JP2019525739A - 誘電泳動（ｄｅｐ）を用いた標的細胞濃度の改善 - Google Patents

誘電泳動（ｄｅｐ）を用いた標的細胞濃度の改善 Download PDF

Info

Publication number
JP2019525739A
JP2019525739A JP2018566214A JP2018566214A JP2019525739A JP 2019525739 A JP2019525739 A JP 2019525739A JP 2018566214 A JP2018566214 A JP 2018566214A JP 2018566214 A JP2018566214 A JP 2018566214A JP 2019525739 A JP2019525739 A JP 2019525739A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
capture region
target particles
chamber
analyte
electrode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2018566214A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6641032B2 (ja
Inventor
オハロラン ジョナサン
オハロラン ジョナサン
マートン ヘザー
マートン ヘザー
オズボーン スティーブン
オズボーン スティーブン
ボアダ エドゥアルド
ボアダ エドゥアルド
サルモン ジョナサン
サルモン ジョナサン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
QuantumDx Group Ltd
Original Assignee
QuantumDx Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1610830.0A external-priority patent/GB201610830D0/en
Priority claimed from GBGB1707566.4A external-priority patent/GB201707566D0/en
Application filed by QuantumDx Group Ltd filed Critical QuantumDx Group Ltd
Publication of JP2019525739A publication Critical patent/JP2019525739A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6641032B2 publication Critical patent/JP6641032B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0424—Dielectrophoretic forces
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N2001/4038—Concentrating samples electric methods, e.g. electromigration, electrophoresis, ionisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本発明は、誘電泳動（ＤＥＰ）を用いて標的細胞を濃縮する方法及びそのためのデバイスに関する。とりわけ、この方法により、検体内に標的細胞が低い濃度で存在する場合であっても標的細胞を迅速に捕捉できるよう、マイクロ流体デバイス中の検体の比較的高いスループット（好ましくは、１００ｍｌまで、又は１０ｍｌまで、又は１ｍｌまでの検体量を用いて）が可能となる。この方法は、検体が流れ通る複数のチャンバーを利用するものであり、チャンバーは、第１の捕捉領域が第２のチャンバーよりも大きな領域及び速い流量を有し、第２のチャンバーは第１の捕捉領域の下流に位置されると共に、第１の捕捉領域で捕捉された物質を更に濃縮するためにより小さく、より遅い流量を有するよう構成される。【選択図】図４

