JP5727174B2 - Hollow fiber module for cell culture and cell culture method - Google Patents

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Description

本発明は、細胞培養用中空糸モジュールおよび細胞培養方法に関するものである。   The present invention relates to a hollow fiber module for cell culture and a cell culture method.

従来、慢性的臓器機能不全疾患に対する有用な治療方法として、臓器移植や人工臓器埋設が行われている。しかし、臓器移植は、拒絶反応や免疫抑制剤の投与が必要といった医学的問題および深刻なドナー不足といった社会的問題を伴う。また、人工臓器は、生体適合性、機能性、利便性といった生体機能代替性という点で、満足できる治療手段とは言えない。   Conventionally, organ transplantation and artificial organ implantation have been performed as useful treatment methods for chronic organ dysfunction diseases. However, organ transplantation involves medical problems such as rejection and administration of immunosuppressants, and social problems such as a serious shortage of donors. In addition, an artificial organ is not a satisfactory therapeutic means in terms of biological function substitutability such as biocompatibility, functionality, and convenience.

このような問題を解決する方法として、再生医療が注目されている。再生医療は、機能不全に陥った臓器等の生体組織を再生する方法として有用であり、既に、皮膚や骨の分野においては実用化され、世界的にも臨床への応用が開始されている。しかし、臓器に関しては、未だ臨床応用には至っていない。臓器の形成には、大量の生体組織細胞を必要とするが、現在のところ、生体組織細胞の大量培養技術が確立されていないためである。従って、再生医療が、広く臨床に応用可能となるためには、細胞の大量培養技術の開発が必要
となる。
Regenerative medicine has attracted attention as a method for solving such problems. Regenerative medicine is useful as a method for regenerating biological tissues such as organs that have become dysfunctional, and has already been put to practical use in the field of skin and bone, and has been applied to clinical applications worldwide. However, regarding organs, clinical application has not yet been achieved. This is because organ formation requires a large amount of biological tissue cells, but at present, a technique for mass culture of biological tissue cells has not been established. Therefore, in order for regenerative medicine to be widely applicable to clinical practice, it is necessary to develop a mass culture technique for cells.

近年、遺伝子組換えあるいはハイブリドーマの技術開発に伴い、インターフェロン、エリスロポエチン等の種々のヒト由来生理活性タンパクを製造するための大量細胞培養方法が開発されている。かかる細胞培養法は、好気的条件下で増殖する動物細胞を用いるものであり、一般にジャーファーメンター法によって細胞培養を行う技術である。しかし、このような技術は、医薬品原料の生産手段としての細胞培養技術であり、細胞固有の生理特性あるいは機能を発現、維持した細胞を利用する方法ではない。   In recent years, mass cell culture methods for producing various human-derived bioactive proteins such as interferon and erythropoietin have been developed with the technological development of genetic recombination or hybridoma. Such a cell culture method uses animal cells that proliferate under aerobic conditions, and is generally a technique for performing cell culture by the jar fermenter method. However, such a technique is a cell culture technique as a means for producing a pharmaceutical raw material, and is not a method of using cells that express and maintain the physiological characteristics or functions unique to the cells.

一方、細胞固有の機能を発現させるための生体組織細胞培養法としては、三次元培養法が提案されている。かかる技術は、コラーゲン等による細胞付着マトリックスを核として三次元的に細胞を増殖させるものであり、そのためには、細胞が増殖するための空間と、マトリックスを介して付着した細胞が増殖するための担体を提供することが必要である。   On the other hand, a three-dimensional culture method has been proposed as a biological tissue cell culture method for expressing cell-specific functions. Such a technique is to proliferate cells three-dimensionally using a cell adhesion matrix made of collagen or the like as a nucleus. For this purpose, a space for the cells to grow and a cell attached through the matrix to grow It is necessary to provide a carrier.

このような培養方法に、上記ジャーファーメンター法を応用することも考えられる。しかし、ジャーファーメンター法では、撹拌による細胞の物理的損傷が発生するおそれがあることに加え、交差汚染の防止を十分に図ることが困難なため、各個人に応じた個別識別細胞培養が必要とされる再生医療に適した方法とはいえない。   It is also conceivable to apply the jar fermenter method to such a culture method. However, in the jar fermenter method, in addition to the possibility of physical damage of cells due to agitation, it is difficult to adequately prevent cross-contamination, so individual cell culture for each individual is required. It is not a suitable method for regenerative medicine.

そこで、細胞付着担体を有し、培養細胞の物理的損傷および交差汚染を抑制した大量細
胞培養法として、中空糸モジュールを用いた細胞培養技術が提案されている(特許文献1〜3参照)。これらの中空糸モジュールを用いた細胞培養技術の中でも、特許文献3に記載の技術は、特許文献1,2に記載の技術に対して、培養細胞の回収を従来よりも一層効果的に行うことができ、培養細胞の生産性を高めることができる。
Thus, a cell culture technique using a hollow fiber module has been proposed as a large-scale cell culture method having a cell adhesion carrier and suppressing physical damage and cross contamination of cultured cells (see Patent Documents 1 to 3). Among the cell culture techniques using these hollow fiber modules, the technique described in Patent Document 3 is more effective than the techniques described in Patent Documents 1 and 2 for recovering cultured cells than before. And the productivity of cultured cells can be increased.

特開昭49−419579号公報JP 49-419579 A 特開平6−169755号公報JP-A-6-169755 特開2006−345778号公報JP 2006-345778 A

しかしながら、特許文献3に記載の技術を利用して、中空糸モジュール内で細胞を培養した後、この培養細胞を回収するためには、中空糸に付着した細胞を、中空糸から分離する必要がある。中空糸自体は、培養細胞の移植においては不要なものであるためである。このため、分離作業の際に、培養細胞の回収ロスが発生する。これに加えて、培養細胞を回収するためには、培養細胞を中空糸から分離する必要があるため、この分離処理に伴い、培養細胞がダメージを受け、培養細胞の活性度が低下しやすくなる。   However, in order to recover the cultured cells after culturing the cells in the hollow fiber module using the technique described in Patent Document 3, it is necessary to separate the cells attached to the hollow fibers from the hollow fibers. is there. This is because the hollow fiber itself is unnecessary in transplanting cultured cells. For this reason, a recovery loss of the cultured cells occurs during the separation operation. In addition, since it is necessary to separate the cultured cells from the hollow fiber in order to collect the cultured cells, the cultured cells are easily damaged by the separation process, and the activity of the cultured cells is likely to be reduced. .

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、培養細胞の回収ロスを抑制することが可能な細胞培養用中空糸モジュール、および、当該細胞培養用中空糸モジュールを用いた細胞培養方法を提供することを課題とする。   The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a cell culture hollow fiber module capable of suppressing a recovery loss of cultured cells, and a cell culture method using the cell culture hollow fiber module. The issue is to provide.

上記課題は以下の本発明により達成される。すなわち、
本発明の細胞培養用中空糸モジュールは、重量平均分子量が70000〜180000の範囲内である生分解性材料からなり、半透膜機能を有する中空糸を1本以上含み、かつ、中空糸の内部空間に培養液を供給することにより中空糸の外部空間(ECS)に存在する細胞に生育必須成分を供給するための中空糸束と、該中空糸束を格納するハウジングと、を少なくとも有し、かつ、ハウジングの任意の部分が脱着可能であると共に、中空糸束の少なくとも一部が外部に露出可能な構造を有することを特徴とする。
The above-mentioned subject is achieved by the following present invention. That is,
The hollow fiber module for cell culture of the present invention is made of a biodegradable material having a weight average molecular weight in the range of 70,000 to 180,000 , includes at least one hollow fiber having a semipermeable membrane function, and the inside of the hollow fiber. A hollow fiber bundle for supplying a growth essential component to cells existing in the external space (ECS) of the hollow fiber by supplying a culture solution to the space, and a housing for storing the hollow fiber bundle, In addition, an arbitrary part of the housing is detachable, and at least a part of the hollow fiber bundle has a structure that can be exposed to the outside.

本発明の細胞培養中空糸モジュールの一実施態様は、生分解性材料が、(i)ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、脂肪族ポリエステル、ポリアミド、(ii)(i)に示す高分子材料からなる群より選択される少なくとも2種類以上の高分子材料を含む混合材料、および、(iii)(i)に示す高分子材料からなる群より選択される少なくとも2種類以上の高分子材料の重合に用いる各々の単量体を共重合させた共重合体、から選択される材料であることが好ましい。   In one embodiment of the cell culture hollow fiber module of the present invention, the biodegradable material is (i) polylactic acid, polyglycolic acid, polycaprolactone, aliphatic polyester, polyamide, (ii) a polymer material shown in (i) Polymerization of a mixed material containing at least two polymer materials selected from the group consisting of: and (iii) at least two polymer materials selected from the group consisting of polymer materials shown in (i) It is preferably a material selected from a copolymer obtained by copolymerizing each monomer used in the above.

