JP5690058B2 - Gold nanorod structure and manufacturing method thereof - Google Patents
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本発明は、保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子（金ナノロッド）によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、金微粒子が近赤外光を熱に変換し、この発熱によってリンカーと保持物質の結合部位が切断され、保持物質と金微粒子が脱離する金ナノロッド構造体とその製造方法に関する。
The present invention comprises a holding substance, a linker, and rod-shaped gold fine particles (gold nanorods) , the holding substance is bonded to the gold fine particles through the linker, and the gold fine particles convert near-infrared light into heat, The present invention relates to a gold nanorod structure in which a binding site between a linker and a holding substance is cut by this heat generation, and the holding substance and gold fine particles are detached, and a method for manufacturing the same.
本発明は、より具体的には、金ナノロッドの光熱変換反応による発生熱で起こる逆Diels-Alder反応によって、金ナノロッドと保持物質を結合するリンカー部位が開裂し、金ナノロッドから保持物質を分離することが可能な金微粒子構造体とその製造方法である。 More specifically, the present invention separates the retention substance from the gold nanorod by cleaving the linker site that bonds the gold nanorod and the retention substance by the reverse Diels-Alder reaction that occurs due to the heat generated by the photothermal conversion reaction of the gold nanorod. And a method for producing the same.
本発明の金微粒子構造体によれば、保持物質が蛍光体（色素）である場合、金ナノロッドから蛍光体が脱離することによって、金ナノロッドにクエンチされていた状態から解かれるため、蛍光を発することができる状態となり、蛍光を検出信号とする検出方法やバイオイメージングとして有用である。また、保持物質が薬剤の場合、特定の部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステムとして有用である。さらに、保持物質がポリエチレングリコールの場合、特定の部位でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を放出させ、分散安定性が低下した金微粒子を凝集させることができるため、金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルで金微粒子の存在する部位を検出する検出方法やバイオイメージングとして有用である。 According to the gold fine particle structure of the present invention, when the holding substance is a phosphor (dye), the phosphor is desorbed from the gold nanorod, so that the gold nanorod is released from the quenched state. It becomes a state that can emit light, and is useful as a detection method and bioimaging using fluorescence as a detection signal. Further, when the holding substance is a drug, it is useful as a drug delivery system that releases the drug to a specific site. In addition, when the retention substance is polyethylene glycol, it is possible to release polyethylene glycol (PEG) at a specific site and agglomerate gold microparticles with reduced dispersion stability, so localized surface plasmon resonance caused by accumulation of gold microparticles It is useful as a detection method or bioimaging for detecting a site where gold fine particles are present in the absorption spectrum.
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：LSPR）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０nm程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。このように、金ナノロッドについて長軸長さ、短軸長さの数値に基づいた吸収波長の理論計算が可能である。また、非特許文献２に記載されているように、金ナノロッドは表面には異なる結晶面が存在しており、単純な円柱ではなく多面体構造である。なお、本発明において、ロッド状とは、非特許文献１に記載されているように、形状が円柱状ないし棒状であって、長さが短い方向を短軸と云い、長い方向を長軸と云う。 When the metal fine particles dispersed in the solvent are irradiated with light, a resonance absorption phenomenon called localized surface plasmon resonance (LSPR) occurs. The absorption wavelength is determined by the type and shape of the metal and the refractive index of the medium around the metal fine particles. For example, when spherical gold fine particles are dispersed in water, there is an absorption region around 530 nm, and when the shape of the gold fine particles is made into a rod shape (gold nanorod) having a minor axis of about 10 nm, the vicinity of 530 nm caused by the minor axis of the rod In addition to absorption, it is known to have absorption on the long wavelength side caused by the long axis of the rod (Non-Patent Document 1). Thus, the theoretical calculation of the absorption wavelength based on the numerical values of the major axis length and minor axis length of the gold nanorods is possible. Further, as described in Non-Patent Document 2, the gold nanorod has a different crystal plane on the surface, and is not a simple cylinder but a polyhedral structure. In the present invention, as described in Non-Patent Document 1, the rod shape is a columnar shape or a rod shape, and a short direction is called a short axis, and a long direction is a long axis. say.
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは、形状の変化や凝集状態の変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献３、４、５、６）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。 These metal fine particle dispersions can be stably dispersed in a solvent without aggregation of the metal fine particles by adsorbing or binding to the surface of the metal fine particles using a low molecular compound or a polymer compound as a protective agent. In particular, gold nanorods are unique gold fine particles whose spectroscopic properties change depending on changes in shape, changes in the aggregation state, and the environment around the gold nanorods (Non-Patent Documents 3, 4, 5, and 6), and probe near-infrared light. As a new spectroscopic material to be used as
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズ（例えば、長軸５〜１００nm、短軸３〜３０nm）の金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第４級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４、非特許文献７、８）。 Gold nanorods are rod-shaped nanosized gold fine particles having an aspect ratio (major axis length / minor axis length) larger than 1, for example, major axis 5 to 100 nm, minor axis 3 to 30 nm. It is synthesized in water dissolved in the surfactant quaternary ammonium salt hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), and gold ions in CTAB aqueous solution can be synthesized by chemical reduction, electroreduction, photoreduction, etc. Yes, the synthesized gold nanorods are stably dispersed in water by the protective action of CTAB (Patent Documents 1, 2, 3, 4, Non-Patent Documents 7 and 8).
金ナノロッドの表面処理方法としては、近赤外域にプラズモン吸収のピークトップを有する金ナノロッドについて、金ナノロッド水分散液中の過剰なＣＴＡＢを除去しておき、α−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコール（ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ）を表面修飾して生体内での分散安定性を高める技術（非特許文献９）や、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面修飾した金ナノロッドをシリカ処理することによって、シリカが金ナノロッドに表面処理された金ナノロッド／シリカ（コア／シェル）粒子を得る技術が報告されている（非特許文献１０）。また、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面処理した金ナノロッドをＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）で埋包した粒子について、ＮＩＰＡＭの感温性と金ナノロッドの光熱変換特性を利用することによって、金ナノロッドを埋包しているＮＩＰＡＭに親水性と疎水性を発現させる技術が報告されている(非特許文献１１)。 As a surface treatment method for gold nanorods, for gold nanorods having a peak top of plasmon absorption in the near infrared region, excess CTAB in the gold nanorod aqueous dispersion is removed, and α-methoxy-ω-mercaptopolyethylene glycol ( m-PEG-SH) is surface-modified to improve dispersion stability in vivo (Non-patent Document 9), and gold nanorods surface-modified m-PEG-SH are treated with silica, so that the silica becomes gold A technique for obtaining gold nanorod / silica (core / shell) particles surface-treated on nanorods has been reported (Non-patent Document 10). In addition, the gold nanorods embedded with N-isopropylacrylamide (NIPAM) on the surface of m-PEG-SH surface-treated gold nanorods are embedded by utilizing the temperature sensitivity of NIPAM and the photothermal conversion characteristics of the gold nanorods. A technique for expressing hydrophilicity and hydrophobicity in the encapsulated NIPAM has been reported (Non-patent Document 11).
金コロイドの表面処理方法としては、非特許文献１２には、球状の金コロイド、またはシリカ粒子表面に金膜を形成したシリカ／金（コア／シェル）粒子に7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideをリンカーとしてフルオレセイン色素を導入しておき、逆Diels-Alder反応によってリンカー部位を開裂することによって、フルオレセイン色素を結合している粒子から分離する技術が報告されている。 As a surface treatment method for colloidal gold, Non-Patent Document 12 discloses that spherical gold colloid or 7-oxa-bicyclo [2.2.1] is applied to silica / gold (core / shell) particles having a gold film formed on the surface of silica particles. ] Technology to separate fluorescein dye from particles by introducing fluorescein dye with hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide as linker and cleaving the linker site by reverse Diels-Alder reaction Has been reported.
また、非特許文献１３には、金微粒子表面の近傍に化学的結合されている色素の蛍光はクエンチされて、蛍光強度が弱く観察されることが報告されている。 Non-Patent Document 13 reports that the fluorescence of a dye chemically bonded in the vicinity of the surface of a gold fine particle is quenched and the fluorescence intensity is observed to be weak.
金ナノロッドの表面に色素や薬剤などの機能性素子を修飾し、かつ特定の部位でそれらの機能性素子を分離することによって、生体内におけるバイオマーカーとして利用することや、ドラッグデリバリーシステム（DDS）の構築が可能となる。しかし、特許文献１〜４などに示されるように、金ナノロッドは一般にＣＴＡＢが表面に吸着しており、色素や薬剤、あるいは分散剤となるＰＥＧをそのまま吸着させた場合、任意のタイミングで分離操作を行うことはできない。また、ＣＴＡＢの毒性のために生体内への適用はできないという問題があった。 By modifying functional elements such as dyes and drugs on the surface of gold nanorods and separating them at specific sites, they can be used as biomarkers in vivo, or drug delivery systems (DDS) Can be constructed. However, as shown in Patent Documents 1 to 4 and the like, gold nanorods generally have CTAB adsorbed on the surface, and when PEG as a dye, drug, or dispersant is adsorbed as it is, separation operation is performed at an arbitrary timing. Can not do. In addition, there is a problem that it cannot be applied in vivo due to the toxicity of CTAB.
非特許文献１２の方法では、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideをリンカーとして球状金コロイド表面に色素を修飾しているが、表面にＣＴＡＢのない状態の球状金コロイド、またはシリカ／金（コア／シェル）粒子を対象としており、ＣＴＡＢが吸着している金ナノロッドの場合には適用できない。また、球状の金コロイドのプラズモン吸収は５２０nm付近であり、逆Diels-Alder反応を起こすエネルギーとして近赤外光を利用する場合には、吸収域が異なるため光熱変換に利用できないという問題がある。さらに、近赤外域にプラズモン吸収を有するシリカ／金（コア／シェル）粒子は、粒子径が２００nm以上と大きいため沈降しやすく、プラズモン吸収はシャープではなくブロードな吸収特性となるために光熱変換の効率が低いという問題がある。 In the method of Non-Patent Document 12, a pigment is modified on the surface of a spherical gold colloid using 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide as a linker. It is not applicable in the case of gold nanorods in which CAB is adsorbed, which is intended for spherical gold colloids or silica / gold (core / shell) particles. Further, the plasmon absorption of the spherical gold colloid is around 520 nm, and when near infrared light is used as the energy for causing the reverse Diels-Alder reaction, there is a problem that the absorption region is different and it cannot be used for photothermal conversion. Furthermore, silica / gold (core / shell) particles having plasmon absorption in the near-infrared region are likely to settle because the particle diameter is as large as 200 nm or more, and plasmon absorption is not sharp but has a broad absorption characteristic. There is a problem of low efficiency.