Description

本発明は、誘電泳動（ＤＥＰ）を用いて標的細胞を濃縮する方法及びそのためのデバイスに関する。とりわけ、この方法により、検体内に標的細胞が低い濃度で存在する場合であっても標的細胞を迅速に捕捉できるよう、マイクロ流体デバイス中の検体の比較的高いスループット（好ましくは、１００ｍｌまで、又は１０ｍｌまで、又は１ｍｌまでの検体量を用いて）が可能となる。この方法は、検体が流れ通る複数の領域又はチャンバーを利用するものであり、ここで、該領域又はチャンバーは、第１の捕捉領域が第２のチャンバーよりも大きな領域及び速い流量を有し、該第２のチャンバーは該第１の捕捉領域の下流に位置されると共に、該第１の捕捉領域で捕捉された物質を更に濃縮するためにより小さく、より遅い流量を有するよう構成される。
病原体の早期検出は、多くのケースにおいて効果的でタイムリーな治療へのカギである。例えば、結核（ＴＢ）は、ほとんどのケースが治癒可能であるにもかかわらず、年間２００万人の死をもたらしている。入手可能な有効ワクチンが無い中、この病気を排除するためには早期診断及び効果的な治療が重要である。ＴＢ試験を必要としている患者の推定６０％が地域社会に根ざした保健センターにいるものの、多剤耐性結核（ＭＤＲ−ＴＢ）の診断試験は、高価で複雑な実験室設備や、紹介機関又はサテライトラボで見つかるような高度に熟練したスタッフを必要とする。薬剤耐性マーカーのパネルを含め、結果が数週間返ってこないこともあり、その間に感染が地域社会内に広がる可能性がある。
マイクロ流体の優位性は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）診断装置が現実のものにより近づいていることである。しかしながら、提案されているＰＯＣシステムにはかなりのボトルネックがなお存在し、その多くは、病原体濃度の潜在的に低い検体がより濃縮された量の病原性物質を提供するために処理されなければならないという、試験用検体の前処理に関連する。ポイントオブケア診断の提供に真に適した許容可能な時間枠内で比較的大量の検体を処理することには課題もある。
誘電泳動（ＤＥＰ）では、誘電体粒子又は分極性粒子が空間的に不均一な電場にさらされた時に、誘電体粒子又は分極性粒子に力が働いて誘電体粒子又は分極性粒子を動かす。ＤＥＰの動きは、電極表面に向かって（正のＤＥＰ）又は電極表面から遠ざかるように（負のＤＥＰ）誘導することができる。
標的細胞を潜在的に含有する検体のマイクロ流体連続フロー処理において、その標的細胞を濃縮するためにＤＥＰを使用することができる。ＤＥＰ電極は、マイクロ流体チャネル内部の指定領域上の検体流中に漂う標的細胞を選択的にトラップするように調節され、その一方で、不要な細胞及び物質は、フローによってマイクロ流体チャネルを通じて出続ける。これには、流体力学的な力に対抗して細胞をトラップし続けるのに十分強い、標的に特異的なＤＥＰ力を必要とする。標的細胞は電極表面で捕捉でき、その後電場をオフにすることで放出できるので、ＤＥＰの作業は、トラップに基づく細胞の分離及び濃縮に効果的である。
このようなアプローチは有用であり得る一方、処理速度が原因で、現状は臨床の場面において制限されている。とりわけ、検体中に病原体又は標的細胞が非常に低い濃度でしか存在していないかも知れない場合においては、比較的高い検体量がマイクロ流体システム中を流れる必要がある。仮に検体が典型的なＤＥＰマイクロ流体システム中を高すぎる流量で流れる場合、標的細胞を捕捉する効率が低下する−理論によって制限されることを望むこと無く、高い流量は以下の理由のために有害であると考えられる、（ｉ）電極からより遠くにある細胞が受ける力はより小さく、それゆえに流体力学的な力に負け得るため、捕捉を逃れる細胞がある、（ｉｉ）経時的に、先にトラップされた細胞を実際上洗い落としてしまう。従って、ＰＯＣ診断プロセス全体にかなりの時間を加えながら、ＤＥＰの捕捉はゆっくりと行われる必要があるであろう。
本発明は、従来技術に関連した一つ以上の欠点を除去又は軽減することを目的とする。
本発明の第一の態様に従い、
マイクロ流体デバイスを設ける工程と；
ここで、前記デバイスは、少なくとも一つの第１の捕捉領域と；前記第１の捕捉領域の下流で前記第１の捕捉領域と流体連通する第２の領域と；を含み、
前記第１の捕捉領域は、標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための第１の手段を含み、前記手段は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記手段の上を流れるように構成され；
前記第２の領域は、前記第１の捕捉領域よりも容量が小さく、標的粒子を捕捉する第２の手段を含み、前記第２の捕捉領域中を流れる検体が第２の手段（them）の上を流れるように構成される；
検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的粒子をトラップできる標的細胞を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流す工程と；
トラップされた標的粒子を標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段から放出して、濃縮検体をもたらす工程と；
前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的粒子をトラップできる標的粒子を捕捉する前記第２の手段を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２のチャンバー中に流す工程と；
更なる処理工程を実行する工程と；
を含む、検体中の標的粒子を濃縮する方法が提供される。
好ましくは、前記標的粒子は標的細胞である。
好ましくは、標的細胞を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記手段は、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極である。
好ましくは、標的細胞を捕捉する前記第２の手段は、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極である。
驚くべきことに、発明者らは、ＤＥＰ電極を有するチャンバーなどの第１の大きな領域中に比較的高い流量で検体を流すことにより、初期の迅速な捕捉が可能となることを見出し、捕捉された細胞はその後放出されることができ、更にその後、結果物としての濃縮フローを第１の捕捉領域内でよりも低い流量で第２の小さなチャンバー中に流せることを見出した。これにより、（特に、ＤＥＰ電極を有するチャネル中に単に流す方法と比較して）標的細胞を効率的且つ迅速に濃縮することができる。とりわけ、これにより、存在する標的の量が多いか少ないかに関係なく、比較的大量の検体を時間的に有効な仕方で処理することが可能となる。実際上、このシステムにより、検体は、第２の領域でよりも高い平均速度で第１の領域を流れ渡ることができる。
好ましくは、検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的細胞をトラップできる標的細胞を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段を用いて、前記領域にわたり第１の体積流量で、前記第１の捕捉領域中に流す前記工程は、検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的細胞をトラップするように活性化された前記電極を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流すことを含む。電極は、標的細胞を選択的にトラップするためにＤＥＰを利用するように構成される。
好ましくは、トラップされた標的細胞を、標的細胞を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段から放出して、濃縮検体をもたらす前記工程は、トラップされた標的細胞を放出して濃縮検体をもたらす時間後に、前記第１の捕捉領域内の前記電極を非活性化することを含む。
好ましくは、前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的細胞をトラップできる標的細胞を捕捉する前記第２の手段を用いて、前記第２の領域にわたり前記第１の流量よりも低い第２の体積流量で、前記第２のチャンバー中に流す前記工程は、前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的細胞をトラップするように活性化された前記電極を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２のチャンバー中に流すことを含む。電極は、標的細胞を選択的にトラップするためにＤＥＰを利用するように構成される。
好ましくは、前記少なくとも一つの第１の捕捉領域は、少なくとも一つの注入口及び少なくとも一つの出口を含む。
好ましくは、前記第２の領域は、少なくとも一つの注入口及び少なくとも一つの出口を含む。しかしながら、この注入口及び（an）出口はチャネル内の領域から単に形成されていてもよい。
このような細胞が元の検体に存在する場合にのみ、即ち、検体が病原体を含有するならば、濃縮検体又は更に濃縮された濃縮検体への言及が標的細胞を含むものであると理解されるであろう。
任意的に、第１の捕捉領域はチャンバーである。
任意的に、第２の領域はチャンバーである。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口は、各チャネルが前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口よりも小さい円周である複数のチャネルに分かれる。
好ましくは、前記複数のチャネルは複数の平行チャネルである。
有利なことに、第１の捕捉領域を、複数の、好ましくは平行の、より小さな円周のチャネルに分けることにより、より少量という特徴をもって比較的大量の検体を流すことができる。第１の捕捉領域は今や実際上複数のチャネルを有する捕捉領域であるので、フローの中心が端よりも典型的に速いという層流特性にしばしば関連した課題が減る。とりわけ、チャネルの端でのフローに関連した課題が軽減され、電極間の電圧降下を伴う問題が少なくなる。
好ましくは、前記複数のチャネルは前記少なくとも一つの第１の捕捉領域の出口で合流する。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口は、複数のチャネルに分かれる少なくとも一つの分岐部を備える。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの出口は、単一のチャネルに合流する少なくとも一つの分岐部を備える。
有利なことに、注入口のチャネルを分ける又は出口のチャネルを合流させる分岐部を使用することで、圧力を上昇又は降下させるための再現可能且つ扱いやすい方途が得られる。
任意的に、前記マイクロ流体デバイスは複数の分離可能部を含んでいてもよい。
任意的に、前記第１の捕捉領域内の前記電極を非活性化する前に、前記第１の捕捉領域内に新たな緩衝剤又は媒体を流す。この新たな緩衝剤は水でもよい。その後電極を非活性化する際に、標的細胞が新たな緩衝剤内に放出され、標的細胞の濃度がより高まった濃縮検体が得られる。
好ましくは、前記検体は低塩又は低イオン強度である。
任意的に、更なる処理工程は、トラップされた標的細胞を放出して更に濃縮された濃縮検体をもたらす時間後に、前記第２のチャンバー内の前記電極を非活性化することを含んでもよい。任意的に、前記第２のチャンバー内の前記電極を非活性化する前に、前記第１の捕捉領域内に新たな緩衝剤又は媒体を流す。この新たな緩衝剤は水でもよい。その後電極を非活性化する際に、標的細胞が新たな緩衝剤内に放出され、標的細胞の濃度がより高まった更に濃縮された濃縮検体が得られる。
任意的に、更なる処理工程は細胞をin situで溶解することを含んでもよく、任意的に核酸抽出及び／又は核酸増幅を実行する。
任意的に、前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバー内に、前記標的細胞に対する抗体を導入してもよい。このような抗体としてはフルオロフォアを挙げ得る。
任意的に、前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバー内に、前記標的細胞に特異的な生物学的染色を導入してもよい。
任意的に、光検出デバイスが設けられる。
好ましくは、前記光検出デバイスは前記第２のチャンバーからの信号を検出するように構成される。好ましくは、前記光検出デバイスは蛍光を検出でき、好ましくは蛍光を区別又は分析できる。任意的に、前記光検出デバイスは励起源及び検出器を含む。
任意的に、前記デバイスはフロー調整部を備える。任意的に、このフロー調整部はポンプである。当業者には容易に理解されるであろうように、いくつかの方途でフローを調整できる。マイクロ流体チャネル及びチャンバーの外形及びサイズを変更することにより、並びに／或いは、ポンプなどの追加手段を用いることにより、フローの変更を達成できる。
好ましくは、前記第１の捕捉領域内の前記電極が活性化している際に、前記検体が前記捕捉領域から廃棄物貯留槽に流れ出る。好ましくは、前記第１の捕捉領域内の前記電極が非活性化している際に、前記検体が前記第１の捕捉領域から前記第２のチャンバーに流れ出る。
好ましくは、前記第２のチャンバー内の前記電極が活性化している際に、前記検体が前記第２のチャンバーから廃棄物貯留槽に流れ出る。
本発明の第二の態様によれば、
第１の捕捉領域と；前記第１の捕捉領域の下流で前記第１の捕捉領域と流体連通する第２のチャンバーと；電極制御モジュールと；フロー制御手段と；を含み、
前記第１の捕捉領域は、少なくとも一つの注入口及び少なくとも一つの出口を含み、使用中には、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極を更に含み、前記電極は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記電極（them）の上を流れるように構成され；