本発明の細胞培養方法は、本発明の細胞培養用中空糸モジュールを用いて、細胞を培養した後に、ハウジングの任意の部分を分離し、中空糸束の少なくとも一部を外部に露出し、中空糸に付着した細胞を、中空糸に付着した状態で回収することを特徴とする。   In the cell culture method of the present invention, after culturing cells using the hollow fiber module for cell culture of the present invention, an arbitrary part of the housing is separated, and at least a part of the hollow fiber bundle is exposed to the outside, The cells attached to the yarn are collected while attached to the hollow fiber.

本発明の細胞培養方法の一実施態様は、細胞が軟骨細胞であることが好ましい。   In one embodiment of the cell culture method of the present invention, the cell is preferably a chondrocyte.

本発明によれば、培養細胞の回収ロスを抑制することが可能な細胞培養用中空糸モジュール、および、当該細胞培養用中空糸モジュールを用いた細胞培養方法を提供することができる。   ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cell culture hollow fiber module which can suppress the collection | recovery loss of a cultured cell, and the cell culture method using the said hollow fiber module for cell culture can be provided.

本実施形態の細胞培養中空糸モジュールの一例を示す概略模式図である。It is a schematic diagram which shows an example of the cell culture hollow fiber module of this embodiment. 実施例1の細胞培養テストに用いた中空糸と同じ重量平均分子量を有する多孔体の生体内における生分解性を示す位相差顕微鏡像である。2 is a phase contrast microscopic image showing biodegradability in a living body of a porous body having the same weight average molecular weight as the hollow fiber used in the cell culture test of Example 1. FIG.

(細胞培養中空糸モジュール)
本実施形態の細胞培養用中空糸モジュール(以下、「モジュール」と略す場合がある。)は、生分解性材料からなり、半透膜機能を有する中空糸を1本以上含み、かつ、中空糸の内部空間(以下、「ルーメン」と称す場合がある。)に培養液を供給することにより中空糸の外部空間(Extracapillary Space、以下、「ECS」と称す場合がる)に存在する細胞に生育必須成分を供給するための中空糸束と、該中空糸束を格納するハウジングと、を少なくとも有し、かつ、ハウジングの任意の部分が脱着可能であると共に、中空糸束の少なくとも一部が外部に露出可能な構造を有することを特徴とする。
(Cell culture hollow fiber module)
The hollow fiber module for cell culture of the present embodiment (hereinafter sometimes abbreviated as “module”) is made of a biodegradable material, includes at least one hollow fiber having a semipermeable membrane function, and the hollow fiber. Grows into cells existing in the external space of the hollow fiber (hereinafter referred to as “ECS”) by supplying a culture solution to the internal space (hereinafter sometimes referred to as “lumen”) It has at least a hollow fiber bundle for supplying essential components and a housing for storing the hollow fiber bundle, and any part of the housing is removable, and at least a part of the hollow fiber bundle is external. It has the structure which can be exposed to.

本実施形態のモジュールを用いた細胞の培養は、モジュール内に細胞を配置した状態で、ルーメン内に培養液を供給することにより行われる。なお、ルーメンとECSとは、互いに隔離されているため、細胞が培養液中に流出することは無い。一方、細胞は、中空糸を介して十分な栄養成分および酸素の供給を受けることができるため、高密度に増殖することが可能である。そして、ECS内で高密度化した培養細胞は、中空糸に付着する。なお、「培養細胞が中空糸に付着」とは、培養細胞が中空糸表面に直接付着、または、細胞付着担体を介して間接的に付着することを意味し、中空糸同士の間隙あるいは中空糸とハウジングとの間隙に存在することも含む。   Cell culture using the module of the present embodiment is performed by supplying a culture solution into the lumen while the cells are arranged in the module. In addition, since the lumen and ECS are isolated from each other, the cells do not flow out into the culture solution. On the other hand, since cells can be supplied with sufficient nutrients and oxygen through the hollow fiber, they can proliferate at high density. And the cultured cell densified in ECS adheres to a hollow fiber. “Cultivated cells adhere to the hollow fiber” means that the cultured cells adhere directly to the surface of the hollow fiber or indirectly through a cell attachment carrier, and the gap between the hollow fibers or the hollow fiber. It also exists in the gap between the housing and the housing.

−中空糸および中空糸束−
本実施形態のモジュールでは、中空糸が生分解性材料からなる。このため、この中空糸を生体内に配置しても、中空糸は生体内で分解され、体内に吸収されるため、生体に対して何らの悪影響を与えるおそれも無い。それゆえ、本実施形態のモジュールを用いて細胞の培養を行った場合、培養細胞が中空糸に付着した状態で回収することができる。この場合、培養細胞を中空糸に付着した状態で、中空糸と共に生体内に移植することができる。それゆえ、本実施形態の細胞培養用中空糸モジュールを用いて細胞を培養した場合、特許文献3に記載の技術と比較して、細胞移植等の各種治療に利用できる培養細胞の利用効率をさらに高めることができ、また、培養細胞の回収に際して培養細胞の活性度が低下するのを抑制できる。
-Hollow fiber and hollow fiber bundle-
In the module of this embodiment, the hollow fiber is made of a biodegradable material. For this reason, even if this hollow fiber is disposed in the living body, the hollow fiber is decomposed in the living body and absorbed in the body, so there is no possibility of any adverse effects on the living body. Therefore, when cells are cultured using the module of this embodiment, the cultured cells can be collected in a state where they are attached to the hollow fiber. In this case, the cultured cells can be transplanted into the living body together with the hollow fiber in a state of being attached to the hollow fiber. Therefore, when cells are cultured using the hollow fiber module for cell culture of the present embodiment, compared to the technique described in Patent Document 3, the utilization efficiency of cultured cells that can be used for various treatments such as cell transplantation is further increased. Moreover, it can suppress that the activity of a cultured cell falls at the time of collection | recovery of a cultured cell.

また、中空糸は、生分解性材料から構成される。この生分解性材料としては公知の生分解性材料が利用できる。しかしながら、細胞との親和性等を考慮した場合、生分解性材料としては、下記(i)〜(iii)に示す材料から選択することが好ましい。
(i)ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、脂肪族ポリエステル、ポリアミド
(ii)(i)に示す高分子材料からなる群より選択される少なくとも2種類以上の高分子材料を含む混合材料
(iii)(i)に示す高分子材料からなる群より選択される少なくとも2種類以上の高分子材料の重合に用いる各々の単量体を共重合させた共重合体
The hollow fiber is made of a biodegradable material. A known biodegradable material can be used as this biodegradable material. However, considering the affinity with cells and the like, the biodegradable material is preferably selected from the materials shown in the following (i) to (iii).
(I) A mixed material containing at least two kinds of polymer materials selected from the group consisting of polylactic acid, polyglycolic acid, polycaprolactone, aliphatic polyester, polyamide (ii) (i) (iii) (iii) ) A copolymer obtained by copolymerizing each monomer used for polymerization of at least two kinds of polymer materials selected from the group consisting of polymer materials shown in (i)

なお、中空糸は、この中空糸を培養細胞と共に生体中に移植した場合において、生体親和性に優れ、材料の分解に伴う生体への負荷も小さいことが必要である。これに加えて、細胞の培養においては、予め中空糸モジュールを滅菌しておくことが必要である。従って、中空糸を構成する生分解性材料は、生体親和性に優れること、材料分解に伴う生体への負荷が低いこと、および、効果的かつ簡易な滅菌処理が可能な高圧蒸気滅菌処理に耐えうる高い耐熱性を有していることが必要である。これらの特性をバランス良く満たすという観点からは、上記に列挙した生分解性材料の中でも、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、あるいは、これら高分子材料の重合に用いる各々の単量体を2種以上重合させた共重合体が特に好ましい。   The hollow fiber is required to have excellent biocompatibility when the hollow fiber is transplanted into the living body together with the cultured cells, and the burden on the living body accompanying the decomposition of the material is small. In addition, in culturing cells, it is necessary to sterilize the hollow fiber module in advance. Therefore, the biodegradable material constituting the hollow fiber is excellent in biocompatibility, has a low burden on the living body due to material decomposition, and withstands high-pressure steam sterilization that enables effective and simple sterilization. It is necessary to have high heat resistance. From the viewpoint of satisfying these properties in a well-balanced manner, among the biodegradable materials listed above, each of the monomers used for polymerization of polylactic acid, polyglycolic acid, polycaprolactone, or these polymer materials is 2 A copolymer obtained by polymerizing more than one species is particularly preferable.