本発明は、従来の上記技術では知られていない金ナノロッドを利用した新規な金微粒子構造体と、その製造方法および用途を提供する。 The present invention provides a novel fine gold particle structure using gold nanorods that is not known in the above-described conventional technology, and a method for producing the same and uses thereof.
本発明によれば以下の構成を有する金ナノロッド構造体とその製造方法が提供される。
〔１〕保持物質が以下の反応生成物を介して金ナノロッドに結合した構造であって、
保持物質がローダミンＢ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Alexa Fluor 488、およびAlexa Fluor750からなる群から選択される色素、あるいは、ドキソルビシンおよびパクリタキセルからなる群から選択される薬剤であり、
金ナノロッド表面にポリエチレングリコールが結合しており、該ポリエチレングリコールの上にシリカ層が形成されており、該シリカ層にポリエチレンイミン層が積層されており、該ポリエチレンイミン層にマレイミドが結合しており、
一方、保持物質にフランが結合しており、該フランが上記マレイミドとの反応生成物である７−オキサ−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボン酸イミドによって結合していることを特徴とする金ナノロッド構造体。
〔２〕表面に界面活性剤が吸着した金ナノロッドの分散液にポリエチレングリコールを添加して金ナノロッド表面の界面活性剤をポリエチレングリコールに置換し、このポリエチレングリコールが結合した金ナノロッドの分散液に珪酸化合物の溶解液を添加して、ポリエチレングリコールを包むシリカ層を形成し、このシリカ層を有する金ナノロッドの分散液にポリエチレンイミン溶解液を添加して上記シリカ層の表面にポリエチレンイミン層を形成し、該ポリエチレンイミン層を有する金ナノロッドの分散液にマレイミド溶解液を添加して該マレイミドがポリエチレンイミン層の表面に結合した金ナノロッドを調製し、
一方、ローダミンＢ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Alexa Fluor 488、およびAlexa Fluor750からなる群から選択される色素、あるいは、ドキソルビシンおよびパクリタキセルからなる群から選択される薬剤である保持物質の溶解液に、フラン溶解液を添加して該保持物質にフランを結合させ、
マレイミドが表面に結合した上記金ナノロッドの分散液と、フランが結合した上記保持物質の分散液を混合し、上記マレイミドと上記フランとの反応生成物である７−オキサ−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボン酸イミドを形成することによって保持物質が金ナノロッドに結合した金ナノロッド構造体を製造する方法。
According to the present invention, a gold nanorod structure having the following configuration and a method for producing the same are provided.
[1] A structure in which a holding substance is bonded to a gold nanorod through the following reaction product,
A retention substance is a dye selected from the group consisting of rhodamine B, fluorescein, Cy3, Cy5, Alexa Fluor 488, and Alexa Fluor 750 , or a drug selected from the group consisting of doxorubicin and paclitaxel;
Polyethylene glycol is bonded to the gold nanorod surface, a silica layer is formed on the polyethylene glycol, a polyethyleneimine layer is laminated on the silica layer, and maleimide is bonded to the polyethyleneimine layer. ,
On the other hand, furan is bonded to the holding substance, and the furan is bonded by 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide which is a reaction product with maleimide. A gold nanorod structure characterized by comprising:
[2] Polyethylene glycol is added to a dispersion of gold nanorods having a surfactant adsorbed on the surface to replace the surfactant on the surface of the gold nanorods with polyethylene glycol. A compound solution is added to form a silica layer enclosing polyethylene glycol, and a polyethyleneimine solution is added to the dispersion of gold nanorods having this silica layer to form a polyethyleneimine layer on the surface of the silica layer. Then, a maleimide solution is added to a dispersion of gold nanorods having the polyethyleneimine layer to prepare gold nanorods in which the maleimide is bonded to the surface of the polyethyleneimine layer,
On the other hand, a dye selected from the group consisting of rhodamine B, fluorescein, Cy3, Cy5, Alexa Fluor 488, and Alexa Fluor 750 , or a retention substance solution that is a drug selected from the group consisting of doxorubicin and paclitaxel. lysates were by joining furan to the retentate added,
7-Oxabicyclo [2.2.1] , which is a reaction product of the maleimide and the furan, is prepared by mixing the dispersion of the gold nanorod with the maleimide bonded to the surface and the dispersion of the holding material with the furan bonded thereto . A method for producing a gold nanorod structure in which a holding substance is bonded to a gold nanorod by forming hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide .
また、本発明によれば以下の構成を有する金ナノロッド構造体とその製造方法が提供される。
〔３〕保持物質がマレイミドを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、チオール基を有するフランが上記マレイミドとの反応生成物である７−オキサ−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボン酸イミドによって上記ＰＥＧと結合しており、さらに該反応生成物がそのチオール基によって金ナノロッド表面に結合していることを特徴とする金ナノロッド構造体。
〔４〕マレイミドを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とチオール基を有するフランを反応させて、反応生成物である７−オキサ−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボン酸イミドによってＰＥＧとフランを結合させ、このフランが結合したＰＥＧと、金ナノロッド の分散液とを混合し、該反応生成物のチオール基を金ナノロッド表面に結合させてＰＥＧが反応生成物を介して金ナノロッドに結合した金ナノロッド構造体を製造する方法。
Moreover, according to this invention, the gold | metal | money nanorod structure which has the following structures and its manufacturing method are provided.
[3] 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2, wherein the retention substance is polyethylene glycol (PEG) containing maleimide, and the furan having a thiol group is a reaction product with the maleimide . A gold nanorod structure characterized in that it is bound to the PEG by 3-dicarboxylic acid imide , and the reaction product is bound to the surface of the gold nanorod by its thiol group.
[4] 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide which is a reaction product by reacting polyethylene glycol (PEG) containing maleimide with furan having a thiol group PEG and furan are bonded together by the above, and the furan-bonded PEG and a dispersion of gold nanorods are mixed, and the thiol group of the reaction product is bonded to the surface of the gold nanorod, so that PEG is bonded to the gold via the reaction product. A method for producing a gold nanorod structure bonded to a nanorod.
さらに、本発明によれば上記金微粒子構造体を用いた以下の用途が提供される。
〔１５〕上記[６]または上記[７]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、近傍の金微粒子によって発光がクエンチされている色素を金微粒子から脱離させることによって蛍光を発生させる蛍光発光方法。
〔１６〕上記[１０]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、ポリエチレングリコールを金微粒子から脱離させることによって、金微粒子の分散安定性を失わせて金微粒子を凝集させる金微粒子の集積方法。
〔１７〕上記[１６]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で金微粒子の存在する部位を検出する方法。
〔１８〕上記[１５]に記載する蛍光発光検出、または上記[１７]に記載する吸収スペクトル検出を情報とするバイオイメージング。
〔１９〕上記[８]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、薬剤を金微粒子から脱離させることによって、特定の部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）。
Furthermore, according to the present invention, the following uses using the gold fine particle structure are provided.
[15] Fluorescence that uses the rod-shaped gold fine particle structure described in [6] or [7] above to generate fluorescence by desorbing a dye whose light emission has been quenched by a nearby gold fine particle from the gold fine particle Luminescent method.
[16] Accumulation of gold fine particles using the rod-shaped gold fine particle structure described in [10] above, wherein polyethylene glycol is desorbed from the gold fine particles so that the dispersion stability of the gold fine particles is lost and the gold fine particles are aggregated Method.
[17] The method for detecting a site where gold fine particles are present by a change in an absorption spectrum of localized surface plasmon resonance generated by accumulation of the gold fine particles as described in [16].
[18] Bioimaging using the fluorescence emission detection described in [15] above or the absorption spectrum detection described in [17] above as information.
[19] Drug delivery that uses the rod-shaped gold fine particle structure described in [8] above and irradiates a near infrared ray of 700 to 2000 nm to release the drug from the gold fine particle, thereby releasing the drug to a specific site. System (DDS).
本発明の金微粒子構造体は、保持物質、リンカー、金ナノロッドによって構成されており、保持物質がリンカーを介して金ナノロッドに結合しており、金ナノロッドが近赤外光を熱に変換し、リンカーと保持物質を結合する部位が発生した熱によって切断できるため、目的の部位やタイミングで近赤外光を照射することによって、保持物質と金ナノロッドを脱離させることができる。また、金ナノロッド表面に吸着しているＣＴＡＢはリンカーによって置換することによって除去し、またはシリカ層を形成してこれに埋包することも可能であるため、ＣＴＡＢの毒性が問題にならず、生体内への適用が可能である。 The gold fine particle structure of the present invention is constituted by a holding substance, a linker, and a gold nanorod, the holding substance is bonded to the gold nanorod through the linker, and the gold nanorod converts near infrared light to heat, Since the site | part which couple | bonds a linker and a holding | maintenance substance can be cut | disconnected by the heat | fever which generate | occur | produced, a holding | maintenance substance and a gold | metal | money nanorod can be desorbed by irradiating near-infrared light at the target site | part and timing. In addition, CTAB adsorbed on the gold nanorod surface can be removed by substitution with a linker, or a silica layer can be formed and embedded in the CTAB. It can be applied to the body.
具体的には、本発明の金微粒子構造体およびその製造方法の一例では、ＣＴＡＢが吸着した金ナノロッド表面にｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面修飾することによって大部分のＣＴＡＢを置換し、さらに金微粒子表面にシリカ層を形成することによって、金ナノロッド表面にＣＴＡＢが僅かに残留している場合に、このＣＴＡＢをシリカ層によって埋包するので、ＣＴＡＢの毒性の問題を解消することができる。 Specifically, in an example of the gold fine particle structure and the method for producing the same according to the present invention, most of CTAB is substituted by surface modification of m-PEG-SH on the surface of gold nanorods adsorbed with CTAB, and further, gold fine particles By forming a silica layer on the surface, when CTAB remains slightly on the surface of the gold nanorod, the CTAB is embedded by the silica layer, so that the problem of toxicity of CTAB can be solved.