前記第２のチャンバーは、前記第１の捕捉領域よりも容量が小さく、少なくとも一つの注入口及び少なくとも一つの出口を含み、使用中には、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極を更に含み、前記電極は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記電極（them）の上を流れるように構成され；
前記電極制御モジュールは、電極を活性化及び非活性化し；
前記フロー制御手段は、前記第２のチャンバー中の流量を前記第１の捕捉領域中の流量よりも低くすることができる；
検体中の標的細胞を濃縮するためのマイクロ流体デバイスが提供される。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口が、各チャネルが前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口よりも小さい円周である複数のチャネルに分かれる。
好ましくは、前記複数のチャネルが複数の平行チャネルである。
好ましくは、前記複数のチャネルが前記少なくとも一つの第１の捕捉領域の前記出口で合流する。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口が、複数のチャネルに分かれる少なくとも一つの分岐部を備える。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの出口が、単一のチャネルに合流する少なくとも一つの分岐部を備える。
任意的に、前記マイクロ流体デバイスは複数の分離可能部を含んでいてもよい。
任意的に、前記デバイスは、前記第１の捕捉領域と流体連通する新たな緩衝剤又は媒体の貯留槽を含む。任意的に、前記新たな緩衝剤又は媒体の貯留槽は前記第２のチャンバーと流体連通する。或いは、第２の新たな緩衝剤又は媒体の貯留槽が前記第２のチャンバーと流体連通する。任意的に、前記新たな緩衝剤又は媒体は水である。前記デバイスは、前記電極が非活性化された際に、前記第１の捕捉領域及び／又は第２のチャンバー内に、新たな緩衝剤又は媒体のフローを導入する制御モジュールを更に含んでいてもよい。
任意的に、前記デバイスは、前記標的細胞に対する抗体の貯留槽を含む。任意的に、前記抗体の貯留槽は流体連通している。
任意的に、前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバー内に、前記標的細胞に特異的な生物学的染色を導入してもよい。
任意的に、光検出デバイスが設けられる。
好ましくは、前記光検出デバイスは前記第２のチャンバーからの信号を検出するように構成される。好ましくは、前記光検出デバイスは蛍光を検出でき、好ましくは蛍光を区別又は分析できる。任意的に、前記光検出デバイスは励起源及び検出器を含む。
任意的に、前記デバイスは前処理モジュールを含む。これには、前記検体を前処理するための、前記第１の捕捉領域と流体連通する追加的なチャンバーが挙げられ得る。これは、前記検体の粘性、塩分含有量等を変えることを含み得る。
任意的に、前記デバイスはフロー調整部を備える。任意的に、このフロー調整部はポンプである。
好ましくは、前記デバイスは廃棄物貯留槽を備える。任意的に、前記廃棄物貯留槽は前記第１の捕捉領域と流体連通している。好ましくは、前記廃棄物貯留槽は前記第２のチャンバーと流体連通している。
本発明の第一の態様の好適な別形は、
マイクロ流体デバイスを設ける工程と；
ここで、前記デバイスは、第１の捕捉領域と；前記第１の捕捉領域の下流で前記第１の捕捉領域と流体連通する第２の捕捉領域と；を含み、
前記第１の捕捉領域は、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極を含み、前記電極は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記電極（them）の上を流れるように構成され；
前記第２の捕捉領域は、前記第１の捕捉領域よりも容量が小さく、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極を含み、前記電極は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記電極（them）の上を流れるように構成される；
検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的細胞をトラップできるように活性化された前記電極を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流す工程と；
トラップされた標的細胞を放出して濃縮検体をもたらす時間後に、前記第１の捕捉領域内の前記電極を非活性化する工程と；
前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的細胞をトラップできるように活性化された前記電極を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２の捕捉領域中に流す工程と；
を含む、標的細胞を濃縮する方法である。
本発明のより良い理解のために、単なる例として、そして以下の図を参照して、実施形態について説明する。
図１は、本発明の実施形態に従ったマイクロ流体デバイス又はその一部の実施形態を示す。 図２は、本発明に従ったマイクロ流体デバイス又はその一部の他の実施形態を示す。 図３ａは、本発明に従ったデバイスの別の実施形態を示し、図３ｂは、本発明に従った、分岐したチャネルを含む該デバイス内の第１の捕捉領域の拡大図を示す。 図４は、実のところ複数の第１の捕捉領域があるような設計の分岐したチャネルを有する、第１の捕捉領域の更なる別形を有する該デバイスの他の実施形態を示す。
マイクロ流体デバイス１（又はその一部）は一般に図１に描かれている。デバイスは、流体が第１の注入口を通って第１の捕捉領域２内へと流れることのできる第１の注入口３と、流体が第１の出口を通って第１の捕捉領域２から離れることのできる第１の出口４とを有する、チャンバーの形態の第１の捕捉領域２を含む。第１の捕捉領域は、デバイスの使用中に、検体が複数の電極（them）の上を流れるように、又は検体が複数の電極（them）と接触するように構成された複数の電極５を含む。電極５は、当業者によって理解されるであろうように適切に調節され、電極が活性化された際にＤＥＰを用いて標的細胞をトラップする。例えば、ある場合では、電極は、スメグマ菌に対して１０ＭＨｚ、５Ｖを使用することができるが、実際には、流量及び電極の形状次第で、周波数及び電圧の全範囲にわたって作用可能である。
デバイスはまた、第１の捕捉領域２の下流にあると共に第１の捕捉領域２と流体連通している第２のチャンバー６も含む。流体が第２のチャンバー注入口を通って第２のチャンバー６内へと流れることのできる第２のチャンバー注入口７と、流体が第２のチャンバー出口を通って第２のチャンバー６から離れることのできる第２のチャンバー出口８とがある。第２のチャンバーは、デバイスの使用中に、検体が複数の電極（them）の上を流れるように、又は検体が複数の電極（them）と接触するように構成された複数の電極５ａを含む。電極５ａは、当業者によって理解されるであろうように適切に調節され、電極が活性化された際にＤＥＰを用いて標的細胞をトラップする。
使用中は、検体が、第１の流量で第１の捕捉領域２内に導入される。流量はポンプ（図示されず）によって調整される。電極５が活性化されることにより、検体中の標的細胞（例えば、結核菌細胞又はスメグマ菌細胞）が、ＤＥＰ力によって、電極５の表面の少なくとも一部でトラップされる。検体は、標的細胞が捕捉され続けるようにチャンバー中を流れ続ける一方で、標的細胞が除去されたところからの残りの検体溶出物は、廃棄物貯留槽９又はその他の領域に進む。予め決められた時間でもよい、ある時間後に、電極５が非活性化され、トラップされた標的細胞が電極表面から放出される。この結果、第１の捕捉領域２内を通る媒体は標的細胞で濃縮される（もちろん、この標的細胞が実際に元の検体中に存在していたとして）。これは、本明細書において濃縮検体と呼ばれる。
濃縮検体はその後、チャネル、この例ではマイクロ流体チャネル中を通って第２のチャンバー６内へと流れる。第２のチャンバー６中のフローは、第１の捕捉領域２中の検体の流量よりも低い第２の流量で行われる。第２のチャンバー６内の電極５ａが活性化されることにより、検体中の標的細胞（例えば、結核菌細胞又はスメグマ菌細胞）が、この場合もまた、ＤＥＰ力によって、電極５ａの表面の少なくとも一部でトラップされる。濃縮検体は既により濃縮された量の標的細胞を含有しているであろうから、標的細胞の捕捉又はトラップは非常に有効である。
廃棄物瓶の形状でデバイスの外部にあり得る廃棄物貯留槽９も設けられる。第１の捕捉領域２及び第２のチャンバー６は、どちらも廃棄物貯留槽９と流体連通しており、これにより、細胞が取り除かれたところ又は不要物が流れ通るところからの検体を除去することができる。しかしながら、当業者であれば、この構造は本発明にとって本質的なものではないことを認識するであろう。
当業者であれば、検体が第１の捕捉領域内に導入される前に、様々な前処理工程及び前処理モジュールが含まれ得ることを理解するであろう。
当業者であれば、また、第２のチャンバー内の濃縮検体から標的細胞がトラップ又は捕捉された後に、様々な後処理工程及び後処理モジュールが含まれ得ることも理解するであろう。例えば、細胞はin situで溶解され得、その後核酸が抽出、濃縮又は増幅される。また、第２のチャンバー内の電極は非活性化され得、標的細胞が放出されて更に濃縮された検体が得られる。
当業者であれば、第１の捕捉領域及び第２のチャンバーが説明されている一方で、追加的な濃縮チャンバーも含まれ得ることを理解するであろう。第１及び第２のチャンバーが流体連通している一方で、他のモジュール、貯留槽及びマイクロ流体機構がこれらのチャンバーの間に含まれ得る。
図２に最も良く示されるように、目的の細胞と結合するように選択され、フルオロフォア又は他のマーカーを備えるか、フルオロフォア又は他のマーカーと関連づけられる抗体の、抗体貯留槽１０が含まれ得る。当業者であれば、抗体貯留槽１０は、後の処理中に標的細胞を同定できるようにするであろう生物学的染料、染色又は他の製品と置き換え可能であると認識するであろう。必要に応じて抗体を第１の捕捉領域２’又は第２のチャンバー６’内に導入するために、バルブシステム１１を使用することができる。
第２のチャンバー６’は、開口型頂部又は視覚的に透明な上面を備えている。これは、使用中に、第２のチャンバー６’が第２のチャンバーからの信号を検出するように構成された光検出デバイス（図示されず）と関連付けることができるか、又は光検出デバイスを用いて観察することができるように、そうなっている。好ましくは、この光検出デバイスは蛍光を検出することができ、好ましくは蛍光を区別又は分析することができる。この場合、光検出デバイスは励起源及び検出器を含むであろう。
更なる、そして多くの場合において好適な実施形態を図３及び４に示す。
これらの各実施形態では、第２の捕捉領域６’、６”から上流に位置する第１の捕捉領域２’、２”を有するカセットデバイス１’、１”が設けられる。カセットはガラス基板上に形成される（他の材料もまた使用可能であると認識されるであろうが）。
図３ａでは、第１の捕捉領域が、デバイスの使用中に、検体が電極上を流れるように又は電極と接触するように構成された複数の電極５’を含む（拡大図３ｂに、より明確に示される通り）。電極５’は適切に調節され、当業者には理解されるであろうように、電極が活性化された際にＤＥＰを用いて標的細胞をトラップする。例えば、ある場合では、電極は、スメグマ菌に対して１０ＭＨｚ、５Ｖを使用することができるが、実際には、流量及び電極の形状次第で、周波数及び電圧の全範囲にわたって作用可能である。
第１の注入口３’は第１の捕捉領域内へと通じている。図３に示される実施形態では、注入口３’から流れるチャネルは分岐部１３’を備えており、それから、分岐された各チャネルは、最初のチャネルよりも小さな円周の複数の平行チャネル１４”へと注入口が実際上通じるように、更なる分岐部を備えている。分岐部の数は、必要な流体のフローに応じて選択することができる。複数の平行チャネル１４’はそれぞれ、その中のチャンバー及び電極５’を流れ渡る。実際上、この実施形態では、実のところチャンバーが、単一の開口型チャンバーというよりはむしろ、流体が電極を流れ渡ることを可能とする複数のチャネル１４’である。これにより、流体のフローを管理することができる。それからチャネル１４’は、分岐部の逆型を流れ通って最終的には一緒に合流する。注入口端部にある各分岐部は、その内部へと通じるチャネルの高さ、幅、又は円周を小さくし、これにより、大量の検体が注入口３’中に導入されて管理可能なフロー特性で第１の捕捉領域２’を流れ渡ることを可能とする。逆に、出口端部にある各分岐部は、その内部へと通じる個々のチャネルと比較して、高さ及び幅、又は円周を大きくし得る。
標的配列を効率的に誘電泳動で固定化するには、場との調節された相互作用を必要とした。フロー速度の摂動は場に対する標的の応答を変え得るので、フロー速度は慎重に制御されなければならない。高いスループット量を維持しながらも一貫性があり且つ制御されたフロー速度を確実にするために、速度変化及び起こり得る気泡形成の影響を低減するような細い平行チャンバーが必要である。より大きなチャネル内部では、中央領域でのフロー速度が著しく速いので、デバイス全体にわたり捕捉を最適化することができない。複数のより小さなチャネルにわたってフローを均等に分割する分岐部を使用することにより、最適化されたＤＥＰ捕捉に対するフロー速度をより良好に制御することができる。
図４に示された実施形態では、平行チャネルの構想が更に発展して、比較的小さな負荷（footprint）で検体の比較的速いフロースルーを可能とする。この実施形態では、基板はガラスであり、共に挟まれてスライド又はカセットデバイス１”を形成する複数の層がある。基板を複数の層として設けることにより、チャネルを異なる深さで層内に形成することができ、これは、より容易に製造できるように基板を設計する際に特に有用であり得る。チャネルによっては、少なくとも部分的に２層以上に作製することができる。このことは図４で見ることができ、図４では、注入口３”からのフローがブロック白色で示されていて、上層に作製されており、それから、第１の分岐部（図４では、第１の分岐部はまさに流体が流れることを可能とし、図中に示される実線は単に異なる層への変化を表示するものと理解されるべきである）で下層のチャネル内へと注ぎ込まれる（図４に平行線で表示されている）。注入口３”は、チャネルを２つのチャネルに分割する分岐部１３”を有し、それから複数のチャネル１４”となる更なる分岐部を有するように再び構成される。注入口３”のすぐ下流にあるチャネルは、基板の複数の層中に（又は、基板の層中を深さＸまで）延びる比較的深いチャネルである。しかしながら、最初の分岐部以降は、更なるチャネル分岐部はチャネルがより小さくなる結果となり、これらの小さなチャネルは、より少ない数の基板層内に（又は、基板の異なる層中を深さ＞Ｘまで）、典型的には基板の中間層に形成される。
