JP5674760B2

JP5674760B2 - 移植可能な生体材料への免疫細胞の結合に対するリガンド特異的阻害

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Publication number: JP5674760B2
Application number: JP2012504891A
Authority: JP
Inventors: スタンリージェイ．スタチェレック，; デニスディッシャー，; ロバートジェイ．レビー，; マサコウエダ，; リチャードツァイ，
Original assignee: ザチルドレンズホスピタルオブフィラデルフィア; ザトラスティーズオブザユニバーシティオブペンシルバニア
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2030-04-09
Also published as: JP2012523292A; JP2015044078A; US20150306284A1; AU2010233152A1; EP2416815A1; AU2010233152B2; CA2757842A1; EP2416815B1; WO2010118335A1; US20120251586A1; EP2416815A4

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条の下、２００９年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６１／２４８，６１８号、および２００９年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／１６７，９９１号の優先権を主張し、この米国仮特許出願の双方の内容は、その全体においてかつ全ての目的のために、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、一般に、免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、特に、生体材料が動物の身体へと移植される場合に、上記生体材料を免疫細胞媒介性損傷から保護することに関する。

（発明の背景）
種々の刊行物（特許、出願公開公報、技術的文献および学術文献を含む）は、本明細書全体を通して引用される。これら引用される刊行物の各々は、その全体においてかつ全ての目的のために、本明細書に参考として援用される。

移植可能なポリウレタン（ＰＥ）含有デバイスの材料分解は、慢性炎症の結果として、未だ生体材料研究において重大な問題のままである。接着性単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）から放出される反応性酸素種（ＲＯＳ）は、ＰＥ含有血管インプラント（例えば、ペースメーカー導線の絶縁）において観察される構造的損傷においてある役割をはたす（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ＭＡら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３４：５１９−３０；Ｌａｂｏｗ，ＲＳら（２００２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２３：３９６９−７５；およびＳａｎｔｅｒｒｅ，ＪＰら（２００５）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２６：７４５７−７０）。フェノールベースの抗酸化剤でＰＥのバルク調製物を改変すると、ＰＥフィルムに対する上記ＲＯＳ媒介性損傷が効率的に低減させるが、上記改変は、上記抗酸化能は、酸素ラジカルと反応した後に使い果たされてしまう（Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ，ＳＪら（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．７８：６５３−６１；Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ，ＳＪら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．８２：１００４−１１；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ＭＡら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３２：４９３−５０４；およびＳｃｈｕｂｅｒｔ，ＭＡら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３４：４９３−５０５）という事実によって制限されている。

免疫細胞活性化を阻害しようとする以前の試みは、表面に適応した分子がタンパク質吸着を低下させるという考えで、上記ＰＥ表面に、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）もしくはトリブロックフッ素化高分子のような分子を付加することによって、上記ＰＥ表面を改変するために同時ブレンド（ｃｏ−ｂｌｅｎｄｉｎｇ）ストラテジーを大いに使用してきた（Ｍａｓｓａ，ＴＭら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．８１：１７８−８５；Ｗａｒｄ，Ｒら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．８０：３４−４４；およびＥｂｅｒｔ，Ｍら（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．７５：１７５−８４）。これら同時ブレンドストラテジーは、実際には、ＭＤＭ活性化のレベルを低下させたが、送達ストラテジーとしての同時ブレンドは、一部は、同時ブレンドが効果がないので限界がある。なぜなら治療分子の全てが、必要とされるＰＥフィルム表面に適応するわけではなく；そして同時ブレンドは、上記ＰＥフィルムの物理的特性を変化させるからである。

生体材料の物理的特性を変化させない、該生体材料のより効率的な保護が、当該分野で必要とされている。

（発明の要旨）
本発明は、生体材料を保護するための、および生体材料への免疫細胞結合を阻害もしくは防止するための方法を提供する。一般に、上記方法は、ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインを生体材料の表面に結合させる工程を包含する。上記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、上記生体材料への免疫細胞結合および／もしくは免疫細胞媒介性損傷を阻害もしくは低下させることによって、生体材料を保護する。上記方法は、生体材料への免疫細胞結合もしくは免疫細胞媒介性損傷を、インビトロもしくはインビボで阻害もしくは低下させるために使用され得る。

本発明はまた、上記生体材料への免疫細胞結合および／もしくは免疫細胞媒介性損傷から保護された生体材料を提供する。例えば、保護された生体材料は、上記生体材料の表面に結合されているＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインを含む。上記生体材料は、上記生体材料の表面上に少なくとも１種の連結分子をさらに含む。上記連結分子は、上記表面への上記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインの結合を媒介する。

好ましい生体材料は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリフルオロテトラエチレン、もしくはポリビニル、またはこれらの混合物のようなポリマーを含む。上記方法は、とりわけ、インプラント、カテーテル、医療用デバイス、チューブ、もしくは治療剤送達ビヒクルにおける生体材料を保護するために使用され得る。従って、インプラント、カテーテル、医療用デバイス、チューブ、もしくは治療剤送達ビヒクルは、１種以上の生体材料を含み得、そして／または１種以上の生体材料でコーティングされ得る。

上記生体材料の表面は、上記生体材料とＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインとの相互作用を媒介するように、少なくとも１種の連結分子を含むように改変され得る。さらに、上記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、少なくとも１種の連結分子と複合体化されて、上記生体材料もしくは上記生体材料上の連結分子とのその相互作用を媒介し得る。連結分子の例としては、アビジン、ビオチン、チオール、フォレート（ｆｏｌａｔｅ）、葉酸レセプター、ＳＰＤＰ、およびＳＭＣＣが挙げられる。

上記の方法は、生体材料を、任意の免疫細胞結合もしくは任意の免疫細胞によって誘導される損傷から保護するために使用され得る。好ましくは、上記免疫細胞としては、ＳＩＲＰ−αを発現する。例示的免疫細胞としては、単球およびマクロファージ、ならびに多形核細胞（例えば、好中球）が挙げられる。本発明の方法によって阻害もしくは低下させられる損傷は、炎症性応答（例えば、免疫細胞によって放出され、宿主および／もしくは上記移植された生体材料に対して有害な作用を有し得るサイトカイン、反応性酸素種、もしくは加水分解酵素が挙げられるが、これらに限定されない）に直接関連する。

