JP5657574B2

JP5657574B2 - トリグリセリド合成経路の、細胞に基づいたアッセイ

Info

Publication number: JP5657574B2
Application number: JP2011549219A
Authority: JP
Inventors: キ・チアン−シェン; ラング・ウェンシェン; コネリー・マージェリー・エイ
Original assignee: ヤンセンファーマシューティカエヌ．ベー．
Priority date: 2009-02-04
Filing date: 2010-02-03
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2030-02-03
Also published as: WO2010091041A1; CN102378816A; US20100196930A1; EP2393938B1; US9012159B2; JP2012516698A; EP2393938A1; AU2010210717B2; CN102378816B; CA2772734A1; AU2010210717A1

Description

開示の内容

〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２００９年２月４日出願の米国仮特許出願第６１／１４９，８４１号の利益を主張し、この仮特許出願は、参照により全体として、またあらゆる目的で、本明細書に組み込まれる。

〔発明の背景〕
発明の分野
安定同位体標識脂肪酸と共にインキュベートされた細胞中で、脂質およびホスファチジン酸中間体（phosphatidate intermediates）を同時に検出する方法を提供する。この方法は、高スループットフォーマットでトリグリセリド生合成を調節する化合物をスクリーニングするのに使用され得る。

関連技術の説明
トリグリセリドまたはトリアシルグリセロールは、真核生物における主要な輸送源およびエネルギー貯蔵部（major transport source and energy storage）である。トリグリセリドは、グリセロール分子、および３つの脂肪酸分子から合成される。脂肪酸分子はそれぞれ、エステル結合によって、グリセロール分子の３つのヒドロキシル基に付着する。トリグリセリドは、多くの中性脂質のように、一般的な長さが１６、１８、または２０個の炭素の、さまざまな鎖長の脂肪酸分子を含有する。

トリグリセリドの２つの主要な生合成経路は、肝臓および脂肪組織に優位に存在するグリセロール−３−リン酸経路、ならびに、腸に優位に存在するモノアシルグリセロール経路である。肝臓で９０％超のトリグリセリドを生成するグリセロール−３−リン酸経路が、以下に例示される：

式中、ＦＡ−ＣｏＡは、脂肪酸ＣｏＡであり、ＧＰＡＴは、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼであり、ＡＧＰＡＴは、１−アシルグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼであり、ＰＡＰは、ホスファチジン酸ホスファターゼであり、ＤＧＡＴは、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである。

グリセロール−３−リン酸生合成経路の最終段階は、ＤＧＡＴ１またはＤＧＡＴ２により触媒され得る（Cases et al. 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95: 13018; Cases et al. 2001 J Biol Chem 276:38870）。ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２の双方は、ジグリセリドをトリグリセリドに変換するが、これらは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列において類似していない。ＤＧＡＴ１のないノックアウトマウス（Ｄｇａｔ１^−／−）は、肝臓中のトリグリセリド代謝に明らかな変化を示さないことが報告されている（Smith et al. 2000, Nat Genet 25:87）。加えて、ＤＧＡＴ２のないノックアウトマウス（Ｄｇａｔ２^−／−）は、肝臓中のトリグリセリド含有量が激しく減少していることを示す（Stone et al. 2004, J Biol Chem 279:11767）。さらに、研究では、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＤＧＡＴ２抑制が、げっ歯類において肝臓トリグリセリド含有量を減少させ（Chol et al. 2007, J Biol Chem 282:22678; Liu et al. 2008, Biochim Biophy Acta 1781:97）、ラットにおいて食餌誘発性脂肪肝およびインスリン抵抗性を逆行させる（Chol et al. 2007, J Biol Chem 282:22678）、ことが示されている。これらの研究は、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２がトリグリセリド生合成では別様に機能することを示唆している。したがって、ＤＧＡＴ１またはＤＧＡＴ２いずれかの特定の標的化は、毒性が制限された状態で、トリグリセリドの調節における利益を提供することができる。

トリグリセリド代謝の乱れまたは不均衡は、肥満、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患、および冠動脈心疾患の病原ならびに高まるリスクに関連している（Lewis et al. 2002, Endocrine Reviews 23:201; Malloy and Kane 2001, Adv Intern Med 47:111）。したがって、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２を含む、トリグリセリド生合成経路内の酵素活性を調節する化合物が、代謝疾患の潜在的な治療標的として有用であるかもしれない。