また、生分解性材料の重量平均分子量としては、30000〜500000の範囲内が好ましく、70000〜180000の範囲内がより好ましい。重量平均分子量を30000以上とすることにより、中空糸を紡糸する際に用いる紡糸用原料の粘性が増大し、紡糸が容易となる。また、重量平均分子量を500000以下とすることにより、モジュール内での細胞の培養に必要な期間(通常、最大で6カ月)中においては、生分解性材料の分解の進行に伴う中空糸の著しい強度の低下を防ぎつつ、生体内への移植後においては速やかな分解が可能となるため、移植治療に好適である。さらに、中空糸が、円筒状の膜からなり、この膜の厚み方向に貫通する孔が設けられることで半透膜機能を発揮する場合、紡糸用原料の粘性の著しい増大を防ぐことができるため、孔の形成が容易となる。   Moreover, as a weight average molecular weight of a biodegradable material, the inside of the range of 30000-500000 is preferable, and the inside of the range of 70000-180000 is more preferable. By setting the weight average molecular weight to 30000 or more, the viscosity of the spinning raw material used for spinning the hollow fiber increases, and spinning becomes easy. In addition, by setting the weight average molecular weight to 500,000 or less, during the period required for culturing cells in the module (usually 6 months at the maximum), the hollow fiber significantly increases with the progress of degradation of the biodegradable material. It is suitable for transplantation treatment because rapid degradation is possible after transplantation into a living body while preventing a decrease in strength. Furthermore, when the hollow fiber is made of a cylindrical membrane and a semipermeable membrane function is exhibited by providing a hole penetrating in the thickness direction of the membrane, it is possible to prevent a significant increase in the viscosity of the spinning raw material. The formation of holes is facilitated.

また、中空糸は、その表面が親水化処理されたものであることがより好ましい。親水化処理を行うことによって、細胞に対する親和性が増すと共に、培養液の膜透過性も向上するからである。親水化処理方法として、たとえば、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アルコールなどによる処理が挙げられ、アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール等が挙げられる。これらの親水化処理方法の中でも、ポリビニルピロリドン処理が好ましい。中空糸の表面により安定的な親水性を付与することができるからである。   Moreover, it is more preferable that the hollow fiber has a hydrophilic surface. This is because the hydrophilic treatment increases the affinity for cells and also improves the membrane permeability of the culture solution. Examples of the hydrophilization treatment method include treatment with polyvinylpyrrolidone, ethylene vinyl alcohol copolymer, polyvinyl acetal diethylaminoacetate, alcohol, etc. Examples of alcohol include ethanol, isopropanol, and the like. Among these hydrophilization treatment methods, polyvinylpyrrolidone treatment is preferable. This is because stable hydrophilicity can be imparted to the surface of the hollow fiber.

また、本実施形態の細胞培養用中空糸モジュールに用いられる中空糸束は、1本以上の中空糸を含むものである。なお、中空糸束が2本以上の中空糸から構成される場合、通常、各々の中空糸は互いに平行に配置される。また、中空糸は、直線を成すようにその両端がハウジング内に固定される。たとえば、ハウジングが円筒体である場合、中空糸が、ハウジングの軸方向と平行を成すように、中空糸の両端をハウジング内に固定することができる。   The hollow fiber bundle used in the cell culture hollow fiber module of the present embodiment includes one or more hollow fibers. In addition, when a hollow fiber bundle is comprised from two or more hollow fibers, each hollow fiber is normally arrange | positioned in parallel mutually. Further, both ends of the hollow fiber are fixed in the housing so as to form a straight line. For example, when the housing is a cylindrical body, both ends of the hollow fiber can be fixed in the housing so that the hollow fiber is parallel to the axial direction of the housing.

中空糸束を構成する中空糸は、半透膜機能を有する。ここで、半透膜機能とは、ルーメン側からESC側へ、あるいは、ESC側からルーメン側へと、溶液中に含まれる一部の成分は通すが、他の成分は通さない機能を意味する。半透膜機能を有する中空糸は、たとえば、孔径によって通過可能な成分を変化させることができる多孔質膜や、濃度勾配による通過のみならず様々な膜通過機能を有する生体膜と同様の機能を有する膜や部材等から構成することができ、培養しようとする細胞の種類や培養液等に応じて、中空糸を構成する部材を適宜選択して用いることができる。なお、以下の説明においては、中空糸が、円筒状の膜からなり、この膜の厚み方向に貫通する孔が設けられることで半透膜機能を発揮する場合について説明する。   The hollow fibers constituting the hollow fiber bundle have a semipermeable membrane function. Here, the semipermeable membrane function means a function that allows some components contained in the solution to pass from the lumen side to the ESC side or from the ESC side to the lumen side but not other components. . A hollow fiber having a semipermeable membrane function has the same function as, for example, a porous membrane that can change the component that can be passed depending on the pore diameter, and a biological membrane that has various membrane passage functions as well as passage due to a concentration gradient. A member constituting the hollow fiber can be appropriately selected and used according to the type of cell to be cultured, the culture solution, and the like. In the following description, a case will be described in which the hollow fiber is made of a cylindrical membrane and a semipermeable membrane function is exhibited by providing a hole penetrating in the thickness direction of the membrane.

ここで、中孔糸を構成する膜に設けられる孔の孔径(以下、「膜孔径」と称す場合がある。)は、培養液をルーメン側からESC側に通過させることができ、培養しようとする細胞がESC側からルーメン側へと通過できないものであれば特に限定されるものではない。なお、膜孔径が小さくなれば膜強度は強くなるが、物質交換率は小さくなり、一方、膜孔径が大きくなれば膜強度は弱くなるが、物質交換率は大きくなる。したがって、膜強度、すなわち中空糸の強度と、大きな物質交換率とを、バランス良く両立させるためには、中空糸の平均膜孔径は、0.01μm〜0.8μmの範囲内が好ましく、0.1μm〜0.4μmの範囲内がより好ましい。   Here, the pore diameter (hereinafter sometimes referred to as “membrane pore diameter”) provided in the membrane constituting the mesoporous yarn is such that the culture solution can be passed from the lumen side to the ESC side. There is no particular limitation as long as the cells to be passed cannot pass from the ESC side to the lumen side. It should be noted that as the membrane pore size decreases, the membrane strength increases, but the material exchange rate decreases. On the other hand, as the membrane pore size increases, the membrane strength decreases but the material exchange rate increases. Therefore, in order to achieve a balance between membrane strength, that is, the strength of the hollow fiber and a large mass exchange rate, the average membrane pore diameter of the hollow fiber is preferably in the range of 0.01 μm to 0.8 μm. More preferably within the range of 1 μm to 0.4 μm.

中空糸の内径としては、培養液を供給することができる太さであれば、特に限定されないが、高い膜透過性を確保する観点から、0.1mm〜3mmの範囲内が好ましい。また、加工が容易であることや、培養液中に生じた不溶成分による目詰まりを抑制する観点も考慮した場合、内径は、0.5mm〜1.5mmの範囲内がより好ましい。なお、内径は、0.5mm〜1.5mmの範囲内とする場合、外径は、0.2mm〜3.0mmの範囲内とすることが好ましい。   The inner diameter of the hollow fiber is not particularly limited as long as it is thick enough to supply the culture solution, but is preferably in the range of 0.1 mm to 3 mm from the viewpoint of ensuring high membrane permeability. In view of ease of processing and suppression of clogging due to insoluble components generated in the culture solution, the inner diameter is more preferably in the range of 0.5 mm to 1.5 mm. When the inner diameter is in the range of 0.5 mm to 1.5 mm, the outer diameter is preferably in the range of 0.2 mm to 3.0 mm.

また、中空糸束を構成する中空糸の本数や、膜厚は、細胞の培養が可能であれば特に限定されないが、後述する様に、必要とする細胞数、培養細胞が必要とする栄養量および酸素量、モジュール内のECSの体積のいずれか1つまたは複数との関係等で適宜調整することが好ましい。   In addition, the number of hollow fibers constituting the hollow fiber bundle and the film thickness are not particularly limited as long as cells can be cultured. However, as will be described later, the number of cells required and the amount of nutrients required by the cultured cells. It is preferable to appropriately adjust the amount of oxygen, the amount of oxygen, the volume of ECS in the module, or the relationship with one or more.

中空糸束が2本以上の中空糸から構成される場合、中空糸束の両端部分は、一般に使用される封止材を用いて中空糸間の間隙を封鎖すると共に、たとえば、糊付け等することでハウジングの内壁に固定することができる。封止材としては、たとえば、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂などの公知の樹脂を利用できる。   When the hollow fiber bundle is composed of two or more hollow fibers, both end portions of the hollow fiber bundle should be sealed with a generally used sealing material and, for example, glued Can be fixed to the inner wall of the housing. As the sealing material, for example, a known resin such as urethane resin or epoxy resin can be used.

