JP5691140B2 - 非対称流フィールドフローフラクショネーションユニットによって粒子の物性を特定する方法、および流体手段中に懸濁している粒子の試料を分画するためのa4fユニット - Google Patents

非対称流フィールドフローフラクショネーションユニットによって粒子の物性を特定する方法、および流体手段中に懸濁している粒子の試料を分画するためのa4fユニット Download PDF

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Description

背景
高分子、ウイルス様粒子、バクテリア、またはコロイドなどの小さな粒子を分離する必要性が、粒子の質量またはサイズの測定、およびそれらの分布の判断の準備として、重要な課題になっている。最近では、このような粒子を分離できる最も成功した手段のうちの1つは、非対称流フィールドフローフラクショネーション、略してAsFFFFまたはA4Fによるものである。この装置は、J.カルビン・ギディングズ(J. Calvin Giddings)によってサイエンス(Science)第260巻、第1456〜1465頁の彼の1993年の論文に記載された以前のクロスフロー型FFF装置を変形させたものである。A4F変形例は、その発明者であるカール−グスタフ・ウォーランド(Carl-Gustav Wahlund)によって、アナリティカル・ケミストリ(Analytical Chemistry)第59巻、第1332〜39頁の彼の1987年の論文「透過性の壁を1つ有する非対称流フィールドフローフラクショネーションチャンネルの特性(Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall)」に、J.カルビン・ギディングズとともに記載されている。
A4Fユニットは、要素を結び付けるための手段とともに、以下の要素からなっている。以下の要素とは、1)通常は焼結ステンレス鋼粒子でできた、液体透過性フリットを保持する底部アセンブリ構造、2)フリットの上に横たわる透過性膜、3)キャビティを含む、厚みが約75〜800μmのスペーサ、4)レキサン(登録商標)またはガラスなどの材料からなる透明なプレートを一般的には保持する上部アセンブリ構造である。結果として生じるサンドイッチ構造は、ボルトまたは他の手段で結び付けられる。スペーサにおける棺形状のキャビティは、分離が生じるチャンネルの働きをする。上部アセンブリ構造は、概して透明なプレートを貫通する、ポートと呼ばれる3つの孔を含み、これらの孔はチャンネルの上部で中心に位置決めされ、これらの孔によってそこに取付具を取付けることができる。これらのポートは、1)チャンネルの始まり付近に位置し、キャリア液体、いわゆる移動相を送り出す移動相入口ポート、2)分離すべき試料のアリコート、すなわち、分離すべき試料のうち、分離操作のために取り出した一部分をチャンネルに導入する、入口ポートに近接しかつ入口ポートの下流にある試料ポート、および3)分画されたアリコートがチャンネルを出る出口ポートである。
A4Fチャンネルは、サイズ範囲が数ナノメートルから数十マイクロメートルに亘る、上記のさまざまな種類の粒子を分離するために用いられる。このような粒子からなる試料アリコートの分離は、ひいては、棺形状のキャビティの長さ、幅および厚みに依存する。加えて、試料アリコートの分離は、チャンネルフロー量、チャンネルフローに対するクロスフローの割合、温度、液体粘度、pH、イオン性、粒子自体の物理的組成、およびフリットの上に横たわる透過性膜のタイプに依存する。チャンネルフローとクロスフローとの割合の時間変化を好適にプログラムすることによって、異なる粒子種類の分離を大幅に改良することができ、多くの場合、注入された試料アリコートに存在する広範囲の粒子サイズを同じ操作の中で分離することができる。実際、分離すべき粒子の各種類について、アクセス可能なそれらの変数を実験的に変更することによって、最適な分離を進展させることができる。従来のチャンネルについて変更できない唯一の変数は、チャンネル長である。
歴史的に見て、A4Fのチャンネル長は約25〜30cmであり、最大幅は約1〜3cmであり、その長さに沿って先細りになっており、出口ポートの幅に匹敵する幅で終了す
るようなものであった。最近の研究は、長さがより短いチャンネルが特定のメリットを提供するであろうと示唆しており、これに基づいて、全く新しい構造が開発され、より短いA4Fユニットに組み入れられた。しかしながら、単一のチャンネルを選択するにあたって、影響を及ぼす上記の変数をすべてテストし得ない限り、特定の種類の粒子をよりよく分離する可能性を完璧に研究することはできない。したがって、固定チャンネルを用いて各種類の粒子の分離に対する流量の影響を容易にテストするが、現在のチャンネル構成の伝統は、長さを変更することを考慮に入れていない。現在のチャンネル構成の伝統では、3つのポートの位置を同じにした状態でチャンネル幅および膜厚を変更できる。利用できるチャンネル長が1つだけである場合、いくつかの疑問が生じる。利用可能な固定長装置のいずれかがもたらす分離よりも優れた分離をもたらす長さは存在するのか?等価の分離をもたらすがより小さな試料アリコートサイズを必要とする最適な長さは存在するのか?調査される試料のより優れたキャラクタリゼーションをもたらすために、同じ試料についていくつかの異なる長さから得られた結果を組合せてもよいのか?各試料タイプの最適な分離は、関連する最良のチャンネル長を有するのか?
