JP5727932B2 - 低分子ゲル化剤により化合物が内包されたゲル - Google Patents
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Description
本発明の内包ゲルは、スキンケア製品、外用医薬品、創傷被服剤、癒着防止膜、薬物速達システム、芳香剤、消臭剤、防虫剤、殺虫剤、農薬用基材、診断薬用基材、化学反応や酵素反応の溶材、化学センサ用基材、バイオセンサー用基材などに好適に利用可能である。
ところで、これらゲル剤にて重合反応を用いずに安全で安定なシート状のものを作成しようとした際には、天然高分子を溶解させた溶液をシート形状の型に入れゲル化させることになるが、このように作成したゲルシートは水に浸漬しておくと次第に天然高分子がゲルシートから水へと抜け落ち、崩壊してしまう。このように、物理ゲルのみでゲルシート作成は極めて困難であった(非特許文献1)。また、低分子ゲルによるゲルシートの作成は知られていなかった。
また、低分子ゲル化剤によりチトクロームcのような酵素を内包した場合、ゲル内に取り込まれた酵素がその活性を損なうことなく維持することができれば、そのゲル内で酵素反応を進行させることが可能になると考えられ、さらにゲル内で反応を見ることができ、酵素を内包したゲルをバイオセンサーや検査・診断薬等として使用することができると考えられる(特許文献3〜6)。
すなわち、第1観点として、式(1):
第2観点として、前記式(1)中、R1が不飽和結合を0乃至2個有し得る炭素原子数11乃至23の直鎖状脂肪族基であることを特徴とする、第1観点に記載の内包ゲル。
第3観点として、前記式(1)中、R2乃至R5はそれぞれ互いに独立して、水素原子、炭素原子1又は2の分枝鎖を有し得る炭素原子数1乃至4のアルキル基、フェニルメチル基、又は−(CH2)n−X基を表し、かつR2乃至R5のうち一つ又は二つが−(CH2)n−X基を表し、nは1乃至4の数を表し、Xはアミノ基、グアニジノ基、−CONH2基、又は窒素原子を1乃至2個有し得る5員環又は5員環と6員環から構成される縮合複素環を表すことを特徴とする、第1観点又は第2観点に記載の内包ゲル。
第4観点として、前記式(1)中、R2乃至R5はそれぞれ互いに独立して、水素原子、炭素原子1又は2の分枝鎖を有し得る炭素原子数1乃至4のアルキル基、フェニルメチル基、又は−(CH2)n−X基を表し、かつR2乃至R5のうち一つ又は二つが−(CH2)n−X基を表し、nは1乃至4の数を表し、Xはアミノ基、グアニジノ基、−CONH2基、ピロール基、イミダゾール基、ピラゾール基又はインドール基を表すことを特徴とする、第3観点に記載の内包ゲル。
第5観点として、前記式(1)中、R2乃至R5はそれぞれ互いに独立して、水素原子、メチル基、エチル基、n−プロピル基、i−プロピル基、n−ブチル基、i−ブチル基、第二ブチル基、第三ブチル基、フェニルメチル基、アミノメチル基、2−アミノエチル基、3−アミノプロピル基、4−アミノブチル基、カルバモイルメチル基、2−カルバモイルエチル基、3−カルバモイルプロピル基、2−グアニジノエチル基、3−グアニジノプロピル基、ピロールメチル基、イミダゾールメチル基、ピラゾールメチル基又は3−インドールメチル基を表し、かつR2乃至R5のうち一つ又は二つがアミノメチル基、2−アミノエチル基、3−アミノプロピル基、4−アミノブチル基、カルバモイルメチル基、2−カルバモイルエチル基、3−カルバモイルプロピル基、2−グアニジノエチル基、3−グアニジノプロピル基、ピロールメチル基、イミダゾールメチル基、ピラゾールメチル基又は3−インドールメチル基を表すことを特徴とする、第4観点に記載の内包ゲル。
第6観点として、前記式(1)中、R2乃至R5は、それぞれ独立して水素原子、メチル基、i−プロピル基、i−ブチル基、第二ブチル基、フェニルメチル基、4−アミノブチル基、カルバモイルメチル基、2−カルバモイルエチル基、3−グアニジノプロピル基、イミダゾールメチル基又は3−インドールメチル基を表し、かつR2乃至R5のうち一つ又は二つが4−アミノブチル基、カルバモイルメチル基、2−カルバモイルエチル基、3−グアニジノプロピル基、イミダゾールメチル基、又は3−インドールメチル基を表すことを特徴とする、第5観点に記載の内包ゲル。