放射性基質および薄層クロマトグラフィーが、トリグリセリド合成を観察するのに広く使用されている（Stone et al. 2004, J Biol Chem 279:11767; Zhu et al. 2002, Atherosclerosis 164:221）。Stoneらは、初代培養肝細胞において^３Ｈ−グリセロールでトリグリセリドを標識し、薄層クロマトグラフィーおよび放射性画像分析（radio image analysis）を用いて放射性同位体標識トリグリセリドを検出する（Stone et al. 2004, J Biol Chem 279:11767）。同様に、Zhuらは、ヒトの肝細胞癌細胞において^３Ｈ−オレイン酸でトリグリセリドを標識し、薄層クロマトグラフィーを使用して、標識されたトリグリセリドを検出している（Zhu et al. 2002, Atherosclerosis 164:221）。

近年、Magkosらは、質量分析テクノロジーを使用して、中性脂質を検出している（Magkos et al. 2007, J Lipid Research 48: 1204）。Magkosらは、１，１，２，３，３−^２Ｈ−グリセロールおよび２，２−^２Ｈ−パルミチン酸をｉｎｖｉｖｏで投与し、クロロホルム／メタノールおよび超遠心分離法によって、非常に低密度のリポタンパク質トリグリセリドを血漿から抽出している。Magkosらは、ガスクロマトグラフィー−質量分析システムを使用して、トリグリセリドから放出された標識グリセロールおよびメチル化パルミチン酸を検出している（Magkos et al. 2007, J Lipid Research 48: 1204）。Magkosらは、未変化のトリグリセリド、すなわち特定のトリグリセリド分子も、異なる中間体も、トリグリセリド経路において検出していない。

出願人が知る限り、既存のアッセイは、トリグリセリド生合成中に生成されるリゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、およびジアシルグリセロールを含む中間体を観察または検出しない。また、既存のアッセイは、追加の抽出処置、および労働集約型の検出技術を必要とする。さらに、これらの方法は、スループットが限られており、多数の化合物をスクリーニングするため高スループットフォーマットに適合させることが困難である。したがって、トリグリセリド生合成を分析し、高スループットフォーマットでトリグリセリド経路を調節する化合物を識別する方法を確立する必要が、依然としてある。

〔概要〕
本出願の目的は、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の活性を抑制する化合物を識別する方法を提供することである。この方法は、その化合物の存在下または非存在下で、安定同位体標識脂肪酸を細胞と接触させる工程と、イソプロピルアルコールでその細胞を抽出する工程と、化合物の存在下で、安定同位体標識トリグリセリドのレベルを測定する工程と、化合物の非存在下で、安定同位体標識トリグリセリドのレベルを測定する工程と、を含み、安定同位体標識トリグリセリドのレベルの変化は、化合物がＤＧＡＴ活性を抑制することを示す。

本出願の別の目的は、トリグリセリド合成に関わる酵素の活性を計る方法を提供することである。この方法は、安定同位体標識脂肪酸分子を細胞と接触させる工程と、イソプロピルアルコールでその細胞を抽出する工程と、安定同位体標識リゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロール、またはトリグリセリドの存在を検出する工程と、を含む。

本出願によれば、安定同位体標識脂肪酸は、^１３Ｃ_１８−オレイン酸であってよい。また、本出願によれば、安定同位体標識トリグリセリドは、液体クロマトグラフィー‐質量分光光度計システムによって検出され得る。

本発明の他の目的および特徴は、添付図面と関連して考慮される以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、図面は、単に例示目的で設計されており、請求項に対して参照が行われるべき本発明の限界の定義として設計されているわけではないことが、理解される。図面は必ずしも一定の割合で描かれていないこと、ならびに、特に指定のない限り、図面は本明細書で説明する構造および処置を概念的に説明することを意図しているに過ぎないことが、さらに理解されるべきである。