この実施形態では、チャネルの位置決めは、最初は全てが平行には走っていないが、注入口３”の下流にある小さな円周の平行チャネル１４”の複数のグループへと通じるようになされる。再び、複数の平行チャネル１４”はそれぞれその中の電極を流れ渡る。フローは、ここに示される通り、複数の第１の捕捉領域２”中を流れることができるようにチャネルを構成することで方向付けることができる。加えて、デバイス１”は、チャネルの深さを容易に構成できるように多層化され得る。多層チャネルの構成により、分岐ゾーンへと通じる異なるチャネル深さが可能となる。それはまた、チャネルが異なる平面内を走ることができるため、より小さな負荷も可能とする。このように、主要な捕捉チャネル内部において、圧力が一貫して低減され、最小化される。
デバイスはまた、第１の捕捉領域２”（又はチャンバー２”）の下流で第１の捕捉領域２”（又はチャンバー２”）と流体連通する第２の領域６”も含む。第１の領域２”と第２の領域６”との間に設けられた廃棄物出口が存在していてもよく、該廃棄物出口は、例えばオープンといった第１の位置にバルブがあるときはフローが廃棄物出口１２”を通って廃棄物チャンバー又は領域へと方向づけられ、例えばクローズといった第２の位置にバルブがあるときはフローが廃棄物出口を経由して出ていかずに、代わりに第２の領域へと方向づけられるようにバルブを備えることができる。
流体（少量の濃縮検体である）が第２のチャンバー注入口を通って第２のチャンバー６”内へと流れることのできる第２のチャンバー注入口が存在していてもよいし、又は、単に第２の領域が下流に位置して流体フローチャネル内にあってもよい。流体が第２のチャンバー出口を通って第２の領域６”から出ていくことのできる第２のチャンバー出口８”が存在していてもよい。第２の領域が、デバイスの使用中に、濃縮検体が電極上を流れるように又は電極と接触するように構成された複数の電極５ａ”を含む。電極５ａは適切に調節され、当業者には理解されるであろうように、電極が活性化された際にＤＥＰを用いて標的細胞をトラップする。
使用中には、検体が、第１の流量で、第１の捕捉領域２”内に導入される。流量はポンプ（図示されず）により調整される。電極５”は活性化され、それにより、検体中の標的細胞（例えば、結核菌細胞又はスメグマ菌細胞）が、電極５”表面の少なくとも一部でＤＥＰ力によりトラップされる。検体は、標的細胞が捕捉され続けるようにチャンバー２”中を流れ続ける一方で、標的細胞が除去されたところからの残りの検体溶出物は、廃棄物出口１２”を経由して廃棄物貯留槽又はその他の領域に進む。予め決められた時間でもよい、ある時間後に、電極５”が非活性化され、トラップされた標的細胞が電極”表面から放出される。この結果、第１の捕捉領域２”内の媒体は標的細胞で濃縮される（もちろん、この標的細胞が実際に元の検体中に存在していたとして）。これは、本明細書において濃縮検体と呼ばれる。
濃縮検体は廃棄物チャンバーへ流れない代わりに、その後チャネル、この例ではマイクロ流体チャネル中を通って第２のチャンバー又は領域６”内へと流れる。第２のチャンバー６”中のフローは、第１の捕捉領域２”中の検体の流量よりも低い第２の流量で行われる。
上述の好適な実施形態は、標的細胞を捕捉して濃縮するための電極及び誘電泳動を使用する方法及びデバイスについて説明しているが、それらが選択的であり且つ必要に応じて任意の捕捉された粒子を放出することができる、即ち、細胞又は粒子の結合又は捕捉が可逆的であるのであれば、典型的には細胞である標的粒子を捕捉するための代替手段を用いることができると想定され得る。放出には、電気的変化というよりはむしろ、例えば、光又は化学的変化を使用することができる。
一実施形態からの特徴は、そうすることが技術的に実施不可能である場合を除き、他の実施形態に適宜組み込まれ得ることが認識されるであろう。
本明細書における実質的にいかなる複数及び／又は単数の用語の使用に関しては、当業者であれば、文脈及び／又は用途に適したように、複数から単数に及び／又は単数から複数に翻訳できる。明瞭化のために、本明細書において様々な単数／複数の置き換えを明確に定め得る。
一般的に、本明細書、特に添付の特許請求の範囲で使用されている用語は、一般に「オープンな」用語として意図されているということが当業者によって理解されるであろう（例えば、用語「含む（including）」は「制限されることなく含む」として解釈されるべきであり、用語「有する（having）」は「少なくとも有する」として解釈されるべきであり、用語「含む（includes）」は「制限されることなく含む」として解釈されるべきであり、等である）。更に、導入された請求項の記載の具体的な数字が意図される場合、そのような意図は請求項において明示的に記載され、そのような記載が無い場合はそのような意図が存在しないということが当業者によって理解されるであろう。例えば、理解の助けのために、以下に添付された特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために導入句「少なくとも一つの（at least one）」及び「一つ以上の（one or more）」の使用を含むかも知れない。しかしながら、このような句の使用は、不定冠詞「a」又は「an」による請求項の記載の導入が、このように導入された請求項の記載を含むいかなる特定の請求項も、たった一つのこのような記載を含む実施形態に限定することを示すものと解釈されるべきではない。これは、たとえ同様の請求項が「一つ以上の」又は「少なくとも一つの」の導入句及び「a」又は「an」などの不定冠詞を含む場合であっても然りであり（例えば、「a」及び／又は「an」は「少なくとも一つの」又は「一つ以上の」を意味するものと解釈されるべきである）；請求項の記載を導入するのに使用されている定冠詞の使用にも同様のことが通用する。加えて、たとえ導入された請求項の記載の具体的な数字が明示的に記載される場合であっても、当業者であれば、このような記載が少なくともその記載された数字を意味すると解釈されるべきであると認めるであろう（例えば、他の修飾語句が無く「２つの記載」とだけある記載は、少なくとも２つの記載又は２つ以上の記載を意味する）。
本開示の様々な実施形態が例証のために本明細書において説明されてきたこと、そして本開示の範囲及び精神から逸脱することなく様々な変更がなされ得ることが認識されるであろう。それに応じて、以下の特許請求の範囲によって示されている真の範囲及び精神をもって、本明細書で開示された様々な実施形態は限定する意図ではない。
本発明は、誘電泳動（ＤＥＰ）を用いて標的細胞を濃縮する方法及びそのためのデバイスに関する。とりわけ、この方法により、検体内に標的細胞が低い濃度で存在する場合であっても標的細胞を迅速に捕捉できるよう、マイクロ流体デバイス中の検体の比較的高いスループット（好ましくは、１００ｍｌまで、又は１０ｍｌまで、又は１ｍｌまでの検体量を用いて）が可能となる。この方法は、検体が流れ通る複数の領域又はチャンバーを利用するものであり、ここで、該領域又はチャンバーは、第１の捕捉領域が第２のチャンバーよりも大きな領域及び速い流量を有し、該第２のチャンバーは該第１の捕捉領域の下流に位置されると共に、該第１の捕捉領域で捕捉された物質を更に濃縮するためにより小さく、より遅い流量を有するよう構成される。
病原体の早期検出は、多くのケースにおいて効果的でタイムリーな治療へのカギである。例えば、結核（ＴＢ）は、ほとんどのケースが治癒可能であるにもかかわらず、年間２００万人の死をもたらしている。入手可能な有効ワクチンが無い中、この病気を排除するためには早期診断及び効果的な治療が重要である。ＴＢ試験を必要としている患者の推定６０％が地域社会に根ざした保健センターにいるものの、多剤耐性結核（ＭＤＲ−ＴＢ）の診断試験は、高価で複雑な実験室設備や、紹介機関又はサテライトラボで見つかるような高度に熟練したスタッフを必要とする。薬剤耐性マーカーのパネルを含め、結果が数週間返ってこないこともあり、その間に感染が地域社会内に広がる可能性がある。
マイクロ流体の優位性は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）診断装置が現実のものにより近づいていることである。しかしながら、提案されているＰＯＣシステムにはかなりのボトルネックがなお存在し、その多くは、病原体濃度の潜在的に低い検体がより濃縮された量の病原性物質を提供するために処理されなければならないという、試験用検体の前処理に関連する。ポイントオブケア診断の提供に真に適した許容可能な時間枠内で比較的大量の検体を処理することには課題もある。
誘電泳動（ＤＥＰ）では、誘電体粒子又は分極性粒子が空間的に不均一な電場にさらされた時に、誘電体粒子又は分極性粒子に力が働いて誘電体粒子又は分極性粒子を動かす。ＤＥＰの動きは、電極表面に向かって（正のＤＥＰ）又は電極表面から遠ざかるように（負のＤＥＰ）誘導することができる。
標的細胞を潜在的に含有する検体のマイクロ流体連続フロー処理において、その標的細胞を濃縮するためにＤＥＰを使用することができる。ＤＥＰ電極は、マイクロ流体チャネル内部の指定領域上の検体流中に漂う標的細胞を選択的にトラップするように調節され、その一方で、不要な細胞及び物質は、フローによってマイクロ流体チャネルを通じて出続ける。これには、流体力学的な力に対抗して細胞をトラップし続けるのに十分強い、標的に特異的なＤＥＰ力を必要とする。標的細胞は電極表面で捕捉でき、その後電場をオフにすることで放出できるので、ＤＥＰの作業は、トラップに基づく細胞の分離及び濃縮に効果的である。
このようなアプローチは有用であり得る一方、処理速度が原因で、現状は臨床の場面において制限されている。とりわけ、検体中に病原体又は標的細胞が非常に低い濃度でしか存在していないかも知れない場合においては、比較的高い検体量がマイクロ流体システム中を流れる必要がある。仮に検体が典型的なＤＥＰマイクロ流体システム中を高すぎる流量で流れる場合、標的細胞を捕捉する効率が低下する−理論によって制限されることを望むこと無く、高い流量は以下の理由のために有害であると考えられる、（ｉ）電極からより遠くにある細胞が受ける力はより小さく、それゆえに流体力学的な力に負け得るため、捕捉を逃れる細胞がある、（ｉｉ）経時的に、先にトラップされた細胞を実際上洗い落としてしまう。従って、ＰＯＣ診断プロセス全体にかなりの時間を加えながら、ＤＥＰの捕捉はゆっくりと行われる必要があるであろう。
フローに制限があるデバイスの例は、Ｓｈａｎｔａｎｕ Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら（２００８年１月１日）、微細加工プラットフォームにおけるＰＣＲ検出、Ｌａｂ Ｏｎ Ａ Ｃｈｉｐ、８巻、１１３０〜１１３６頁で見ることができる。
Ｓｈａｎｔａｎｕ Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら（２００８年１月１日）、微細加工プラットフォームにおけるＰＣＲ検出、Ｌａｂ Ｏｎ Ａ Ｃｈｉｐ、８巻、１１３０〜１１３６頁
本発明は、従来技術に関連した一つ以上の欠点を除去又は軽減することを目的とする。
本発明の第一の態様に従い、
マイクロ流体デバイスを設ける工程と；
ここで、前記デバイスは、少なくとも一つの第１の捕捉領域と；前記第１の捕捉領域の下流で前記第１の捕捉領域と流体連通する第２の領域と；を含み、
前記第１の捕捉領域は、標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための、活性化された際に電極表面で標的粒子をトラップする複数の電極と、少なくとも一つの注入口とを含み、前記複数の電極は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記複数の電極の上を流れるように構成され、前記少なくとも一つの注入口は、各チャネルが前記少なくとも一つの注入口よりも小さい円周である複数のチャネルに分かれ；
前記第２の領域は、前記第１の捕捉領域よりも容量が小さく、活性化された際に電極表面で標的粒子をトラップする第２の複数の電極（５ａ，５ａ’，５ａ”）を含み、前記第２の領域中を流れる検体が前記第２の複数の電極の上を流れるように構成される；
検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的粒子をトラップできる前記第１の複数の電極を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流す工程と；
トラップされた標的粒子を前記第１の複数の電極から放出して、濃縮検体をもたらす工程と；
前記濃縮検体を前記第２の領域に導入して、前記濃縮検体を、標的粒子をトラップするように構成された前記第２の複数の電極を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２の領域中に流す工程と；
更なる処理工程を実行する工程と；
を含む、検体中の標的粒子を濃縮する方法が提供される。
好ましくは、前記標的粒子は標的細胞である。
好ましくは、標的細胞を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記手段は、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極である。
好ましくは、標的細胞を捕捉する前記第２の手段は、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極である。
驚くべきことに、発明者らは、ＤＥＰ電極を有するチャンバーなどの第１の大きな領域中に比較的高い流量で検体を流すことにより、初期の迅速な捕捉が可能となることを見出し、捕捉された細胞はその後放出されることができ、更にその後、結果物としての濃縮フローを第１の捕捉領域内でよりも低い流量で第２の小さなチャンバー中に流せることを見出した。これにより、（特に、ＤＥＰ電極を有するチャネル中に単に流す方法と比較して）標的細胞を効率的且つ迅速に濃縮することができる。とりわけ、これにより、存在する標的の量が多いか少ないかに関係なく、比較的大量の検体を時間的に有効な仕方で処理することが可能となる。実際上、このシステムにより、検体は、第２の領域でよりも高い平均速度で第１の領域を流れ渡ることができる。