第7観点として前記式(1)中、mは1を表すことを特徴とする、第1観点乃至第6観点に記載の内包ゲル。
第8観点として、前記化合物が疎水性化合物又は親水性化合物、若しくはその両方の化合物であることを特徴とする、第1観点乃至第7観点に記載の内包ゲル。
第9観点として、前記化合物が酵素であることを特徴とする、第1観点乃至第7観点の内包ゲル。
第10観点として、前記化合物がチトクロームcであることを特徴とする、第9観点に記載の内包ゲル。
第11観点として、第9観点に記載の内包ゲルを酵素反応に用いる方法。
第12観点として、第10観点に記載の内包ゲルをH2O2による目的物の酸化反応に用いる方法。
第13観点として、第9観点に記載の内包ゲルを酵素反応に用いることにより、該内包ゲルをバイオセンサーとして使用する方法。
第14観点として、第10観点に記載の内包ゲルをH2O2による酸化反応に用いることにより、該内包ゲルをバイオセンサーとして使用する方法。
第15観点として、第11観点又は第12観点に記載の内包ゲルを備えたバイオセンサー。
また、このゲルシートの溶剤を凍結乾燥させずに蒸発させることで、フィルムを提供することも可能である。
R1及び隣接するカルボニル基で構成される脂質部(アシル基)の具体例としては、
ミリストイル基、ペンタデカノイル基、パルミトイル基、マルガロイル基、オレオイル基、エライドイル基、リノレオイル基、ステアロイル基、バクセノイル基、オクタデシルカルボニル基、アラキドイル基、イコサノイル基等を挙げることができ、好ましくは、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、マルガロイル基、マルガリル基、ステアロイル基、エライドイル基、ベヘノイル基、オレオイル基、及びカルダノイル基である。
該炭素原子1又は2の分枝鎖を有し得る炭素原子数1乃至4のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、i−プロピル基、n−ブチル基、i−ブチル基、第二ブチル基又は第三ブチル基等を挙げることができ、好ましくは、メチル基、i−プロピル基、i−ブチル基、又は第二ブチル基等である。
したがって、上記−(CH2)n−X基は、好ましくはアミノメチル基、2−アミノエチル基、3−アミノプロピル基、4−アミノブチル基、カルバモイルメチル基、2−カルバモイルエチル基、3−カルバモイルプロピル基、2−グアニジノエチル基、3−グアニジノプロピル基、ピロールメチル基、イミダゾールメチル基、ピラゾールメチル基又は3−インドールメチル基等であり、より好ましくは4−アミノブチル基、カルバモイルメチル基、3−カルバモイルプロピル基、イミダゾールメチル基又は3−インドールメチル基である。
なおアミノ酸の略称としては、アラニン(Ala)、アルギニン(Arg)、グルタミン(Gln)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リジン(Lys)、トリプトファン(Trp)、バリン(Val)を表す。:ラウロイル−Gly−Gly−Gly−His、ラウロイル―Gly−Gly−Gly−Gln、ラウロイル−Gly−Gly−Gly−Asn、ラウロイル−Gly−Gly−Gly−Trp、ラウロイル−Gly−Gly−Gly−Lys、ラウロイル−Gly−Gly−Ala−His、ラウロイル−Gly−Gly−Ala−Gln、ラウロイル−Gly−Gly−Ala−Asn、ラウロイル−Gly−Gly−Ala−Trp、ラウロイル−Gly−Gly−Ala−Lys、ラウロイル−Gly−Ala−Gly−His、ラウロイル−Gly−Ala−Gly−Gln、ラウロイル−Gly−Ala−Gly−Asn、ラウロイル−Gly−Ala−Gly−Trp、ラウロイル−Gly−Ala−Gly−Lys、ラウロイル−Ala−Gly―Gly−His、ラウロイル−Ala−Gly−Gly−Gln、ラウロイル−Ala−Gly−Gly−Asn、ラウロイル−Ala−Gly−Gly−Trp、ラウロイル−Ala−Gly−Gly−Lys、ラウロイル−Gly−Gly−His−Gly、ラウロイル−Gly−His−Gly−Gly、ラウロイル−His−Gly−Gly−Gly;ミリストイル−Gly−Gly−Gly−His、ミリストイル−Gly−Gly−Gly−Gln、ミリストイル−Gly−Gly−Gly−Asn、ミリストイル−Gly−Gly−Gly−Trp,ミリストイル−Gly−Gly−Gly−Lys、ミリストイル−Gly−Gly−Ala−His、ミリストイル−Gly−Gly−Ala−Gln、ミリストイル−Gly−Gly−Ala−Asn、ミリストイル−Gly−Gly−Ala−Trp、ミリストイル−Gly−Gly−Ala−Lys、ミリストイル−Gly−Ala−Gly−His、ミリストイル−Gly−Ala−Gly−Gln、ミリストイル−Gly−Ala−Gly−Asn、ミリストイル−Gly−Ala−Gly−Trp、ミリストイル−Gly−Ala−Gly−Lys、ミリストイル−Ala−Gly―Gly−His、ミリストイル−Ala−Gly−Gly−Gln、ミリストイル−Ala−Gly−Gly−Asn、ミリストイル−Ala−Gly−Gly−Trp、ミリストイル−Ala−Gly−Gly−Lys、ミリストイル−Gly−Gly−His−Gly、ミリストイル−Gly−His−Gly−Gly、ミリストイル−His−Gly−Gly−Gly;パルミトイル−Gly−Gly−Gly−His、パルミトイル―Gly−Gly−Gly−Gln、パルミトイル−Gly−Gly−Gly−Asn、パルミトイル−Gly−Gly−Gly−Trp、パルミトイル−Gly−Gly−Gly−Lys、パルミトイル−Gly−Gly−Ala−His、パルミトイル−Gly−Gly−Ala−Gln、パルミトイル−Gly−Gly−Ala−Asn、パルミトイル−Gly−Gly−Ala−Trp、パルミトイル−Gly−Gly−Ala−Lys、パルミトイル−Gly−Ala−Gly−His、パルミトイル−Gly−Ala−Gly−Gln、パルミトイル−Gly−Ala−Gly−Asn、パルミトイル−Gly−Ala−Gly−Trp、パルミトイル−Gly−Ala−Gly−Lys、パルミトイル−Ala−Gly―Gly−His、パルミトイル−Ala−Gly−Gly−Gln、パルミトイル−Ala−Gly−Gly−Asn、パルミトイル−Ala−Gly−Gly−Trp、パルミトイル−Ala−Gly−Gly−Lys、パルミトイル−Gly−Gly−His−Gly、パルミトイル−Gly−His−Gly−Gly、パルミトイル−His−Gly−Gly−Gly;ステアロイル−Gly−Gly−Gly−His、ステアロイル―Gly−Gly−Gly−Gln、ステアロイル−Gly−Gly−Gly−Asn、ステアロイル−Gly−Gly−Gly−Trp、ステアロイル−Gly−Gly−Gly−Lys、ステアロイル−Gly−Gly−Ala−His、ステアロイル−Gly−Gly−Ala−Gln、ステアロイル−Gly−Gly−Ala−Asn、ステアロイル−Gly−Gly−Ala−Trp、ステアロイル−Gly−Gly−Ala−Lys、ステアロイル−Gly−Ala−Gly−His、ステアロイル−Gly−Ala−Gly−Gln、ステアロイル−Gly−Ala−Gly−Asn、ステアロイル−Gly−Ala−Gly−Trp、ステアロイル−Gly−Ala−Gly−Lys、ステアロイル−Ala−Gly―Gly−His、ステアロイル−Ala−Gly−Gly−Gln、ステアロイル−Ala−Gly−Gly−Asn、ステアロイル−Ala−Gly−Gly−Trp、ステアロイル−Ala−Gly−Gly−Lys、ステアロイル−Gly−Gly−His−Gly、ステアロイル−Gly−His−Gly−Gly、ステアロイル−His−Gly−Gly−Gly。