さらに、本発明の金微粒子構造体の一例では、色素や薬剤をあらかじめフランに結合しておき、金ナノロッドに修飾したマレイミドと上記フランとのDiels-Alder付加環化反応（Diels-Alder反応と云う）によって色素や薬剤を金ナノロッドに結合させるため、金ナノロッドに修飾する色素や薬剤の量をあらかじめ任意に調整することが可能である。また、フランに結合させる色素や薬剤などの機能性素子を適宜選択することによって、金ナノロッドに導入する機能性素子を選択しやすい利点がある。 Furthermore, in an example of the gold fine particle structure of the present invention, a Diels-Alder cycloaddition reaction (referred to as a Diels-Alder reaction) between a maleimide modified with a gold nanorod and a furan previously bonded with a dye or a drug and the above furan. ), The amount of the dye or drug to be modified to the gold nanorod can be arbitrarily adjusted in advance. Moreover, there is an advantage that it is easy to select a functional element to be introduced into the gold nanorod by appropriately selecting a functional element such as a dye or a drug to be bonded to furan.
また、本発明に係る金微粒子構造体およびその製造方法の他例では、保持物質のＰＥＧに導入したマレイミドとチオール基を有するフランとをDiels-Alder反応させて結合し、次いでフランのチオール基によって金ナノロッド表面に結合するので、金ナノロッド表面に修飾しているＣＴＡＢは該チオール基の結合によって大部分が置換されるので、ＣＴＡＢの毒性の問題を低下させることができる。また、この金微粒子構造体では、ＰＥＧはあらかじめフランに結合しているので、ＰＥＧの量や鎖長をあらかじめ任意に調整することが可能である。 Further, in another example of the gold fine particle structure and the method for producing the same according to the present invention, maleimide introduced into PEG as a holding substance and furan having a thiol group are bonded by Diels-Alder reaction, and then the thiol group of furan is used. Since it binds to the gold nanorod surface, the CTAB modified on the gold nanorod surface is largely substituted by the bond of the thiol group, so that the toxicity problem of CTAB can be reduced. In this gold fine particle structure, since PEG is bonded to furan in advance, the amount and chain length of PEG can be arbitrarily adjusted in advance.
さらに、本発明の金微粒子構造体は上記何れの場合でも、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッド固有のLSPRに相当する波長の光（近赤外光）を照射すると熱に変換され、保持物質と金ナノロッドとの結合部位７−オキサ−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボン酸イミド（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）に変換した熱を与えて逆Diels-Alder反応を起し、フランとマレイミドに開裂させることができるので、フランに結合している色素や薬剤を金ナノロッドから容易に分離することが可能であり、あるいはマレイミドに結合するＰＥＧ鎖を金ナノロッドから容易に分離することが可能である。
Furthermore, in any of the above cases, the gold nanorods of the present invention have a photothermal conversion function, so that they are converted into heat when irradiated with light (near infrared light) having a wavelength corresponding to the LSPR unique to the gold nanorods. 7-oxa- bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide (7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-) 2,3-dicarboxylic imide) can be heated to cause reverse Diels-Alder reaction and cleaved into furan and maleimide, allowing easy separation of dyes and drugs bound to furan from gold nanorods Or the PEG chain attached to maleimide can be easily separated from the gold nanorods.
本発明の金微粒子構造体に用いられる金ナノロッドは、LSPRの最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲であり、特に波長７５０〜１１００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Water Window）、生体にも安全な波長域であり、生体内に投与された場合、金ナノロッドをバイオマーカーとしてLSPRの分光変化を確認することで、近赤外光を用いたバイオイメージングが可能であり、近赤外分析システムを構築するのに適している。さらに、金ナノロッドに光照射して色素や薬剤、更にはＰＥＧ鎖を分離することによって標的部位周辺組織に対するフォトサーマル治療のみならず、色素を用いたバイオイメージングを行うことができ、さらに、薬剤放出によるドラックデリバリーシステムの構築や金微粒子の集積によって生じるLSPRの吸収スペクトルによって金微粒子の存在する部位のイメージングが可能である。 The gold nanorod used in the gold fine particle structure of the present invention has a maximum absorption wavelength of LSPR in the range of 700 to 2000 nm, and particularly near infrared light having a wavelength of 750 to 1100 nm is less affected by water absorption (Water Window). It is a safe wavelength range for the living body, and when administered into the living body, bio-imaging using near-infrared light is possible by confirming the spectral change of LSPR using gold nanorods as a biomarker. Suitable for building infrared analysis systems. Furthermore, by irradiating gold nanorods with light and separating dyes, drugs, and PEG chains, bio-imaging using dyes as well as photothermal treatment of tissues around target sites can be performed, and drug release The site where gold fine particles exist can be imaged by the absorption spectrum of LSPR generated by the construction of drug delivery system and the accumulation of gold fine particles.
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on embodiments. The concentration% is mass% unless otherwise indicated.
本発明の金微粒子構造体は、保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体である。 The gold fine particle structure of the present invention is composed of a holding substance, a linker, and rod-shaped gold fine particles, the holding substance is bonded to the gold fine particle through the linker, and the binding site of the protective substance and the linker is a Diels-Alder reaction. It is formed by a product substance, and the reaction product substance has a property of being cleaved by heat generated by thermal conversion of near infrared light, and the retention substance and the gold fine particles are detached by cleavage of the binding site. It is a rod-shaped gold fine particle structure.
本発明の金微粒子構造体において、Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルはそれぞれフランとマレイミドであり、これらの結合について以下の態様を含む。
（イ）保持物質の色素や薬剤がフランに修飾されており、このフランとリンカーの一部であるマレイミドとのDiels-Alder反応によって7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、これを結合部位として保持物質と金ナノロッドが結合されている態様。
（ロ）保持物質のＰＥＧにマレイミドが導入されており、リンカーがチオール基を含む該フランであり、このフランとＰＥＧのマレイミドとのDiels-Alder反応によって7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、これを結合部位としてＰＥＧがリンカーに結合し、該リンカーのチオール基で金ナノロッド結合されている態様。
In the gold fine particle structure of the present invention, the diene and dienophile involved in the Diels-Alder reaction are furan and maleimide, respectively, and these bonds include the following embodiments.
(B) The dye or drug of the retention substance is modified with furan, and 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene- by the Diels-Alder reaction between this furan and maleimide, which is part of the linker A mode in which a 2,3-dicarboxylic imide is formed and the holding substance and the gold nanorod are bound to each other as a binding site.
(B) Maleimide is introduced into the PEG of the retention material, and the linker is the furan containing a thiol group, and 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept by Diels-Alder reaction of this furan with PEG maleimide. An embodiment in which -5-ene-2,3-dicarboxylic imide is formed, PEG is bonded to a linker using this as a binding site, and gold nanorods are bonded to the thiol group of the linker.
〔金ナノロッド〕
本発明の金微粒子構造体にはロッド状の金微粒子（金ナノロッド）が用いられる。この金ナノロッドは、長軸長さ５〜１００nm、短軸長さ３〜３０nmであって、アスペクト比２〜１２であり、LSPRの最大吸収波長が７００〜２００００nmの範囲にある。さらに、この金ナノロッドは、長軸長さ２０〜８０nm、短軸長さ４〜１０nmの粒子径であるものが分散安定性の面からより好ましい。長軸長さが１００nmより長いと、金ナノロッドが自重で沈降しやすくなる傾向があるため、分散媒中での分散安定性が失われる。また、金ナノロッドのアスペクト比は、生体内に投与した場合でも、光照射や検出が可能な近赤外域にLSPRの最大吸収波長を有するものが好ましく、従って上記アスペクト比の範囲が適当である。
[Gold nanorods]
Rod-shaped gold fine particles (gold nanorods) are used in the gold fine particle structure of the present invention. This gold nanorod has a major axis length of 5 to 100 nm, a minor axis length of 3 to 30 nm, an aspect ratio of 2 to 12, and a maximum absorption wavelength of LSPR in the range of 700 to 20000 nm. Further, the gold nanorods having a major axis length of 20 to 80 nm and a minor axis length of 4 to 10 nm are more preferable from the viewpoint of dispersion stability. If the long axis length is longer than 100 nm, the gold nanorods tend to settle due to their own weight, so that the dispersion stability in the dispersion medium is lost. Further, the aspect ratio of the gold nanorod is preferably one having the maximum absorption wavelength of LSPR in the near-infrared region where light irradiation and detection can be performed even when administered in vivo, and thus the above aspect ratio range is appropriate.
上記金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イオンを還元することによって合成することができる。例えば、n＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。合成した段階での金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
The gold nanorods can be synthesized by reducing gold ions in an aqueous solution in which a quaternary ammonium salt represented by the following formula [I] is dissolved. For example, by using n = 15 hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), gold nanorods with CTAB adsorbed on the surface can be obtained. The gold nanorods at the stage of synthesis are stably dispersed in water with CTAB adsorbed.
CH 3 (CH 2 ) n N + (CH 3 ) 3 Br − (n is an integer of 1 to 15)… [I]
金ナノロッド水分散液は、上記式[Ｉ]に示される水中に存在する余剰の界面活性剤を除去してから表面処理するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、界面活性剤を含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰な界面活性剤を除去することができる。なお、界面活性剤を過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。 The gold nanorod aqueous dispersion may be subjected to a surface treatment after removing the excess surfactant present in the water represented by the above formula [I]. Specifically, the gold nanorod aqueous dispersion is centrifuged to precipitate the gold nanorods at the bottom of the centrifuge tube, and the supernatant containing the surfactant is removed. The precipitated gold nanorods are redispersed by adding water. The surplus surfactant can be removed by repeating this operation 1 to 3 times. If the surfactant is removed excessively, the gold nanorods aggregate and do not re-disperse in water.
〔リンカー〕
本発明の金微粒子構造体において、金ナノロッドに吸着しているリンカーは、例えば、片末端がチオール基であるＰＥＧを含有するシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドによって構成される。片末端がチオール基であるＰＥＧと金ナノロッドは、チオール基で結合している。ＰＥＧはシリカ層に含有されており、シリカ層とポリエチレンイミン層は静電相互作用で吸着している。このポリエチレンイミン層とマレイミドはアミド結合しており、このマレイミドは保持物質に修飾しているフランと結合している
いる。
[Linker]
In the gold fine particle structure of the present invention, the linker adsorbed on the gold nanorod is composed of, for example, a silica layer / polyethyleneimine layer / maleimide containing PEG having one end as a thiol group. PEG having one end at the thiol group and the gold nanorod are bonded by a thiol group. PEG is contained in the silica layer, and the silica layer and the polyethyleneimine layer are adsorbed by electrostatic interaction. This polyethyleneimine layer and maleimide are amide-bonded, and this maleimide is bonded to furan which is modifying the holding substance.
本発明の金微粒子構造体において、リンカーの他の例は、チオール基を有するフランによって構成されている。チオール基を有するフランと金ナノロッドはこのチオール基で結合している。 In the gold fine particle structure of the present invention, another example of the linker is constituted by a furan having a thiol group. The furan having a thiol group and the gold nanorod are bonded by this thiol group.
〔保持物質（色素、薬剤の場合）〕
保持物質が色素や薬剤の場合、あらかじめ色素や薬剤をフランに結合しておき、このフランとリンカーのマレイミドとのDiels-Alder反応によって、色素や薬剤をリンカーに結合し、このリンカーを介して金ナノロッドに結合することができる。
[Retained substance (in the case of dyes, drugs)]
When the retention substance is a dye or drug, the dye or drug is bound to furan in advance, and the dye or drug is bound to the linker by the Diels-Alder reaction between this furan and the maleimide of the linker. Can bind to nanorods.
色素は金ナノロッドのLSPR吸収と重ならないような波長域に吸収を有するものが好ましい。金ナノロッドと色素の吸収が重なると、色素単体の吸収波長を確認することが困難になる傾向がある。色素としては、具体的には、例えば、ローダミンＢ、フルオレセイン、Cyシリーズ（Cy３, Cy５）、Alexa Fluorシリーズ(Alexa Fluor 488,Alexa Fluor750)などの商品名で市販されているものが挙げられる。これらは特に問題なく使用することができる。薬剤は特定の病巣で投与され改善が得られるような薬剤を選択すれば良い。薬剤としては、例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、パクリタキセルなどの商品名で市販されているものが挙げられる。これらは特に問題なく使用することができる。 The dye preferably has an absorption in a wavelength region that does not overlap with the LSPR absorption of the gold nanorods. If the absorption of the gold nanorods and the dye overlaps, it tends to be difficult to confirm the absorption wavelength of the dye alone. Specific examples of the dye include those commercially available under trade names such as rhodamine B, fluorescein, Cy series (Cy3, Cy5), Alexa Fluor series (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 750). These can be used without any particular problem. A drug that can be administered at a specific lesion and can be improved may be selected. Examples of the drug include those marketed under trade names such as doxorubicin (DOX) and paclitaxel. These can be used without any particular problem.
〔保持物質（ＰＥＧの場合）〕
保持物質がＰＥＧの場合、あらかじめＰＥＧにマレイミドを導入しておき、リンカーとしてチオール基を含むフランを用い、ＰＥＧのマレイミドとリンカーのフランとのDiels-Alder反応によって、ＰＥＧをリンカーに結合し、このリンカーのチオール基によって金ナノロッドに結合することができる。ＰＥＧとしては生体中で金ナノロッドが安定に分散できるようなものを選択すればよく、特に重量平均分子量１０００以上のＰＥＧを使用した場合、生体内において金ナノロッドの高い分散安定性が得られる。
[Retained substance (in the case of PEG)]
When the retention substance is PEG, maleimide is introduced into PEG in advance, furan containing a thiol group is used as a linker, and PEG is bound to the linker by Diels-Alder reaction between maleimide of PEG and linker furan. It can be attached to the gold nanorods by the thiol group of the linker. The PEG may be selected so that the gold nanorods can be stably dispersed in the living body. In particular, when PEG having a weight average molecular weight of 1000 or more is used, high dispersion stability of the gold nanorods can be obtained in the living body.
〔表面処理方法（保持物質が色素、薬剤の場合）〕
次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩（界面活性剤：ＣＴＡＢなど）が吸着した金ナノロッド表面にＰＥＧを修飾し、これに珪酸化合物（ＴＥＯＳなど）を反応させて金ナノロッド表面にＰＥＧ含有シリカ層を形成し、このシリカ層にポリエチレンイミン層を静電相互作用によって積層し、このポリエチレンイミンのアミノ基とマレイミドをアミド結合させることによって、ＰＥＧ含有シリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドからなるリンカーによって被覆された金ナノロッド(Ｂ)を調製する。一方、フランに色素を結合した保持物質(Ａ)を調製する。この保持物質(Ａ)と金ナノロッド(Ｂ)とを混合し、上記フランと上記マレイミドとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することにより、色素が金ナノロッド表面に結合されたロッド状金微粒子構造体を製造することができる。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
[Surface Treatment Method (When Retaining Substance is Dye or Drug)]
PEG is modified on the surface of gold nanorods adsorbed with a quaternary ammonium salt represented by the following formula [I] (surfactant: CTAB, etc.) and reacted with a silicic acid compound (TEOS, etc.) to contain PEG on the gold nanorod surface. A linker composed of PEG-containing silica layer / polyethyleneimine layer / maleimide is formed by forming a silica layer, laminating a polyethyleneimine layer on the silica layer by electrostatic interaction, and bonding an amino group of the polyethyleneimine and maleimide. A gold nanorod (B) coated with is prepared. On the other hand, a holding substance (A) in which a dye is bound to furan is prepared. 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3- is prepared by mixing the retentate (A) and the gold nanorod (B) and conducting a Diels-Alder reaction between the furan and the maleimide. By forming a dicarboxylic imide, a rod-shaped gold fine particle structure in which a pigment is bonded to the gold nanorod surface can be produced.
CH 3 (CH 2 ) n N + (CH 3 ) 3 Br − (n is an integer of 1 to 15)… [I]
金ナノロッドに表面処理するＰＥＧとしては、片方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がチオール基を有する重量平均分子量１０００〜４００００のポリエチレングリコール（ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ）を使用すればよく、好ましくは重量平均分子量２０００〜２００００のｍ-ＰＥＧ-ＳＨがよい。余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド水分散液にｍ-ＰＥＧ-ＳＨを添加して攪拌すると、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨは末端のチオール基で金ナノロッド表面と結合し、金ナノロッド表面のＣＴＡＢは大部分がｍ-ＰＥＧ-ＳＨによって置換され、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面修飾された金ナノロッドが得られる。金ナノロッドに結合しない余剰のｍ-ＰＥＧ-ＳＨは遠心操作で除去するとよい。ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面処理した金ナノロッドは、アルコール（エタノールなど）に分散することができる。このとき、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの重量平均分子量が１０００より小さいとアルコール中の分散安定性が悪くなり、一方、重合平均分子量が２００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。 As the PEG to be surface-treated on the gold nanorod, polyethylene glycol (m-PEG-SH) having a weight average molecular weight of 1000 to 40000 having one end having a methoxy group and the other end having a thiol group may be used. Preferably, m-PEG-SH having a weight average molecular weight of 2000 to 20000 is used. When m-PEG-SH is added to an aqueous dispersion of gold nanorods from which excess CTAB has been removed and stirred, m-PEG-SH binds to the gold nanorod surface with terminal thiol groups, and the CTAB on the gold nanorod surface is mostly Are replaced by m-PEG-SH, resulting in gold nanorods surface-modified with m-PEG-SH. Excess m-PEG-SH that does not bind to the gold nanorods may be removed by centrifugation. Gold nanorods surface-treated with m-PEG-SH can be dispersed in alcohol (ethanol or the like). At this time, if the weight average molecular weight of m-PEG-SH is less than 1000, the dispersion stability in the alcohol deteriorates. On the other hand, if the polymerization average molecular weight is more than 20000, the dispersion stability does not change, which is disadvantageous in cost. is there.
ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの添加量は、分散液中で、金濃度１mMに対して、０.０１〜１０mMになる濃度範囲がよく、好ましくは０.１〜１mMの範囲が良い。ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの濃度が０.０１mMより低いと、アルコール中での分散が不安定となり、アルコール中に安定分散させることができない。一方、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの濃度が１０mMより高いと金ナノロッドに吸着しない余剰分が発生し、コスト的に不利である。なお、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨによって表面修飾しない金ナノロッドを用いてエタノール分散液を調製した場合、金ナノロッド表面に修飾していつ分散剤のＣＴＡＢがエタノールに溶解するため、金ナノロッドが凝集する。 The amount of m-PEG-SH added is preferably in a concentration range of 0.01 to 10 mM, preferably in the range of 0.1 to 1 mM, with respect to a gold concentration of 1 mM in the dispersion. When the concentration of m-PEG-SH is lower than 0.01 mM, the dispersion in the alcohol becomes unstable and cannot be stably dispersed in the alcohol. On the other hand, if the concentration of m-PEG-SH is higher than 10 mM, a surplus not adsorbed on the gold nanorods is generated, which is disadvantageous in terms of cost. When an ethanol dispersion liquid is prepared using gold nanorods that are not surface-modified with m-PEG-SH, the gold nanorods aggregate because the CTAB of the dispersant dissolves in ethanol when the gold nanorod surface is modified.
ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面修飾した金ナノロッドの水分散液に、オルト珪酸テトラエチル(ＴＥＯＳ)などの珪酸化合物を溶解したエタノールを添加し、攪拌すると、金ナノロッド表面にシリカ層が形成され、金ナノロッドをコアとし、シリカ層をシェルとするコア／シェル微粒子を得ることができる。このとき、金ナノロッド表面に吸着しているｍ-ＰＥＧ-ＳＨはシリカ層に埋包された状態になる。従って、金ナノロッド表面にＣＴＡＢが僅かに残留している場合でも、このＣＴＡＢはシリカ層に埋包されるので、ＣＴＡＢの毒性の問題を解消することができる。 When an ethanol in which a silicic acid compound such as tetraethyl orthosilicate (TEOS) is dissolved is added to an aqueous dispersion of gold nanorods surface-modified with m-PEG-SH and stirred, a silica layer is formed on the surface of the gold nanorods. Core / shell fine particles having a silica layer as a shell and a silica layer as a shell can be obtained. At this time, m-PEG-SH adsorbed on the gold nanorod surface is embedded in the silica layer. Therefore, even if CTAB remains slightly on the surface of the gold nanorod, the CTAB is embedded in the silica layer, so that the problem of toxicity of CTAB can be solved.