〔現在好適な実施形態の詳細な説明〕
本出願は、トリグリセリド合成を分析する既存のアッセイの制限を克服する方法を提供する。本明細書に記載する方法は、反応混合物中の安定同位体標識脂肪酸を使用し、その反応混合物が、細胞、成長培地、および安定同位体標識脂肪酸を含有するようにする。本明細書に記載する方法は、トリグリセリド合成に関わる酵素を調節する化合物をスクリーニングするのに使用されることもできる。スクリーニング目的では、反応混合物は、グリセロール−３−リン酸経路中のＤＧＡＴなど、トリグリセリドに関わる酵素のモジュレーターをさらに含んでよい。

任意の原核細胞および真核細胞を、本明細書に記載する方法に使用することができる。脂肪細胞、肝細胞腫細胞、癌細胞、または白血病細胞が好ましく、例えば、３Ｔ３−Ｌ１、ＨＵＨ７、ＦＵ５ＡＨ、ＴＨＰ−１、ＨｅｐＧ２、Ｃ３ＨＴ１０１／２、ＭｃＡ−ＲＨ７７７７、ＭＣＦ７、Ａ５４９、およびＲＡＷ２６４．７である。これらの細胞は、商業的供給源を通じて入手されるか、または一般に知られる方法によって単離されることができる。例えば、肝細胞を単離する方法は、Berry and Friend, 1969, J Cell Biol 43: 506に見ることができ、脂肪細胞を単離する方法は、Green et al. 1990, J Biol Chem 265:5206に見ることができる。白血球は、個人から採取した生物学的サンプル、例えば任意の体液または組織サンプルから、単離され得る。任意の体液には、血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液（ｃｓｆ）、および腹水（acitic fluid）が含まれるが、これらに限定されない。適切な組織サンプルには、全血、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、頬側スミア、皮膚、ならびに筋もしくは神経組織および毛髪などの特定の器官組織の生検が含まれる。生物学的サンプル中のグリセロール−３−リン酸経路の活性の分析は、代謝疾患用薬物による治療に対する患者の反応を観察するバイオマーカーとして有用となり得る。

細胞は、通常の成長培地、例えばダルベッコ変法イーグル培地、最小必須培地、ＲＰＭＩなどで維持され得る。いくつかの細胞は、分析される前に、誘導（induced）または分化され得る。特定の細胞系を維持および／または誘導するためには、適切な培地および条件が必要であることを、当業者は認識するであろう。例えば、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地で維持され、誘導培地によって、成熟脂肪細胞になるよう誘導されることができる。

安定同位体で標識された任意の脂肪酸分子を、本明細書に記載する方法に使用することができる。本明細書で使用される「安定同位体」という用語は、概して、^１３Ｃまたは^２Ｈを含む、放射性ではない同位体分子を指す。安定同位体標識脂肪酸は、室内で合成されるか、または商業的に入手されることができる。好適な脂肪酸分子は、モノ不飽和Ｃ_１６およびＣ_１８など、Ｃ_１０〜Ｃ_２０の範囲の鎖長を含む。脂肪酸分子は、^１３Ｃまたは^２Ｈによって、均一に、または部分的に標識されてよく、例えば、均一に標識された^１３Ｃ−１４：０、^１３Ｃ−１６：１、^１３Ｃ−１６：０、^１３Ｃ−１８：２、^１３Ｃ−１８：１、^１３Ｃ−１８：０、^２Ｈ_２９−１６：１、^２Ｈ_３１−１６：０、^２Ｈ_３３−１８：１、^２Ｈ_３５−１８：０、または質量シフトが少なくとも４ａｍｕ（６．６４×１０^−２７ｋｇ）の、部分的に標識された^２Ｈである。一実施形態では、標識分子は、^１３Ｃ_１８−オレイン酸である。安定同位体標識脂肪酸は、経路の各段階に組み込まれて、新規合成中間体、または安定同位体で標識された生成物を生じることができる。

さまざまな他の試薬も、反応混合物中に含めることができる。これらには、酵素活性を促進させるのに使用され得る、塩、緩衝液、中性タンパク質（neutral proteins）（例えばアルブミン）、洗剤などといった試薬が含まれる。このような試薬は、反応成分の非特異性または背景相互作用（background interactions）を減少させることもできる。抑制物質、抗菌薬などといった、アッセイの効率を改善する他の試薬も使用することができる。