本発明はまた、生体材料を保護するためのキットを提供する。一般に、上記キットは、ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメイン、ならびに生体材料を保護するための方法および／または生体材料への免疫細胞の結合を阻害もしくは低下させるための方法において上記キットを使用するための説明書を含む。上記キットは、上記生体材料の表面もしくはＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインに結合され得る１種以上の連結分子を含み得る。連結分子の例としては、アビジン、ビオチン、チオール、フォレート、葉酸レセプター、ＳＰＤＰ、およびＳＭＣＣが挙げられる。上記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、連結分子と予め複合体化され得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
生体材料を保護するための方法であって、該方法は、ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインを、該生体材料の表面に結合する工程を包含し、ここで該ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、該生体材料への免疫細胞媒介性損傷を阻害もしくは低下させる、方法。
（項目２）
前記生体材料は、ポリマーを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ポリマーは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリフルオロテトラエチレン、もしくはポリビニル、またはこれらの混合物である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ポリマーは、ポリウレタンである、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記ポリマーは、ポリビニルクロリドである、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記生体材料は、インプラントの表面に存在する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記生体材料は、医療用デバイスの表面に存在する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記生体材料は、チューブの表面に存在する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記生体材料は、治療剤送達ビヒクルの表面上に存在する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記インプラントは、前記生体材料を含む、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記インプラントは、前記生体材料でコーティングされている、項目６に記載の方法。
（項目１２）
前記医療用デバイスは、前記生体材料を含む、項目７に記載の方法。
（項目１３）
前記医療用デバイスは、前記生体材料でコーティングされている、項目７に記載の方法。
（項目１４）
前記チューブは、前記生体材料を含む、項目８に記載の方法。
（項目１５）
前記チューブは、前記生体材料でコーティングされている、項目８に記載の方法。
（項目１６）
前記治療剤送達ビヒクルは、前記生体材料を含む、項目９に記載の方法。
（項目１７）
前記治療剤送達ビヒクルは、前記生体材料でコーティングされている、項目９に記載の方法。
（項目１８）
前記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、前記生体材料への免疫細胞媒介性損傷をインビトロで阻害もしくは低下させる、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、前記生体材料への免疫細胞媒介性損傷をインビボで阻害もしくは低下させる、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記生体材料の表面は、少なくとも１種の連結分子を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記連結分子は、アビジンである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記連結分子は、チオールを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記連結分子は、フォレートである、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記連結分子は、葉酸レセプターである、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、連結分子と複合体化される、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記連結分子は、ＳＰＤＰもしくはＳＭＣＣである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記連結分子は、フォレートである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記連結分子は、葉酸レセプターである、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記連結分子は、ビオチンである、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記免疫細胞は、ＳＩＲＰ−αを発現する、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記免疫細胞は、単球もしくはマクロファージである、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記損傷は、酸化的損傷もしくは炎症性損傷である、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記インプラントは、ペースメーカー導線である、項目６に記載の方法。
（項目３４）
前記チューブは、心肺バイパスの一部である、項目８に記載の方法。
（項目３５）
生体材料を保護するためのキットであって、該キットは、ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメイン、および項目１に記載の方法に従って該キットを使用するための説明書を含む、キット。
（項目３６）
前記生体材料の表面に結合され得る連結分子をさらに含む、項目３５に記載のキット。
（項目３７）
前記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインに結合され得る連結分子をさらに含む、項目３５に記載のキット。
（項目３８）
前記連結分子は、アビジンである、項目３６に記載のキット。
（項目３９）
前記連結分子は、葉酸レセプターである、項目３６に記載のキット。
（項目４０）
前記連結分子は、ビオチンである、項目３７に記載のキット。
（項目４１）
前記連結分子は、ＳＰＤＰもしくはＳＭＣＣである、項目３８に記載のキット。
（項目４２）
前記連結分子は、フォレートである、項目３８に記載のキット。
（項目４３）
前記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、ＳＰＤＰもしくはＳＭＣＣと複合体化される、項目３５に記載のキット。
（項目４４）
前記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、ビオチンと複合体化される、項目３５に記載のキット。
（項目４５）
前記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、フォレートと複合体化される、項目３５に記載のキット。
（項目４６）
生体材料への免疫細胞結合を阻害もしくは低下させるための方法であって、該方法は、ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインを該生体材料の表面に結合させる工程を包含し、ここで該ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインは、該生体材料への免疫細胞結合を阻害もしくは低下させる、方法。
（項目４７）
前記生体材料は、ポリマーを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記ポリマーは、ポリウレタンである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ポリマーは、ポリビニルクロリドである、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記免疫細胞は、ＳＩＲＰ−αを発現している、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
前記免疫細胞は、単球もしくはマクロファージである、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
前記免疫細胞は、多形核白血球である、項目１に記載の方法。
（項目５３）
前記多形核白血球は、好中球である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記免疫細胞は、多形核白血球である、項目４６に記載の方法。
（項目５５）
前記多形核白血球は、好中球である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
生体材料であって、ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインが該生体材料の表面に結合された、生体材料。
（項目５７）
前記生体材料の表面に少なくとも１種の連結分子をさらに含む、項目５６に記載の生体材料。
（項目５８）
前記少なくとも１種の連結分子は、前記表面への前記ＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインの結合を媒介する、項目５７に記載の生体材料。

図１は、ＣＤ４７を、光活性化されたポリウレタン表面に、二官能性架橋剤であるＳＰＤＰを使用して付加するための化学反応スキームを示す。図２は、ＳＩＲＰ−αがＰＥへのＭＤＭ結合機構に関与することを示す。ＴＨＰ−１系由来のヒトＭＤＭ細胞を、ホルボールエステルで活性化し、漸増濃度の抗ＳＩＲＰ−α抗体の存在下で、ＰＥフィルム上で培養した。４８時間後、フィルムを洗浄し、上記ＰＥフィルムへの接着について評価した。これらデータは、抗ＳＩＲＰが、ＰＥフィルムへのＴＨＰ−１細胞の結合をブロックすることを示す。図３Ａおよび図３Ｂは、ＰＥ表面へのＣＤ４７の固定化を示す。（Ａ）は、表面固定化アビジンとの反応によって、ＰＥフィルム上へのビオチン化ＣＤ４７の固定化を図示する模式図を示す。（Ｂ）は、ＣＤ４７固定化ＰＥ表面において強いシグナルを示す、固定化ＣＤ４７の免疫蛍光検出のために使用した抗ＣＤ４７抗体およびＦＩＴＣ結合体化種特異的抗体を示す。図４は、表面固定化ＣＤ４７が、ＰＥへのＭＤＭ結合を阻害することを示す。ＰＥ表面を、光反応性化学物質を介した上記表面へ漸増濃度のビオチン化ＣＤ４７を固定化することによって改変した。ヒトＭＤＭ細胞系の細胞であるＴＨＰ−１を、ホルボールエステルで活性化し、上記ＣＤ４７改変ＰＥフィルム上で培養した。４８時間後、フィルムを洗浄し、４８時間にわたって上記改変フィルム上で培養したＴＨＰ−１細胞の上記ＰＥフィルムへの接着について評価した。ＰＥ表面へのＴＨＰ−１細胞の接着は、固定化ＣＤ４７の存在によって著しく阻害された。図５Ａ〜５Ｃは、ＰＶＣチューブの表面上のＨＬ−６０好中球の核染色を示す。ＰＶＣチューブを、その表面上にＣＤ４７を固定化することによって改変した。好中球系の細胞であるＨＬ−６０を、表面改変ＰＶＣチューブおよびコントロールＰＶＣチューブ中に入れ、数時間にわたってインキュベートした。（Ａ）は、非改変ＰＶＣチューブ類に接着したＤＡＰＩ染色した好中球を示す。（Ｂ）は、その表面上にアビジン固定化したＰＶＣチューブ類に接着したＤＡＰＩ染色した好中球を示す。（Ｃ）は、非改変ＰＶＣ、アビジン単独で改変したＰＶＣ、ならびにアビジンおよびビオチン化ＣＤ４７で改変したＰＶＣの表面に接着した、ＤＡＰＩ染色好中球の数の定量結果を示す。図６Ａ〜６Ｃは、血流を模倣した後のＰＶＣチューブの表面上のヒト白血球を示す。ＰＶＣチューブを、ＣＤ４７をその表面上に固定化することによって改変した。新たに単離したヒト白血球を、表面改変ＰＶＣチューブおよびコントロールＰＶＣチューブ中に入れ、Ｃｈａｎｄｌｅｒループシステムを数時間使用して、血流を模倣した。（Ａ）は、非改変ＰＶＣチューブ類に接着したＤＡＰＩ染色白血球を示す。（Ｂ）は、その表面にＣＤ４７を固定化したＰＶＣチューブ類の表面上の、最小限のＤＡＰＩ染色白血球を示す。（Ｃ）は、非改変ＰＶＣ、ならびにアビジンおよびビオチン化ＣＤ４７で改変したＰＶＣの表面に接着したＤＡＰＩ染色白血球数の定量結果を示す。図７は、非改変ポリウレタン（ＰＵ）、ウシＣＤ４７（ｂＣＤ４７）で改変したＰＵ、抗ｈＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２と予めインキュベートしかつｂＣＤ４７で改変したＰＵ、ヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）で改変したＰＵ、およびＢ６Ｈ１２と予めインキュベートしかつｈＣＤ４７で改変したＰＵの表面に接着したＭＤＭ細胞数の定量結果を示す。図８Ａ〜８Ｅは、ラットにおけるポリウレタン（ＰＵ）皮下インプラントの酸化関連分解の評価を示す。（Ａ）は、外移植したフィルム上のヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）の存在を示す。（Ｂ）は、上記外移植したフィルム上のエーテル架橋を示す。（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）は、外移植したフィルムの走査電顕写真を示す。図９は、模倣血流後の（Ａ）ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）チューブ類および（Ｂ）Ｔｅｒｕｍｏ−Ｘチューブ類のＣＤ４７改変表面上のヒト白血球を示す。