ＴＥＯＳの添加量は、金濃度１mMに対して、０.５〜１００mMの濃度範囲がよく、好ましくは１〜５０mMの範囲がよい。ＴＥＯＳの濃度が０.５mMより低いと金ナノロッドを十分にシリカ被覆することができない。一方、ＴＥＯＳの濃度が１００mMより高いとシリカの金ナノロッド被覆量が多くなり、粒子径が大きくなって分散安定性が低下し、沈降物を生じるので好ましくない。またコスト的にも不利である。シリカ処置の際、アンモニアを触媒として５％程度添加するとよい。 The addition amount of TEOS is preferably in a concentration range of 0.5 to 100 mM, preferably in a range of 1 to 50 mM, with respect to a gold concentration of 1 mM. If the TEOS concentration is lower than 0.5 mM, the gold nanorods cannot be sufficiently coated with silica. On the other hand, if the concentration of TEOS is higher than 100 mM, the amount of silica coated with gold nanorods is increased, the particle size is increased, the dispersion stability is lowered, and a precipitate is generated, which is not preferable. It is also disadvantageous in terms of cost. At the time of silica treatment, about 5% of ammonia is preferably added as a catalyst.
金ナノロッドの表面に負の電荷であるシリカ層のシェルを形成することで、正の電荷であるポリエチレンイミンを静電相互作用によって吸着させることができる。余剰のＴＥＯＳを除去した金ナノロッド／シリカのコア／シェル粒子の９０％エタノール分散液（１０％は水）に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を溶解した９０％エタノールを添加し、攪拌すると、静電相互作用によってシリカ層の表面にＰＥＩ層が形成され、金ナノロッド／ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層から形成される微粒子を得ることができる。 By forming a shell of a silica layer having a negative charge on the surface of the gold nanorod, polyethyleneimine having a positive charge can be adsorbed by electrostatic interaction. When 90% ethanol in which polyethyleneimine (PEI) was dissolved was added to a 90% ethanol dispersion (10% water) of gold nanorods / silica core / shell particles from which excess TEOS had been removed, By the action, a PEI layer is formed on the surface of the silica layer, and fine particles formed from the gold nanorod / m-PEG-SH-containing silica layer / PEI layer can be obtained.
金ナノロッドに表面処理するＰＥＩとしては、重量平均分子量１０００〜１０００００のＰＥＩを使用すればよく、好ましくは重量平均分子量１８００〜６００００のＰＥＩがよい。ＰＥＩの重量平均分子量が１０００より小さいとアルコール中の分散安定性が低下し、一方、重合平均分子量が１０００００より大きいと粒子の沈殿が認められる。 As PEI for surface treatment of gold nanorods, PEI having a weight average molecular weight of 1000 to 100,000 may be used, and PEI having a weight average molecular weight of 1800 to 60000 is preferable. When the weight average molecular weight of PEI is less than 1000, the dispersion stability in alcohol is lowered. On the other hand, when the polymerization average molecular weight is more than 100,000, precipitation of particles is observed.
ＰＥＩの添加量は、金濃度１mMに対して、０.１３〜１２.５mMの濃度範囲がよく、好ましくは、０.２１〜６.９４mMの範囲がよい。ＰＥＩの濃度が０.１３mMより低いとシリカ層を十分にＰＥＩで被覆することができない。一方、PEIの濃度が１２.５mMより高いとシリカ層上のＰＥＩ被覆量が多くなり、粒子径が大きくなって分散安定性が低下し、沈降物を生じるので好ましくない。 The amount of PEI added is preferably in the range of 0.13 to 12.5 mM, and preferably in the range of 0.21 to 6.94 mM, with respect to a gold concentration of 1 mM. If the concentration of PEI is lower than 0.13 mM, the silica layer cannot be sufficiently covered with PEI. On the other hand, if the concentration of PEI is higher than 12.5 mM, the amount of PEI coating on the silica layer is increased, the particle size is increased, the dispersion stability is lowered, and a precipitate is formed, which is not preferable.
金ナノロッド表面のシリカ層とＰＥＩ層の膜厚が厚くなると、後の工程で修飾する色素などの蛍光物質の蛍光発光がクエンチされなくなる。具体的には、例えばシリカ層とＰＥＩ層の膜厚の合計が３０nmを超えると蛍光発光のクエンチが起こらなくなるため、これより薄い膜厚がよい。 When the film thickness of the silica layer and the PEI layer on the gold nanorod surface is increased, the fluorescence emission of a fluorescent material such as a dye to be modified in a later step is not quenched. Specifically, for example, when the total thickness of the silica layer and the PEI layer exceeds 30 nm, quenching of fluorescence emission does not occur, and thus a thinner thickness is preferable.
金ナノロッド表面に形成したｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層の表面に、Diels-Alder反応に関わるジエノフィルであるマレイミド基を導入する。マレイミド基の導入は、ＰＥＩ中のアミノ基と反応する官能基を末端に有し、もう片方の末端にはマレイミド基を有する化合物（クロスリンカー）を用いればよく、アミノ基との反応基としては、カルボキシル基、カルボン酸無水物、スクシンイミジル基などが挙げられる。 Maleimide groups, which are dienophiles involved in the Diels-Alder reaction, are introduced into the surface of the m-PEG-SH-containing silica layer / PEI layer formed on the gold nanorod surface. For the introduction of the maleimide group, a compound having a functional group that reacts with an amino group in PEI at the terminal and a maleimide group at the other terminal (crosslinker) may be used. , Carboxyl group, carboxylic acid anhydride, succinimidyl group and the like.
金ナノロッド表面にｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層を有する金ナノロッド水分散液にクロスリンカーを溶解した水溶液を添加し、攪拌すると、ＰＥＩ層のアミノ基とクロスリンカー中の反応基が反応して結合し、金ナノロッド／ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層／マレイミドから形成される表面処理層を有する金ナノロッド（Ma-NRs）の分散液を得ることができる。 When an aqueous solution in which a crosslinker is dissolved in an aqueous dispersion of gold nanorods having a m-PEG-SH-containing silica layer / PEI layer on the gold nanorod surface is added and stirred, the amino groups of the PEI layer react with the reactive groups in the crosslinker. And a dispersion of gold nanorods (Ma-NRs) having a surface treatment layer formed of gold nanorods / m-PEG-SH-containing silica layer / PEI layer / maleimide can be obtained.
クロスリンカーの添加量は、金濃度１mMに対して、０.１〜２０mMの濃度範囲がよく、好ましくは１〜１０mMの範囲がよい。クロスリンカーの濃度が０.１mMより低いとマレイミド基を十分に導入することができないため、Diels-Alder反応で保持物質を十分に結合させることができない。一方、クロスリンカーの濃度が２０mMより高いとＰＥＩのアミノ基よりも過剰となるため未反応のクロスリンカーが発生する。 The amount of the crosslinker added is preferably in the range of 0.1 to 20 mM, and preferably in the range of 1 to 10 mM, with respect to the gold concentration of 1 mM. If the crosslinker concentration is lower than 0.1 mM, the maleimide group cannot be sufficiently introduced, and thus the retention substance cannot be sufficiently bound by the Diels-Alder reaction. On the other hand, when the concentration of the crosslinker is higher than 20 mM, it becomes excessive as compared with the amino group of PEI, so that an unreacted crosslinker is generated.
Ma-NRs表面のマレイミドとのDiels-Alder反応に関わるジエンとしてはフランを用いればよい。フランとしては保持物質である色素や薬剤を結合するための反応基を有していることが好ましく、例えば、フルフリルアミン（Furfurylamine）などが挙げられる。例えば、アミノ基を有するフランであるフルフリルアミンと、カルボキシ基を有する色素であるローダミンＢを反応させると、保持物質である色素とフランの縮合体（Fu-RoB）が得られる。 Furan may be used as the diene involved in the Diels-Alder reaction with the maleimide on the Ma-NRs surface. The furan preferably has a reactive group for binding a dye or a drug as a holding substance, and examples thereof include furfurylamine. For example, when furfurylamine, which is a furan having an amino group, is reacted with rhodamine B, which is a dye having a carboxy group, a condensate (Fu-RoB) of a dye and furan that is a holding substance is obtained.
Ma-NRｓと色素や薬剤を結合したフランとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成して、金ナノロッドに保持物質を結合することができる。例えば、Ma-NRsとFu-RoBのDiels-Alder反応によって、金ナノロッドに保持物質として色素ローダミンBを結合することができる。 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide is formed by the Diels-Alder reaction between Ma-NRs and furan combined with dyes and drugs, and held in gold nanorods Substances can be bound. For example, the dye rhodamine B can be bound to the gold nanorod as a retention substance by the Diels-Alder reaction of Ma-NRs and Fu-RoB.
〔表面処理方法（保持物質がＰＥＧの場合）〕
マレイミドを導入した保持物質のＰＥＧとして、例えば、重量平均分子量１０００以上のマレイミド（α-［3-（3マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコール）を用い、一方、チオール基を有するフランをリンカーとして用い、ＰＥＧのマレイミドとフランとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）、ＰＥＧにフランを結合し、このフランのチオール基によって、次式［Ｉ］で示される界面活性剤が吸着した金ナノロッド表面に結合させることによって、保持物質のＰＥＧが結合した金ナノロッド（PEG-DA-NRs）を得ることができる。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …［Ｉ］
[Surface treatment method (when the retention substance is PEG)]
For example, maleimide (α- [3- (3maleimido-1-oxopropyl) amino] propyl-ω-methoxypolyethylene glycol) having a weight average molecular weight of 1000 or more is used as the PEG of the retention material into which maleimide has been introduced. PEG maleimide and furan are subjected to Diels-Alder reaction to form 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide (PEG) -DA-SH), furan was bonded to PEG, and the thiol group of this furan was bonded to the surface of the gold nanorod on which the surfactant represented by the following formula [I] was adsorbed, whereby the holding substance PEG was bonded. Gold nanorods (PEG-DA-NRs) can be obtained.
CH 3 (CH 2 ) n N + (CH 3 ) 3 Br − (n is an integer of 1 to 15)… [I]
ＰＥＧはあらかじめフランにDiels-Alder反応で結合しておくので、金ナノロッドに修飾するＰＥＧの量や鎖長を容易に調整することができる。 Since PEG is previously bonded to furan by Diels-Alder reaction, the amount and chain length of PEG to be modified into gold nanorods can be easily adjusted.