前記溶媒としては、低分子ゲル化剤のファイバー化やヒドロゲル化を防げるものでなければ特に限定されないが、好ましくは、水、アルコール、水とアルコールの混合溶媒、水と水溶性溶媒の混合溶液を用いることができる。より好ましくは、水又は水とアルコールの混合溶媒であり、さらに好ましくは、水である。
前記アルコールは、好ましくは水に自由に溶解する水溶性アルコールであり、より好ましくは炭素原子数1乃至6のアルコールであり、さらに好ましくは、メタノール、エタノール、2−プロパノール又はi−ブタノールであり、さらに特に好ましくはエタノール又は2−プロパノールである。
前記水溶性有機溶媒とは、アルコール以外の有機溶媒であって、かつ水に任意の割合で溶解する有機溶媒を意味する。用いる水溶性有機溶媒の例としては、アセトン又はジオキサン等が挙げられる。
塩は、複数種を加えても良いが、好ましくは1又は2種である。塩を2種類加えることで、溶液が緩衝能をもつことも望ましい。
前記の塩は、無機塩若しくは有機塩である。好ましい無機塩の例としては、炭酸塩、無機硫酸塩若しくは無機リン酸塩が挙げられる。より好ましくは、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はリン酸二水素ナトリウムである。また、好ましい有機塩の例としては、有機アミンの塩酸塩若しくは有機アミン酢酸塩が挙げられる。より好ましくは、エチレンジアミン塩酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩である。
本発明に用いる低分子ゲル化剤である、上記式(1)で表される低分子化合物(脂質ペプチド)は、水溶液又はアルコール溶液系に投入されると、式(1)におけるペプチド部が水素結合により分子間非共有結合を形成し、一方、式(1)における脂質部が疎水的にパッキングするように自己集合化(或いは自己組織化ともいう)し、ファイバーが形成される。ファイバーの形状は限定されないが、筒状又は板状の形状が挙げられる。
参考として図1に脂質ペプチドの自己集合化及びゲル化の概念図の一例を示す(但し、本発明の内包ゲルにおいて、全ての脂質ペプチドが図1に示す自己集合化及びゲル化の形態をとっているとは限らない)。該脂質ペプチド分子(a)は疎水性部位である脂質部を中心として集合し(b)、自己集合化によりファイバー(c)を形成する。
ファイバ−形成には、前記低分子ゲル化剤を1種類用いても良いし2種類以上を組み合わせて用いても良い。好ましくは、1種類又は2種類を用い、さらに好ましくは、1種類を用いる。ただし、2種類用いる場合は、1種類の場合と異なる性質を得ることが期待できる。
そこで、Pal−GGGHゲル中に内包されたチトクロームcは、Pal−GGGHゲルが生体膜と同様のチトクロームcとの相互作用を有することが予測され、Pal−GGGHゲル中に内包されたチトクロームcのペルオキシダーゼ活性の強化及びチトクロームcの安定性強化が期待される。
このため、本発明の内包ゲルは、患部や損傷部位認識能を有する創傷被覆剤、癒着防止膜、薬物速達システム、スキンケア製品、ヘアケア製品、外用医薬品、芳香剤、消臭剤、防虫剤、殺虫剤、農薬用基材、洗浄剤、塗料、防腐剤、環境汚染物質の捕捉用基材などに広く利用することができる。
以下の実施例で用いる略記号の意味は、次のとおりである。
Gly:グリシン
His:ヒスチジン
HBTU:2−(1−H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート(渡辺化学工業(株))
HOBt:1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール((株)ペプチド研究所)
DMF:ジメチルホルムアミド
DCM:ジクロロメタン
DIEA:N,N−ジイソプロピルエチルアミン (東京化成工業(株))
TFA:トリフルオロ酢酸(渡辺化学工業(株))
