判定基準に合致しないプライマーは廃棄される);
- 12個または24個のABLプライマーのプールに組み込み、このプールを各BCRプライマーとペアを組ませ、PCR増幅によって以前に生成したBCR鋳型を用いた実験的PCRによる試験を行うこと(増幅を生成し、したがって、この試験に落第するあらゆるプールを、どれが増幅を担うかを決定するために個々のABLプライマーの各々を試験することによってさらに分析する。同定したら、このプライマーを廃棄する)。
Claims (14)
- 遺伝子切断点を同定する方法であって、
(i)第一ラウンドの反応において、DNA試料を、
(a)隣接遺伝子またはその断片のゲノムDNA領域のアンチセンス鎖に対する1個または複数のフォワードプライマーであって、前記領域が遺伝子切断点に対して5'に位置する、フォワードプライマー、
(b)隣接遺伝子またはその断片のゲノムDNA領域のセンス鎖に対する1個または複数のリバースプライマーであって、前記領域が遺伝子切断点に対して3'に位置する、リバースプライマーであって、
全てのフォワードプライマーまたは全てのリバースプライマーまたは全てのフォワードプライマーおよび全てのリバースプライマーの両方が、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結するプライマーであって、
-フォワードプライマーがオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結している場合は、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(i)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、
-リバースプライマーがオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結している場合は、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(i)(b)のリバースプライマーのタグに対して同じであり、
-フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方がオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結している場合は、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なる、プライマー、
(c)フォアワードプライマーのタグが存在している場合は、ステップ(i)(a)のフォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)リバースプライマーのタグが存在している場合は、ステップ(i)(b)のリバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を増幅するステップと、
(iii)第二ラウンドの反応において、ステップ(ii)で得られた増幅産物を、
(a)隣接遺伝子またはその断片のゲノムDNA領域のアンチセンス鎖に対する1個または複数のフォワードプライマーであって、前記領域が、遺伝子切断点に対して5'、および、ステップ(i)(a)の1個または複数の領域の3'に位置する、フォワードプライマー、
(b)隣接遺伝子またはその断片のゲノムDNA領域のセンス鎖に対する1個または複数のリバースプライマーであって、前記領域が、遺伝子切断点に対して3'、および、ステップ(i)(b)の1個または複数の領域の5'に位置する、リバースプライマーであって、
全てのフォワードプライマーまたは全てのリバースプライマーまたは全てのフォワードプライマーおよび全てのリバースプライマーの両方が、その5'末端でオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結するプライマーであって、
-フォワードプライマーがオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結している場合は、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(a)のフォワードプライマーのタグに対して同じであり、
-リバースプライマーがオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結している場合は、リバースプライマーのオリゴヌクレオチドタグはステップ(iii)(b)のリバースプライマーのタグに対して同じであり、
-フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方がオリゴヌクレオチドタグに作動可能に連結している場合は、フォワードプライマーのオリゴヌクレオチドタグはリバースプライマーのタグに対して異なり、ステップ(iii)のフォワードおよびリバースプライマーのタグは、ステップ(i)のフォワードおよびリバースプライマーのタグに対して異なる、プライマー
(c)フォワードプライマーのタグが存在する場合は、ステップ(iii)(a)のフォワードプライマーオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー、および
(d)リバースプライマーのタグが存在する場合は、ステップ(iii)(b)のリバースプライマーオリゴヌクレオチドタグに対するプライマー
と接触させるステップ、
(iv)ステップ(iii)のDNA試料を増幅するステップと、
(v)増幅したDNAを分析するステップと
を含む方法。 - ステップ(i)(a)において1個のプライマーを用い、ステップ(i)(b)において24〜400個のプライマーを用いる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(i)(b)において1個のプライマーを用い、ステップ(i)(a)において2個以上のプライマーを用いる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(iii)(a)において1個のプライマーを用い、ステップ(iii)(b)において24〜400個のプライマーを用いる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(iii)(b)において1個のプライマーを用い、ステップ(iii)(a)において2個以上のプライマーを用いる、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子切断点が遺伝子転座切断点または相同組換え点である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子転座切断点が染色体遺伝子転座切断点である、請求項6に記載の方法。
- 前記遺伝子転座切断点が、
(i)BCR-ABL転座
(ii)PML-RARα転座
(iii)t(2;5)(p23;q35)転座
(iv)t(8;14)転座
(v)t(9;22)(q34;q11)転座
(vi)t(11;14)転座
(vii)t(11;22)(q24;q11.2-12)転座
(viii)t(14;18)(q32;q21)転座
(ix)t(17;22)転座
(x)t(15;17)転座
(xi)t(1;12)(q21;p13)転座
(xii)t(9;12)(p24;p13)転座
(xiii)t(X;18)(p11.2;q11.2)転座
(xiv)t(1;11)(q42.1;q14.3)転座
(xv)t(1;19)転座
から選択される、請求項7に記載の方法。 - 1〜30個のプライマーをステップ(i)(a)において用い、24〜400個のプライマーをステップ(i)(b)において用いる、請求項1に記載の方法。
- 1〜30個のプライマーをステップ(iii)(a)において用い、24〜400個のプライマーをステップ(iii)(b)において用いる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(iv)の前記増幅したDNAを、増幅、選択、または濃縮のさらなるステップにかける、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子切断点が染色体BCR-ABL転座であり、
(a)ステップ(i)(a)のフォワードプライマーが配列番号10〜15に相当し、
(b)ステップ(i)(b)のリバースプライマーが配列番号23〜304に相当し、配列番号22によって規定されるオリゴヌクレオチドタグに連結している、
請求項1に記載の方法。 - (a)ステップ(iii)(a)のフォワードプライマーが配列番号16〜21に相当し、
(b)ステップ(iii)(b)のリバースプライマーが配列番号306〜587に相当し、配列番号305によって規定されるオリゴヌクレオチドタグに連結している、
請求項12に記載の方法。 - 前記遺伝子切断点が染色体RML-RARα転座であり、
(a)ステップ(i)(a)のフォワードプライマーが配列番号588〜593に相当し、
(b)ステップ(i)(b)のリバースプライマーが配列番号601〜634に相当し、配列番号22によって規定されるオリゴヌクレオチドタグに連結している、
請求項1に記載の方法。
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