トリグリセリド生合成を分析する方法を開始する前に、内在性脂肪酸が、木炭処理した血清、または無血清培地で適切な期間にわたり細胞を培養することにより、枯渇させられる。次に、^１３Ｃ_１８‐オレイン酸などの、安定同位体標識脂肪酸が、反応に加えられる。細胞は次に、リン酸緩衝食塩水で洗浄され、脂質分子が、イソプロピルアルコールで抽出される。ヘキサン、クロロホルム、へプタン、アセトン、ジメチル硫黄酸化物（dimethyl sulfur oxide）、およびブタノールを含む他の溶媒系も、脂質分子を抽出するのに使用され得る。

新規合成標識脂質中間体または生成物は、同位体の存在を検出するか、または同位体分子の分子質量を計るのに適した任意の方法によって、検出されることができる。例えば、薄層クロマトグラフィーおよび質量分析を使用することができる。一実施形態では、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）システムを使用して、安定同位体標識アシル鎖を含む新規合成脂質分子を検出および定量化する。さらに、複数の標識脂質分子を同時に検出することができる。一実施形態では、質量分析システムが、グリセロール−３−リン酸経路中のモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、およびトリアシルグリセロールならびにホスファチジン酸中間体を含む、複数の中性脂質の同時分析のため、改変される。改変は、質量分析システム中のプレカラム誘導体化なしで、正負切り替えにおける電子スプレーイオン化による作業を含む。複数の脂質の同時検出も、１回の分析作業で行うことができる。

いったん標識脂質分子が検出されると、それらの適切なレベルが、正規化濃度法によって測定され得る。例として、正規化濃度は、１，３−ジパルミトイル−２−ステアロイル−グリセロール−ｄ５（ＰＳＰ−ｄ５）の内部標準によって測定される。サンプル中の内部標準のものに対するトリオレインまたは新規合成脂質分子の相対レスポンスが、定量化のため入手され使用される。イソプロピルアルコール中の約１μＭのＰＳＰ−ｄ５溶液が、脂質分子を抽出するために直接使用され得ることがここで分かる。さらに、ｍ／ｚ８５８．０でのＰＳＰ−ｄ５のアンモニウム付加イオンを、イオン抽出および組み込みに使用することができる。当業者は、他の一般に使用される方法によって、検出分子の特定のレベルを測定することができる。

化合物がトリグリセリド合成を調節できるかどうかを評価するため、化合物は、安定同位体標識脂肪酸、成長培地および細胞を含む反応混合物に加えられる。反応は、適切な時間にわたり、例えば約１０分〜約２４時間、インキュベートされる。反応は、イソプロピルアルコールで脂質分子について抽出され、ＬＣ−ＭＳシステムを用いて分析される。化合物を有する反応における標識トリグリセリドのレベルが、化合物なしの反応の場合と著しく異なる場合、その化合物はトリグリセリド合成に関わる酵素を調節すると思われる。本明細書で使用される「著しく異なる」という用語は、その差によって、トリグリセリド合成が調節されると当業者が考えることを意味する。標識トリグリセリドのレベルの差は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％であってよい。

化合物は、多くの化学的分類を包含するが、典型的には有機化合物である。また、化合物は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な化学官能基（functional chemical groups）を含み、典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み、好ましくはそれらの化学官能基のうち少なくとも２つを含み、さらに好ましくは化学官能基のうち少なくとも３つを含む。化合物は、前述した官能基のうち１つもしくは複数で置換された環式炭素（cyclic carbon）または複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。化合物は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、前述したものの誘導体もしくは構造類似体（structure analogs）、またはそれらの組み合わせなどといった、生体分子であってもよい。化合物が核酸である場合、化合物は典型的には、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であるが、非自然結合もしくはサブユニットを有する修飾核酸も企図される。

化合物は、合成または天然化合物のライブラリーを含む広範な供給源から入手することができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを含む、多くの手段が、広範な有機化合物および生体分子のランダムおよび直接合成に利用可能である。化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）を含む当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法：逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法における多くのアプローチのうちのいずれかを用いて入手することもできる（Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145）。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然および合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて、容易に修飾され得る。