サイエンス(Science)第260巻、第1456〜1465頁 アナリティカル・ケミストリ(Analytical Chemistry)第59巻、第1332〜39頁
この発明の基本的な目的は、これらの疑問に答えることができる装置および方法を提供することである。分離は多くのパラメータに依存し、そのパラメータのうちのいくつかはソフトウェアおよびシステムオペレータによって制御される。しかしながら、この発明までは、1つのパラメータ、すなわちチャンネル長を変更できなかった。したがって、この発明のさらなる目的は、同じチャンネル構造内で異なるチャンネル長を利用しやすくすることによってより広範囲に亘って試料をキャラクタライズできる、より大きな分離の柔軟性を提供することである。
発明の簡単な説明
A4Fユニットの概して透明な上部プレート要素の新しい形態について説明し、この新しい形態によって、さまざまなチャンネル長および形状を与えるスペーサを用いることができる。この発明の上部プレートの形態は、入口ポート、試料注入ポートおよび出口ポートに対して1組の3つの位置を提供するのではなく、複数の試料注入ポートおよび出口ポートの位置を提供することを含む。所与の分離は、試料注入ポートから、分画された試料アリコートがチャンネルを出る出口ポートまでの距離、すなわち、チャンネルフローおよびクロスフローの複合作用によってアリコートが分画されているチャンネルの領域に大きく依存する。したがって、チャンネルが1つである場合、出口ポートに近づいた、試料を注入するための試料注入ポートを選択することによって、チャンネルの有効長が短くなる。他の構造要素はすべて同じままである。代替的に、スペーサ自体を、より短いチャンネルを有するスペーサと置換えてもよい。この修正例では、当初の試料注入ポートは同じままであろうが、当初の試料注入ポートに近づいた、分画済試料出口ポートは、新しい有効なチャンネルのための適切な位置に基づいて用いられるであろう。したがって、より短いスペーサチャンネルを用いて、試料注入ポートに近づいた出口ポートを選択することによって、チャンネル分離長は短くなるであろう。必要になるまで、複数の未使用のポートアパーチャは、封止されたまままたは塞がったままである。
先行技術のA4F構造要素を示す図である。 2つの異なるチャンネル長を用いた分画の差を示す図である。 チャンネルフローが一定に保たれた分離に対するクロスフロー変更の影響を示す図である。 この発明の上部プレートの実施例を示す図である。 この発明とともに用いられる、各々が異なるチャンネルを有するスペーサの組を示す図である。 2つのチャンネルとともに用いられる上部プレートおよび対応するスペーサを示す図である。 ユーザによって選択可能なチャンネル構造のさらなる柔軟性を可能にする、複数のポートが中に配置されたこの発明の上部プレートの別の実施例を示す図である。
発明の詳細な説明
図1は、非対称流フィールドフローフラクショネーションユニットおよびその構成要素の伝統的な構造を示す。典型的なユニットは、上部プレート1を保持する上部プレートアセンブリ10と、多孔性フリット構造3を含む底部プレート2と、流体のうちのいくらかが流れ得る膜4と、先細りチャンネル6が切り抜かれたスペーサ5と、移動相の挿入のための入口ポート7と、分画すべき試料アリコートを導入する試料注入ポート8と、分画された試料および移動相が1つ以上の検出装置に入る前にこの構造を出る出口ポート9と、装置に対して十分なフローおよび制御を供給するための種々のポンプおよびコントローラと、からなっている。上部プレートアセンブリ10は、一般的に、ボルト11によって底部プレート2に固定される。上部プレート1は概して透明であるため、必要であれば試料分画中にチャンネル6が観察される。上部プレート1はまた、一般的にポート7、8および9を含む。出口ポート9を通るフローは、膜4を出るフローを制限することによって生じる。したがって、移動相入口フローがたとえば毎分2mlであり、膜を通るフローが0.5ml/分に制限されると、出口フローは1.5ml/分になるであろう。