TIS:トリイソプロピルシラン(渡辺化学工業(株))
Pal−GGGH:パルミトイル−Gly−Gly−Gly−His
cyt c:チトクロームc
脂質ペプチドは、以下に示すFmoc固相ペプチド合成法の手順に従って合成した。樹脂は主にアミノ酸−Barlos Resinを用いた。合成スケールは0.3mmolで行った。
ヒスチジンBarlos Resin(渡辺化学工業(株))390mgをPD−10カラムに添加し、DCM 5mlにて3回、DMF 5mlにて3回、それぞれ洗浄した。次に、上記カラムにFmoc−Gly−OH(渡辺化学工業(株))を270mg、縮合剤溶液1(HBTU 3.05g、HOBt 1.25gをDMF 16mlに溶解したもの)2.1mlを添加し、さらに縮合剤溶液2(DIEA 2.75mlをDMF 14.25mlに溶解したもの)2.1mlを加えた。これを30分間バイブレーターにて攪拌した後、DMF 5mlにて5回、DCM 5mlにて3回、さらにDMF 5mlにて3回、それぞれ洗浄した。
次に、20%ピペリジン/DMF溶液5mlを加えて1分間攪拌した後溶液を捨て、再び20%ピペリジン/DMF溶液5mlを加えて45分間攪拌し、DMF 5mlにて5回洗浄した。
乾燥後、TFA 3.8ml及びTIS 0.1mlをカラムに添加し1時間攪拌した。
回収した混合溶液に水を添加し、固形物を析出させた後、吸引ろ過を行って生成物を回収し、凍結乾燥を行った後、アセトニトリル4mlにて3回洗浄することで、目的化合物を得た。
N−パルミトイル−Gly−Gly−Gly−Hisのトリフルオロ酢酸塩0.5gに、50mlの飽和NaHCO3水を加えて分散させ、遠心分離(3500rpm、10分間、8℃)(トミー社製、SRX−201高速冷却遠心機)した。得られたぺレットにEtOH 40mlを加え、遠心分離(3500rpm、10分間、8℃)し、さらに、ペレットに2% NaCl水を加え、遠心分離(3500rpm、10分間、8℃)した。その後、得られたペレットに50mlの純水を加え、遠心(3500rpm、10分間、8℃)で洗浄した。この洗浄操作を2回繰り返して、ペレットを凍結乾燥((株)池田理化社製、VFD−SP、真空凍結乾燥機)して、450mgの白色固形物を得た。
なお、本発明で用いる低分子ゲル化剤は、不織布や高分子化合物といった基材を用いずに簡便に当該低分子ゲル化剤のみでゲルをシート形状をはじめ様々な形状にすることが可能であるが、実施例1乃至実施例7においては、便宜上、ゲルをシート状にして用いている。
パルミトイル−Gly―Gly−Gly−His 40.8mgをスクリュー管(マルエムNO7)に入れ、0.2%(w/v)(wは質量(g)、vは体積(mL)を意味する。)の濃度になるようにリン酸緩衝液(和光純薬工業(株)製 phosphate buffer powder、1/15mol/L、pH=7.4、組成:Na2HPO4 7.6g、KH2PO4 1.8g/L)を添加し、ドライ・バス・インキュベーター(First Gene社製)で、加熱(100℃、10分)し、得られた溶解液のうち3mlをスチロール非帯電角型ケース(36mm×36mm×14mm)に移し、室温まで冷却した。溶液が固化し、ゲル化を確認後、日本薬局方水3mlを滴下し、室温で、静置させた。1日後、シート状ゲルの切片(1cm×0.5cm)を切取り、スクリュー管(マルエムNO5)に入れ、日本薬局方水、及びリン酸緩衝液(pH=2、pH=7.4、pH=11、pHは、NaOH又はHClを滴下して調製)6mlを加え、3ヶ月間、シート状ゲルの切片が融解・分解するか否か、3ヶ月間達観的に観察した。