（発明の詳細な説明）
ＣＤ４７が、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα経路を利用することによって、免疫細胞が引き起こす損傷に対して生体材料を保護することができるということが、本発明によって観察された。ポリウレタンおよびポリビニルクロリド表面をＣＤ４７のＩｇドメインで不動化することの実行可能性を、このような生体材料ポリマーに対して開始される炎症応答を低下させる手段として調査した。従って、本発明の実施形態は、生体材料を保護するための方法を提供する。一般に、上記方法は、ＣＤ４７、そのＩｇドメイン、または他の適切なドメインもしくはそのサブドメインを、生体材料の表面に結合させる工程を包含し、ここで上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメインは、上記生体材料への免疫細胞媒介性損傷を阻害もしくは低下させる。

シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰ−α）は、免疫耐性を移植可能な生体材料に付与するために標的とされ得るＭＤＭにおいて見いだされた潜在的なシグナル伝達タンパク質である。ＳＩＲＰ−αは、ＭＤＭおよび骨髄起源の他の細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。ＳＩＲＰ−αシグナル伝達は、ＳＩＲＰ−αの細胞質テールに位置するチロシン阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）によって媒介される。上記ＳＩＲＰＩＴＩＭは、Ｓｒｃホモロジードメイン２−含有ホスファターゼ−１（ＳＨＰ−１）および（ＳＨＰ−２）を活性化する。ＳＩＲＰ−αによるＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の動員および活性化は、マクロファージによる食作用を負に調節する（ｖａｎＢｅｅｋ，ＥＭら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：７７８１−７）。ＳＩＲＰ−αはまた、ＣＤ１７２Ａ、ＳＨＰＳ１、Ｐ８４、ＭＹＤ−１、ＢＩＴ、ＰＴＰＮＳ１もしくはＳＩＲＰ−１αとしても同定され得る。

ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質としても公知）は、遍在的に発現される膜貫通タンパク質である。これは、Ｎ末端に単一の可変性Ｉｇドメインを有する膜タンパク質の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。上記ＣＤ４７のＩｇドメインは、ＳＩＲＰ−αのリガンドとして最近同定された（Ｂｒｏｗｎ，ＥＪら（２００１）ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ１１：１３０−５；Ｖｅｒｎｏｎ−Ｗｉｌｓｏｎ，ＥＦら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２１３０−７；Ｔａｋｉｚａｗａ，Ｈら（２００７）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１２８７−９；およびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓら（２００６）Ｂｌｏｏｄ１０７：２５４８−５６）。さらなる研究から、ＣＤ４７へのＳＩＲＰ−α結合が、ＭＤＭによる、ＣＤ４７固定化ミクロビーズおよびＣＤ４７固定化赤血球の種特異的様式での食作用を防止することが示された（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓら（２００６）Ｂｌｏｏｄ１０７：２５４８−５６；Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ，ＰＡ（２００４）Ｌｅｕｋ，Ｌｙｍｐｈｏｍａ４５：１３１９−２７；Ｔｓａｉ，ＲＫら（２００８）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１８０：９８９−１００３；Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ，ＰＡら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８：２０５１−４；およびＯｋａｚａｗａ，Ｈら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：２００４−１１）。さらに、粘液腫ウイルスによって発現されるＣＤ４７ホモログが、ＭＤＭ活性化のダウンレギュレーションに寄与することが示された（Ｃａｍｅｒｏｎ，ＣＭら（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３７：５５−６７）。上記ＣＤ４７タンパク質のＩｇドメインは、種間で非常に変動している。この変動性は、ＳＩＲＰ−αとＣＤ４７との間の結合親和性に影響を及ぼすことが報告された（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．ら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（３）：１８０５−１８）。

本明細書に記載されかつ例示される方法は、任意の生体材料を保護するために適している。生体材料としては、生物学的、生物医学的、もしくは医学的適用に適した任意の材料が挙げられる。生体材料の非限定的な例としては、ファブリック、セラミック、ポリマー、熱可塑性物質（例えば、ポリアリールエーテルケトンおよびポリエーテルケトンケトン）、接着剤、骨セメント、金属などが挙げられる。ポリマーが最も好ましい。生体材料ポリマーとしては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリフルオロテトラエチレン、もしくはポリビニル、ポリエチレンイミン、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオルトエステル、ポリエーテル−エステル、ポリラクトン、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリエチレンビニルアセテート、ポリヒドロキシブチレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリオキシエチレンなど、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。非常に好ましいポリマーとしては、ポリウレタンおよびポリビニルクロリドが挙げられる。

生体材料は、種々の生物学的、生物医学的、もしくは医学的適用において使用される。このような適用としては、組成物、生成物、およびデバイス、例えば、人工関節、インプラント、ステント、歯科用インプラント、骨セメント、カテーテル、チューブ、人工腱および人工靱帯、人工皮膚、人工心臓弁、治療剤のための送達ビヒクル、粒子などの製作が挙げられる。好ましい局面において、上記方法は、これら組成物、生成物、およびデバイスを製造するために使用される上記生体材料、ならびに／またはこれら組成物、生成物、およびデバイスの表面をコーティングする生体材料を保護するために適用可能である。従って、好ましい局面において、上記方法は、生体材料を含む組成物、生成物、およびデバイスを保護するために適用可能である。好ましくは、上記方法は、生体材料を含むインプラント、チューブ、カテーテル、および治療剤送達ビヒクルを保護するために使用される。より好ましくは、上記方法は、生体材料を含む心臓ペースメーカーの導線、および患者と心臓−肺バイパス機械との間の血液を運ぶ生体材料を含むチューブを保護するために使用される。