〔PEG-DA-NRの作製方法〕
フランは金微粒子と吸着するためのチオール基を有するものであればよい。また、マレイミドは、重量平均分子量１０００以上のＰＥＧが導入されたものであればよく、ＰＥＧの片方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がマレイミド基である。ＰＥＧの重量平均分子量が１０００より小さいと生体内での金ナノロッドの分散安定性が悪くなり、一方、重合平均分子量が２００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。
[Production method of PEG-DA-NR]
Any furan may be used as long as it has a thiol group for adsorbing with gold fine particles. Further, the maleimide may be any in which PEG having a weight average molecular weight of 1000 or more is introduced, and one end of the PEG is a methoxy group and the other end is a maleimide group. When the weight average molecular weight of PEG is less than 1000, the dispersion stability of the gold nanorods in vivo deteriorates. On the other hand, when the polymerization average molecular weight is more than 20000, the dispersion stability does not change, which is disadvantageous in cost.
チオール基を有するフランと、ＰＥＧを有するマレイミドとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成して得られた化合物（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）は、チオール基を有しているため、金ナノロッドに吸着させることが可能である。特に上記式[Ｉ]の界面活性剤が吸着した金ナノロッドに対しても、硫黄の吸着力が強いため、PEG-DA-SHを添加するだけで、金ナノロッド表面に修飾している界面活性剤はPEG-DA-SHによって置換され、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨを金ナノロッドに表面修飾することができ、保持物質のＰＥＧをリンカーを介して金ナノロッドに結合することができる。 Compound obtained by Diels-Alder reaction of furan having thiol group and maleimide having PEG to form 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide Since (PEG-DA-SH) has a thiol group, it can be adsorbed on gold nanorods. In particular, the gold nanorods adsorbed with the surfactant of the above formula [I] have a strong sulfur adsorbing power. Therefore, the surfactant is modified on the gold nanorod surface only by adding PEG-DA-SH. Can be substituted by PEG-DA-SH, PEG-DA-SH can be surface-modified to gold nanorods, and the PEG of the retention material can be attached to the gold nanorods via a linker.
ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの添加量は、分散液中で、金濃度１mMに対して、０.０１〜１０mMになる濃度範囲がよく、好ましくは０.１〜１mMの範囲が良い。ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの濃度が０.０１mMより低いと水中での分散が不安定となり、安定に分散させることができない。一方、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの濃度が１０mMより高いと金ナノロッドに吸着しない余剰分が発生し、コスト的に不利である。 The amount of PEG-DA-SH added is preferably in the concentration range of 0.01 to 10 mM, preferably in the range of 0.1 to 1 mM, with respect to the gold concentration of 1 mM in the dispersion. If the concentration of PEG-DA-SH is lower than 0.01 mM, the dispersion in water becomes unstable and cannot be stably dispersed. On the other hand, if the concentration of PEG-DA-SH is higher than 10 mM, a surplus that does not adsorb on the gold nanorods is generated, which is disadvantageous in terms of cost.
なお、ＣＴＡＢによって表面修飾されている金ナノロッドの水分散液について、液中の余剰のＣＴＡＢを透析して除去する場合、金ナノロッド表面のＣＴＡＢも透析によって排除されるので金ナノロッドが凝集する。一方、ＣＴＡＢに代えてＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨによって表面修飾された金ナノロッドはＰＥＧが分散剤として機能するので、このような凝集を生じない。 In addition, about the aqueous dispersion liquid of the gold nanorod surface-modified by CTAB, when excess CTAB in a liquid is removed by dialysis, the gold nanorod aggregates because CTAB on the gold nanorod surface is also removed by dialysis. On the other hand, gold nanorods surface-modified with PEG-DA-SH instead of CTAB do not cause such aggregation because PEG functions as a dispersant.
〔保持物質の脱離方法〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００nmにLSPRの吸収ピークを有しており、金ナノロッドにLSPR吸収ピークの光を照射すると、光熱変換で熱が発生し、発生した熱によって、金ナノロッドと保持物質の結合部位を形成している7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideが逆Diels-Alder反応を起こすため、金ナノロッドから保持物質が脱離する。
[Removal method of retained substance]
The gold nanorod used in the present invention has an LSPR absorption peak at 700 to 2000 nm. When the gold nanorod is irradiated with light having an LSPR absorption peak, heat is generated by photothermal conversion, and the generated heat causes the gold nanorod to 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide, which forms the binding site for the retention substance, causes a reverse Diels-Alder reaction. Release.
特に波長８００〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの光熱変換を起こすことが可能である。 In particular, near-infrared light with a wavelength of 800 to 1200 nm is less affected by water absorption (Near Infrared Window) and is a safe wavelength range for the living body. By irradiating near-infrared light from outside the living body, Photothermal conversion of administered gold nanorods is possible.
〔検出方法・治療方法等〕
本発明の金微粒子構造体は、金ナノロッドが、照射された近赤外光を熱に変換し、この熱によってリンカーと保持物質の結合部位（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）が逆Diels-Alder反応を起こして分離し、保持物質と金ナノロッドが脱離することを利用して、光照射による検出方法、バイオイメージング、ドラッグデリバリーシステムなどを構築することができる。近赤外光としては、近赤外線を発する近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー）などを利用すればよい。また、保持物質を脱離するための逆Diels-Alder反応が起こる熱が加えられればよく、金ナノロッドの光熱変換機能による熱発生に限らず、本発明の金微粒子構造体が分散している系を加熱する方法でもよい。
[Detection and treatment methods]
In the gold fine particle structure of the present invention, gold nanorods convert irradiated near-infrared light into heat, and this heat causes the linker-retaining substance binding site (7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5 -ene-2,3-dicarboxylic imide) undergoes reverse Diels-Alder reaction and is separated, and the retention substance and gold nanorods are desorbed to detect by light irradiation, bioimaging, drug delivery system, etc. Can be built. As the near-infrared light, a near-infrared laser (CW, semiconductor laser) that emits near-infrared light may be used. In addition, it is only necessary to apply heat that causes the reverse Diels-Alder reaction to desorb the holding substance, and not only heat generation by the photothermal conversion function of the gold nanorods but also a system in which the gold fine particle structure of the present invention is dispersed. The method of heating may be used.
保持物質が色素の場合、金ナノロッドから色素が脱離することによって、クエンチされた状態から解かれて、色素固有の蛍光発光を発するようになり、その蛍光を検出することが可能である。特に、生体内へ近赤外光を照射して色素の脱離を起こし、その蛍光を測定して画像化することにより、バイオイメージングが可能となる。 When the holding substance is a dye, the dye is detached from the gold nanorods, so that it is released from the quenched state and emits fluorescence specific to the dye, and the fluorescence can be detected. In particular, bioimaging can be performed by irradiating near-infrared light into a living body to cause desorption of the dye, and measuring the fluorescence to form an image.
保持物質が薬剤の場合、特定部位にある金ナノロッドに近赤外光照射し光熱変換機能で熱を発生させ、この熱で逆Diels-Alder反応を起こして結合部位（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）を開裂させ、薬剤を脱離させることによって、薬物を効率よく放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）を構築することができる。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。 When the retentate is a drug, gold nanorods at a specific site are irradiated with near-infrared light to generate heat by the photothermal conversion function, and this heat causes a reverse Diels-Alder reaction, resulting in a binding site (7-oxa-bicyclo [2.2 .1] Hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide) can be cleaved and the drug can be released to construct a drug delivery system (DDS) that efficiently releases the drug. In particular, gold is a biologically safe material and is useful as a carrier.
ＰＥＧを保持物質として利用した場合は、ＰＥＧ鎖が分散剤として機能するため生体内における金ナノロッドの分散安定性が得られるばかりでなく、近赤外光照射した場合、金ナノロッドの光熱変換機能で発生した熱で逆Diels-Alder反応が起こり、結合部位が開裂してマレイミド部位のＰＥＧが金ナノロッドから脱離するため、分散安定性が失われて金ナノロッドが凝集し、あるいは、周辺組織に吸着させることができ、この金ナノロッドの集積によって生じるLSPRの吸収スペクトルによって金ナノロッドが凝集する部位のイメージングが可能である。 When PEG is used as a retention substance, the dispersion stability of the gold nanorods in the living body can be obtained because the PEG chain functions as a dispersing agent, and when irradiated with near-infrared light, the photothermal conversion function of the gold nanorods The generated heat causes a reverse Diels-Alder reaction, which cleaves the binding site and detaches the PEG at the maleimide site from the gold nanorod, losing dispersion stability and aggregating the gold nanorod or adsorbing to the surrounding tissue It is possible to image the site where gold nanorods aggregate by the absorption spectrum of LSPR generated by the accumulation of gold nanorods.
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例において、金ナノロッドはＣＴＡＢを保護剤として塩化金酸を水中で還元して合成された長軸４０nm、短軸１０nm、アスペクト比４のロッド形状の金微粒子であり（特許文献３参照）、主に９００nm付近の波長域におけるLSPRの吸収波長シフトが測定されているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２００００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。また分光特性は日本分光株式会社製品（製品名V-570）を用いて測定した。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. Moreover, a comparative example is shown. In the following examples, gold nanorods are rod-shaped gold fine particles having a major axis of 40 nm, a minor axis of 10 nm, and an aspect ratio of 4 synthesized by reducing chloroauric acid in water using CTAB as a protective agent (Patent Document). 3), the absorption wavelength shift of LSPR is mainly measured in the wavelength region near 900 nm, but the same absorption wavelength shift can be achieved in the wavelength region from 700 to 20000 nm by changing the aspect ratio of the gold nanorods. Can be measured. Spectral characteristics were measured using a JASCO product (product name: V-570).
〔実施例１〕
以下の手順で、保持物質を結合した金微粒子を得た。製造工程の概念図を図１に示す。
[Example 1]
Gold fine particles to which the holding substance was bound were obtained by the following procedure. A conceptual diagram of the manufacturing process is shown in FIG.
〔金ナノロッド水分散液〕
CTABで表面修飾された金ナノロッドの水分散液を次の手順で準備した。
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドを水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することによって余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドを水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド水分散液（CTAB-NRs、金含有量：１.６mM）を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
[Gold nanorod aqueous dispersion]
An aqueous dispersion of gold nanorods surface-modified with CTAB was prepared by the following procedure.