パルミトイル−Gly―Gly−Gly−His 81.6mg及び60.1mgに超純水(栗田工業(株)製)、リン酸緩衝液(和光純薬工業(株)製 phosphate buffer powder、1/15mol/L、pH=7.4、組成:Na2HPO4 7.6g、KH2PO4 1.8g/L)を加え、2時間ソニケーション後、90℃で3分間加熱して得られた溶解液のうち3mlをスチロール非帯電角型ケース(36mm×36mm×14mm)に移し、室温静置により0.3%(w/v)濃度のパルミトイル−Gly―Gly−Gly−Hisゲルを作成した。このゲルを1g切り取とって、超純水(栗田工業(株)製)5mlの入ったスクリュー管(マルエムNO7)に入れ24時間室温静置し、シート化した。この水浸漬中のゲルシートに超純水に溶解させたAlbumin from bovine serum Fraction V(Sigma社製、≧98%、BSA)を最終濃度1mg/mlになるように添加した。浸漬液500μlを採取し、外液の浸漬液中のBSA量をHPLCで測定し、ゲルへの吸着タンパク量を算出した。
カラム:Inertsil WP300 C8 5μm、2.1mm i.d.×150mm
溶離液:A;0.1% TFA−MeCN B;0.1% TFA−Water
B;70%(0min)−20%(10min) (分析時間:10min)
流速:0.3ml/min
カラム温度:60℃
検出:UV214nm(BW10nm)
注入量:2μl
ポストコンディショニング:7min
以上の結果から、パルミトイル−Gly―Gly−Gly−Hisゲルシートはアルブミン吸着効果を有する。
パルミトイル−Gly―Gly−Gly−His 128.2mgをスクリュー管(マルエムNO7)に入れ、0.3%(w/v)の濃度になるようにリン酸緩衝液(和光純薬工業(株)製 phosphate buffer powder、1/15mol/L、pH=7.4、組成:Na2HPO47.6g、KH2PO41.8g/L)を加え、ドライ・バス・インキュベーター(First Gene社製)で、加熱(100℃、10分)し、得られた溶解液のうち3mlをガラスシャーレー(直径6cm、高さ4cm)内に置いたアルミ製の円筒(直径2.5cm、高さ4cm)に移し、室温まで冷却した。溶液が固化したのを確認後、アルミ製の円筒を取り除き、日本薬局方水6mlをガラスシャーレ内に加えた。1時間後、リボフラビン(和光純薬工業(株)製)水溶液(2mg/mL)250μLをガラスシャーレ内加えると、14時間後にゲル内が黄色に着色し、リボフラビンがゲル内に内包されてシート化した。
セルロースゲルは、セロディーヌ4M(ナノウオープ、セルロースゲル4wt%、第一工業製薬(株)製)100gに166gの日本局方水を加えて、攪拌装置T.K. mixing analyzer MA2500(プライミクス株式会社)を用いて、5000rpmで240分間攪拌し、ゲル化が認められるまで室温静置して、セルロースゲル(1.5wt%のセルロース水分散体)を得た。
2%カルボキシビニルポリマーは、カーボポール940(アイ・ティー・オー社製)0.252gに日本局方水を加えた後、溶解するまで水浴中で加温してゲル化させた。
5%キサンタンガムは、キサンタンガム(東京化成工業(株)製)0.725gに日本局方水を加えた後、溶解するまで水浴中で加温してゲル化させた。
カルボキシビニルポリマー(2wt%,カーボポール)1g、セルロースゲル(1.5wt%,セロディーヌ)1g、キサンタンガム(1.5wt%)及びカードラン(1.5wt%)1gをプラスティックシャーレ(直径8.5cm×深さ1.4cm)に入れ、水6ml水に浸漬させたところ、72日後にはゲルは消失し、シートの形成は認められなかった。
疎水性環境応答性プローブである8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸(ANS)を用いた。疎水性環境応答性プローブであるANSは、その周辺における極性が減少すると共に蛍光極大波長が短波長側にシフトし、蛍光強度が増大することが知られている。そこで、終濃度5μMとなるように、リン酸緩衝液(pH7.5)にANSを溶解し、各ゲル(0.5又は0.02wt%のPal−GGGH、0.5wt%のアガロース、3wt%のアルギン酸ナトリウム、5wt%のポリアクリルアミド)を調整した。