−培養液−
また、中空糸は、ルーメンに培養液を供給することによりECSに存在する細胞に生育必須成分を供給すると共に、細胞の代謝成分を拡散除去する。ここで、培養液は、培養しようとする細胞の生育必須成分を含有するものであれば、従来公知のいかなる培養液も用いることができ、特に限定されない。ここで、「生育必須成分」とは、培養しようとする細胞が増殖する上で必要不可欠な成分を意味し、通常は、種々の有機物および無機物から構成され、細胞に酸素等を供給するための溶存ガスも含まれる。生育必須成分としては、たとえば、ダルベッコMEM、RPMI1640、ハムF12等の汎用培地に、血清あるいは各種増殖因子、分化誘導因子を添加して作成した培地等が用いられる。
-Culture solution-
Further, the hollow fiber supplies a growth essential component to cells existing in ECS by supplying a culture solution to the lumen, and diffuses and removes metabolic components of the cells. Here, as long as the culture solution contains an essential component for growth of cells to be cultured, any conventionally known culture solution can be used and is not particularly limited. Here, the “growth essential component” means a component indispensable for the cell to be cultured to proliferate, and is usually composed of various organic and inorganic substances for supplying oxygen and the like to the cell. Dissolved gas is also included. As the essential growth component, for example, a medium prepared by adding serum or various growth factors and differentiation-inducing factors to a general-purpose medium such as Dulbecco MEM, RPMI 1640, and Ham F12 is used.

なお、ルーメン内への培養液の供給は、通常、容器に収納された培養液を、ポンプにてルーメン内を繰り返し循環させることにより実施されるが、ルーメン内に供給された培養液を循環させない一過性の供給であってもよい。   The supply of the culture solution into the lumen is usually performed by repeatedly circulating the culture solution stored in the container through the lumen with a pump, but the culture solution supplied into the lumen is not circulated. It may be a temporary supply.

−ハウジング−
ハウジングは、中空糸束を格納する。また、モジュールが組み立てられた状態において、ハウジングは、その内部に配置された中空糸の外周表面とハウジングの内壁との間に密閉空間、すなわちECSを形成する。このため、このECS内で細胞培養を行うことができる。また、ハウジングには、通常、ハウジング内に固定された中空糸のルーメンに培養液を供給およびルーメン内に供給された培養液を再び外部に排出するためのチューブ接続用導管(ルーメン用導管)、および、ECS内に細胞を投入すると共に、ECS内への細胞の投入に伴い投入した細胞の体積に相当するECS内のその他の成分を外部に排出するためのチューブ接続用導管(ECS用導管)が設けられる。そして、ECS用導管から細胞をECS内に投入した後、ルーメン用導管を利用してルーメン内に培養液を供給することにより、細胞の培養を行うことができる。ここで、ECSおよびルーメンは、お互いに隔離されているため、培養液と細胞とは直接接触せず、半透膜機能を有する中空糸の孔を通過した培養液中の所定の成分のみが細胞と接触する。なお、ルーメン用導管は、通常、ハウジングに2つ設けられ、ECS用導管も、通常、ハウジングに2つ設けられる。
-Housing-
The housing stores the hollow fiber bundle. Further, in a state where the module is assembled, the housing forms a sealed space, that is, an ECS, between the outer peripheral surface of the hollow fiber disposed therein and the inner wall of the housing. For this reason, cell culture can be performed in this ECS. Also, the housing is usually a tube connection conduit (lumen conduit) for supplying the culture solution to the lumen of the hollow fiber fixed in the housing and discharging the culture solution supplied in the lumen to the outside again, In addition, a tube connection conduit (ECS conduit) for discharging cells into the ECS and discharging other components in the ECS corresponding to the volume of the cells input with the cells into the ECS. Is provided. Then, after the cells are introduced into the ECS from the ECS conduit, the cells can be cultured by supplying a culture solution into the lumen using the lumen conduit. Here, since the ECS and the lumen are isolated from each other, the culture solution and the cells are not in direct contact with each other, and only predetermined components in the culture solution that have passed through the hollow fiber hole having a semipermeable membrane function are cells. Contact with. Two lumen conduits are usually provided in the housing, and two ECS conduits are usually provided in the housing.

ハウジングを構成する材質は、特に限定されるものではないが、たとえば、ポリカーボネート樹脂、ポリスルホン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、アクリル樹脂などの樹脂材料を利用することができる。これらの樹脂材料の中でも、ポリカーボネート樹脂およびポリスルホン樹脂が好ましい。ポリカーボネート樹脂およびポリスルホン樹脂は、耐熱性に優れるため、ハウジングの高圧蒸気滅菌が可能となり、効率的な滅菌処理を行うことができる。また、ポリカーボネート樹脂およびポリスルホン樹脂は、透明性が高いため、肉眼により細胞の培養状態を容易に確認することができる。   Although the material which comprises a housing is not specifically limited, For example, resin materials, such as a polycarbonate resin, a polysulfone resin, a polypropylene resin, a polystyrene resin, a polyethylene resin, an acrylic resin, can be utilized. Among these resin materials, polycarbonate resin and polysulfone resin are preferable. Since the polycarbonate resin and the polysulfone resin are excellent in heat resistance, the high-pressure steam sterilization of the housing becomes possible, and an efficient sterilization process can be performed. In addition, since the polycarbonate resin and the polysulfone resin are highly transparent, the cultured state of the cells can be easily confirmed with the naked eye.

また、本実施形態のモジュールでは、ハウジングの任意の部分が脱着可能である。ここで、「ハウジングの任意の部分が脱着可能」とは、ハウジングの任意の部分(脱着可能部分)がハウジングのその他の部分(本体部分)から分離可能であり、かつ、脱着可能部分は、本体部分に装着可能であることを意味する。また、「脱着可能」とは、脱着可能部分を、本体部分と接触させたまま開閉することが可能な態様、または、脱着可能部分を本体部分から完全に離間するように分離できると共に、分離した脱着可能部分を再び本体部分に取り付け可能な態様を意味する。   Moreover, in the module of this embodiment, the arbitrary parts of a housing are removable. Here, “any part of the housing is removable” means that any part of the housing (removable part) can be separated from the other part (main body part) of the housing, and the removable part is the main body It means that it can be attached to the part. “Removable” means that the removable part can be opened and closed while being in contact with the main body part, or the removable part can be separated so as to be completely separated from the main body part. The aspect which can attach a detachable part to a main-body part again is meant.

さらに、本実施形態のモジュールでは、中空糸束の少なくとも一部が外部に露出可能な構造を有する。ここで、「中空糸の少なくとも一部が外部に露出可能」とは、モジュール内に密閉され外部環境から遮断された状態にある中空糸束の少なくとも一部が、ハウジングの脱着可能部分を本体部分から分離することによって、外部環境に露出できることを意味する。ここで、ハウジングの脱着可能部分を本体部分から分離した場合における、中空糸束の外部環境に対する露出の度合は、特に限定されないが、露出の度合は大きければ大きい程好ましく、中空糸束全体が外部環境に露出可能であることが特に好ましい。この場合、中空糸に付着した状態で培養した細胞を回収することがより容易になるためである。   Furthermore, the module of this embodiment has a structure in which at least a part of the hollow fiber bundle can be exposed to the outside. Here, “at least a part of the hollow fiber can be exposed to the outside” means that at least a part of the hollow fiber bundle that is sealed in the module and shielded from the external environment has the removable part of the housing as the main body part. It means that it can be exposed to the external environment. Here, when the detachable part of the housing is separated from the main body part, the degree of exposure of the hollow fiber bundle to the external environment is not particularly limited, but the larger the degree of exposure, the better. It is particularly preferred that it be exposed to the environment. In this case, it is because it becomes easier to collect | recover the cell cultured in the state attached to the hollow fiber.

ハウジングの形状・サイズとしては、特に限定されず、必要に応じて適宜設定することができる。しかしながら、モジュール内のデッドスペースの減少や、細胞の培養のし易さ等の実用上の観点からは、ハウジングは筒状部材を有することが好ましく、この筒状部材は円筒状部材であることがより好ましい。ハウジングが筒状部材を有する場合、中空糸束は、たとえば、中空糸の軸方向とハウジングの軸方向とが一致するように筒状部材内に配置される。そして、中空糸束は、中空糸束の両端部分が封止材を介して筒状部材の内壁に固定される。また、筒状部材両端の開口部は、キャップを用いて密閉される。すなわち、この場合、ハウジングは、その主要部が、筒状部材とキャップとから構成される。   The shape and size of the housing is not particularly limited, and can be set as necessary. However, from a practical point of view such as reduction of dead space in the module and ease of cell culture, the housing preferably has a cylindrical member, and the cylindrical member is preferably a cylindrical member. More preferred. When the housing has a cylindrical member, the hollow fiber bundle is disposed in the cylindrical member so that the axial direction of the hollow fiber and the axial direction of the housing coincide, for example. And as for a hollow fiber bundle, the both ends of a hollow fiber bundle are fixed to the inner wall of a cylindrical member via a sealing material. Moreover, the opening part of a cylindrical member both ends is sealed using a cap. That is, in this case, the main part of the housing is composed of a cylindrical member and a cap.