粒子は、一旦A4Fユニットによって分離されると、一般的にはそれに応答してさまざまな種類の検出機器によって調査される。これらは、光散乱光度計、UV吸収計、示差屈折率検出器、および示差粘度計を含み得る。このような装置は、モル質量、固有の粘度測定法、サイズなどの点で、分離された粒子/分子をキャラクタライズするために用いられる。
このようなチャンネルのいわゆる分画力F、すなわち、さまざまなサイズの粒子をチャンネルが分離する能力は、以下の関係によって表わしてもよい。
Figure 0005691140
ここで、Sはいわゆる選択定数であり、Vcrossはチャンネルクロスフロー量であり、Vchannelはチャンネル縦方向フロー量であり、bはチャンネル幅であり、Lはチャンネル長であり、wはチャンネルの厚みであり、Dはアインシュタイン−ストークス方程式によって粒子の流体力学半径Rhに関係付けられる粒子拡散係数である。粒子の流体力学半径Rhは、すなわち以下のとおりである。
Figure 0005691140
ここで、ηは絶対温度Tでの溶液粘度であり、kbはボルツマン定数である。
上の式(1)から、チャンネル長が減少すると試料の分離が改良する可能性があるようであることに気づく。しかしながら、チャンネルが粒子を保有する能力は、チャンネルによって規定される膜のエリア、すなわち、スペーサのキャビティによって規定される膜領域、の単位面積当りのクロスフローに依存する。単位面積当りのクロスフローがおよそVcross/bL=ξであるので、式(1)は以下のとおりになる。
Figure 0005691140
Figure 0005691140
Figure 0005691140
表1に示す結果が得られた分子のタイプは、図2のデータをもたらすものとはかなり異なっていた。しかしながら、より短いチャンネルが同じ品質の分離を達成したようであるが、その分離はより高速であり、必要な試料がより少なかったことに注目することが重要である。
図2から、二量体およびより高いオリゴマー分画から生じるピークは、標準的なチャネル12よりも、より長いチャンネル13においてより早く溶離していることがわかり、これは表1の観察結果の別の確証である。したがって、チャンネル長の関数として分画を調査することによって特定の試料を分析する能力は、任意のA4Fシステムの非常に重要な特徴であろう。現在のところ、チャンネルが1つだけの構造の実験が可能であり、実際的な見地から、最適な分離をもたらすチャンネル長の判断は、チャンネルを含む別個のユニットを用いることによってのみ達成でき、チャンネルを含む別個のユニットは各々、固定長に基づく。この発明の時点で、対応して異なるチャンネル長を有する、異なるチャンネルが2つだけの構造が利用可能であり、それらのチャンネル構造からのデータは、上の表1のデータと類似していた。図2のより短いチャンネルのデータ13はより長いチャンネルのデータ12を超える可能な改良を示唆しているが、13をより綿密に調査すると、オリゴマー状態では、ピークは基線分解されるようには見えない。ピーク間の最小値は、溶離が増大するにつれて、基線からの逸脱を増大させる。分離および分解能への、チャンネル長の関数依存性の推定値はいずれも、提示されたデータには明らかに存在しない。2つだけのチャンネル長の値および比較的粗のA4F理論では、流量などの他のパラメータの変更を伴ってまたは変更を伴わずにチャンネル長を変化させることの重要性は、答の見つからない疑問のままである。
Figure 0005691140
チャンネル長の変更の影響を詳細に調査できる手段がなかったので、2つの市販の構造の結果だけを用いて、このような結果を調査した。ここで、図4に示される構造を考慮されたい。ここでは、複数のさらなる試料注入ポートが含まれる以外は、図1の構造と同一のチャンネル構造であることが分かる。可能な1組のこのようなさらなるポートは、それぞれ、印14、15、16、17および18をふることによって示されている。このようなポートの実際の数およびチャンネルの長さに沿ったそれらの位置は変化し得る。出口ポート9からの各々のこれらの試料注入ポートの距離は、チャンネルの有効分画長、すなわち、チャンネルを出る前に試料を分画し得る距離に対応する。