JP5676892B2 - サイトグロビン遺伝子ノックアウト非ヒト癌モデル動物 - Google Patents
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アミノ酸からなり分子量21,496ダルトンであることが判った(非特許文献11)。この蛋白質をstellate cell-activation associated protein (STAP)と名付けた。その後、この蛋白質は他のグロビンと似ていることから、サイトグロビン(cytoglobin, Cygb)と呼ばれるようになった(非特許文献12)。このCygb(ラット)のN末端側NH2-MEKVPGDMEIERRERNEE+Cys-COOHを抗原としてウサギに免疫して抗ペプチド抗体を作製した。この抗体を用いて免疫染色をすると、ラット分離培養した星細胞の活性化に伴い細胞内で蛋白質は発現増加した。また、ラットに肝臓毒であるチオアセトアミドを用いて肝硬変に近い線維化を誘導するとその線維隔壁に沿って、平滑筋型α-アクチン陽性の星細胞が存在する位置にCygbが強陽性であった。これらの知見から、Cygbは星細胞の活性化や肝臓の線維化と密接に関係する分子であることが判った。
項1. サイトグロビン遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の、癌のモデル動物としての使用。
項2. 癌が、乳癌、リンパ腫、肝癌、又は肺癌である、項1に記載の使用。
項3. 非ヒト動物がマウスである、項1又は2に記載の使用。
項4. サイトグロビン遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物に、被験物質を投与し、癌の発症率及び重症度を評価することを特徴とする、癌の予防又は治療薬のスクリーニング方法。
項5. サイトグロビン遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の組織と、比較対象組織との間で被験物質の発現プロファイルを比較する工程、及び
前記非ヒト動物の組織における被験物質の発現が、比較対象組織における発現と比べて変動している被験物質を、癌マーカーとして選択する工程を含む、癌のマーカーのスクリーニング方法。
項6. 癌が、乳癌、リンパ腫、肝癌、又は肺癌である、項4又は5に記載のスクリーニング方法。
本発明で使用される非ヒト動物は、サイトグロビン(Cygb)遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物である。
上記「1.Cygb遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の、癌のモデル動物としての使用」欄に記載されるCygb遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、癌の予防又は治療薬のスクリーニングに使用できる。
上記「1.Cygb遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の、癌のモデル動物としての使用」欄に記載されるCygb遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、癌のマーカーのスクリーニングに使用できる。
本発明で使用されるCyb遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の製造方法については特に制限されず、通常のノックアウト動物の製造方法と同様に実施されるが、一例としてCygb遺伝子が不活性化された胚幹細胞を胚盤胞に導入して得られるキメラ胚を、対象動物の雌の子宮に着床させることにより、キメラ動物を得る方法が例示される。より具体的には、以下に説明する工程(1)〜(6)を経ることにより、本発明で使用される非ヒト動物を得ることができる。
先ず、CygbのゲノムDNAのフラグメントをクローニングする(工程(1))。
次いで、前記工程(1)で得られたフラグメントを改変して、Cygb遺伝子をノックアウトさせる改変フラグメントを作製する(工程(2))。具体的には、前記工程(1)で得られたフラグメントに対して、欠失、置換又は付加を行うことにより、Cygb遺伝子を不活性化する改変フラグメントを得ることができる。前記工程(1)で得られたフラグメントにおいて改変がなされる部位には、Cygb遺伝子のコード領域、好ましくはエクソン1又は2が含まれていることが望ましい。
次いで、前記工程(2)で得られた改変フラグメントが組み込まれたターゲッティングベクターを作製する(工程(3))。
次いで、前記工程(3)で得られたターゲッティングベクターを胚性幹細胞に相同組み換えを行うことにより、Cygb遺伝子がノックアウトされた胚性幹細胞を作製する(工程(4))。
次いで、前記工程(4)で得られたCygb遺伝子がノックアウトされた胚性幹細胞が導入されたキメラ胚を作製する(工程(5))。
次いで、前記工程(5)で得られたキメラ胚を雌非ヒト動物の子宮に着床させて、キメラ動物を発生させる(工程(6))。
ブロット解析やPCRアッセイ等を行うことにより、所望のキメラ動物が得られたことを確認することも可能である。
前記工程(6)で得られたキメラ動物同士を交配させることにより、ヘテロ接合体のCygb遺伝子ノックアウト非ヒト動物、又はホモ接合体のCygb遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物を得ることができる。得られたCygb遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物が、ヘテロ接合体であるか、或いはホモ接合体であるかについては、サザンブロット法等の公知の解析手法によって確認できる。
実施例1 Cygb遺伝子ノックアウトマウスの作製及び確認
(1) Cygb遺伝子ノックアウトマウスの作製