次に、ハウジングの主要部が、筒状部材とキャップとから構成される場合について、より詳細に説明する。この場合、細胞培養後に、筒状部材の両端を封止する2つのキャップのうち、少なくとも一方のキャップを筒状部材から取り外すことにより、培養細胞が付着した中空糸束をハウジングから取り出すことが可能となり、中空糸束を完全に外部環境へ露出させることができる。その結果、中空糸束に付着した状態で培養細胞を回収することができる。ここで、キャップは、筒状部材の両端部に脱着可能なものであれば公知のいかなるキャップも用いることができ、特に限定されないが、たとえば、はめ込み式キャップを用いることができる。また、筒状部材が、円筒状部材である場合には、スクリュー式キャップを用いることができる。なお、ハウジングを構成する筒状部材およびキャップを構成する材料としては、上述した樹脂材料などが利用できる。筒状部材およびキャップを構成する各々の材料は、同じ材料を用いてもよく、異なる材料を用いてもよい。   Next, the case where the main part of the housing is composed of a cylindrical member and a cap will be described in more detail. In this case, after cell culture, the hollow fiber bundle with the cultured cells attached can be removed from the housing by removing at least one of the two caps sealing both ends of the cylindrical member from the cylindrical member. Thus, the hollow fiber bundle can be completely exposed to the external environment. As a result, the cultured cells can be collected while attached to the hollow fiber bundle. Here, as the cap, any known cap can be used as long as it can be attached to and removed from both ends of the cylindrical member. Although not particularly limited, for example, a fitting cap can be used. Moreover, when a cylindrical member is a cylindrical member, a screw type cap can be used. In addition, as a material which comprises the cylindrical member and cap which comprise a housing, the resin material etc. which were mentioned above can be utilized. The same material may be used for each material which comprises a cylindrical member and a cap, and a different material may be used for it.

−モジュールの具体例−
次に、本実施形態の細胞培養中空糸モジュールの具体例について、図面を用いて説明する。図1は、本実施形態の細胞培養中空糸モジュールの一例を示す概略模式図である。ここで、図1中の水平方向に伸びる中心軸Cの上側がモジュールの内部構造を示す断面図であり、中心線の下側がモジュールの外観を示す側面図である。
-Specific examples of modules-
Next, a specific example of the cell culture hollow fiber module of the present embodiment will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the cell culture hollow fiber module of the present embodiment. Here, the upper side of the central axis C extending in the horizontal direction in FIG. 1 is a cross-sectional view showing the internal structure of the module, and the lower side of the center line is a side view showing the appearance of the module.

図1に示すモジュール10は、その主要部が、ハウジング20と、このハウジング20内に配置された中空糸束30と、から構成される。ここで、ハウジング20は、図面の中央部に配置される円筒状部材22と、円筒状部材22の両端開口部を封止するキャップ24A、24Bと、を有している。また、円筒状部材22の外周面側には、キャップ24Aが配置された側に第一のECS用導管26Aが設けられ、キャップ24Bが配置された側に第二のECS用導管26Bが設けられている。また、キャップ24Aの軸方向の外面側には、第一のルーメン用導管28Aが設けられ、キャップ24Bの軸方向の外面側には、第二のルーメン用導管28Bが設けられている。   The main part of the module 10 shown in FIG. 1 includes a housing 20 and a hollow fiber bundle 30 arranged in the housing 20. Here, the housing 20 includes a cylindrical member 22 disposed in the center of the drawing, and caps 24A and 24B that seal both end openings of the cylindrical member 22. On the outer peripheral surface side of the cylindrical member 22, a first ECS conduit 26A is provided on the side where the cap 24A is disposed, and a second ECS conduit 26B is provided on the side where the cap 24B is disposed. ing. A first lumen conduit 28A is provided on the outer surface side of the cap 24A in the axial direction, and a second lumen conduit 28B is provided on the outer surface side of the cap 24B in the axial direction.

中空糸束30は、複数本の互いに平行に配置された中空糸から構成され、その長手方向が、円筒状部材22の軸方向Cと平行となるようにハウジング20内に配置されている。また、中空糸束30の両端部分には、この中空糸束30を構成する個々の中空糸間の間隙を満たすと共に中空糸束30の外周部分を覆うように封止材が充填されており、この封止材からなる円柱状の封止材ブロック40A、40Bが形成されている。そして、封止材ブロック40A、40Bの外周面を保持すると共に、封止材ブロック40A、40Bと円筒状部材22の内周面との間の隙間を塞ぐように、円筒状のスリーブ50A、50Bが配置されている。このため、中空糸束30は、その両端部分が、スリーブ50A、50Bを介して、ハウジング20を構成する円筒状部材22の内周側に固定して配置されることになる。また、中空糸束30内には、その中心軸を貫通するように円柱状の芯棒60が設けられている。なお、中空糸束30に設けられるスリーブ50A,50Bおよび芯棒60は、中空糸束30の保持および取り扱いを容易にするために設けられるものである。このため、スリーブ50Aの内周面と封止材ブロック40Aの外周面との間、および、スリーブ50Bの内周面と封止材ブロック40Bの外周面との間は、糊などの接着剤を介して接着される。   The hollow fiber bundle 30 is composed of a plurality of hollow fibers arranged in parallel to each other, and is arranged in the housing 20 so that the longitudinal direction thereof is parallel to the axial direction C of the cylindrical member 22. Further, both end portions of the hollow fiber bundle 30 are filled with a sealing material so as to fill the gaps between the individual hollow fibers constituting the hollow fiber bundle 30 and cover the outer peripheral portion of the hollow fiber bundle 30, Cylindrical sealing material blocks 40A and 40B made of this sealing material are formed. And while holding the outer peripheral surface of sealing material block 40A, 40B, cylindrical sleeve 50A, 50B so that the clearance gap between sealing material block 40A, 40B and the internal peripheral surface of the cylindrical member 22 may be plugged up. Is arranged. For this reason, both ends of the hollow fiber bundle 30 are fixed to the inner peripheral side of the cylindrical member 22 constituting the housing 20 via the sleeves 50A and 50B. Further, a cylindrical core rod 60 is provided in the hollow fiber bundle 30 so as to penetrate the central axis. The sleeves 50 </ b> A and 50 </ b> B and the core rod 60 provided in the hollow fiber bundle 30 are provided to facilitate the holding and handling of the hollow fiber bundle 30. Therefore, an adhesive such as glue is provided between the inner peripheral surface of the sleeve 50A and the outer peripheral surface of the sealing material block 40A and between the inner peripheral surface of the sleeve 50B and the outer peripheral surface of the sealing material block 40B. Glued through.

さらに、円筒状スリーブ50Aのキャップ24Aが配置された側の外周面と円筒状部材22の内周面との間、円筒状スリーブ50Bのキャップ24Bが配置された側の外周面と円筒状部材22の内周面との間、円筒状部材22の端面とキャップ24Aの内面との間、および、円筒状部材22の端面とキャップ24Bの内面との間には、気密性を確保するために、Oリング70が配置される。   Furthermore, between the outer peripheral surface of the cylindrical sleeve 50A on the side where the cap 24A is disposed and the inner peripheral surface of the cylindrical member 22, the outer peripheral surface on the side where the cap 24B of the cylindrical sleeve 50B is disposed and the cylindrical member 22 are disposed. In order to ensure airtightness between the inner peripheral surface of the cylindrical member 22, the end surface of the cylindrical member 22 and the inner surface of the cap 24A, and between the end surface of the cylindrical member 22 and the inner surface of the cap 24B, An O-ring 70 is disposed.

なお、中空糸束30の長さは、円筒状部材22の長さと略同程度に設定される。また、中空糸束30の両端を保持するスリーブ50A、50Bの直径は、円筒状部材22に対する中空糸束30の出し入れを容易とするために、円筒状部材22の内径よりも若干小さめに設定されることが好ましい。ここで、円筒状部材22の外周面側に設けられるECS用導管26A、26Bの各孔の軸方向Cに対する配置位置は、円筒状部材22の端部側からスリーブ50A、50Bの長さを加えた領域と重複しない位置に設定される。すなわち、ECS導管26A、26Bの各孔の位置は、スリーブ50A,50Bと重複しない位置とされる。   The length of the hollow fiber bundle 30 is set to be approximately the same as the length of the cylindrical member 22. Further, the diameters of the sleeves 50 </ b> A and 50 </ b> B that hold both ends of the hollow fiber bundle 30 are set slightly smaller than the inner diameter of the cylindrical member 22 in order to facilitate the insertion and removal of the hollow fiber bundle 30 with respect to the cylindrical member 22. It is preferable. Here, the positions of the respective holes of the ECS conduits 26A and 26B provided on the outer peripheral surface side of the cylindrical member 22 in the axial direction C are obtained by adding the lengths of the sleeves 50A and 50B from the end side of the cylindrical member 22. It is set at a position that does not overlap with the selected area. That is, the positions of the holes of the ECS conduits 26A and 26B are not overlapped with the sleeves 50A and 50B.