A gold nanorod aqueous dispersion synthesized in 400 mM CTAB aqueous solution is placed in a centrifuge tube and centrifuged at 14000 (× g) relative centrifugal acceleration (centrifugal acceleration divided by the Earth's gravitational acceleration) for 10 minutes. Nanorods were allowed to settle to the bottom of the centrifuge tube. The supernatant was placed in another centrifuge tube and the settled gold nanorods were redispersed with water. The supernatant in another centrifuge tube was centrifuged again at 14000 (× g) for 10 minutes to settle the gold nanorods, and excess CTAB was removed by removing the supernatant. The precipitated gold nanorods were redispersed with water and combined with the previous redispersion liquid to obtain a gold nanorod water dispersion liquid (CTAB-NRs, gold content: 1.6 mM). The gold atom concentration in the gold nanorod aqueous dispersion was determined from the absorbance.
〔ローダミンＢとフルフリルアミン縮合体の合成〕
保持物質として色素ローダミンＢを準備した。Diels-Alder反応に関わるジエンとしてフランを準備した。ローダミンＢに存在するカルボキシル基とフルフリルアミンに存在するアミノ基との縮合反応を行い、色素をフランに結合した（Fu-RoB、図２）。具体的には、５０mlナスフラスコに、０.５mmolのローダミンＢ、０.６mmolのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide；ＮＨＳ）、０.６mmolの１-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)を入れ、１０mlのＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)に溶解した。この溶液にトリエチルアミン１４μlを氷冷下条件で添加し、０.５mmolのフルフリルアミンを５mlのＤＭＦで溶解した溶液を同様に氷冷下で滴下した。滴下終了から１時間後、室温にて２３時間攪拌反応させた（図２）。
[Synthesis of Rhodamine B and Furfurylamine Condensate]
Dye rhodamine B was prepared as a retention substance. Furan was prepared as a diene involved in the Diels-Alder reaction. A condensation reaction between a carboxyl group present in rhodamine B and an amino group present in furfurylamine was carried out to bind the dye to furan (Fu-RoB, FIG. 2). Specifically, in a 50 ml eggplant flask, 0.5 mmol rhodamine B, 0.6 mmol N-hydroxysuccinimide (NHS), 0.6 mmol 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide hydrochloride (EDC) was added and dissolved in 10 ml N, N-dimethylformamide (DMF). To this solution, 14 μl of triethylamine was added under ice-cooling conditions, and a solution of 0.5 mmol of furfurylamine dissolved in 5 ml of DMF was similarly added dropwise under ice-cooling. One hour after the completion of the dropping, the mixture was stirred at room temperature for 23 hours (FIG. 2).
〔金微粒子表面へのリンカー導入〕
（イ）CTAB-NRs水分散液とｍ-ＰＥＧ-ＳＨ（重量平均分子量２００００）をモル比でNRs（金原子）：ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ＝1：1になるように添加し、２４時間攪拌して、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨが片末端のチオール基でNRs表面に結合した微粒子（PEG-NRs）の水分散液を得た。この水分散液を、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜にて透析して、過剰のＣＴＡＢを取り除いた。透析後の水分散液を１４０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離してNRsに結合していない余剰のｍ-ＰＥＧ-ＳＨを除去し、遠沈管の底に沈降させたNRsを水で再分散後、１０mM（金原子）PEG-NRs水分散液を調整した。
（ロ）このPEG-NRs水分散液に、エタノール、１％ＴＥＯＳ、５％アンモニアを添加し、２４時間攪拌してシリカ層を形成し、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの吸着したNRsがシリカで埋包された微粒子（Si-NRs）のエタノール分散液を得た。調製したSi-NRsエタノール分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で10分間遠心分離してSi-NRsを遠沈管の底に沈降させ、９０％エタノールで再分散させてSi-NRsエタノール分散液を調製した。
（ハ）このSi-NRsエタノール分散液に、ＰＥＩを溶解した９０％エタノールを添加し、モル比でNRs（金原子）：ＰＥＩ＝１０：１になるように調整して２４時間攪拌し、Si-NRs表面にＰＥＩが静電相互作用により吸着した粒子（PEI-NRs）エタノール分散液を得た。
調製したPEI-NRsエタノール分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心し、PEI-NRsを遠沈管の底に沈降させた後、上澄みを除去し、０.２Mリン酸バッファー（pH8.0）に再分散した。
（ニ）再分散したPEI-NRsエタノール分散液にクロスリンカー（Linker、succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)-dodecaethyleneglycol]ester：NHS-PEO12-mal）を加え、モル比でNRs（金原子）：クロスリンカー＝１：６になるように調整して９０分攪拌し、その後、５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離して上澄みを除去し、ＤＭＦで再分散させて、マレイミド部位を有するクロスリンカーが修飾されたNRs（Ma-NRs）のＤＭＦ分散液を得た。
[Introduction of linker to gold fine particle surface]
(I) CTAB-NRs aqueous dispersion and m-PEG-SH (weight average molecular weight 20000) were added at a molar ratio of NRs (gold atom): m-PEG-SH = 1: 1 and stirred for 24 hours. Thus, an aqueous dispersion of fine particles (PEG-NRs) in which m-PEG-SH was bonded to the NRs surface with a thiol group at one end was obtained. This aqueous dispersion was dialyzed with a dialysis membrane having MWCO = 10000 to remove excess CTAB. The dialyzed aqueous dispersion was centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 14000 (× g) for 10 minutes to remove excess m-PEG-SH not bound to NRs, and NRs that had settled at the bottom of the centrifuge tube were removed. After redispersion with water, a 10 mM (gold atom) PEG-NRs aqueous dispersion was prepared.
(B) Ethanol, 1% TEOS, and 5% ammonia are added to the aqueous dispersion of PEG-NRs, and stirred for 24 hours to form a silica layer. The NRs adsorbed with m-PEG-SH are embedded in silica. An ethanol dispersion of the fine particles (Si-NRs) was obtained. The prepared Si-NRs ethanol dispersion is centrifuged for 10 minutes at a relative centrifugal acceleration of 5000 (xg), Si-NRs is settled on the bottom of the centrifuge tube, and re-dispersed with 90% ethanol to disperse Si-NRs ethanol. A liquid was prepared.
(C) To this Si-NRs ethanol dispersion, 90% ethanol in which PEI is dissolved is added, adjusted to a molar ratio of NRs (gold atoms): PEI = 10: 1, and stirred for 24 hours. A particle (PEI-NRs) ethanol dispersion in which PEI was adsorbed on the surface of -NRs by electrostatic interaction was obtained.
The prepared PEI-NRs ethanol dispersion was centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 5000 (× g) for 10 minutes to allow PEI-NRs to settle on the bottom of the centrifuge tube, and then the supernatant was removed, and a 0.2 M phosphate buffer ( Redispersed to pH 8.0).
(D) Cross-linker (Linker, succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido) -dodecaethyleneglycol] ester: NHS-PEO 12 -mal) is added to the redispersed PEI-NRs ethanol dispersion, and NRs (gold atoms) in molar ratio: Crosslinker is adjusted to 1: 6 and stirred for 90 minutes, then centrifuged at 5000 (× g) relative centrifugal acceleration for 10 minutes to remove the supernatant, redispersed with DMF, and maleimide site A DMF dispersion of NRs (Ma-NRs) modified with a crosslinker having
〔保持物質ローダミンＢの導入〕
上記Ma-NRsのＤＭＦ分散液と、図２の縮合体(Fu-RoB)のＤＭＦ分散液を混合し、NRｓ（金原子）：Fu-RoB＝１：９になるように調整し、６０℃で24時間攪拌し、Diels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、金ナノロッドにローダミンＢを結合させた（RoB-NRs、図１）。調製したRoB-NRsのＤＭＦ分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し、RoB-NRsを遠沈管底に沈降させた後、上澄みを除去し、未反応のローダミンBを取り除くために、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜で透析した。透析後、５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心し、上澄みを除去した後、水で再分散させて金濃度０.５mMに調整し、ローダミンＢが7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを介して金ナノロッドに結合した微粒子（DA-NRs）の水分散液を得た。このDA-NRの分光特性を図３に示す。
[Introduction of retention substance Rhodamine B]
The above-mentioned Ma-NRs DMF dispersion and the condensate (Fu-RoB) DMF dispersion of FIG. 2 are mixed and adjusted so that NRs (gold atom): Fu-RoB = 1: 9, and 60 ° C. The mixture was stirred for 24 hours, and 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide was formed by Diels-Alder reaction, and rhodamine B was bound to gold nanorods (RoB- NRs, Figure 1). The prepared DMF dispersion of RoB-NRs is centrifuged for 10 minutes at a relative centrifugal acceleration of 5000 (× g), RoB-NRs is allowed to settle on the bottom of the centrifuge tube, the supernatant is removed, and unreacted rhodamine B is removed. In order to remove, it dialyzed with the dialysis membrane of MWCO = 10000. After dialysis, the mixture was centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 5000 (× g) for 10 minutes, the supernatant was removed, and then redispersed with water to adjust the gold concentration to 0.5 mM. Rhodamine B was 7-oxa-bicyclo [2.2. 1] An aqueous dispersion of fine particles (DA-NRs) bonded to gold nanorods via hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide was obtained. The spectral characteristics of this DA-NR are shown in FIG.
〔保持物質(ローダミンＢ)の放出〕
上記Da-NRの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー、８０７nm）を５００mWで１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間照射した。この結果、逆Diels-Alder反応によって、色素ローダミンＢが金ナノロッドより放出され、クエンチされていたローダミンＢの蛍光スペクトルが５８０nm付近に観察された。この蛍光スペクトルを図４に示す。
[Release of retention substance (rhodamine B)]
100 μl of the above aqueous dispersion of Da-NR was placed in a glass tube, and irradiated with a near infrared laser (CW, semiconductor laser, 807 nm) at 500 mW for 1, 5, 10, 20, and 30 minutes. As a result, the dye Rhodamine B was released from the gold nanorods by the reverse Diels-Alder reaction, and the fluorescence spectrum of the quenched Rhodamine B was observed at around 580 nm. This fluorescence spectrum is shown in FIG.