ＣＤ４７は、とりわけ、インビボでの細胞外マトリクスへの細胞接着においてある役割を果たし、トロンボスポンジンのＣ末端ドメインのレセプターとしても働く。ＣＤ４７はまた、細胞シグナル伝達においてある役割を果たすと考えられている。上記方法は、ＣＤ４７、もしくはその任意のアイソフォームを利用し得る。本発明の方法はまた、ＣＤ４７の任意の適切なサブドメイン（細胞外Ｉｇドメインもしくはそのサブドメインが挙げられる）を利用し得る。ＣＤ４７の適切なサブドメインもしくはそのＩｇドメインは、好ましくは、ＳＩＲＰ−αもしくは、生体材料を損傷する因子（例えば、反応性酸素種）を活性化も生成もしないよう免疫細胞にシグナル伝達する該免疫細胞上の任意の他のリガンドに結合し得るか、または別の方法でＳＩＲＰ−αもしくは該任意の他のリガンドと相互作用し得るＣＤ４７のサブドメインもしくはそのＩｇドメインである。

上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくは他のその適切なサブドメインは、任意の種に由来し得、上記種としては、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ヒトなどが挙げられる。ブタ、ウシおよびヒトのＣＤ４７が、特に好ましい。

生体材料は、上記生体材料への免疫細胞結合および／もしくは免疫細胞媒介性損傷を低下もしくは阻害するために改変され得る。例えば、改変された生体材料は、上記生体材料の表面に結合したＣＤ４７もしくはそのＩｇドメインを含む。

上記方法は、生体材料（例えば、細胞培養もしくは一般に実験で使用される生体材料）への免疫細胞媒介性損傷をインビトロで阻害もしくは低下させるのに適している。上記方法はまた、上記生体材料（例えば、恒久的にもしくは一時的に動物に移植した、投与した、挿入した、または別の方法で内部にある生体材料）への免疫細胞媒介性損傷をインビボで阻害もしくは低下させるために適している。

上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはその適切なサブドメインは、当該分野で適した任意の手段に従って、上記生体材料に結合され得る。例えば、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはその適切なサブドメインは、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはその適切なサブドメインが、上記生体材料全体にわたって（上記生体材料から生成される特定の組成物、生成物、もしくはデバイスの表面上を含む）散在するように、上記生体材料を含む組成物、生成物もしくはデバイスの製造の間に、上記生体材料と混合され得る。いくつかの局面において、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはその適切なサブドメインは、上記生体材料に、例えば、非共有結合的分子間引力によって、または上記生体材料と、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはその適切なサブドメインとの間のイオン結合もしくは共有結合によって、結合され得る。

いくつかの好ましい局面において、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはその適切なサブドメインは、連結分子によって、上記生体材料に結合され得る。上記連結分子は、上記生体材料および／または上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはその適切なサブドメインに複合体化もしくは結合体化され得る。連結分子は、上記生体材料への上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはその適切なサブドメインの結合を媒介もしくは促進し得る任意の分子である。連結分子は、任意の有機化合物もしくは無機化合物、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカリド、脂質、チオールなどであり得る。連結分子は、当該分野で公知であり、実施者の必要性に応じて選択され得る。連結分子の対としてのいくつかの非限定的な例としては、アビジンもしくはストレプトアビジンとビオチン、チオールとスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）もしくはスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、またはその適切な改変体もしくはアイソフォーム、およびフォレートと葉酸レセプターが挙げられる。

従って、いくつかの好ましい局面において、ＣＤ４７は、そのリジン残基のＮＨ_２と、二官能性アミノ反応性およびチオール反応性架橋剤（例えば、ＳＰＤＰ（図１に示されるとおり，２−ピリジルジチオ基を挿入する）もしくはＮ−スクシンイミジルトランス−４−マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ，上記タンパク質に結合したチオール反応性マレイミド残基を生じる））との反応を介して、チオール反応基を含むように調製され得る。上記チオール反応性ＣＤ４７は、次いで、上記生体材料表面上のチオール基と反応し得る。この相互作用の結果として、上記生体材料の表面は、共有結合を介して上記生体材料の高分子に結合したＣＤ４７の層でコーティングされる（図１）。いくつかの好ましい局面において、ビオチン化ＣＤ４７は、本明細書で記載されかつ例示されるように（例えば、図３Ａに示されるように）、アビジンを介して上記生体材料表面に結合され得る。いくつかの好ましい局面において、方法論（プラズマグロー放電もしくは求核性置換が挙げられるが、これらに限定されない）は、上記生体材料表面へＣＤ４７を結合するために使用され得る。

本発明の方法は、免疫細胞によって誘導されるかもしくは悪化させられる損傷から生体材料を保護する。好ましくは、上記方法は、多形核細胞（好中球、好塩基球、および好酸球が挙げられる）、末梢血単核球（単球、および／もしくはマクロファージが挙げられる）によって誘導されるかもしくは悪化させられる損傷から生体材料を保護する。いくつかの局面において、上記方法は、ＣＤ４７のリガンドもしくはレセプター（例えば、ＳＩＲＰ−α）を発現する免疫細胞によって誘導されるかもしくは悪化させられる損傷から生体材料を保護する。いくつかの局面において、上記方法は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰ−α機構をシス作用することによって引き起こされ、同じ細胞においてともに発現されるＳＩＲＰ−α分子とのＣＤ４７分子相互作用によって誘発される免疫細胞応答に対して保護し得る。上記方法は、免疫細胞によって誘導されるかもしくは悪化させられる任意の損傷に対して保護し得、好ましくは、酸化的損傷（例えば、免疫細胞によって生成される反応性酸素種およびラジカルへの曝露によって引き起こされる上記生体材料への損傷）に対して保護し得る。上記方法はまた、免疫細胞によって生成される炎症性分子、サイトカインおよび／もしくは加水分解酵素に対して保護し得る。

本発明の実施形態は、本明細書に記載されかつ例示される方法を利用して、生体材料を保護するためのキットを含む。いくつかの局面において、上記キットは、ＣＤ４７、該ＣＤ４７Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメイン、ならびに生体材料を保護するための方法において上記キットを使用するための説明書を含む。いくつかの局面において、上記キットは、生体材料の表面に結合され得、そして／または上記ＣＤ４７、上記ＣＤ４７Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメインに結合され得る１種以上の連結分子をさらに含み、上記連結分子を上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメインに結合するために適した試薬をさらに含み得る。いくつかの局面において、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメインは、連結分子と複合体化される。いくつかの詳細な局面において、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメインは、ＳＰＤＰもしくはＳＭＣＣと複合体化される。いくつかの詳細な局面において、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメインは、ビオチンと複合体化される。いくつかの詳細な局面において、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメインは、フォレートと複合体化される。いくつかの詳細な局面において、上記ＣＤ４７、Ｉｇドメイン、もしくはそのサブドメインは、葉酸レセプターと複合体化される。