また、各有機溶媒(エタノール、1−プロパノール、アセトン、ジオキサン)に、5μMとなるようにANSを溶解した。各ゲル及び有機溶媒の蛍光強度を測定した(ex 350nm、em 480nm)。
その結果、Pal−GGGHだけに蛍光強度の増大が見られ、ゲル内に疎水性環境を有していることが明らかとなった(図2)。一方、他の高分子ゲルでは蛍光強度にほとんど変化が見られないことから、ゲルの形成ではなく、Pal−GGGHの自己組織化に伴った疎水性領域の形成が、蛍光強度の増大に影響を与えたものと考えられる。また、Pal−GGGHはゲル形成濃度以下(0.02wt%)でも蛍光を示したことから、ゲル化していない低濃度でも自己組織化して疎水領域を形成していると考えられる。
ゲルシートからの内包物質の放出性の評価を行った。先の実験で使用したANSとビタミンB2(リボフラビン)を親水性内包物質とした。緩衝液はそれぞれpH3:クエン酸緩衝液溶液、pH7.4:リン酸緩衝液、pH9.0:Tris−HCl緩衝液を用いた。100又は300μMになるようにANS又はリボフラビンを緩衝液に溶解し、各溶液1mlに対しゲル化剤(ゲル化剤濃度0.3又は0.6wt%)を加え、ゲルシートを作成した。そこに抽出用緩衝液10mlを加え40rpmで振とうして内包物質を抽出した。サンプルは経時的にサンプリングを行い、各時間の放出濃度を吸光度(ANS:350nm、リボフラビン:445nm)から算出した。
ゲルシートをリボフラビンの溶液に浸漬することで、リボフラビンをゲルシート内に取り込むことが可能であるか実験を行った。リン酸緩衝液1mlに対しゲル化剤(ゲル化剤濃度0.3wt%)を加えてゲルシートを作成した。ゲルシートを各濃度(10μg/ml〜200μg/ml)のリボフラビン溶液5mlに68時間浸漬させ、浸漬液の濃度を吸光度(445nm)から算出することで、ゲルシートへのリボフラビンの内包量を求めた。
ゲル化剤Pal−GGGHによるゲルを用いることで、どの程度疎水性物質を可溶化できるのか、その溶解度の評価を行った。モデル疎水性物質としてピレン及びビタミンE(α−トコフェロール)を用いた。まず疎水性物質をDMSO又はエタノールに溶解し、ストック溶液を調製した。このストック溶液をリン酸緩衝液(pH7.5)で希釈することで、疎水性物質が終濃度100μM〜900μMのサンプル溶液を調製した(DMSO及びエタノール5%又は1%を含む)。各サンプル溶液にゲル化剤(最終濃度0.1wt%〜0.4wt%)を添加し、ゲル化した。
図8に示す疎水性物質可溶化の程度の基準を用いて、ゲル化による疎水性物質の溶解度の評価を目視により行った。ここで、図8に示す疎水性物質可溶化の程度の基準は、(I)は、溶解した状態を示し、(II)は、若干白濁した状態を示し、(III)は、溶解せずに白濁した状態を示す。
前述のストック溶液を、MOPS緩衝液(pH7.5)を用いて希釈し、500μMビタミンE水溶液を調製した(5%エタノールを含む)。これを用いて各ゲル(0.5wt%のPal−GGGH、0.5wt%のアガロース、5%のポリアクリルアミド)を調製し、ビタミンE内包ゲルを作成した。
以上より、Pal−GGGHゲルはビタミンEを可溶化することが示された。
ビタミンC(アスコルビン酸リン酸ナトリウム)を1mg/mlとなるようにMOPS緩衝液(pH7.5)に溶解した。そこへ、0.5wt%のPal−GGGHを添加し、さらに500μMのビタミンEとなるようにストック溶液を加え(5%のエタノールを含む)、溶液をゲル化させ、疎水性物質であるビタミンEと親水性物質であるビタミンCの同時内包ゲルを作成した。
以上より、Pal−GGGHを用いることで、溶解性の異なるビタミンEとビタミンCを、同時に溶解・内包したゲルを作成可能であることが示された。
ビタミンEストック溶液をMOPS緩衝液(pH7.5)を用いて希釈し、500μMビタミンE水溶液を調製した(5%のエタノールを含む)。ここへ、0.3wt%となるようにPal−GGGHを添加し、加熱・放冷してゲルシートを作成した。ゲルシートを5mlのエタノール水溶液(50、70、100%)に浸し、45rpmで振とう攪拌しビタミンEを放出させた。放出液を経時的にサンプリングし、各時間におけるビタミンEの放出濃度を吸光度(292nm)から算出した。