マウス129SvゲノムDNAから、PCR法によりCygb遺伝子の5′上流域の6.0kbDNAフラグメントをクローニングした。このフラグメントは、CygbゲノムDNAの5’UTRおよびエクソン1の一部を有する。さらに、マウス129SvゲノムDNAから、PCR法によりCygb遺伝子の3′下流域の6.5kbDNAフラグメントをクローニングした。このフラグメントは、サイトグロビンゲノムDNAのエクソン3,4および3’UTRを有する。上流6.0kbDNAフラグメントの下流にホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター/ネオマイシン抵抗遺伝子カセット(PGK-neo-ATG)を結合し、さらにその下流に、6.5kbのDNAフラグメントを結合した。ネオマイシン抵抗遺伝子カセットは、両側をバクテリオファージP1のloxPとよばれる部位特異的組換え配列で挟まれている。この改変フラグメントを、プラスミドベクターpBluescript II(ストラタジーン株式会社)に組み込んで、ターゲッティングベクターpTVneo/Cygbを得た(図1参照)。
上記で作製されたマウス尾からDNAを抽出し、PCRを行いCygb遺伝子とネオマイシン遺伝子の存在をプライマー[CTCCCAGCCGGGACCGCGGTGGCCTT (両者に共通するforward primer;配列番号1), GGAGCCGAGGCCGGTGCGTGCGAGGC (Cygbに対するreverse primer;配列番号2), GTGGGGTGGGATTAGATAAATGCCTGCTCT (Neoに対するreverse primer;配列番号3)]で検討したところ、野生型ではCygb+/Neo-、ヘテロマウスではCygb+/Neo+であり、ホモマウスでは完全にCygb遺伝子がノックアウトされていた(図2参照)。更に、上記で作製されたマウスの肝臓をホモゲネートし、その10μgをSDS-PAGEで分離後、抗ラットCygbペプチド抗体(Kawada N, KristensenDB, et al. J Biol Chem. 2001;276:25318)を用いてウエスタンブロット法でCygb蛋白発現を確認したところ、ヘテロマウスではCygb蛋白質が半分に減少し、ホモマウスでは完全にCygb蛋白質がほぼ発現していないことを確認した(図3参照)。
。ハイブリダイゼーションは65℃ 16時間、メンブレンの洗浄は、0.1 x SSC/0.1%SDS、65℃で30分行った。次いで、NBT/BCIT(nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)を加えて染色を行った。その結果、野生型マウスではCygb遺伝子が検出されたが、ホモマウスではCygb遺伝子がノックアウトされていることを確認した(図4参照)。
自然発生中のCygb遺伝子ノックアウトホモマウス及びCygb遺伝子ノックアウトヘテロマウスの雌について、生後半年以上観察し得たものについて、乳腺組織における癌の発生を、肉眼、及びホルマリン固定後パラフィン包埋しヘマトキシリン・エオシン(HE)染色した5μm厚切片の顕微鏡観察により組織学的所見を評価した。結果を表1及び図6に示す。観察した10匹のヘテロマウスについては、正常であったものは1匹のみであった。1匹で乳腺上皮の腺腫(Adenoma)、6匹で乳癌(非浸潤性乳管癌(Ductal carcinoma in situ)あるいは乳腺癌(Adenocarcinoma))、2匹で悪性リンパ腫(Maligant lymphoma)の発生が認められた。観察した1匹のホモマウスについては、乳癌(Adenocarcinoma)の発生が認められた。一方、対照の野生型マウス10匹においては、観察期間中に腫瘍形成は認められなかった。
上記実施例1で得られたCygb遺伝子ノックアウトヘテロマウス及びCygb遺伝子ノックアウトホモマウスについて、ジエチルニトロサミンを継続投与したものの特性を評価するために、生育及び生理学的特徴を経時的に観察した。
配列番号2は、配列番号1に示される塩基配列のプライマーと共に用いて、Cygb遺伝子の存在を確認するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号3は、配列番号1に示される塩基配列のプライマーと共に用いて、ネオマイシン遺伝子の存在を確認するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号4および5は、マウスサイトグロビン遺伝子の断片を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号6および7は、マウスER遺伝子cDNAの断片を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号8および9は、マウスPR遺伝子cDNAの断片を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号10および11は、マウスHER2/Neu遺伝子cDNAの断片を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号12および13は、マウスGADPH遺伝子cDNAの断片をを増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
Claims (4)
- サイトグロビン遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の、乳癌、リンパ腫、肝癌、又は肺癌のモデル動物としての使用。
- 非ヒト動物がマウスである、請求項1に記載の使用。
- サイトグロビン遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物に、被験物質を投与し、乳癌、リンパ腫、肝癌、又は肺癌の発症率及び重症度を評価することを特徴とする、乳癌、リンパ腫、肝癌、又は肺癌の予防又は治療薬のスクリーニング方法。
- サイトグロビン遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の組織と、比較対象組織との間で被験物質の発現プロファイルを比較する工程、及び
前記非ヒト動物の組織における被験物質の発現が、比較対象組織における発現と比べて変動している被験物質を、乳癌、リンパ腫、肝癌、又は肺癌のマーカーとして選択する工程を含む、乳癌、リンパ腫、肝癌、又は肺癌のマーカーのスクリーニング方法。
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