さらに、既知の薬剤が、アシル化、アルキル化（akylation）、エステル化、アミド化（amidification）などといった、定方向またはランダム化学修飾（directed or random chemical modifications）を受けて、それらの薬剤の構造類似体を生成することができる。化合物は、ランダムに選択されてよく、または、ＤＧＡＴ活性に結合し、かつ／またはそれを調節する既存の化合物に基づいていてよい。したがって、候補薬剤供給源は、既知のＤＧＡＴモジュレーターに基づいた分子のライブラリーであり、化合物の構造は、より多いかもしくは少ない化学的部分（chemical moieties）または異なる化学的部分を含有するように、分子の１つもしくは複数の位置において変化する。類似体活性化物質／抑制物質のライブラリーを作る上で分子に対してなされる構造変化は、定方向性であるか、ランダムであるか、または定方向性およびランダム置換および／もしくは付加の双方の組み合わせであることができる。コンビナトリアルライブラリーを準備する分野の当業者は、既存のＤＧＡＴモジュレーターに基づいてそのようなライブラリーを容易に準備することができる。本明細書で使用される用語「モジュレーター」、「調節する」などは、酵素活性を増大または減少させる化合物を指す。化合物の存在下で酵素活性が減少する場合、その化合物は、抑制物質と呼ばれる。化合物の存在下で酵素活性が増大する場合、その化合物は、活性化物質と呼ばれる。

例として、トリグリセリド合成に対するＤＧＡＴモジュレーター化合物１および２の効果が、本明細書に記載する方法を使用して評価される。化合物１および２は、参照により全体として組み込まれるＷＯ２００８１４８８６８およびＷＯ２００４０６９８０９に開示されている。化合物１、すなわちＤＧＡＴ１抑制物質は、Ｎ−［２，６−ジクロロ−４−（ピロリジン−１−イルメチル）フェニル］−４−（４−｛［（４−メトキシフェニル）アセチル］アミノ｝フェニル）ピペラジン−１−カルボキサミドである。化合物１は、５９６．５５の分子量を有し、以下の構造を有する。

化合物２、すなわちＤＧＡＴ２抑制物質は、ジメチル１−［シクロヘキシル（３，４−ジクロロフェニル）メチル］−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−４，５−ジカルボキシレートである。化合物２は、４５７．３８の分子量を有し、以下の構造を有する。

ＬＣ−ＭＳシステムが、標識トリグリセリド分子の検出に使用される場合、反応混合物から脂質分子を抽出するのに、適切な溶液が必要である。ヘキサン、クロロホルム／メタノール、ＤＭＳＯなどといったいくつかの有機溶媒は、逆相ＬＣ−ＭＳ検出システムと適合性がないかもしれない。したがって、ヘキサン、クロロホルム／メタノール、ＤＭＳＯなどを抽出に使用する場合、ＬＣ−ＭＳシステムによる検出前に、そのような有機溶媒を除去し、適合性の溶媒系で抽出反応混合物を再構築する、追加の段階が必要となる。

イソプロピルアルコールの使用が、ＬＣ−ＭＳシステムと適合性があることが、本明細書において分かったので、追加の段階なしで、脂質分子を抽出および送達するのにイソプロピルアルコールを使用することができる。１段階抽出により効率が増大し、トリグリセリド合成を調節する多数の化合物のスクリーニングおよび化合物の識別に望ましい、高スループットフォーマットが可能となる。

用語「高スループット」は、同時に複数のサンプルを容易にスクリーニングすることと、ロボット操作の能力と、を可能にするアッセイデザインを指す。高スループットアッセイの、別の所望の特徴は、試薬の使用を減少させるか、または操作回数（number of manipulations）を最小限にして、所望の分析を達成するように最適化された、アッセイデザインである。アッセイフォーマットの例には、９６ウェルまたは３８４ウェルプレート、浮揚液滴（levitating droplets）、および液体を扱う実験に使用される「チップ上のラボ（lab on a chip）」マイクロチャネルチップが含まれる。プラスチック鋳型および液体取り扱い装置の小型化が進むにつれて、または、改良されたアッセイ装置が設計されるにつれて、より多数のサンプリングが本発明のデザインを使用して実行され得ることが、当技術分野で周知である。