好ましくは、検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的細胞をトラップできる標的細胞を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段を用いて、前記領域にわたり第１の体積流量で、前記第１の捕捉領域中に流す前記工程は、検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的細胞をトラップするように活性化された前記電極を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流すことを含む。電極は、標的細胞を選択的にトラップするためにＤＥＰを利用するように構成される。
好ましくは、トラップされた標的細胞を、標的細胞を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段から放出して、濃縮検体をもたらす前記工程は、トラップされた標的細胞を放出して濃縮検体をもたらす時間後に、前記第１の捕捉領域内の前記電極を非活性化することを含む。
好ましくは、前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的細胞をトラップできる標的細胞を捕捉する前記第２の手段を用いて、前記第２の領域にわたり前記第１の流量よりも低い第２の体積流量で、前記第２のチャンバー中に流す前記工程は、前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的細胞をトラップするように活性化された前記電極を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２のチャンバー中に流すことを含む。電極は、標的細胞を選択的にトラップするためにＤＥＰを利用するように構成される。
好ましくは、前記少なくとも一つの第１の捕捉領域は、少なくとも一つの注入口及び少なくとも一つの出口を含む。
好ましくは、前記第２の領域は、少なくとも一つの注入口及び少なくとも一つの出口を含む。しかしながら、この注入口及び（an）出口はチャネル内の領域から単に形成されていてもよい。
このような細胞が元の検体に存在する場合にのみ、即ち、検体が病原体を含有するならば、濃縮検体又は更に濃縮された濃縮検体への言及が標的細胞を含むものであると理解されるであろう。
任意的に、第１の捕捉領域はチャンバーである。
任意的に、第２の領域はチャンバーである。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口は、各チャネルが前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口よりも小さい円周である複数のチャネルに分かれる。
好ましくは、前記複数のチャネルは複数の平行チャネルである。
有利なことに、第１の捕捉領域を、複数の、好ましくは平行の、より小さな円周のチャネルに分けることにより、より少量という特徴をもって比較的大量の検体を流すことができる。第１の捕捉領域は今や実際上複数のチャネルを有する捕捉領域であるので、フローの中心が端よりも典型的に速いという層流特性にしばしば関連した課題が減る。とりわけ、チャネルの端でのフローに関連した課題が軽減され、電極間の電圧降下を伴う問題が少なくなる。
好ましくは、前記複数のチャネルは前記少なくとも一つの第１の捕捉領域の出口で合流する。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口は、複数のチャネルに分かれる少なくとも一つの分岐部を備える。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの出口は、単一のチャネルに合流する少なくとも一つの分岐部を備える。
有利なことに、注入口のチャネルを分ける又は出口のチャネルを合流させる分岐部を使用することで、圧力を上昇又は降下させるための再現可能且つ扱いやすい方途が得られる。
任意的に、前記マイクロ流体デバイスは複数の分離可能部を含んでいてもよい。
任意的に、前記第１の捕捉領域内の前記電極を非活性化する前に、前記第１の捕捉領域内に新たな緩衝剤又は媒体を流す。この新たな緩衝剤は水でもよい。その後電極を非活性化する際に、標的細胞が新たな緩衝剤内に放出され、標的細胞の濃度がより高まった濃縮検体が得られる。
好ましくは、前記検体は低塩又は低イオン強度である。
任意的に、更なる処理工程は、トラップされた標的細胞を放出して更に濃縮された濃縮検体をもたらす時間後に、前記第２のチャンバー内の前記電極を非活性化することを含んでもよい。任意的に、前記第２のチャンバー内の前記電極を非活性化する前に、前記第１の捕捉領域内に新たな緩衝剤又は媒体を流す。この新たな緩衝剤は水でもよい。その後電極を非活性化する際に、標的細胞が新たな緩衝剤内に放出され、標的細胞の濃度がより高まった更に濃縮された濃縮検体が得られる。
任意的に、更なる処理工程は細胞をin situで溶解することを含んでもよく、任意的に核酸抽出及び／又は核酸増幅を実行する。
任意的に、前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバー内に、前記標的細胞に対する抗体を導入してもよい。このような抗体としてはフルオロフォアを挙げ得る。
任意的に、前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバー内に、前記標的細胞に特異的な生物学的染色を導入してもよい。
任意的に、光検出デバイスが設けられる。
好ましくは、前記光検出デバイスは前記第２のチャンバーからの信号を検出するように構成される。好ましくは、前記光検出デバイスは蛍光を検出でき、好ましくは蛍光を区別又は分析できる。任意的に、前記光検出デバイスは励起源及び検出器を含む。
任意的に、前記デバイスはフロー調整部を備える。任意的に、このフロー調整部はポンプである。当業者には容易に理解されるであろうように、いくつかの方途でフローを調整できる。マイクロ流体チャネル及びチャンバーの外形及びサイズを変更することにより、並びに／或いは、ポンプなどの追加手段を用いることにより、フローの変更を達成できる。
好ましくは、前記第１の捕捉領域内の前記電極が活性化している際に、前記検体が前記捕捉領域から廃棄物貯留槽に流れ出る。好ましくは、前記第１の捕捉領域内の前記電極が非活性化している際に、前記検体が前記第１の捕捉領域から前記第２のチャンバーに流れ出る。
好ましくは、前記第２のチャンバー内の前記電極が活性化している際に、前記検体が前記第２のチャンバーから廃棄物貯留槽に流れ出る。
本発明の第二の態様によれば、
第１の捕捉領域と；前記第１の捕捉領域の下流で前記第１の捕捉領域と流体連通する第２の領域と；制御モジュールと；フロー制御手段と；を含み、
前記第１の捕捉領域は、標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする第１の複数の電極と、少なくとも一つの注入口とを含み、前記第１の複数の電極は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記第１の複数の電極の上を流れるように構成され、前記注入口は、各チャネルが前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口よりも小さい円周である複数のチャネルに分かれ；
前記第２の領域は、前記第１の捕捉領域よりも容量が小さく、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップして標的粒子を捕捉する第２の複数の電極を含み、前記第２の領域中を流れる検体が前記第２の複数の電極の上を流れるように構成され；
前記制御モジュールは、前記電極の前記活性化及び非活性化を制御し；
前記フロー制御手段は、前記第２のチャンバー中の流量を前記第１の捕捉領域中の流量よりも低くすることができる；
検体中の標的細胞などの標的粒子を濃縮するためのマイクロ流体デバイスが提供される。
好ましくは、前記複数のチャネルが複数の平行チャネルである。
好ましくは、前記複数のチャネルが前記少なくとも一つの第１の捕捉領域の前記出口で合流する。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口が、複数のチャネルに分かれる少なくとも一つの分岐部を備える。
好ましくは、前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの出口が、単一のチャネルに合流する少なくとも一つの分岐部を備える。
任意的に、前記マイクロ流体デバイスは複数の分離可能部を含んでいてもよい。
任意的に、前記デバイスは、前記第１の捕捉領域と流体連通する新たな緩衝剤又は媒体の貯留槽を含む。任意的に、前記新たな緩衝剤又は媒体の貯留槽は前記第２のチャンバーと流体連通する。或いは、第２の新たな緩衝剤又は媒体の貯留槽が前記第２のチャンバーと流体連通する。任意的に、前記新たな緩衝剤又は媒体は水である。前記デバイスは、前記電極が非活性化された際に、前記第１の捕捉領域及び／又は第２のチャンバー内に、新たな緩衝剤又は媒体のフローを導入する制御モジュールを更に含んでいてもよい。
任意的に、前記デバイスは、前記標的細胞に対する抗体の貯留槽を含む。任意的に、前記抗体の貯留槽は流体連通している。
任意的に、前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバー内に、前記標的細胞に特異的な生物学的染色を導入してもよい。
任意的に、光検出デバイスが設けられる。
好ましくは、前記光検出デバイスは前記第２のチャンバーからの信号を検出するように構成される。好ましくは、前記光検出デバイスは蛍光を検出でき、好ましくは蛍光を区別又は分析できる。任意的に、前記光検出デバイスは励起源及び検出器を含む。
任意的に、前記デバイスは前処理モジュールを含む。これには、前記検体を前処理するための、前記第１の捕捉領域と流体連通する追加的なチャンバーが挙げられ得る。これは、前記検体の粘性、塩分含有量等を変えることを含み得る。
任意的に、前記デバイスはフロー調整部を備える。任意的に、このフロー調整部はポンプである。
好ましくは、前記デバイスは廃棄物貯留槽を備える。任意的に、前記廃棄物貯留槽は前記第１の捕捉領域と流体連通している。好ましくは、前記廃棄物貯留槽は前記第２のチャンバーと流体連通している。
本発明の第一の態様の好適な別形は、
マイクロ流体デバイスを設ける工程と；
ここで、前記デバイスは、第１の捕捉領域と；前記第１の捕捉領域の下流で前記第１の捕捉領域と流体連通する第２の捕捉領域と；を含み、
前記第１の捕捉領域は、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極を含み、前記電極は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記電極（them）の上を流れるように構成され；
前記第２の捕捉領域は、前記第１の捕捉領域よりも容量が小さく、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極を含み、前記電極は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記電極（them）の上を流れるように構成される；
検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的細胞をトラップできるように活性化された前記電極を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流す工程と；
トラップされた標的細胞を放出して濃縮検体をもたらす時間後に、前記第１の捕捉領域内の前記電極を非活性化する工程と；
前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的細胞をトラップできるように活性化された前記電極を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２の捕捉領域中に流す工程と；
を含む、標的細胞を濃縮する方法である。
本発明のより良い理解のために、単なる例として、そして以下の図を参照して、実施形態について説明する。
図１は、本発明の実施形態に従ったマイクロ流体デバイス又はその一部の実施形態を示す。 図２は、本発明に従ったマイクロ流体デバイス又はその一部の他の実施形態を示す。 図３ａは、本発明に従ったデバイスの別の実施形態を示し、図３ｂは、本発明に従った、分岐したチャネルを含む該デバイス内の第１の捕捉領域の拡大図を示す。 図４は、実のところ複数の第１の捕捉領域があるような設計の分岐したチャネルを有する、第１の捕捉領域の更なる別形を有する該デバイスの他の実施形態を示す。
マイクロ流体デバイス１（又はその一部）は一般に図１に描かれている。デバイスは、流体が第１の注入口を通って第１の捕捉領域２内へと流れることのできる第１の注入口３と、流体が第１の出口を通って第１の捕捉領域２から離れることのできる第１の出口４とを有する、チャンバーの形態の第１の捕捉領域２を含む。第１の捕捉領域は、デバイスの使用中に、検体が複数の電極（them）の上を流れるように、又は検体が複数の電極（them）と接触するように構成された複数の電極５を含む。電極５は、当業者によって理解されるであろうように適切に調節され、電極が活性化された際にＤＥＰを用いて標的細胞をトラップする。例えば、ある場合では、電極は、スメグマ菌に対して１０ＭＨｚ、５Ｖを使用することができるが、実際には、流量及び電極の形状次第で、周波数及び電圧の全範囲にわたって作用可能である。
デバイスはまた、第１の捕捉領域２の下流にあると共に第１の捕捉領域２と流体連通している第２のチャンバー６も含む。流体が第２のチャンバー注入口を通って第２のチャンバー６内へと流れることのできる第２のチャンバー注入口７と、流体が第２のチャンバー出口を通って第２のチャンバー６から離れることのできる第２のチャンバー出口８とがある。第２のチャンバーは、デバイスの使用中に、検体が複数の電極（them）の上を流れるように、又は検体が複数の電極（them）と接触するように構成された複数の電極５ａを含む。電極５ａは、当業者によって理解されるであろうように適切に調節され、電極が活性化された際にＤＥＰを用いて標的細胞をトラップする。