したがって、各々のこのような注入ポートに対応して、対応する試料注入および試料フォーカシングは、その後の伝統的な分離を開始させる。同一の試料アリコートを順次的に注入するためにある範囲の注入ポートを選択することによってある範囲のチャンネル長に亘って同じ試料を分離することで、そのように研究された各試料について最適なチャンネル長を判断できる。特定の注入中に使用されない試料注入ポートは、一時的に塞がれる場合もあれば、外付けの弁および管によって制御される場合もある。したがって、複数ポート試料注入弁は、各注入ポートが対応する位置を有し、すべてのポートが直ちに接続され、一度に1つのポートだけが作動するように構成されてもよい。長さ、チャンネルフロー量およびクロスフロー量の関数としてのチャンネル挙動の測定は、一旦自動化されると、容易に行なうことができる。
上述の可能な実験のタイプは、現在の市販のA4Fユニット構造がすべて、与えられるチャンネル長についてしっかりした根拠を持っていないことを強く示唆している。利用できる選択肢はなく、なぜベンダーが指定するチャンネルでのみ用いられるようにA4Fユニットが作られてきたかを示唆するデータは不足している。特定のチャンネル長に関連する分離のメリットについてなされてきた研究はあまりにも少ない。当然ながら、流量、スペーサの厚みおよびスペーサの形状の変更の影響を実証する、図3に示されるような多くの研究がある。しかしながら、この発明までは、チャンネル長の影響は研究対象ではなかった。最適な長さを各々の別個の試料タイプに関連付けることが可能であり得る。このような研究は大幅に遅れている。
図4によって示される実施例はチャンネル長の影響のさらなる探求および研究を可能にするであろうが、一定のチャンネルの形状を維持しながらのチャンネル長の影響の調査が
重要であることが判明し得る。図4の実施例は、選択された注入ポートから出口ポートまで同じチャンネルの形状を利用する。伝統的には、移動相入口ポートと試料注入ポートとの間の領域は、先細り形状を備えている。図4に示されるようなこの発明の異なる試料注入ポートを用いることによって、この遷移キャビティの形状は不要となる。このような注入前形状についてのコメントまたは研究はこの文献では殆ど見ることができないが、その後の分離に影響を及ぼすことは予想されない。このような研究に役立つこの発明の別の実施例が、図5に示される。この実施例の場合、選択された長さごとに、A4Fユニットを開けて、スペーサを交換しなければならないが、類似したチャンネルの形状が、さまざまな選択された長さに用いられ得る。
図5に示される上部プレートは、移動相注入ポート7と試料注入ポート8とを有する上部プレート構造を示す。加えて、1組の流出ポート19、20、21、22、23および24がある。同じ入口ポート7および試料注入ポート8を共有するチャンネルを有するスペーサが、各々のこのような出口ポートに対応しているであろう。したがって、25と表記されるスペーサは、出口ポート24に対応して切り抜かれたキャビティを有し、26と表記されるスペーサは、出口ポート21に対応して切り抜かれたキャビティを有する、などであろう。関連するチャンネル長が存在するであろうこのような出口ポートの数は図5では6個であるように示されているが、この数およびポート間の距離の増分はより多い場合もあれば、より少ない場合もある。
上部プレートの柔軟性およびそこに位置するさまざまなポートの位置の可能性が、図4および図5の例によって示されてきた。このような多くのポートの位置を収容するために上部プレートの使用を拡大させる能力について、本明細書において明らかに説明してきた。別の単純な修正例が図6に示され、図6では、単一のスペーサが2つ以上の別個のスペーサキャビティを提供できるように上部プレートにはポートが取付けられている。この単純な例の場合、上部プレートには、2組の移動相入口ポート7と、対応する2組の試料注入ポート8とが付いている。スペーサは2つの対応する出口ポート9を有するが、2つのスペーサキャビティ27および28の長さおよび形状は異なっていてもよい。キャビティは同じコントローラユニットに接続されてもよく、適切な複数弁構造によって、このようなチャンネルは順次的に切換えられ、用いられてもよいことに注目されたい。同じスペーサ内にさらなる能動的キャビティを可能にするのに必要なさまざまなポートを含むようにA4Fチャンネルの上部プレートを修正することにはさらなるメリットがある。さらなるメリットとは、このような分離に必要な最も高価な使い捨て品である膜の有用性が大きく高められ得ることである。チャンネル構造の現在の構成では、結果的に、膜表面積のうち僅かな部分しか用いられない。同じスペーサ内に2つ以上のチャンネルを配置できるように伝統的なチャンネルの位置を変化させることによって、膜はより有効に用いられ、動作コストは劇的に低減される。