一実施形態では、細胞は、９６または３８６ウェルプレートなどの複数のウェルを含むマイクロタイタープレートで培養および分析される。プレートは、各プレートの各ウェルの反応を読み取り、数値データを生成する、ＬＣ‐ＭＳなどの検出システムに装填される。本明細書に記載する方法は、ＤＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＡＧＰＡＴ、およびＰＡＰを含む、トリグリセリド合成に関わる酵素の細胞活性を評価するのにも有用である。この方法は、高スループットフォーマットでトリグリセリド生合成における酵素活性を調節する化合物をスクリーニングするのにも使用されてよい。さらに、本出願の方法は、ヒト被験者からの単離細胞におけるトリグリセリド合成の代謝活性を測定する診断アッセイとして使用されることができる。

実施例１細胞系の準備
３Ｔ３−Ｌ１マウス前脂肪細胞が、１０% ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持された。細胞は、９６ウェルプレートに播種された。コンフルエント（confluency）から２日後、培地は、ＩＢＭＸ、インスリン、およびデキサメタゾンを含む誘導培地（Adipolysis kit, Cayman Chemical Company）に変更された。誘導から３日後、培地は、インスリン培地（Adipolysis kit, Cayman Chemical Company）に変更された。誘導から５日後、培地は、２日間かけて、新鮮なインスリン培地に置き換えられた。ヒト肝細胞腫細胞株ＨＵＨ７が、１０%のＦＢＳ、４．５ｇ／ＬのＤグルコースを含むＤＭＥＭ中に維持された。ラットの肝細胞腫細胞株ＦＵ５ＡＨが、５％のＦＢＳを含むイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中に維持された。肝細胞腫細胞は、９６ウェルプレートに蒔かれ、８０％コンフルエンスで使用された。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７細胞が、１０％のＦＢＳ、４．５ｇ／ＬのＤグルコースを含むＤＭＥＭ中に維持された。ヒト単球性白血病細胞株ＴＨＰ−１が、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で維持され、５ｘ１０^５個の細胞／ｍＬで使用された。

実施例２トリグリセリド合成経路の安定同位体標識
ＨＵＨ７細胞または分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞が、５％のＣＯ_２中、３７℃で一晩、１０％の木炭剥離ＦＢＳ（charcoal-stripped FBS）（Gibco）を含むＤＭＥＭと共にインキュベートされた。ＦＵ５ＡＨ細胞は、５％のＣＯ_２中、３７℃で一晩、５％の木炭剥離ＦＢＳを含むＭＥＭと共にインキュベートされた。０．５％の無脂肪酸ＢＳＡ（SIGMA）と予め合成された（precomplexed）約１００μＬの３００μＭの^１３Ｃ_１８−オレイン酸（SIGMA）が、５％のＣＯ_２中、３７℃で０、３０、６０、１２０および１８０分間、細胞懸濁液に添加された。次に、細胞は、リン酸緩衝食塩水で１回洗浄され、１００μＬのイソプロピルアルコールで抽出される。１０分間室温でインキュベートした後、抽出物が、ガラスバイアルに移され、ＬＣ‐ＭＳシステムを使用して標識脂質分子について検出された。