〔参考例１〕
上記DA-NRの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、９０℃で３時間加熱した。この結果、逆Diels-Alder反応によって、ローダミンＢが金ナノロッドより放出され、クエンチされていたローダミンＢの蛍光スペクトルが５８０nm付近に観察された。この蛍光スペクトルを図４に示す。
[Reference Example 1]
100 μl of the DA-NR aqueous dispersion was placed in a glass tube and heated at 90 ° C. for 3 hours. As a result, rhodamine B was released from the gold nanorods by the reverse Diels-Alder reaction, and the fluorescence spectrum of rhodamine B that had been quenched was observed at around 580 nm. This fluorescence spectrum is shown in FIG.
〔実施例２〕
以下の手順で、保持物質を結合した金微粒子を得た。製造工程の概念図を図５に示す。
[Example 2]
Gold fine particles to which the holding substance was bound were obtained by the following procedure. A conceptual diagram of the manufacturing process is shown in FIG.
〔ＰＥＧ修飾マレイミドとフランの反応〕
保持物質としてα−［3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコールを準備した。Diels-Alder反応に関わるジエンとしてフランを準備した。１０ml遠沈管に０．０１mmolのα−［3-（3マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコール（重量平均分子量５０００）、０.２mmolのフルフリルジスルフィドを入れ、５mlのDMFに溶解した。この溶液を６０℃、７２時間攪拌反応させた。反応後、室温に戻し、１mmolのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、２４時間攪拌反応させ、スルフィド部位を開裂してチオール基とした。反応後、ＤＭＦをローターリーエバポレーターで留去し、ＭＷＣＯ＝３５００の透析膜にて、未反応のフランと残留ＤＴＴを取り除き、凍結乾燥にて目的物（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）を得た（図６）。
[Reaction of PEG-modified maleimide and furan]
Α- [3- (3-Maleimido-1-oxopropyl) amino] propyl-ω-methoxypolyethylene glycol was prepared as a holding material. Furan was prepared as a diene involved in the Diels-Alder reaction. Into a 10 ml centrifuge tube, 0.01 mmol of α- [3- (3maleimido-1-oxopropyl) amino] propyl-ω-methoxypolyethylene glycol (weight average molecular weight 5000), 0.2 mmol of furfuryl disulfide was placed. Dissolved in DMF. This solution was reacted by stirring at 60 ° C. for 72 hours. After the reaction, the temperature was returned to room temperature, 1 mmol of dithiothreitol (DTT) was added, and the mixture was allowed to stir for 24 hours to cleave the sulfide site to obtain a thiol group. After the reaction, DMF was distilled off with a rotary evaporator, unreacted furan and residual DTT were removed by a dialysis membrane with MWCO = 3500, and the target product (PEG-DA-SH) was obtained by lyophilization (Fig. 6).
〔金微粒子表面へのリンカーと保持物質の導入〕
ＣＴＡＢを除去していないNRs水分散液と、上記ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ（重量平均分子量５０００）をモル比で、NRｓ(金原子)：ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ＝１：０.２になるように添加し、２４時間攪拌して、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨが片末端のチオール基でNRs表面に結合した微粒子（PEG-DA-NRs）水分散液を得た（図５）。この水分散液を、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜にて透析して、過剰のＣＴＡＢを取り除いた。透析後の水分散液を１４０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離してNRsに結合していない余剰のＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨを除去し、遠沈管の底に沈降させたNRsを水で再分散させ、金濃度０.５mMに調整し、ＰＥＧが7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを介してNRsに結合した金微粒子（PEG-DA-NRs）の水分散液を得た。このPEG-DA-NRsの分光特性を図７に示す。
[Introduction of linker and retention substance to the surface of gold fine particles]
NRs aqueous dispersion from which CTAB is not removed and the above PEG-DA-SH (weight average molecular weight 5000) in a molar ratio such that NRs (gold atom): PEG-DA-SH = 1: 0.2. The mixture was added and stirred for 24 hours to obtain an aqueous dispersion of fine particles (PEG-DA-NRs) in which PEG-DA-SH was bonded to the NRs surface with a thiol group at one end (FIG. 5). This aqueous dispersion was dialyzed with a dialysis membrane having MWCO = 10000 to remove excess CTAB. The dialyzed aqueous dispersion was centrifuged at a relative centrifugal acceleration of 14000 (× g) for 10 minutes to remove excess PEG-DA-SH that was not bound to NRs, and NRs that had settled at the bottom of the centrifuge tube were removed. Gold fine particles (PEG), redispersed in water, adjusted to a gold concentration of 0.5 mM, and PEG bound to NRs via 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide -DA-NRs) was obtained. The spectral characteristics of the PEG-DA-NRs are shown in FIG.
〔保持物質(ＰＥＧ)の放出〕
上記PEG-DA-NRsの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー、８０７nm）を５００mWで１０分間照射した。この結果、逆Diels-Alder反応によってＰＥＧがNRsより放出された。このＰＥＧについてバリウムーヨウ素法によって濁度として５３５nmの吸収波長を分光時計にて測定した。この結果を表１に示す。
(Release of retention substance (PEG))
100 μl of the above PEG-DA-NRs aqueous dispersion was put in a glass tube, and irradiated with a near infrared laser (CW, semiconductor laser, 807 nm) at 500 mW for 10 minutes. As a result, PEG was released from NRs by the reverse Diels-Alder reaction. With respect to this PEG, an absorption wavelength of 535 nm was measured with a spectroscopic clock as turbidity by the barium-iodine method. The results are shown in Table 1.
〔参考例２〕
上記PEG-DA-NRsの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、９０℃で２時間加熱した。この結果、逆Diels-Alder反応によってＰＥＧがNRsより放出された。このＰＥＧについてバリウムーヨウ素法によって濁度として５３５nmの吸収波長を分光時計にて測定した。この結果を表１に示す。
[Reference Example 2]
100 μl of the above PEG-DA-NRs aqueous dispersion was placed in a glass tube and heated at 90 ° C. for 2 hours. As a result, PEG was released from NRs by the reverse Diels-Alder reaction. With respect to this PEG, an absorption wavelength of 535 nm was measured with a spectroscopic clock as turbidity by the barium-iodine method. The results are shown in Table 1.
Claims (4)
保持物質がローダミンＢ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Alexa Fluor 488、およびAlexa Fluor750からなる群から選択される色素、あるいは、ドキソルビシンおよびパクリタキセルからなる群から選択される薬剤であり、
金ナノロッド表面にポリエチレングリコールが結合しており、該ポリエチレングリコールの上にシリカ層が形成されており、該シリカ層にポリエチレンイミン層が積層されており、該ポリエチレンイミン層にマレイミドが結合しており、
一方、保持物質にフランが結合しており、該フランが上記マレイミドとの反応生成物である７−オキサ−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボン酸イミドによって結合していることを特徴とする金ナノロッド構造体。
The holding substance is bonded to the gold nanorod through the following reaction product,
A retention substance is a dye selected from the group consisting of rhodamine B, fluorescein, Cy3, Cy5, Alexa Fluor 488, and Alexa Fluor 750 , or a drug selected from the group consisting of doxorubicin and paclitaxel;
Polyethylene glycol is bonded to the gold nanorod surface, a silica layer is formed on the polyethylene glycol, a polyethyleneimine layer is laminated on the silica layer, and maleimide is bonded to the polyethyleneimine layer. ,
On the other hand, furan is bonded to the holding substance, and the furan is bonded by 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide which is a reaction product with maleimide. A gold nanorod structure characterized by comprising:
一方、ローダミンＢ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Alexa Fluor 488、およびAlexa Fluor750からなる群から選択される色素、あるいは、ドキソルビシンおよびパクリタキセルからなる群から選択される薬剤である保持物質の溶解液に、フラン溶解液を添加して該保持物質にフランを結合させ、
マレイミドが表面に結合した上記金ナノロッドの分散液と、フランが結合した上記保持物質の分散液を混合し、上記マレイミドと上記フランとの反応生成物である７−オキサ−ビシクロ[2.2.1]ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボン酸イミドを形成することによって保持物質が金ナノロッドに結合した金ナノロッド構造体を製造する方法。
Polyethylene glycol is added to the dispersion of gold nanorods with surfactant adsorbed on the surface to replace the surfactant on the surface of the gold nanorods with polyethylene glycol, and the silicate compound is dissolved in the dispersion of gold nanorods bonded with polyethylene glycol. A liquid is added to form a silica layer enclosing polyethylene glycol, and a polyethyleneimine solution is added to a dispersion of gold nanorods having the silica layer to form a polyethyleneimine layer on the surface of the silica layer. A maleimide solution is added to a dispersion of gold nanorods having an imine layer to prepare gold nanorods in which the maleimide is bonded to the surface of the polyethyleneimine layer,
On the other hand, a dye selected from the group consisting of rhodamine B, fluorescein, Cy3, Cy5, Alexa Fluor 488, and Alexa Fluor 750 , or a retention substance solution that is a drug selected from the group consisting of doxorubicin and paclitaxel. lysates were by joining furan to the retentate added,
7-Oxabicyclo [2.2.1] , which is a reaction product of the maleimide and the furan, is prepared by mixing the dispersion of the gold nanorod with the maleimide bonded to the surface and the dispersion of the holding material with the furan bonded thereto . A method for producing a gold nanorod structure in which a holding substance is bonded to a gold nanorod by forming hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide .
該反応生成物
がそのチオール基によって金ナノロッド表面に結合していることを特徴とする金ナノロッド構造体。
7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic acid in which the retention substance is polyethylene glycol (PEG) containing maleimide, and the furan having a thiol group is a reaction product with the maleimide. A gold nanorod structure, wherein the gold nanorod structure is bonded to the PEG by an acid imide , and the reaction product is bonded to the gold nanorod surface by a thiol group.
このフランが結合したＰＥＧと、金ナノロッド の分散液とを混合し、該反応生成物のチオール基を金ナノロッド表面に結合させてＰＥＧが反応生成物を介して金ナノロッドに結合した金ナノロッド構造体を製造する方法。
Polyethylene glycol (PEG) containing maleimide is reacted with furan having a thiol group, and the reaction product 7-oxa-bicyclo [2.2.1] hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide is reacted with PEG. Combine the francs,
This furan-bonded PEG and a gold nanorod dispersion are mixed, the thiol group of the reaction product is bonded to the gold nanorod surface, and the PEG is bonded to the gold nanorod via the reaction product. How to manufacture.
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