使用中は、検体が、第１の流量で第１の捕捉領域２内に導入される。流量はポンプ（図示されず）によって調整される。電極５が活性化されることにより、検体中の標的細胞（例えば、結核菌細胞又はスメグマ菌細胞）が、ＤＥＰ力によって、電極５の表面の少なくとも一部でトラップされる。検体は、標的細胞が捕捉され続けるようにチャンバー中を流れ続ける一方で、標的細胞が除去されたところからの残りの検体溶出物は、廃棄物貯留槽９又はその他の領域に進む。予め決められた時間でもよい、ある時間後に、電極５が非活性化され、トラップされた標的細胞が電極表面から放出される。この結果、第１の捕捉領域２内を通る媒体は標的細胞で濃縮される（もちろん、この標的細胞が実際に元の検体中に存在していたとして）。これは、本明細書において濃縮検体と呼ばれる。
濃縮検体はその後、チャネル、この例ではマイクロ流体チャネル中を通って第２のチャンバー６内へと流れる。第２のチャンバー６中のフローは、第１の捕捉領域２中の検体の流量よりも低い第２の流量で行われる。第２のチャンバー６内の電極５ａが活性化されることにより、検体中の標的細胞（例えば、結核菌細胞又はスメグマ菌細胞）が、この場合もまた、ＤＥＰ力によって、電極５ａの表面の少なくとも一部でトラップされる。濃縮検体は既により濃縮された量の標的細胞を含有しているであろうから、標的細胞の捕捉又はトラップは非常に有効である。
廃棄物瓶の形状でデバイスの外部にあり得る廃棄物貯留槽９も設けられる。第１の捕捉領域２及び第２のチャンバー６は、どちらも廃棄物貯留槽９と流体連通しており、これにより、細胞が取り除かれたところ又は不要物が流れ通るところからの検体を除去することができる。しかしながら、当業者であれば、この構造は本発明にとって本質的なものではないことを認識するであろう。
当業者であれば、検体が第１の捕捉領域内に導入される前に、様々な前処理工程及び前処理モジュールが含まれ得ることを理解するであろう。
当業者であれば、また、第２のチャンバー内の濃縮検体から標的細胞がトラップ又は捕捉された後に、様々な後処理工程及び後処理モジュールが含まれ得ることも理解するであろう。例えば、細胞はin situで溶解され得、その後核酸が抽出、濃縮又は増幅される。また、第２のチャンバー内の電極は非活性化され得、標的細胞が放出されて更に濃縮された検体が得られる。
当業者であれば、第１の捕捉領域及び第２のチャンバーが説明されている一方で、追加的な濃縮チャンバーも含まれ得ることを理解するであろう。第１及び第２のチャンバーが流体連通している一方で、他のモジュール、貯留槽及びマイクロ流体機構がこれらのチャンバーの間に含まれ得る。
図２に最も良く示されるように、目的の細胞と結合するように選択され、フルオロフォア又は他のマーカーを備えるか、フルオロフォア又は他のマーカーと関連づけられる抗体の、抗体貯留槽１０が含まれ得る。当業者であれば、抗体貯留槽１０は、後の処理中に標的細胞を同定できるようにするであろう生物学的染料、染色又は他の製品と置き換え可能であると認識するであろう。必要に応じて抗体を第１の捕捉領域２’又は第２のチャンバー６’内に導入するために、バルブシステム１１を使用することができる。
第２のチャンバー６’は、開口型頂部又は視覚的に透明な上面を備えている。これは、使用中に、第２のチャンバー６’が第２のチャンバーからの信号を検出するように構成された光検出デバイス（図示されず）と関連付けることができるか、又は光検出デバイスを用いて観察することができるように、そうなっている。好ましくは、この光検出デバイスは蛍光を検出することができ、好ましくは蛍光を区別又は分析することができる。この場合、光検出デバイスは励起源及び検出器を含むであろう。
更なる、そして多くの場合において好適な実施形態を図３及び４に示す。
これらの各実施形態では、第２の捕捉領域６’、６”から上流に位置する第１の捕捉領域２’、２”を有するカセットデバイス１’、１”が設けられる。カセットはガラス基板上に形成される（他の材料もまた使用可能であると認識されるであろうが）。
図３ａでは、第１の捕捉領域が、デバイスの使用中に、検体が電極上を流れるように又は電極と接触するように構成された複数の電極５’を含む（拡大図３ｂに、より明確に示される通り）。電極５’は適切に調節され、当業者には理解されるであろうように、電極が活性化された際にＤＥＰを用いて標的細胞をトラップする。例えば、ある場合では、電極は、スメグマ菌に対して１０ＭＨｚ、５Ｖを使用することができるが、実際には、流量及び電極の形状次第で、周波数及び電圧の全範囲にわたって作用可能である。
第１の注入口３’は第１の捕捉領域内へと通じている。図３に示される実施形態では、注入口３’から流れるチャネルは分岐部１３’を備えており、それから、分岐された各チャネルは、最初のチャネルよりも小さな円周の複数の平行チャネル１４”へと注入口が実際上通じるように、更なる分岐部を備えている。分岐部の数は、必要な流体のフローに応じて選択することができる。複数の平行チャネル１４’はそれぞれ、その中のチャンバー及び電極５’を流れ渡る。実際上、この実施形態では、実のところチャンバーが、単一の開口型チャンバーというよりはむしろ、流体が電極を流れ渡ることを可能とする複数のチャネル１４’である。これにより、流体のフローを管理することができる。それからチャネル１４’は、分岐部の逆型を流れ通って最終的には一緒に合流する。注入口端部にある各分岐部は、その内部へと通じるチャネルの高さ、幅、又は円周を小さくし、これにより、大量の検体が注入口３’中に導入されて管理可能なフロー特性で第１の捕捉領域２’を流れ渡ることを可能とする。逆に、出口端部にある各分岐部は、その内部へと通じる個々のチャネルと比較して、高さ及び幅、又は円周を大きくし得る。
標的配列を効率的に誘電泳動で固定化するには、場との調節された相互作用を必要とした。フロー速度の摂動は場に対する標的の応答を変え得るので、フロー速度は慎重に制御されなければならない。高いスループット量を維持しながらも一貫性があり且つ制御されたフロー速度を確実にするために、速度変化及び起こり得る気泡形成の影響を低減するような細い平行チャンバーが必要である。より大きなチャネル内部では、中央領域でのフロー速度が著しく速いので、デバイス全体にわたり捕捉を最適化することができない。複数のより小さなチャネルにわたってフローを均等に分割する分岐部を使用することにより、最適化されたＤＥＰ捕捉に対するフロー速度をより良好に制御することができる。
図４に示された実施形態では、平行チャネルの構想が更に発展して、比較的小さな負荷（footprint）で検体の比較的速いフロースルーを可能とする。この実施形態では、基板はガラスであり、共に挟まれてスライド又はカセットデバイス１”を形成する複数の層がある。基板を複数の層として設けることにより、チャネルを異なる深さで層内に形成することができ、これは、より容易に製造できるように基板を設計する際に特に有用であり得る。チャネルによっては、少なくとも部分的に２層以上に作製することができる。このことは図４で見ることができ、図４では、注入口３”からのフローがブロック白色で示されていて、上層に作製されており、それから、第１の分岐部（図４では、第１の分岐部はまさに流体が流れることを可能とし、図中に示される実線は単に異なる層への変化を表示するものと理解されるべきである）で下層のチャネル内へと注ぎ込まれる（図４に平行線で表示されている）。注入口３”は、チャネルを２つのチャネルに分割する分岐部１３”を有し、それから複数のチャネル１４”となる更なる分岐部を有するように再び構成される。注入口３”のすぐ下流にあるチャネルは、基板の複数の層中に（又は、基板の層中を深さＸまで）延びる比較的深いチャネルである。しかしながら、最初の分岐部以降は、更なるチャネル分岐部はチャネルがより小さくなる結果となり、これらの小さなチャネルは、より少ない数の基板層内に（又は、基板の異なる層中を深さ＞Ｘまで）、典型的には基板の中間層に形成される。
この実施形態では、チャネルの位置決めは、最初は全てが平行には走っていないが、注入口３”の下流にある小さな円周の平行チャネル１４”の複数のグループへと通じるようになされる。再び、複数の平行チャネル１４”はそれぞれその中の電極を流れ渡る。フローは、ここに示される通り、複数の第１の捕捉領域２”中を流れることができるようにチャネルを構成することで方向付けることができる。加えて、デバイス１”は、チャネルの深さを容易に構成できるように多層化され得る。多層チャネルの構成により、分岐ゾーンへと通じる異なるチャネル深さが可能となる。それはまた、チャネルが異なる平面内を走ることができるため、より小さな負荷も可能とする。このように、主要な捕捉チャネル内部において、圧力が一貫して低減され、最小化される。
デバイスはまた、第１の捕捉領域２”（又はチャンバー２”）の下流で第１の捕捉領域２”（又はチャンバー２”）と流体連通する第２の領域６”も含む。第１の領域２”と第２の領域６”との間に設けられた廃棄物出口が存在していてもよく、該廃棄物出口は、例えばオープンといった第１の位置にバルブがあるときはフローが廃棄物出口１２”を通って廃棄物チャンバー又は領域へと方向づけられ、例えばクローズといった第２の位置にバルブがあるときはフローが廃棄物出口を経由して出ていかずに、代わりに第２の領域へと方向づけられるようにバルブを備えることができる。
流体（少量の濃縮検体である）が第２のチャンバー注入口を通って第２のチャンバー６”内へと流れることのできる第２のチャンバー注入口が存在していてもよいし、又は、単に第２の領域が下流に位置して流体フローチャネル内にあってもよい。流体が第２のチャンバー出口を通って第２の領域６”から出ていくことのできる第２のチャンバー出口８”が存在していてもよい。第２の領域が、デバイスの使用中に、濃縮検体が電極上を流れるように又は電極と接触するように構成された複数の電極５ａ”を含む。電極５ａは適切に調節され、当業者には理解されるであろうように、電極が活性化された際にＤＥＰを用いて標的細胞をトラップする。
使用中には、検体が、第１の流量で、第１の捕捉領域２”内に導入される。流量はポンプ（図示されず）により調整される。電極５”は活性化され、それにより、検体中の標的細胞（例えば、結核菌細胞又はスメグマ菌細胞）が、電極５”表面の少なくとも一部でＤＥＰ力によりトラップされる。検体は、標的細胞が捕捉され続けるようにチャンバー２”中を流れ続ける一方で、標的細胞が除去されたところからの残りの検体溶出物は、廃棄物出口１２”を経由して廃棄物貯留槽又はその他の領域に進む。予め決められた時間でもよい、ある時間後に、電極５”が非活性化され、トラップされた標的細胞が電極”表面から放出される。この結果、第１の捕捉領域２”内の媒体は標的細胞で濃縮される（もちろん、この標的細胞が実際に元の検体中に存在していたとして）。これは、本明細書において濃縮検体と呼ばれる。
濃縮検体は廃棄物チャンバーへ流れない代わりに、その後チャネル、この例ではマイクロ流体チャネル中を通って第２のチャンバー又は領域６”内へと流れる。第２のチャンバー６”中のフローは、第１の捕捉領域２”中の検体の流量よりも低い第２の流量で行われる。
上述の好適な実施形態は、標的細胞を捕捉して濃縮するための電極及び誘電泳動を使用する方法及びデバイスについて説明しているが、それらが選択的であり且つ必要に応じて任意の捕捉された粒子を放出することができる、即ち、細胞又は粒子の結合又は捕捉が可逆的であるのであれば、典型的には細胞である標的粒子を捕捉するための代替手段を用いることができると想定され得る。放出には、電気的変化というよりはむしろ、例えば、光又は化学的変化を使用することができる。
一実施形態からの特徴は、そうすることが技術的に実施不可能である場合を除き、他の実施形態に適宜組み込まれ得ることが認識されるであろう。
本明細書における実質的にいかなる複数及び／又は単数の用語の使用に関しては、当業者であれば、文脈及び／又は用途に適したように、複数から単数に及び／又は単数から複数に翻訳できる。明瞭化のために、本明細書において様々な単数／複数の置き換えを明確に定め得る。
一般的に、本明細書、特に添付の特許請求の範囲で使用されている用語は、一般に「オープンな」用語として意図されているということが当業者によって理解されるであろう（例えば、用語「含む（including）」は「制限されることなく含む」として解釈されるべきであり、用語「有する（having）」は「少なくとも有する」として解釈されるべきであり、用語「含む（includes）」は「制限されることなく含む」として解釈されるべきであり、等である）。更に、導入された請求項の記載の具体的な数字が意図される場合、そのような意図は請求項において明示的に記載され、そのような記載が無い場合はそのような意図が存在しないということが当業者によって理解されるであろう。例えば、理解の助けのために、以下に添付された特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために導入句「少なくとも一つの（at least one）」及び「一つ以上の（one or more）」の使用を含むかも知れない。しかしながら、このような句の使用は、不定冠詞「a」又は「an」による請求項の記載の導入が、このように導入された請求項の記載を含むいかなる特定の請求項も、たった一つのこのような記載を含む実施形態に限定することを示すものと解釈されるべきではない。これは、たとえ同様の請求項が「一つ以上の」又は「少なくとも一つの」の導入句及び「a」又は「an」などの不定冠詞を含む場合であっても然りであり（例えば、「a」及び／又は「an」は「少なくとも一つの」又は「一つ以上の」を意味するものと解釈されるべきである）；請求項の記載を導入するのに使用されている定冠詞の使用にも同様のことが通用する。加えて、たとえ導入された請求項の記載の具体的な数字が明示的に記載される場合であっても、当業者であれば、このような記載が少なくともその記載された数字を意味すると解釈されるべきであると認めるであろう（例えば、他の修飾語句が無く「２つの記載」とだけある記載は、少なくとも２つの記載又は２つ以上の記載を意味する）。
本開示の様々な実施形態が例証のために本明細書において説明されてきたこと、そして本開示の範囲及び精神から逸脱することなく様々な変更がなされ得ることが認識されるであろう。それに応じて、以下の特許請求の範囲によって示されている真の範囲及び精神をもって、本明細書で開示された様々な実施形態は限定する意図ではない。