Pal−GGGHゲルシートのタンパク質吸着素材としての利用を検討するため、チトクロームcのゲルシートへの吸着実験を行った。緩衝液はそれぞれリン酸緩衝液:pH7.4、Tris−HCl緩衝液:pH9.0を用いた。各緩衝液1mlに対しゲル化剤(ゲル化剤濃度0.3wt%)を加えてゲルシートを作成した。ゲルシートを0.3mg/mlチトクロームc溶液に浸漬させ経時的に浸漬液の濃度を吸光度(407nm)により算出してゲルシートへのチトクロームcの吸着量を求めた。
次に吸着したチトクロームcが変性していないことを確認するためにチトクロームc吸着ゲルシートに1M DTT 10μlを滴下してチトクロームcの還元を行った。
さらに、チトクロームcが吸着したゲルシートに1M DTTを滴下したところ、酸化型でオレンジ系赤色であったチトクロームcがピンク色系に変化したため、ゲルシートに吸着したチトクロームcが還元型に変化したことが言える(図15)。つまり、シートに吸着しても変性していないことが示唆された。また、チトクロームcは等電点がpI10付近のタンパク質で、今回の条件下ではプラスの電荷を持つため、より多くのマイナスの電荷を持ったpH9.0のゲル(図7)において、吸着量が上昇したことが考えられる。
0.5mg/mlになるようにチトクロームcをリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解し、0.3wt%となるようにPal−GGGHを添加し、加熱・放冷し、チトクロームc内包ゲルシートを作成した。ゲルシートを10mlの各緩衝液(pH5.0のクエン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4のリン酸緩衝液、pH11.0のリン酸/水酸化ナトリウム緩衝液)に浸し、40rpmで振とう攪拌しチトクロームcを放出させた。放出液を経時的にサンプリングし、各時間におけるチトクロームcの放出濃度を吸光度(407nm)から算出した。
Pal−GGGHゲルに内包されたチトクロームcのペルオキシターゼ活性を評価するために、下記に示される、チトクロームcを内包したPal−GGGHゲルを用いたH2O2による2,6−ジメトキシフェノールの酸化反応を行った。
ここで、チトクロームcを内包したPal−GGGHゲルは、ゲル化剤であるPal−GGGH粉末を含む50mMリン酸緩衝液にチトクロームcを加え、該緩衝液を95℃で加熱してゲル化剤を溶解し室温放冷することにより得た。
チトクロームcを10μMの濃度で含むPal−GGGHゲル(ゲル化剤0.2wt%)、チトクロームcを10μMの濃度で含み前記ゲル調製と同様に95℃の加熱処理を行った50mMリン酸緩衝液(pH7)及びチトクロームcを20μMの濃度で含み前記加熱処理を行っていない50mMリン酸緩衝液(pH7)をそれぞれ1mLセルに調製し波長250nm乃至450nmにおけるCDスペクトルを測定した。加熱処理時間は26分であり装置の温度は25℃に設定した。
実施例8と同様の実験を、ゲル化剤濃度を0.1wt%、0.2wt%及び0.3wt%とした場合で行った。
図21から、ゲル化剤濃度の上昇に伴い反応初速度及び生成物量が増加していることが分かった。
そのため、本発明の内包ゲルは、損傷部位認識能を有する創傷被覆剤、癒着防止膜、薬物速達システム、外用医薬品用基材、芳香剤・消臭剤・防虫剤・殺虫剤・農薬などの基材、検査・診断やバイオセンサー、環境分析用の基材、土中や水中の汚染物質の捕捉といった基材などに広く利用することができる。
Claims (3)
- 式(1)
- 式(1)
- 式(1)
該化合物が酵素又はチトクロームcである、
バイオセンサー。
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