芯棒60およびスリーブ50A,50Bを構成する材料としては、ハウジングを構成する材料と同様のもの、または、ステンレス等の金属など、適度な剛性を有するものが利用できる。なお、図1に示す例では、芯棒60は、中空糸束30の中心軸上に1本配置されているが、中空糸束30中に複数本設けられていてもよい。また、芯棒60は、角柱状であってもよく、省略することもできる。   As a material constituting the core rod 60 and the sleeves 50A and 50B, the same material as that constituting the housing, or a material having an appropriate rigidity such as a metal such as stainless steel can be used. In the example shown in FIG. 1, one core rod 60 is disposed on the central axis of the hollow fiber bundle 30, but a plurality of core bars 60 may be provided in the hollow fiber bundle 30. The core rod 60 may have a prismatic shape or may be omitted.

図1に示すモジュール10を用いて細胞培養を行う場合、まず、モジュール10の組み立てを行う。この場合、中心軸を貫通するように芯棒60が設けられた中空糸束30と、この中空糸束30の端部に位置する封止材ブロック40A、40Bを各々覆うスリーブ50A、50Bと、から構成される中空糸束ユニットを、円筒状部材22の内側に挿入する。その後、円筒状部材22の両端を、キャップ24A、24Bにより封止する。なお、この組立作業に際しては、Oリング70を、上述した位置に配置する。この場合、中空糸束ユニットと、円筒状部材22の内周面との間に形成される空間がECSとなる。   When cell culture is performed using the module 10 illustrated in FIG. 1, first, the module 10 is assembled. In this case, the hollow fiber bundle 30 provided with the core rod 60 so as to penetrate the central axis, and the sleeves 50A and 50B respectively covering the sealing material blocks 40A and 40B located at the ends of the hollow fiber bundle 30, A hollow fiber bundle unit composed of is inserted into the inside of the cylindrical member 22. Thereafter, both ends of the cylindrical member 22 are sealed with caps 24A and 24B. In this assembling operation, the O-ring 70 is disposed at the position described above. In this case, the space formed between the hollow fiber bundle unit and the inner peripheral surface of the cylindrical member 22 is ECS.

続いて、第一のECS用導管26Aもしくは第二のECS用導管26BまたはこれらECS用導管26A、26Bの双方からECS内へと、培養対象となる細胞を投入する。次に、たとえば、第一のルーメン用導管28A側から、ハウジング20内へと培養液を供給する。この培養液は、まず最初に、キャップ24Aと、中空糸束30のキャップ24Aが配置された側の端面との間に形成される空間に流れ込む。そして、培養液は、中空糸束30の端面に露出する個々の中空糸の開口部から、中空糸の内部空間(ルーメン)を流れる。さらに、ルーメン中を流れる培養液は、中空糸束30のキャップ24B側の端面に露出する個々の中空糸の開口部から、キャップ24Bと、中空糸束30のキャップ24Bが配置された側の端面との間に形成される空間に排出され、さらにこの空間から、第二のルーメン用導管28Bを経て、モジュール10外へと排出される。   Subsequently, cells to be cultured are introduced into the ECS from the first ECS conduit 26A, the second ECS conduit 26B, or both of the ECS conduits 26A and 26B. Next, for example, the culture solution is supplied into the housing 20 from the first lumen conduit 28A side. First, the culture fluid flows into a space formed between the cap 24A and the end surface of the hollow fiber bundle 30 on the side where the cap 24A is disposed. Then, the culture fluid flows through the internal space (lumen) of the hollow fiber from the opening of each hollow fiber exposed at the end face of the hollow fiber bundle 30. Furthermore, the culture fluid flowing in the lumen passes from the opening of each hollow fiber exposed at the end surface on the cap 24B side of the hollow fiber bundle 30 to the end surface on the side where the cap 24B and the cap 24B of the hollow fiber bundle 30 are disposed. And is discharged from the space to the outside of the module 10 through the second lumen conduit 28B.

ここで、ルーメン内を流れる培養液中に含まれる生育必須成分は、中空糸の外周面に設けられた孔を介して、ECSに存在する細胞に供給される。このため、細胞の培養が促進される。そして、細胞の培養が完了した後は、円筒状部材22からキャップ24Aおよび/またはキャップ24Bを取り外した後、円筒状部材22内から中空糸ユニットを取り出す。このため、個々の中空糸に培養細胞が付着した状態の中空糸束30を回収することができる。なお、生体内への移植に際しては、中空糸ユニットから、芯棒30を引き抜くと共に、封止材ブロック40A、40Bを、スリーブ50A、50Bと共に切断する等により除去することで、生分解性材料から構成される中空糸のみからなる中空糸束30と、培養細胞とのみからなる部分を利用できる。   Here, the essential growth component contained in the culture fluid flowing in the lumen is supplied to the cells present in the ECS through the holes provided in the outer peripheral surface of the hollow fiber. For this reason, cell culture is promoted. After the cell culture is completed, the cap 24A and / or the cap 24B is removed from the cylindrical member 22, and then the hollow fiber unit is taken out from the cylindrical member 22. For this reason, the hollow fiber bundle 30 in a state where the cultured cells are attached to the individual hollow fibers can be collected. In addition, when transplanting into a living body, the core rod 30 is pulled out from the hollow fiber unit, and the sealing material blocks 40A and 40B are removed by cutting together with the sleeves 50A and 50B. A hollow fiber bundle 30 composed only of the hollow fibers and a portion composed only of cultured cells can be used.

なお、中空糸束30の体積Wに対する、ECSの体積Xの比率(X/W)は、培養しようとする細胞の種類、ECS内で培養された細胞の密度等必要に応じて適宜設定することができるが、1〜20の範囲内が好ましく、2〜6の範囲内がより好ましい。この体積比率を1以上とすることにより、モジュール10内に投入する細胞量を多くすることができ、細胞が増殖する空間も十分に確保することができる。また、上記の体積比率を20以下とすることにより、モジュール10内の細胞への生育必須成分の供給不足を回避することが可能となる。このため、中空糸束30に含まれる中空糸の本数・サイズ等は、上述した体積比率が実現できるように設定することが好ましい。なお、「中空糸束30の体積」とは、中空糸束30を構成する各中空糸のうち、モジュール10内でECSと接触する部分の体積を意味し、中空糸の断面外周によって形成される中空部分を含む断面積と中空糸長さの積の総和で表すことができる。   The ratio of the volume X of ECS to the volume W of the hollow fiber bundle 30 (X / W) should be appropriately set as required, such as the type of cells to be cultured and the density of cells cultured in the ECS. However, it is preferably in the range of 1-20, more preferably in the range of 2-6. By setting the volume ratio to 1 or more, the amount of cells put into the module 10 can be increased, and a sufficient space for cell proliferation can be ensured. In addition, by setting the volume ratio to 20 or less, it becomes possible to avoid insufficient supply of essential growth components to the cells in the module 10. For this reason, it is preferable to set the number and size of the hollow fibers included in the hollow fiber bundle 30 so that the above-described volume ratio can be realized. The “volume of the hollow fiber bundle 30” means the volume of the portion of the hollow fiber constituting the hollow fiber bundle 30 that contacts the ECS in the module 10, and is formed by the outer periphery of the cross section of the hollow fiber. It can be represented by the sum of the product of the cross-sectional area including the hollow portion and the hollow fiber length.

(細胞培養方法)
以上に説明したように、本実施形態のモジュール10を用いて細胞の培養を行った場合、中空糸に付着した細胞を、中空糸に付着した状態で回収することができる。ここで、「細胞が、中空糸に付着する」とは、培養された細胞が中空糸表面に直接付着、または、細胞付着担体を介して間接的に付着すること意味する。この場合、中空糸の外周面から脱落しないように細胞が保持されているのであれば、中空糸同士の間隙あるいは中空糸とハウジングとの間隙に存在する細胞も、中空糸に付着するものに該当する。
(Cell culture method)
As described above, when the cells are cultured using the module 10 of the present embodiment, the cells attached to the hollow fiber can be collected while attached to the hollow fiber. Here, “the cell adheres to the hollow fiber” means that the cultured cell adheres directly to the surface of the hollow fiber or indirectly via a cell attachment carrier. In this case, if the cells are held so as not to fall off from the outer peripheral surface of the hollow fiber, the cells existing in the gap between the hollow fibers or the gap between the hollow fiber and the housing also correspond to those attached to the hollow fiber. To do.