Claims (43)

  1. 本発明の第一の態様に従い、
    マイクロ流体デバイスを設ける工程と；
    ここで、前記デバイスは、少なくとも一つの第１の捕捉領域と；前記第１の捕捉領域の下流で前記第１の捕捉領域と流体連通する第２の領域と；を含み、
    前記第１の捕捉領域は、標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための第１の手段を含み、前記手段は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記手段の上を流れるように構成され；
    前記第２の領域は、前記第１の捕捉領域よりも容量が小さく、標的粒子を捕捉する第２の手段を含み、前記第２の捕捉領域中を流れる検体が前記第２の手段（them）の上を流れるように構成される；
    検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的粒子をトラップするように構成された標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流す工程と；
    トラップされた標的粒子を標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段から放出して、濃縮検体をもたらす工程と；
    前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的粒子をトラップできる標的粒子を捕捉する前記第２の手段を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２のチャンバー中に流す工程と；
    更なる処理工程を実行する工程と；
    を含む、検体中の標的粒子を濃縮する方法が提供される。
  2. 標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記手段が、活性化された際に電極表面で標的粒子をトラップする複数の電極である、請求項１に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  3. 標的粒子を捕捉する前記第２の手段が、活性化された際に電極表面で標的粒子をトラップする複数の電極である、請求項１又は２に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  4. 検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、前記粒子を捕捉するように構成された標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流す前記工程が、検体を前記第１の捕捉領域内に導入して、前記検体を、任意の標的粒子をトラップするように活性化された前記電極を用いて、第１の流量で、前記第１の捕捉領域中に流すことを含む、請求項２又は３のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  5. トラップされた標的粒子を標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段から放出して、濃縮検体をもたらす前記工程が、トラップされた標的粒子を放出して濃縮検体をもたらす時間後に、前記第１の捕捉領域内の前記電極を非活性化することを含む、請求項４に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  6. 前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的粒子をトラップできる標的細胞を捕捉する前記第２の手段を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２のチャンバー中に流す前記工程が、前記濃縮検体を前記第２のチャンバーに導入して、前記濃縮検体を、標的粒子をトラップするように活性化された前記電極を用いて、前記第１の流量よりも低い第２の流量で、前記第２のチャンバー中に流すことを含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  7. 前記第１の捕捉領域の少なくとも一つの注入口が、各チャネルが前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口よりも小さい円周である複数のチャネルに分かれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  8. 前記複数のチャネルが複数の平行チャネルである、請求項７に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  9. 前記複数のチャネルが前記少なくとも一つのチャンバーの出口で合流する、請求項７又は８のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  10. 前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口が、複数のチャネルに分かれる少なくとも一つの分岐部を備える、請求項７〜９のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  11. 前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの出口が、単一のチャネルに合流する少なくとも一つの分岐部を備える、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  12. 前記マイクロ流体デバイスが複数の分離可能部を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  13. 前記第１の捕捉領域内で前記トラップされた標的粒子を放出する前に、前記第１の捕捉領域内に新たな緩衝剤又は媒体を流す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  14. 前記新たな緩衝剤が水である、請求項１３に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  15. 前記検体が低塩又は低イオン強度である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  16. 更なる処理が、トラップされた標的細胞を放出して更に濃縮された濃縮検体をもたらす時間後に、前記第２のチャンバー内の前記電極を非活性化することを含む、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  17. 前記第２のチャンバー内の前記電極を非活性化する前に、前記第１の捕捉領域内に新たな緩衝剤又は媒体を流す、請求項１６に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  18. 更なる処理工程が、核酸抽出及び／又は核酸増幅を実行することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  19. 前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバー内に、前記標的粒子に対する抗体を導入する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  20. 前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバー内に、前記標的粒子に特異的な生物学的染色を導入する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  21. 光検出デバイスを設け、標的粒子が前記光検出デバイス（the same）を用いて観察される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の標的細胞を濃縮する方法。
  22. 前記光検出デバイスが前記第２のチャンバーからの信号を検出するように構成された、請求項２１に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  23. 前記光検出デバイスが蛍光を検出でき、好ましくは蛍光を区別又は分析できる、請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  24. 前記光検出デバイスが励起源及び検出器を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  25. 前記デバイスが、ポンプでもよいフロー調整部を備える、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の標的粒子を濃縮する方法。
  26. 前記第１の捕捉領域内の前記電極が標的粒子を捕捉している際に、前記検体が前記チャンバーから廃棄物貯留槽に流れ出る、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の標的細胞を濃縮する方法。
  27. 第１の捕捉領域と；前記第１の捕捉領域の下流で前記第１の捕捉領域と流体連通する第２のチャンバーと；制御モジュールと；フロー制御手段と；を含み、
    前記第１の捕捉領域は、標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための第１の手段を含み、前記手段は、前記第１の捕捉領域中を流れる検体が前記手段の上を流れるように構成され；
    前記第２のチャンバーは、前記第１の捕捉領域よりも容量が小さく、標的粒子を捕捉する第２の手段を含み、前記第２の捕捉領域中を流れる検体が前記手段の上を流れるように構成され；
    前記フロー制御手段は、前記第２のチャンバー中の流量を前記第１の捕捉領域中の流量よりも低くすることができる；
    検体中の標的細胞などの標的粒子を濃縮するためのマイクロ流体デバイス。
  28. 標的粒子を選択的且つ放出可能に捕捉するための前記第１の手段が、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極である、請求項２７に記載のマイクロ流体デバイス。
  29. 標的粒子を捕捉する前記第２の手段が、活性化された際に電極表面で標的細胞をトラップする複数の電極である、請求項２７又は２８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  30. 前記制御モジュールが前記電極の前記活性化及び非活性化を制御する、請求項２８又は２９のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  31. 前記第１の捕捉領域の注入口が、各チャネルが前記第１の捕捉領域の前記少なくとも一つの注入口よりも小さい円周である複数のチャネルに分かれる、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  32. 前記複数のチャネルが複数の平行チャネルである、請求項３１に記載のマイクロ流体デバイス。
  33. 前記複数のチャネルが前記第１の捕捉領域の出口で合流する、請求項３１〜３２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  34. 前記第１の捕捉領域の前記注入口が、複数のチャネルに分かれる少なくとも一つの分岐部を備える、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  35. 前記第１の捕捉領域の前記出口が、単一のチャネルに合流する少なくとも一つの分岐部を備える、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  36. 前記デバイスが、前記捕捉領域又はチャンバー内の前記電極が非活性化された際に、前記第１の捕捉領域及び／又は第２のチャンバー内に、新たな緩衝剤又は媒体のフローを導入する制御モジュールを含む、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  37. 光検出デバイスを含む、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  38. 前記光検出デバイスが前記第２のチャンバーからの信号を検出するように構成された、請求項３７に記載のマイクロ流体デバイス。
  39. 前記光検出デバイスが蛍光を検出でき、好ましくは蛍光を区別又は分析できる、請求項３７又は３８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  40. 前記光検出デバイスが励起源及び検出器を含む、請求項３７〜３８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  41. 前記デバイスが前処理モジュールを含む、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  42. 前記デバイスが廃棄物貯留槽を備える、請求項２７〜４１のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  43. 前記廃棄物貯留槽が、前記第１の捕捉領域及び／又は前記第２のチャンバーと流体連通する、請求項４６に記載のマイクロ流体デバイス。
JP2018566214A 2016-06-21 2017-06-20 誘電泳動（ｄｅｐ）を用いた標的細胞濃度の改善 Active JP6641032B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1610830.0 2016-06-21
GBGB1610830.0A GB201610830D0 (en) 2016-06-21 2016-06-21 Improved target cell concentration using dielectrophoresis (DEP)
GBGB1707566.4A GB201707566D0 (en) 2017-05-11 2017-05-11 Improved target cell concentration using dielectrophoresis (DEP)
GB1707566.4 2017-05-11
PCT/EP2017/065019 WO2017220534A1 (en) 2016-06-21 2017-06-20 Improved target cell concentration using dielectrophoresis (dep)