以下の実施例は、非常に詳細に本発明の例示的局面を記載するために提供される。それらは、本発明を例示することが意図されるのであって、本発明を限定することは意図しない。

（実施例１：ＳＩＲＰ−α経路は、ＰＥへのＭＤＭ結合に関与する）
ＰＥ表面へのＭＤＭ結合におけるＳＩＲＰα／ＣＤ４７経路の寄与を評価し始めるために、ＭＤＭ細胞系（ＴＨＰ−１）の細胞を、１．６×１０^−７Ｍのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を培地に添加して形質導入し、漸増濃度（０μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ）の、上記タンパク質の細胞外ドメインに対する抗ＳＩＲＰ−α抗体の存在下で、ＰＥフィルム上で培養した。細胞を、４８時間にわたって上記ＰＥフィルムに結合させた。その時点で、上記フィルムをＰＢＳで洗浄し、残っている細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、核特異的染料ＤＡＰＩで染色した。

細胞保持を、ＤＡＰＩ染色し、９つの別個の２００倍率視野を計数することによって決定した。図２に示されるように、ＰＥ表面への形質転換ＴＨＰ−１の結合は、１０μｇの非特異的ＩｇＧ抗体の存在に影響されなかった（９６±７．９細胞／２００倍率視野対１０８±７．７細胞／２００倍率視野）。しかし、結合は、２．５μｇ（６４．４±４．７細胞／２００倍率視野）もしくは５μｇ（６０．５±４．７細胞／２００倍率視野）のＳＩＲＰ−αブロッキング抗体の存在によって有意に（ｐ＜０．００１）阻害された。１０μｇの抗ＳＩＲＰ−αブロッキング抗体の存在下でのＰＥへのＴＨＰ−１結合に、２倍のさらなる低下が認められた。これら結果は、ＰＥ表面へのＴＨＰ−１結合におけるＳＩＲＰα依存性機構を示している。

（実施例２：ＰＥ表面のＣＤ４７固定化の特徴）
初期研究において、ヒト起源のビオチン化ＣＤ４７（ｈＣＤ４７）を、図３に示すように、アビジン固定化フィルムに結合させた。全ての研究を、光活性化化学反応を使用して行った。この化学反応は、ポリマー表面（例えば、ＰＶＣもしくはＰＥ）への上記アビジンの結合に対して特異的である。いったん上記アビジンが連結されると、上記ビオチン化ＣＤ４７は、上記アビジンと反応し得る。後の研究では、ヘンゾフェノン（ＢｚＰＨ）光活性基に連結された２−ピリジルジチオ基（ＰＤＴ）から構成されるポリマー光架橋剤（ＰＤＴ−ＢｚＰｈ）が関与する新規な表面改変を使用した（Ｃｈｏｒｎｙ，Ｍら（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３８２−９１）。

ビオチン化ＣＤ４７を、ミセル懸濁物としてのＰＤＴ−ＢｚＰｈを塗布することによって、上記ＰＥ表面に固定化した。ＵＶ照射の下で、ＢｚＰｈ基は、ＰＥ高分子と共有結合を形成する。次いで、上記ＰＥフィルム上のＰＤＴ基を、ＴＣＥＰの溶液と反応させることによってチオール基に還元した。アビジン（１０ｍｇ／ｍｌ）をＳＰＤＰと反応させ、セファデックス（登録商標）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ−ＳｃｉｅｎｃｅｓＡＢＬＬＣ，ＵｐｐｓａｌａＳｗｅｄｅｎ）カラムを通過させることによって精製した。ＰＥフィルムを、上記チオール反応性アビジンと反応させ、室温で一晩インキュベートした。次いで、上記アビジン固定化フィルムを、ｄＨ_２Ｏで５回洗浄し、漸増濃度（３．９ｎｇ、７．８ｎｇ、１５．６２ｎｇ、３１．２５ｎｇ、６２．５ｎｇ、１２５ｎｇ、２５０ｎｇ、および５００ｎｇ）のビオチン化ＣＤ４７（詳細については以下を参照のこと）を、各フィルムに添加した。

上記ＰＥ表面上のＣＤ４７の固定化を評価するために、コントロールフィルムおよびアビジン架橋フィルムを、マウス抗ＣＤ４７抗体（ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに対して向けられるＢ６Ｈ１２）とインキュベートした。抗原抗体複合体を、ＦＩＴＣ結合体化マウス２次抗体とインキュベートすることによって検出した。上記免疫複合体を、蛍光顕微鏡およびＦＩＴＣフィルタセットを使用して可視化した。

代表的蛍光顕微鏡写真は、上記コントロールＰＥフィルムには存在しない、ＣＤ４７固定化表面において強い蛍光（図３Ｂ）を示す。このことは、上記ＣＤ４７が、上記ＰＥ表面に実際に固定化されたことを示す。ＦＩＴＣ結合体化抗ＣＤ４７抗体でのＣＤ４７固定化表面の蛍光標識は、上記光活性化ＰＥ表面上に負荷された一定範囲（０〜５００ｎｇ）のビオチン化ＣＤ４７が、０〜１２００分子のＣＤ４７／μｍ^２のＣＤ４７表面濃度範囲に対応することを示した。

ビオチン化ＣＤ４７の供給源。ｈＣＤ４７の細胞外ドメインをコードするプラスミドをＰＣＲ増幅し、ＣＤ４７の細胞外ドメインのＣ末端においてＣＤ４ｄ３＋４ビオチンのインフレーム融合物を形成したベクターｐＥＦ−ＢＯＳ−ＸＢとインフレームで連結した。この構築物を、ＣＨＯ（−Ｋ１）細胞へとトランスフェクトし、分泌されたＣＤ４７−ＣＤ４ｄ３＋４を濃縮し、Ｃ末端においてビオチン化し、透析した。上記タンパク質を、モノマーアビジンを使用してアフィニティー精製し、ＰＢＳに対して透析した。

（実施例３：固定化ＣＤ４７は、ポリウレタンエラストマーへのＭＤＭ結合を阻害する）
ＰＭＡ活性化ＴＨＰ−１細胞（１００，０００細胞）を、１ｃｍ^２ＰＥ−ＣＤ４７（一定範囲のＣＤ４７濃度にわたって）フィルムおよびコントロールフィルム上に播種した。ＰＥ−ＣＤ４７フィルムを、実施例２に記載されるように、ビオチン化ｈＣＤ４７を用いて調製した。細胞を、４８時間にわたって上記ＰＥフィルムに結合させ、その時点で、上記フィルムをＰＢＳで洗浄し、残っている細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、上記核特異的染料ＤＡＰＩで染色した。細胞保持を、ＤＡＰＩ染色し、９個の別個の２００倍率視野を計数することによって決定した。図４は、ＣＤ４７固定化表面へのＴＨＰ−１細胞結合が顕著に阻害されることを示す。