本実施形態のモジュール10を用いた細胞培養方法では、生体組織を構成する細胞であれば、如何なる細胞を培養してもよいが、培養対象となる細胞としては、医療上のニーズが最も大きい軟骨細胞であることが特に好ましい。   In the cell culture method using the module 10 of the present embodiment, any cell may be cultured as long as it constitutes a living tissue, but the cartilage that has the greatest medical needs as the cell to be cultured. Particularly preferred are cells.

本実施形態のモジュール10を用いた細胞培養方法において、生物学上、利用可能な細胞培養法としては、公知な細胞培養法が利用できるが、生体組織細胞を立体的に培養し、再生医療に適用する観点から、三次元培養法が好ましい。   In the cell culture method using the module 10 of the present embodiment, as a cell culture method that can be used biologically, a known cell culture method can be used. From the viewpoint of application, a three-dimensional culture method is preferable.

三次元培養法としては、マイクロキャリア法、ゲル包埋法などが挙げられる。マイクロキャリア法は、ガラス、ゼラチン、セルロースなどでできたビーズに細胞を付着させて培養する方法である。また、ゲル包埋培養法は、コラーゲンあるいはアガロース中で細胞を三次元的に培養する方法である。   Examples of the three-dimensional culture method include a microcarrier method and a gel embedding method. The microcarrier method is a method of culturing by attaching cells to beads made of glass, gelatin, cellulose or the like. The gel embedding culture method is a method of culturing cells three-dimensionally in collagen or agarose.

これらの細胞培養法では、細胞とともにマイクロキャリアあるいはゲルを、ECS用導管26A(またはECS用導管26B)から投入し、上述した培養液をルーメンに供給することによって細胞を培養することができる。また、培養液の供給速度、培地交換の有無、酸素添加方法といった培養条件は、細胞の種類、細胞濃度等に応じて適宜設定することができる。   In these cell culture methods, microcarriers or gel can be introduced together with cells from ECS conduit 26A (or ECS conduit 26B), and the cells can be cultured by supplying the aforementioned culture solution to the lumen. In addition, culture conditions such as the supply rate of the culture solution, the presence / absence of medium exchange, and the oxygen addition method can be appropriately set according to the cell type, cell concentration and the like.

以下に、本発明を実施例を挙げてより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

(実施例1)
−細胞培養テスト−
図1に示すモジュール10を用いて、細胞の培養を以下の手順で実施した。まず、中空糸束30を構成する個々の中空糸としては、重量平均分子量145800のポリ乳酸製の中空糸(Durect社製、内径0.7mm、外径1.3mm、平均膜孔径:0.1μm)を用いた。中空糸束30は、70本の中空糸から構成され、その長さは64mmである。また、封止材ブロック40A,40Bを構成する封止材としてはウレタン樹脂を用い、円筒状部材22、キャップ24A、24B、スリーブ50A、50B、芯棒60としては、ポリカーボネート樹脂製のものを用いた。なお、円筒状部材22のサイズは、外径32mm、内径26mm、長さ100mmである。また、キャップ24A、24Bはねじ込み式キャップである。
Example 1
-Cell culture test-
Using the module 10 shown in FIG. 1, the cells were cultured according to the following procedure. First, as individual hollow fibers constituting the hollow fiber bundle 30, a hollow fiber made of polylactic acid having a weight average molecular weight of 145800 (manufactured by Duct, inner diameter 0.7 mm, outer diameter 1.3 mm, average membrane pore diameter: 0.1 μm) ) Was used. The hollow fiber bundle 30 is composed of 70 hollow fibers, and its length is 64 mm. Further, urethane resin is used as the sealing material constituting the sealing material blocks 40A and 40B, and the cylindrical member 22, caps 24A and 24B, sleeves 50A and 50B, and the core rod 60 are made of polycarbonate resin. It was. The cylindrical member 22 has a size of an outer diameter of 32 mm, an inner diameter of 26 mm, and a length of 100 mm. The caps 24A and 24B are screw-type caps.

図1に示すモジュール10を組み立てた後、ルーメンに、5%ヒト血清、FGF−2(Fibroblast Growth Facter−2)およびinsulinを含む軟骨細胞増殖培地を、ルーメン用導管28A、28Bを介して流速5mL/minで循環させた。   After assembling the module 10 shown in FIG. 1, the lumen is filled with chondrocyte growth medium containing 5% human serum, FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) and insulin through a lumen conduit 28A, 28B. Circulated at / min.

この状態で、軟骨細胞(ヒト耳介軟骨由来、細胞数:約4000個)を、0.3%ウシアテロペプチドコラーゲン10mL中に包埋し、ECS用導管26Aを介してECS内に投入した。その後、ECS用導管26A、26Bを密封して、細胞の培養を開始した。細胞の培養は、37℃に設定した恒温槽中にモジュール10を配置した状態で実施し、培養液のpHを約7、酸素分圧を約20体積%に保持して行った。   In this state, chondrocytes (derived from human auricular cartilage, the number of cells: about 4000 cells) were embedded in 10 mL of 0.3% siatelopeptide collagen and introduced into ECS through ECS conduit 26A. Thereafter, the ECS conduits 26A and 26B were sealed, and cell culture was started. The cells were cultured in a state where the module 10 was placed in a thermostat set at 37 ° C., and the culture solution was maintained at a pH of about 7 and an oxygen partial pressure of about 20% by volume.

細胞の増殖を確認するために、細胞の培養開始から、2週間後に、モジュール10を分解して、中空糸に培養した細胞が付着した状態の中空糸ユニットを取り出した。取り出した時点の細胞数は、中空糸中の培養液の透水量を400(L/m・h・atm)とした場合には約8000個であり中空糸中の培養液の透水量を1000(L/m・h・atm)とした場合には約18000個であり細胞が増殖していることが確認された。 In order to confirm the proliferation of the cells, two weeks after the start of cell culture, the module 10 was disassembled, and the hollow fiber unit with the cultured cells attached to the hollow fibers was taken out. The number of cells at the time of removal was about 8000 when the water permeability of the culture solution in the hollow fiber was 400 (L / m 2 · h · atm), and the water permeability of the culture solution in the hollow fiber was 1000. In the case of (L / m 2 · h · atm), the number was about 18000, and it was confirmed that the cells were proliferating.

次に、中空糸に培養した細胞が付着した状態の中空糸ユニットから、芯棒60を引き抜いて除去すると共に、スリーブ50A、50Bと共に、封止材ブロック40A、40Bを切断して除去した。この除去作業に際して、中空糸に付着した細胞の損失は殆どなかった。また、中空糸ユニットの取り出し作業や、中空糸ユニットから、細胞および生分解性材料以外の部分を除去する除去作業に際して、中空糸束30は、型崩れすることが無く、十分な強度を有していることが確認された。   Next, the core rod 60 was pulled out and removed from the hollow fiber unit in which cells cultured on the hollow fiber were adhered, and the sealing material blocks 40A and 40B were cut and removed together with the sleeves 50A and 50B. During this removal operation, there was almost no loss of cells attached to the hollow fiber. In addition, the hollow fiber bundle 30 does not lose its shape and has sufficient strength when the hollow fiber unit is taken out or removed from the hollow fiber unit except for the cells and the biodegradable material. It was confirmed that

−生分解性テスト−
生分解性の評価は、細胞培養テストに用いた中空糸と同一の重量平均分子量を有するポリ乳酸からなる多孔体を耳介軟骨細胞と共にビーグル犬(生後8ヶ月目オス)の背部皮下に移植し、移植後から1カ月目、2カ月目および6カ月目における移植サンプルの凍結切片について、多孔体を構成するポリ乳酸の結晶度を位相差顕微鏡により評価することで実施した。結果を図2に示す。
-Biodegradability test-
The biodegradability was evaluated by implanting a porous body made of polylactic acid having the same weight average molecular weight as the hollow fiber used in the cell culture test, along with the auricular chondrocytes, subcutaneously in the back of a beagle dog (8 months old male). The frozen sections of the transplanted samples at 1 month, 2 months and 6 months after the transplantation were evaluated by evaluating the crystallinity of polylactic acid constituting the porous body with a phase contrast microscope. The results are shown in FIG.

図2に示されるように、結晶度の高さを示す白い部分が、移植後から1カ月目、2カ月目、6カ月目と、時間が経過するに従い少なくなっている。このことから、時間の経過と共に、ポリ乳酸は生体内で分解することが判った。なお、図中、左側の位相差顕微鏡像が移植後から1カ月目の状態を示し、中央の位相差顕微鏡像が移植後から2カ月目の状態を示し、右側の位相差顕微鏡像が移植後から6カ月目の状態を示す。また、3つの位相差顕微鏡写真中の右下に示されるバーの長さは50μmを意味する。   As shown in FIG. 2, the white portion indicating the high degree of crystallinity decreases as time passes, such as the first, second, and sixth months after transplantation. From this, it was found that polylactic acid degrades in vivo over time. In the figure, the left phase contrast microscope image shows the state of the first month after transplantation, the center phase contrast microscope image shows the state of the second month after transplantation, and the right phase contrast microscope image after the transplantation. The state of the sixth month from is shown. Moreover, the length of the bar shown at the lower right in the three phase contrast micrographs means 50 μm.