ＬＣ‐ＭＳ検出は、Z-sprayエレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）を通じて、Micromass triple-quadrupole Quattro Micro mass spectrophotometer（Waters, Milford, MA）と連結されたAgilent 1100 Liquid Chromatographic system（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）で実行された。代謝産物の分離は、Eclipse XDB-C₈カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、粒径＝３．５μｍ）上で実行された。移動相Ａ、イソプロパノール−水（３：７）中の５０ｍＭのギ酸アンモニウム、および移動相Ｂ、イソプロパノール−水（９：１）中の１０ｍＭのギ酸アンモニウムが、以下のとおり、勾配溶離に使用された：２０〜１００％の移動相Ｂを１分間、１００％の移動相Ｂ保持を４分間、２０％の移動相Ｂへの復帰を０．１分間、その後のランタイム後（post run time）が４．５分間。流速は、０．５ｍＬ／分であった。結果として得られたＬＣ溶離液が、１：２の分割（split）で、０．２５ｍＬ／分で質量分析計に導入された。質量分析計は、正負イオン切り替えモード（positive and negative ion switching mode）で操作された。窒素を、噴霧ガス、脱溶媒和ガス、および、コーンカーテンガス（cone curtain gas）として使用した。ＭＳシステムの供給源パラメーター（source parameters）は、キャピラリー電圧、３．１ｋＶ；コーン電圧、２０Ｖ（ＥＳＩ^＋）および１５Ｖ（ＥＳＩ⁻）；抽出器、２Ｖ；ＲＦレンズ、０．１Ｖ；供給源温度（source temperature）、１２０℃；脱溶媒和温度、３００℃；ＬＭ１、ＨＭ１、ＬＭ２もしくはＨＭ２分解能、１５；イオンエネルギー、１．０；入口＆出口（entrance & exit）、１５であった。MassLynxソフトウェアバージョン４．１を、システム制御およびデータ処理に使用した。

ＦＵ５ＡＨ細胞では、グリセロール−３−リン酸経路への^１３Ｃ_１８−オレイン酸の取り込みは、^１３Ｃ_１８−トリオレインの存在によって測定された（図１）。^１３Ｃ_１８−トリオレインのレベルは、３０分、６０分、１２０分、および１８０分の時点の曲線下面積と比較することによって、インキュベーション時間と共に増大していた（図１）。さらに、正負イオン切り替えを用いた、オレオイルリゾホスファチジン酸、２−モノ−オレオイルグリセロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールの中間体、およびトリオレオイル−ｓｎ−グリセロールの最終生成物の同時検出のための、ＬＣ‐ＭＳ法が、本明細書で新たに開発された（図２）。これは、ＬＣ‐ＭＳシステムの検出と組み合わせられた、安定同位体標識が、細胞中のトリグリセリド生合成のさまざまな段階の同時検出に使用され得ることを示す。

実施例３ＤＧＡＴ活性を調節する化合物の評価
ＤＧＡＴ１またはＤＧＡＴ２の活性を調節する化合物を評価するため、ＨＵＨ７または３Ｔ３−Ｌ１細胞が、約１０分間、３７℃で、０．０５％のＤＭＳＯを含む１００μＬの無血清培地中で、約０、０．０３、０．１、０．３、１、３、もしくは１０μＭの化合物１または２と共にプレインキュベートされた。対照は、任意の化合物の非存在下で、約１０分間、３７℃で、０．０５％のＤＭＳＯを含む１００μＬの無血清培地と共にインキュベートされた細胞である。１．０％の無脂肪酸ＢＳＡと予め合成された約１００μＬの６００μＭの^１３Ｃ_１８−オレイン酸が、細胞懸濁液に添加された。３７℃で約９０分間インキュベートした後、細胞が、実施例２に記載したように抽出および検出された。

トリグリセリド生合成に対する化合物１および２の影響を、図３〜図６に示した。ＨＵＨ７、および分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞系の双方は、化合物１の存在下では、新規合成^１３Ｃ_１８−トリオレインのレベルが減少した。ＨＵＨ７細胞系では、１０μＭの化合物１と共にインキュベートされた細胞中の^１３Ｃ_１８−トリオレインのレベルは、対照の約３０％であり、１０μＭの化合物２と共にインキュベートされた細胞中の^１３Ｃ_１８−トリオレインのレベルは、対照の約７５％であった（図３）。加えて、^１３Ｃ_１８−オレオイル−ジグリセリドの一時的な増加が、化合物１と共にインキュベートされたＨＵＨ７細胞で検出された（図５）。これらの結果は、ＨＵＨ７細胞が、^１３Ｃ_１８−ジオレインを^１３Ｃ_１８−トリオレインに変換する機能的ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２酵素の双方を有することを示唆している。

分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞系では、約１０μＭの化合物１と共にインキュベートされた細胞中の^１３Ｃ_１８−トリオレインのレベルは、対照の約３３％であった（図４）。この結果は、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞では、大部分の^１３Ｃ_１８−トリオレインがＤＧＡＴ１により合成されることを示唆している。