最低のＣＤ４７表面濃度（約１０分子／μｍ^２）において、非改変コントロール表面（１３１．２３±２１．６細胞／２００倍率視野）と比較して、ＴＨＰ−１細胞結合（２４．６±８．２細胞／２００倍率視野）の有意な（ｐ＜０．００１）低下が認められた。８０〜３０１分子／μｍ^２の間のＣＤ４７濃度におけるＰＥ−ＣＤ４７表面へのＴＨＰ−１結合において、さらに４倍の低下が認められた。細胞結合は、６００分子／μｍ^２より高いＣＤ４７濃度において実質的に阻止された。これらデータは、ＰＥ上の固定化ＣＤ−４７が単球結合を低下させたことを示し、固定化ＣＤ４７分子を有する生体模倣ＰＥ表面を確立することの実行可能性についての主な証拠を提供する。

（実施例４：ＣＤ４７をコーティングしたポリビニルクロリド（ＰＶＣ）心肺バイパスチューブ類への好中球結合の阻害）
表面固定化された、組換えヒトＣＤ４７（ビオチン化）が、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）表面への好中球接着を阻害し得るか否かを決定するために、研究を行った。

簡潔には、ヒト好中球細胞系であるＨＬ−６０から培養した細胞を、５μｇ／ｍｌのＩｇＧおよび上記ホルボールエステル（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ））を補充した増殖培地中で、約１．５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で懸濁した。上記再懸濁した細胞を、コーティングしていない（コントロール）ＰＶＣチューブ類もしくはＣＤ４７を（アビジン−ビオチン親和性を介して）上記チューブ類の表面に固定化することによって改変したＰＶＣチューブ類、またはアビジン単独のコーティングを有するＰＶＣチューブ類（アビジンコントロール）に添加した。上記細胞を含むチューブを、両方の末端に蓋をし、３時間にわたって３７℃で振盪した。このインキュベーション期間の後、結合していない細胞を含む細胞培地を除去し、上記チューブ類をＰＢＳで４回洗浄し、結合した細胞を、４％パラホルムアルデヒドを添加することによって固定した。上記ＰＶＣチューブ類に結合した細胞を、上記蛍光色素ＤＡＰＩ（蛍光顕微鏡写真で青色）で染色することによって定量し、適切なフィルタセットを備える蛍光顕微鏡を使用して可視化した。

ＰＶＣチューブ類に結合した上記細胞の蛍光顕微鏡写真を、図５に示す。図５は、非改変ＰＶＣ表面（図５Ａ）もしくはアビジン単独で改変されたＰＶＣ表面（図５Ｂ）上の豊富なＤＡＰＩ（青色）染色によって証拠が示されるように、強い細胞保持を実証する。対照的に、固定化ＣＤ４７でコーティングした表面へのＨＬ−６０結合は、細胞結合を殆ど示さないか全く示さなかった。ＤＡＰＩ染色を有さないこれら画像は掲載していない。これらデータの定量分析の結果は、ＰＶＣへのＨＬ−６０結合が、表面固定化アビジンの存在によっていくらか阻害されることを示した（図５Ｃ）。しかし、これら結果は、上記ＰＶＣコントロールデータとは有意差がなかった（図５Ｃ）。上記ＰＶＣバイパスチューブ類へのＣＤ４７の表面結合は、図５Ｃにおいて示されるように、上記ＰＶＣチューブ類へのＨＬ−６０結合を実質的にブロックした。

これら結果は、生体材料ポリマーの表面に固定化したＣＤ４７が、ＰＶＣチューブ類（心肺バイパスシステムにおいて使用される代表的なチューブ類）への多形核白血球結合によって引き起こされる急性炎症応答を低下もしくは防止し得ることを強く示唆する。

（実施例５：新鮮なヒト全血を使用した心肺バイパスシミュレーションモデルにおけるＣＤ４７改変ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）チューブ類への白血球結合の阻害）
上記Ｃｈａｎｄｌｅｒループは、動いている血液（もしくは培養した懸濁細胞）の縦隊（ｃｏｌｕｍｎ）が、斜めになった電動ターンテーブル上で回転する環状の閉じたチューブ類のループ中を流れる装置である。心肺バイパス（ＣＰＢ）回路内の血流の模倣に必要な調査は、しばしば上記Ｃｈａｎｄｌｅｒループを使用する。本実施例において、上記Ｃｈａｎｄｌｅｒループを、模倣血流条件下で全血からＰＶＣ表面を保護することに対するＣＤ４７の効果を調査するために使用した。

簡潔には、１０ｍｌのヒト全血を新たに採血し（ＩＲＢ承認されたプロトコル）、クエン酸ナトリウムを補充して凝固を抑制し、表面を固定化ＣＤ４７（ビオチン化）で改変した、もしくは非改変（ＣＤ４７なし、およびアビジンなし（コントロール））であるかのいずれかであるＰＶＣチューブ類（長さ約３３ｃｍ）から調製したＣｈａｎｄｌｅｒループに導入した。上記チューブ類を、３７℃で３時間にわたって回転させたところ、上記ループ内で血液循環が得られた。上記プロトコルの最後に、上記血液を除去し、上記チューブ類をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。結合した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定した。

チューブ類の長さに沿って規則的な間隔で位置した該チューブ類の５つのセグメント（長さ約３ｃｍ）を切り出し、結合したあらゆる細胞を、上記蛍光色素ＤＡＰＩ（蛍光顕微鏡写真で青色）で染色することによって定量し、適切なフィルタセットを備えた蛍光顕微鏡を使用して可視化した。結果を、図６に示す。

図６Ａは、強い細胞結合を示す。これは、上記非改変のコントロールＰＶＣチューブ類の表面上の白血球接着を示す。対照的に、ＣＤ４７がその表面上に固定化された上記ＰＶＣチューブ類へは、細胞結合がほとんど認められなかった（図６Ｂ）。定量分析から、上記ＣＤ−４７表面改変ＰＶＣチューブ類と比較して、非改変ＰＶＣチューブ類（コントロール）において２０倍より高い細胞結合が示された（図６Ｃ）。

新鮮なヒト全血で得たこれらデータは、好中球細胞系ＨＬ−６０細胞を使用して得られた実施例４に示されるデータを裏付ける。さらに、これら結果は、ＰＶＣチューブ類に表面結合したＣＤ４７の抗炎症特性は、この技術の臨床応用の一例である上記心肺バイパス回路に近いモデルにおいて十分に機能的であることを示す。

（実施例６：ポリウレタン±ＣＤ４７から製造される右側頚静脈ペーサー導線絶縁への生物学的応答についてのブタインプラントモデル）
これは予測実施例である。

外移植したペースメーカー導線絶縁の亀裂は、広く注目されてきた（Ｗｉｇｇｉｎｓ，ＭＪら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５８：３０２−７；およびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｋら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２３６０−７）。これをインビボでモデル化する試みは、酸化的分解に対する耐性についてＣＤ４７含有ＰＥ改変体をスクリーニングする有用でかつ費用効率的なインビボモデルである、ラット皮下移植片モデルに主に依拠してきた（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ＭＡ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３２：４９３−５０４；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ＭＡら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３４：４９３−５０５；およびＳｔａｃｈｅｌｅｋ，ＳＪら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ８２：１００４−１１。しかし、ＰＥ分解は、頚静脈ペーサー導線移植のインビボモデルにおいては一度も研究されてこなかった。