図4または図5に記載される発明態様に類似した実現例を可能にするために各チャンネルについて十分なさらなるポートを追加することによって、さらに大きな多用性がこの複数チャンネルの実現例に与えられ得る。整然と並んだポートが上部プレートのアクセス可能な表面全体に亘って延びているこの実施例の一例が、図7に示される。「アクセス可能な」というのは、このようなポートの直下の領域に、スペーサキャビティが切込まれていなければならず、透過性フリット構造によって支持された膜をその下で露出させていることを意味している。これらの発明要素の重要性はいくら強調してもし過ぎることはない。これらの発明要素によって、A4F技術に対してより大きな柔軟性がもたらされるだけでなく、高価な膜要素をより活用することができる。最も重要なことであるが、これらの発明要素は、分子および/または粒子の各種類についての最適な分離条件を導き出す能力を大幅に拡大させる。
粒子分離およびフィールドフローフラクショネーションの当業者に明らかであるように、実行のために列挙した基本的要素から逸脱しない、我々が発明しかつ記載した多用途のチャンネルの実現例および適用例の多くの明らかな変形例が存在するが、すべてのこのような変形例は、前に記載した我々の発明の明らかな実現例であり、後に続く特許請求の範囲を参照することによって包含される。

Claims (9)

  1. 非対称流フィールドフローフラクショネーションユニット、すなわちA4Fを用いて、粒子の物性を特定する方法であって、A4Fの構造は、
    流体ポートを含む上部プレートアセンブリと、
    前記上部プレートアセンブリの下方に配された、多孔性フリット構造を含む底部プレートアセンブリと、
    前記底部プレートアセンブリから前記上部プレートアセンブリを分離する、2つ以上のスペーサキャビティを含む1つのスペーサと、
    前記多孔性フリットによって前記底部プレートアセンブリ上に支持された、前記粒子が透過することを防ぐ膜とを備え、
    前記底部プレートアセンブリは、前記上部プレートアセンブリを強固に取付けることができ、それによって、前記膜と前記上部プレートとの間の前記キャビティを封止するように構成され、
    前記方法は、
    A.それぞれキャビティ形状が異なる複数のスペーサキャビティを中に含む1つのスペーサを用いることによって、キャビティ形状の異なる複数のキャビティを与えるチャネル構造を組み立てるステップと、
    B.物性を特定すべき前記粒子の懸濁液を作るステップと、
    C.前記A4Fの前記チャネル構造の前記2つ以上のキャビティのうちの第1のキャビティ形状を有するキャビティに前記粒子の試料を注入するステップと、
    D.前記第1のキャビティ形状を有する前記キャビティによって、前記注入された前記試料を分画するステップと、
    E.検出器手段によって、前記分画された前記試料を測定するステップと、
    F.前記チャンネル構造内の前記複数のキャビティのうちの、複数のさらなるキャビティ形状を有するキャビティに、前記チャネル構造を分解することを必要とせずに、前記粒子の複数の前記試料を連続的に注入するステップと、
    G.選択された形状の前記キャビティによって、連続的に注入された前記各試料を分画するステップと、
    H.前記検出器手段によって、前記粒子の前記分画された前記試料を連続的に測定するステップと、
    .そのように測定されたすべての前記試料から収集されたすべての測定値を比較するステップとを備え、