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019236783A Division JP6991192B2 (ja) 2016-06-21 2019-12-26 誘電泳動（ｄｅｐ）を用いた標的細胞濃度の改善

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019525739A true JP2019525739A (ja) 2019-09-12
JP6641032B2 JP6641032B2 (ja) 2020-02-05

Family

ID=59298434

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018566214A Active JP6641032B2 (ja) 2016-06-21 2017-06-20 誘電泳動（ｄｅｐ）を用いた標的細胞濃度の改善
JP2019236783A Active JP6991192B2 (ja) 2016-06-21 2019-12-26 誘電泳動（ｄｅｐ）を用いた標的細胞濃度の改善

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019236783A Active JP6991192B2 (ja) 2016-06-21 2019-12-26 誘電泳動（ｄｅｐ）を用いた標的細胞濃度の改善

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10710075B2 (ja)
EP (2) EP3471879B1 (ja)
JP (2) JP6641032B2 (ja)
ES (2) ES2802261T3 (ja)
PL (1) PL3471879T3 (ja)
WO (1) WO2017220534A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2577074B (en) * 2018-09-12 2022-06-01 Quantumdx Group Ltd Microfluidic device with DEP arrays
CN117916021A (zh) 2021-06-30 2024-04-19 康特姆斯集团有限公司 使用介电泳浓缩流体样本中的目标微粒的微流体设备

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6576459B2 (en) * 2001-03-23 2003-06-10 The Regents Of The University Of California Sample preparation and detection device for infectious agents
US20040011650A1 (en) * 2002-07-22 2004-01-22 Frederic Zenhausern Method and apparatus for manipulating polarizable analytes via dielectrophoresis
US7476360B2 (en) * 2003-12-09 2009-01-13 Genefluidics, Inc. Cartridge for use with electrochemical sensor
GB0618966D0 (en) * 2006-09-26 2006-11-08 Iti Scotland Ltd Cartridge system
WO2010080978A2 (en) 2009-01-08 2010-07-15 The General Hospital Corporation Pre-depletion of leukocytes in whole blood samples prior to the capture of whole blood sample components
US9005987B2 (en) * 2009-04-16 2015-04-14 University Of Southern California Methods for quantitative target detection and related devices and systems
US9857333B2 (en) * 2012-10-31 2018-01-02 Berkeley Lights, Inc. Pens for biological micro-objects
US8934700B2 (en) * 2013-03-04 2015-01-13 Caliper Life Sciences, Inc. High-throughput single-cell imaging, sorting, and isolation
GB201311679D0 (en) * 2013-06-28 2013-08-14 Ibm Microfluidic chip with dielectrophoretic electrodes extending in hydrophilic flow path

Also Published As

Publication number Publication date
EP3693087A1 (en) 2020-08-12
US10710075B2 (en) 2020-07-14
JP6991192B2 (ja) 2022-01-12
WO2017220534A1 (en) 2017-12-28
EP3471879B1 (en) 2020-05-13
PL3471879T3 (pl) 2020-11-16
JP6641032B2 (ja) 2020-02-05
US20200298235A1 (en) 2020-09-24
ES2899107T3 (es) 2022-03-10
JP2020099325A (ja) 2020-07-02
EP3471879A1 (en) 2019-04-24
US20190176151A1 (en) 2019-06-13
EP3693087B1 (en) 2021-09-01
ES2802261T3 (es) 2021-01-18
US11850593B2 (en) 2023-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7453653B2 (ja) 粒子分離システムおよび方法
Garg et al. Whole-blood sorting, enrichment and in situ immunolabeling of cellular subsets using acoustic microstreaming
JP6314220B2 (ja) 細胞の検出及び単離のためのマイクロ流体選別器
TWI691724B (zh) 用於偵測流體樣本中之顆粒之裝置以及於微流體晶片中單離流體樣本之等分試樣的方法
JP5920895B2 (ja) マイクロ流体捕獲渦を使用して不均一溶液から細胞を単離する方法及びデバイス
KR100746431B1 (ko) 셀 소터 칩
Tanaka et al. Separation of cancer cells from a red blood cell suspension using inertial force
US9165359B2 (en) High-throughput single-cell imaging, sorting, and isolation
JP6639906B2 (ja) 生物試料検出方法
JP6991192B2 (ja) 誘電泳動（ｄｅｐ）を用いた標的細胞濃度の改善
US20170247661A1 (en) Particle filtering device and method
JP2019530850A (ja) 粒子を濃縮するための方法、システム、および装置
US20160193606A1 (en) Methods of and devices for capturing circulating tumor cells
EP3048163B1 (en) Particle filtering device and particle filtering method
JP2006226753A (ja) 成分分離機構と成分分離方法
Soong et al. Nanoscale sorting of extracellular vesicles via optically-induced dielectrophoresis on an integrated microfluidic system
CN112368562A (zh) 用于液滴的连续和定量收集的自动微流控系统
US20230383239A1 (en) Microscale cell filter
Zhang et al. On-chip sample preparations for point-of-care cellular analysis of blood
Garg et al. Whole-blood sorting, enrichment and in situ immunolabeling of cellular subsets using
Jin Microfluidic device for continuous deformability based separation of circulating tumor cells
CN115382589A (zh) 基于尺寸筛选的外泌体切向分离与富集微流控芯片装置
WO2019043264A1 (en) DEVICE AND METHOD OF ANALYSIS
Duffy et al. Morphological Characteristics of CTCs and the Potential for Deformability‐Based Separation
Braam Circulating tumor cells in microfluidic devices

Legal Events

Date Code Title Description
A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529

Effective date: 20190124

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190124

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20190124

A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20190510

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190604

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190828

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20191105

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20191204

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20191226

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6641032

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250