ＣＤ４７改変ＰＥの導線処方は、右側頚静脈インプラントモデルにおいて試験する。このモデルの妥当性は、以下のとおりである：１．上記頚静脈インプラントは、臨床的に使用される心臓ペースメーカー導線絶縁としてのＰＥの使用に近い臨床的に関連するモデルである。２．上記頚静脈インプラントは、移植したＰＥへの宿主炎症応答に対する、血液接触環境の作用のインビボ試験を可能にする。

抗酸化剤で改変したＰＥの臨床応用を、ＰＥチューブ類±候補のＣＤ４７改変を、最大１０週間の期間にわたってブタ頚静脈に移植することによってシミュレートする。酸化的分解に関しては、インビボでの１０週間が、Ｈ_２Ｏ_２ＣｏＣｌ_２の溶液中での２週間の曝露に相当することが報告されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ，ＥＭら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．７０：２４５−５５；およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ，ＥＭら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．２６９：４０７−１６）。

簡潔には、去勢した雄性ブタもしくは非妊娠雌性ブタ（ヨークシャー交配種）を、麻酔して挿管する。頚静脈に対する切断により、ＰＥチューブ類の配置を可能にし、その場所で、ＰＥチューブ類を上記静脈に固定し、残りの部分を、ループ内に固定し、皮下ポケットに配置する。

外移植片分析。この研究の最後には、上記動物を、標準的手術手順に従って安楽死させる。導線を外植し、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａでのさらなる分析のために一晩で輸送する。上記チューブ類の長さの半分を、移植の結果として、機械的−物理的特性の変化について種々試験を行なう。残りの半分を、生物学的に関連するエンドポイントについて種々試験を行なう。

機械的−物理的特性。外移植されたチューブ類を、界面活性剤溶液中で洗浄して、生物学的デブリを除去する。軟質セグメント鎖の切断（ｓｏｆｔｓｅｇｍｅｎｔｃｈａｉｎｓｃｉｓｓｉｏｎ）および喪失を、ＦＴＩＲ分析を介して評価する。ＳＥＭは、上記移植されたＰＥ表面への損傷の定量的評価を提供する。一軸応力−歪み試験（ｕｎｉａｘｉａｌｓｔｒｅｓｓ−ｓｔｒａｉｎｔｅｓｔ）もまた、移植の結果として弾性のあらゆる損失を決定するために行う。

生物学的エンドポイント。上記外移植されたチューブ類の半分を、ホルマリン中に入れ、関連する生物学的エンドポイントについて評価する。ギムザ染色を使用して、上記外移植されたＰＥチューブ類上に存在する細胞タイプを同定する。ＤＡＰＩ染色を使用して、上記外移植されたＰＥ表面上の細胞数を定量する。目的のタンパク質を、免疫蛍光顕微鏡検査を介して同定する。これら生物学的エンドポイントは、機械的エンドポイントと、ならびにラットにおける皮下移植片の初期インビボ研究から得られた結果とも相関する。

（実施例７：ｈＣＤ４７およびｂＣＤ４７を固定化したポリウレタン表面へのＭＤＭ結合の阻害）
ポリウレタン（ＰＵ）表面へのＭＤＭ結合に対するヒト起源（ｈＣＤ４７）もしくはウシ起源（ｂＣＤ４７）の固定化ＣＤ４７の効力を比較するために、研究を行った。実施例３に記載されるように、ＰＵフィルムを、ｈＣＤ４７もしくはｂＣＤ４７で同様に改変した。ＰＭＡにより活性化したＴＨＰ−１細胞を、改変ＰＵフィルム表面上で培養した。必要とする場合、上記改変フィルムを、抗ヒトＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２とプレインキュベートした。図７に示されるように、ＴＨＰ−１細胞結合は、非改変ＰＵと比較して、種に拘わらず、表面固定化したＣＤ４７の存在によって、有意に低下した。固定化ｈＣＤ４７は、ｂＣＤ４７と比較して、ＴＨＰ−１結合を低下させることにおいて、８倍より効率的であった。これは、上記ｈＣＤ４７固定化フィルムと、上記抗ｈＣＤ４７抗体とをプレインキュベートすることによって逆転し、これにより、ＴＨＰ−１結合を、ｂＣＤ４７固定化フィルムと匹敵するレベルへ増大させた。上記抗体は、ｂＣＤ４７固定化フィルムへのＴＨＰ−１結合に対して有意な効果を示さなかった。

（実施例８：ｈＣＤ４７およびｂＣＤ４７を固定化したポリウレタン皮下移植物の酸化的分解の阻害）
ラット皮下移植片モデルは、移植した生体材料に対する慢性炎症的効果を調査するためのインビボモデルとして利用されてきた（Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ，ＳＪら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ８２（４）：１００４−１１）。実施例６に記載されるＰＥ分解研究と同様に、ポリウレタン（ＰＵ）皮下インプラントの亀裂研究を、ラットにおいて行った。

全ての手順および動物管理を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａのＩＡＣＵＣによって承認されたとおり、実験動物の飼育および使用に関するＮＩＨ標準に従った。１群あたり５匹のラットの各々に、非改変ＰＵまたは共有結合されたヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）もしくはウシＣＤ４７（ｂＣＤ４７）で改変したＰＵ表面、あるいは３つのフィルムの組み合わせから構成される、３つの１ｃｍ^２ＰＵフィルムを与えた。簡潔には、３００〜３５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、イソフルランで麻酔し、痛覚脱失のために、手術後にフルボキサミン（Ｆｌｕｎｉｘａｍｉｎｅ）を投与した。ＰＵインプラントを、個々に切開した背側皮下の嚢に入れた。動物に、研究期間にわたって、通常のＰｕｒｉｎａＲａｔＣｈｏｗを自由給餌させた。上記研究の７０日目の終わりには、ラットを二酸化炭素窒息によって安楽死させ、上記皮下インプラントを取り出し、生理食塩水でさっとすすぎ、以下に記載されるようにさらに種々の試験を行なった。

上記ラットは、１０週間のポリウレタン（ＰＵ）皮下インプラントに耐え、病的状態も感染の証拠も示さなかった。外植に際して、全てのサンプルを、容易に同定し、これを酸化関連分解の証拠の評価のために種々の試験を行なった。図８Ａに示されるように、ｈＣＤ４７改変ＰＵフィルムから抽出したタンパク質のウェスタンブロット分析は、上記１０週間の移植後にｈＣＤ４７の存在を示した。上記非改変ＰＵから抽出したタンパク質において、免疫反応性のバンドは認められなかった。これら結果は、上記ＣＤ４７改変が、インビボで１０週間後ですら維持されていたことを示す。