    前記さらなるキャビティ形状を有する前記キャビティのうちの1つ以上は、前記第1のキャビティ形状を有する前記キャビティを有する同じスペーサ内の追加のスペーサキャビティによって作られ、前記スペーサキャビティの各々は、移動相ポート、試料注入ポートおよび試料除去ポートとして動作可能なポートを備え、このようなポートはすべて、前記A4Fの前記チャンネル構造の前記上部プレートアセンブリに位置し、その中の未使用のすべてのポートが封止される、方法。
  2. 流体手段中に懸濁している粒子の試料を分画するための、非対称流フィールドフローフラクショネーションユニット、すなわちA4Fユニットであって、
    A.多孔性フリットを組入れる底部プレート、
    B.前記底部プレートの上面に配された膜であって、中に懸濁している前記粒子を運ぶ前記流体手段に対してのみ透過性がある膜、
    C.2つ以上のスペーサキャビティが切込まれた、前記膜の上に配された1つのスペーサ、および
    D.複数の流体ポートの組を各前記スペーサキャビティに対応して含む、前記スペーサの上に配された上部プレートからなっており、前記上部プレートの前記複数の流体ポートの組は、
    1.移動相流体を対応する前記キャビティに注入するための移動相流体ポートと、
    2.分画すべき前記粒子の試料を対応する前記キャビティに注入するための複数の試料注入流体ポートとを含み、前記試料注入流体ポートの各々は、前記移動相流体ポートから異なる距離のところに試料注入位置を提供し、前記上部プレートの前記複数の流体ポートはさらに、
    3.分画後の前記試料を検出器手段に運ぶための出口流体ポートを含む、A4Fユニット。
  3. 前記キャビティのうちの少なくとも1つは、他の前記キャビティのうちの少なくとも1つとは異なるチャンネル有効長を有する、請求項に記載のA4Fユニット。
  4. 前記キャビティのうちの少なくとも1つは、他の前記キャビティのうちの少なくとも1つとは異なる形状を有する、請求項に記載のA4Fユニット。
  5. 流体手段中に懸濁している粒子の試料を分画するための、非対称流フィールドフローフラクショネーションユニット、すなわちA4Fユニットであって、
    上部プレートのアクセス可能な領域上に水平および垂直に延びる複数の行および列の形で配置された流体ポートの配列を備える上部プレートを備え、
    前記行および列の各々は、前記流体ポートのうちの2つ以上を含み、試料注入ポートが移動相注入ポートの下流にあり流出ポートの上流にある限りは、前記流体ポートのうちの2つ以上のうちのいずれかが前記移動相注入ポート、前記試料注入ポートまたは前記流出ポートの役割を果たし得て、未使用のすべてのポートにはアクセスできず、前記移動相注入ポート、試料注入ポートおよび流出ポートの下の領域は、適切に位置決めされたスペーサを有し、前記スペーサは、上にある前記流体手段に対して透過性がある膜から前記上部プレートを分離する1つ以上のスペーサキャビティを含み、前記A4Fユニットはさらに、
    底部プレートに組入れられた多孔性フリットと、
    前記上部プレートを前記底部プレートに接続して封止する手段とを備える、A4Fユニット。
  6. 前記スペーサは2つのスペーサキャビティを含む、請求項に記載のA4Fユニット。
  7. 前記スペーサキャビティのうちの1つは、他の前記スペーサキャビティとは異なるチャンネル有効長を有する、請求項に記載のA4Fユニット。
  8. 前記スペーサキャビティのうちの1つは、他の前記スペーサキャビティとは異なる形状を有する、請求項に記載のA4Fユニット。
  9. 前記スペーサは1つのスペーサキャビティを含む、請求項5に記載のA4Fユニット。
JP2009137185A 2008-06-09 2009-06-08 非対称流フィールドフローフラクショネーションユニットによって粒子の物性を特定する方法、および流体手段中に懸濁している粒子の試料を分画するためのa4fユニット Expired - Fee Related JP5691140B2 (ja)

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