(実施例2)
−細胞培養テスト−
中空糸束30を構成する個々の中空糸として、重量平均分子量133000のポリ乳酸製の中空糸(Durect社製、内径0.7mm、外径1.3mm、平均膜孔径:0.1μm)を用いた以外は、実施例1と同様にして、細胞培養テストを実施した。その結果、実施例1と同程度に細胞が増殖していることが確認された。
(Example 2)
-Cell culture test-
As individual hollow fibers constituting the hollow fiber bundle 30, a polylactic acid hollow fiber having a weight average molecular weight of 133000 (manufactured by Duct, inner diameter 0.7 mm, outer diameter 1.3 mm, average membrane pore diameter: 0.1 μm) is used. A cell culture test was carried out in the same manner as in Example 1 except that. As a result, it was confirmed that the cells were growing to the same extent as in Example 1.

次に、中空糸に培養した細胞が付着した状態の中空糸ユニットから、芯棒60を引き抜いて除去すると共に、スリーブ50A、50Bと共に、封止材ブロック40A、40Bを切断して除去した。この除去作業に際して、中空糸に付着した細胞の損失は殆どなかった。また、中空糸ユニットの取り出し作業や、中空糸ユニットから、細胞および生分解性材料以外の部分を除去する除去作業に際して、中空糸束30は、実施例1と比べて若干の型崩れが生じたものの、十分な強度を有していることが確認された。   Next, the core rod 60 was pulled out and removed from the hollow fiber unit in which cells cultured on the hollow fiber were adhered, and the sealing material blocks 40A and 40B were cut and removed together with the sleeves 50A and 50B. During this removal operation, there was almost no loss of cells attached to the hollow fiber. In addition, the hollow fiber bundle 30 was slightly out of shape as compared with Example 1 during the removal operation of the hollow fiber unit and the removal operation of removing portions other than the cells and the biodegradable material from the hollow fiber unit. However, it was confirmed to have sufficient strength.

(実施例3)
−細胞培養テスト−
中空糸束30を構成する個々の中空糸として、重量平均分子量145800のポリ乳酸製の中空糸(Durect社製、内径0.7mm、外径1.3mm、平均膜孔径:0.05μm)を用いた以外は、実施例1と同様にして、細胞培養テストを実施した。その結果、実施例1と同程度に細胞が増殖していることが確認された。
(Example 3)
-Cell culture test-
As each hollow fiber constituting the hollow fiber bundle 30, a polylactic acid hollow fiber having a weight average molecular weight of 145800 (manufactured by Duct, inner diameter 0.7 mm, outer diameter 1.3 mm, average membrane pore diameter: 0.05 μm) is used. A cell culture test was carried out in the same manner as in Example 1 except that. As a result, it was confirmed that the cells were growing to the same extent as in Example 1.

次に、中空糸に培養した細胞が付着した状態の中空糸ユニットから、芯棒60を引き抜いて除去すると共に、スリーブ50A、50Bと共に、封止材ブロック40A、40Bを切断して除去した。この除去作業に際して、中空糸に付着した細胞の損失は殆どなかった。また、中空糸ユニットの取り出し作業や、中空糸ユニットから、細胞および生分解性材料以外の部分を除去する除去作業に際して、中空糸束30は、十分な強度を有していることが確認された。   Next, the core rod 60 was pulled out and removed from the hollow fiber unit in which cells cultured on the hollow fiber were adhered, and the sealing material blocks 40A and 40B were cut and removed together with the sleeves 50A and 50B. During this removal operation, there was almost no loss of cells attached to the hollow fiber. In addition, it was confirmed that the hollow fiber bundle 30 has sufficient strength when the hollow fiber unit is taken out or removed from the hollow fiber unit except for the cells and the biodegradable material. .

(中空糸の強度評価)
実施例1〜実施例3において用いた中空糸を、37℃の生理食塩水中に浸漬した場合の中空糸の引っ張り強度を以下の条件で評価した。結果を以下の表1に示す。
・浸漬時間:0月、1月、2月、5月
・中空糸サンプルの長さ:60mm
・測定サンプル数:8
・引っ張り強度の測定装置および測定条件:インストロン社4443型を用いて、引っ張り速度:60mm/minで測定
(Evaluation of hollow fiber strength)
The tensile strength of the hollow fiber when the hollow fiber used in Examples 1 to 3 was immersed in physiological saline at 37 ° C. was evaluated under the following conditions. The results are shown in Table 1 below.
・ Immersion time: 0, January, February, May ・ Hollow fiber sample length: 60 mm
-Number of measurement samples: 8
-Tensile strength measurement device and measurement conditions: Measured at a tensile speed of 60 mm / min using an Instron model 4443

10 モジュール(細胞培養中空糸モジュール)
20 ハウジング
22 円筒状部材
24A、24B キャップ
26A 第一のECS用導管
26B 第二のECS用導管
28A 第一のルーメン用導管
28B 第二のルーメン用導管
30 中空糸束
40A、40B 封止材ブロック
50A、50B スリーブ
60 芯棒
70 Oリング
10 Module (Cell culture hollow fiber module)
20 Housing 22 Cylindrical members 24A, 24B Cap 26A First ECS conduit 26B Second ECS conduit 28A First lumen conduit 28B Second lumen conduit 30 Hollow fiber bundles 40A, 40B Sealant block 50A , 50B Sleeve 60 Core rod 70 O-ring

Claims (4)

重量平均分子量が70000〜180000の範囲内である生分解性材料からなり、半透膜機能を有する中空糸を1本以上含み、かつ、上記中空糸の内部空間に培養液を供給することにより上記中空糸の外部空間に存在する細胞に生育必須成分を供給するための中空糸束と、
該中空糸束を格納するハウジングと、を少なくとも有し、かつ、
上記ハウジングの任意の部分が脱着可能であると共に、上記中空糸束の少なくとも一部が外部に露出可能な構造を有することを特徴とする細胞培養用中空糸モジュール。
It is made of a biodegradable material having a weight average molecular weight in the range of 70,000 to 180,000 , contains one or more hollow fibers having a semipermeable membrane function, and supplies the culture solution to the inner space of the hollow fibers. A hollow fiber bundle for supplying essential components for growth to cells existing in the external space of the hollow fiber;
A housing for storing the hollow fiber bundle, and
A hollow fiber module for cell culture, wherein an arbitrary part of the housing is detachable and at least a part of the hollow fiber bundle can be exposed to the outside.
請求項1に記載の細胞培養中空糸モジュールにおいて、
前記生分解性材料が、
(i)ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、脂肪族ポリエステル、ポリアミド、
(ii)上記(i)に示す高分子材料からなる群より選択される少なくとも2種類以上の高分子材料を含む混合材料、および、
(iii)上記(i)に示す高分子材料からなる群より選択される少なくとも2種類以上の高分子材料の重合に用いる各々の単量体を共重合させた共重合体、
から選択される材料であることを特徴とする細胞培養用中空糸モジュール。
In the cell culture hollow fiber module according to claim 1,
The biodegradable material is
(I) polylactic acid, polyglycolic acid, polycaprolactone, aliphatic polyester, polyamide,
(Ii) a mixed material containing at least two or more kinds of polymer materials selected from the group consisting of the polymer materials shown in (i) above, and
(Iii) a copolymer obtained by copolymerizing each monomer used for polymerization of at least two kinds of polymer materials selected from the group consisting of the polymer materials shown in (i) above;
A hollow fiber module for cell culture, which is a material selected from:
請求項1または2に記載の細胞培養用中空糸モジュールを用いて、細胞を培養した後に、上記ハウジングの任意の部分を分離し、上記中空糸束の少なくとも一部を外部に露出し、
上記中空糸に付着した上記細胞を、上記中空糸に付着した状態で回収することを特徴とする細胞培養方法。
After culturing cells using the hollow fiber module for cell culture according to claim 1 or 2, an arbitrary part of the housing is separated, and at least a part of the hollow fiber bundle is exposed to the outside,
A cell culture method comprising collecting the cells attached to the hollow fiber in a state of being attached to the hollow fiber.
請求項3に記載の細胞培養方法において、
前記細胞が軟骨細胞であることを特徴とする細胞培養方法。
The cell culture method according to claim 3, wherein
A cell culture method, wherein the cell is a chondrocyte.
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