外移植されたフィルムを細胞除去し（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）、ＦＴＩＲを介して、酸化的分解の証拠について評価した。ポリウレタンエラストマーの酸化は、１１７４ｃｍ^−１スペクトルピークにおいてのピーク強度の増加と一致することが十分に示されてきた（Ｓｔａｃｈｅｌｅｋ，ＳＪら（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ａ．７８：６５３−６１）。上記１１７４ｃｍ^−１は、酸化的分解のマーカーとして同定された分枝鎖エーテルのυ（Ｃ−Ｏ−Ｃ）に割り当てられ、エーテル架橋の程度は、上記１１７４ｃｍ^−１スペクトルピーク強度を、１５９５ｃｍ^−１スペクトルピークのピーク強度で正規化することによって定量的に決定され得る。上記１５９５ｃｍ^−１ピークは、酸化されていない芳香族環に対応する。図８Ｂに示されるように、ｈＣＤ４７もしくはｂＣＤ４７のいずれかの固定化が、上記ポリウレタンのエーテルの異常な架橋を有意に低下させた。

上記外移植したフィルムの走査型電子顕微鏡写真（図８Ｃ〜８Ｅ）は、最も広範的な表面亀裂が、上記非改変ＰＵ表面上に観察されることを示し、上記ＣＤ４７改変ＰＵ表面は、僅かな亀裂の証拠を示したのみであった。上記ｈＣＤ４７改変表面（図８Ｄ）とｂＣＤ４７改変表面（図８Ｅ）との間の亀裂の比較は、いかなる認識可能な差異も示さなかった。

（実施例９：流動条件下でのＣＤ４７改変ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）チューブ類への白血球結合の阻害）
上記Ｃｈａｎｄｌｅｒループを使用して、実施例５に記載されるプロトコルを使用して流動条件下で白血球結合に対する上記ＣＤ４７改変ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）と、非改変チューブ類もしくはポリ（２−メトキシエチルアクリレート）（ＰＭＥＡ）で改変したＰＶＣチューブ類（ＴｅｒｕｍｏのＸＣｏａｔｉｎｇ^ＴＭ）との表面の効果を比較した。

図９は、上記非改変ＰＶＣチューブ類の表面、ならびにＰＭＥＡで改変したＰＶＣチューブ類の表面への強い細胞結合を示す。形態は、これら結合した細胞が赤血球ではなく、白血球であることを示す。上記ＣＤ４７改変ＰＶＣチューブ類では、細胞結合が乏しいとの証拠が得られた。定量分析から、上記非改変ＰＶＣチューブ類もしくは上記ＰＭＥＡ改変Ｔｅｒｕｍｏチューブ類（Ｔｅｒｕｍｏ−Ｘ）と比較して、上記ＣＤ４７改変表面への細胞結合において２０倍の低下が示される。これらデータは、ＰＶＣチューブ類に表面結合したＣＤ４７の抗炎症性効果を示す。

本発明のシステム、方法、および他の局面に関連する種々の用語が、本明細書および特許請求の範囲全体を通して使用される。このような用語は、別段示されなければ、当該分野でそれらの通常の意味を与えられるべきである。

本発明は、上記に記載されかつ例示された実施形態に限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲の等価物の範囲（ｓｃｏｐｅａｎｄｒａｎｇｅ）内のバリエーションおよび改変が可能である。

Claims

生体材料を保護するための方法であって、該方法は、ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインを、該生体材料の表面に結合する工程を包含し、ここで該ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインは、該生体材料への免疫細胞媒介性損傷を阻害もしくは低下させる、方法。
前記生体材料は、ポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
前記ポリマーは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリフルオロテトラエチレン、ポリビニル、ポリビニルクロリドまたはこれらの混合物である、請求項２に記載の方法。
前記生体材料は、インプラントの表面上に存在する、請求項１に記載の方法。
前記生体材料は、医療用デバイスの表面上に存在する、請求項１に記載の方法。
前記生体材料は、チューブの表面上に存在する、請求項１に記載の方法。
前記生体材料は、治療剤送達ビヒクルの表面上に存在する、請求項１に記載の方法。
前記インプラントは、前記生体材料を含むか、または該生体材料でコーティングされる、請求項４に記載の方法。
前記医療用デバイスは、前記生体材料を含むか、または該生体材料でコーティングされる、請求項５に記載の方法。
前記チューブは、前記生体材料を含むか、または該生体材料でコーティングされる、請求項６に記載の方法。
前記治療剤送達ビヒクルは、前記生体材料を含むか、または該生体材料でコーティングされる、請求項７に記載の方法。
前記ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインは、前記生体材料への免疫細胞媒介性損傷をインビトロで阻害もしくは低下させる、請求項１に記載の方法。
前記ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインは、前記生体材料への免疫細胞媒介性損傷をインビボで阻害もしくは低下させる、請求項１に記載の方法。
前記生体材料の表面は、少なくとも１種の連結分子を含む、請求項１に記載の方法。
前記連結分子は、アビジン、フォレート、葉酸レセプターであるか、またはチオールを含む、請求項１４に記載の方法。
前記ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインは、連結分子と複合体化され、該連結分子は、ＳＰＤＰ、ＳＭＣＣ、フォレート、葉酸レセプター、またはビオチンである、請求項１に記載の方法。
前記免疫細胞は、ＳＩＲＰ−αを発現する、請求項１に記載の方法。
前記免疫細胞は、単球もしくはマクロファージである、請求項１に記載の方法。
前記損傷は、酸化的損傷もしくは炎症性損傷である、請求項１に記載の方法。
前記インプラントは、ペースメーカー導線である、請求項４に記載の方法。
前記チューブは、心肺バイパスの一部である、請求項６に記載の方法。
生体材料を保護するためのキットであって、該キットは、ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメイン、および請求項１に記載の方法に従って該キットを使用するための説明書を含む、キット。
前記生体材料の表面に結合され得る連結分子をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
前記ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインに結合され得る連結分子をさらに含み、該連結分子は、アビジン、フォレート、葉酸レセプター、ビオチン、ＳＰＤＰもしくはＳＭＣＣである、請求項２２および２３に記載のキット。
前記ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインは、ビオチン、フォレート、ＳＰＤＰもしくはＳＭＣＣと複合体化される、請求項２２に記載のキット。
生体材料への免疫細胞結合を阻害もしくは低下させるための方法であって、該方法は、ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインを該生体材料の表面に結合させる工程を包含し、ここで該ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインは、該生体材料への免疫細胞結合を阻害もしくは低下させる、方法。
前記生体材料は、ポリマーを含む、請求項２６に記載の方法。
前記ポリマーは、ポリウレタン、またはポリビニルクロリドである、請求項２７に記載の方法。
前記免疫細胞は、ＳＩＲＰ−αを発現している、請求項２６に記載の方法。
前記免疫細胞は、単球もしくはマクロファージである、請求項２６に記載の方法。
前記免疫細胞は、多形核白血球である、請求項１に記載の方法。
前記多形核白血球は、好中球である、請求項３１に記載の方法。
前記免疫細胞は、多形核白血球である、請求項２６に記載の方法。
前記多形核白血球は、好中球である、請求項３３に記載の方法。
生体材料であって、ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインが該生体材料の表面に結合された、生体材料。
前記生体材料の表面に少なくとも１種の連結分子をさらに含む、請求項３５に記載の生体材料。
前記少なくとも１種の連結分子は、前記表面への前記ＣＤ４７もしくはＳＩＲＰ−αに結合し得るそのサブドメインの結合を媒介する、請求項３６に記載の生体材料。