次に、ＭＣＦ７細胞中の化合物２の影響を評価した。ＭＣＦ７細胞は、２４時間にわたり、９６ウェル培養プレートにおいて１０％のＦＢＳ、４．５ｇ／ＬのＤグルコースを含むＤＭＥＭ中に播種された。コンフルエンスの、またはほぼコンフルエンスの細胞が、０．１５％の無脂肪酸ＢＳＡを含む約１５０μＬの無血清ＤＭＥＭと共に１時間インキュベートされた。次に、３％のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ中の約３μＬの化合物２が、約０、０．１、０．３、１、３、１０μＭの最終濃度に添加された。３７℃で１５分間インキュベートした後、プレートは排水された。次に、細胞は、３％のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ中、０．１５％の無脂肪酸ＢＳＡと予め合成された１５０μＬの１００μＭの^１３Ｃ_１８−オレイン酸および約３μＬの化合物２と共に、約３時間、３７℃でインキュベートされた。細胞は、約１００μＬのイソプロピルアルコールで抽出され、前記のとおり、ＬＣ‐ＭＳ検出が続いた。図６に示すとおり、化合物２と共にインキュベートされた細胞中の^１３Ｃ_１８−トリオレインのレベルは、対照の約８０％であった。この結果は、ここで使用されるＭＣＦ７細胞において、大部分の^１３Ｃ_１８−トリオレインがＤＧＡＴ２によって合成されることを示唆している。

グリセロール−３−リン酸経路中、他の酵素を伴う３つの標識脂肪酸鎖を有する^１３Ｃ_１８−トリオレインの生成として、追加の実験を行って、標識中間体の存在を検出した。ＦＵ５ＡＨ細胞は、６０分間、^１３Ｃ_１８−オレイン酸と共にインキュベートされ、実施例２に記載したような同時検出を用いて分析された。図７に示すように、１つ、２つ、および３つの^１３Ｃ_１８−オレオイル側鎖を含むトリオレインは、それぞれ分子質量がｍ／ｚ９２１．０、９３９．０、および９５７．０の標識分子として現れる。

実施例３の結果は、分化脂肪細胞およびＨＵＨ７細胞が、ＤＧＡＴ１活性を調節する化合物をスクリーニングするのに使用され得ることを示す。一方、ＭＣＦ７細胞は、ＤＧＡＴ２活性を調節する化合物をスクリーニングするのに使用されることができる。さらに、ＭＣＦ７、脂肪細胞および肝細胞腫細胞は、グリセロール−３−リン酸経路など、トリグリセリド生合成に関わるＧＰＡＴ、ＡＧＰＡＴ、またはＰＡＰを含む他の酵素を調節する化合物をスクリーニングするのに使用されてよい。

実施例４白血球中のトリグリセリド生合成の検出
トリグリセリド生合成が白血球中に存在するかどうかを調べるため、ＴＨＰ−１細胞が、無血清ＲＰＭＩと共にインキュベートされ、３７℃で２時間、インキュベートされた。約２００，０００個の細胞が、５分間、５００ｘｇで遠心分離された。ＲＰＭＩ中、０．５％の無脂肪酸ＢＳＡ（SIGMA）と予め合成された約３００μＬの３００μＭの^１３Ｃ_１８−オレイン酸（SIGMA）が、細胞ペレットに添加された。細胞は、３７℃で２時間、標識分子と共にインキュベートされ、前述したように、イソプロピルアルコールで抽出された。

図８に示すように、新規合成^１３Ｃ_１８−トリオレインが、標識オレイン酸と共に培養されたＴＨＰ−１細胞中で検出されたが、標識オレイン酸なしで培養された対照細胞中では、検出されなかった。ＴＨＰ−１細胞が約１２０分間、^１３Ｃ_１８−オレイン酸と共に培養されたとき、１つまたは２つの^１３Ｃ_１８−オレオイル側鎖を有するトリオレインが、標識分子として検出され、分子質量は、それぞれ、ｍ／ｚ９２１．０および９３９．０であった。

部分標識トリオレインの検出は、本出願の方法が、ＡＧＰＡＴ、ＰＡＰ、またはＤＧＡＴの細胞活性を検出するのに使用され得ることを示す。さらに、本明細書に記載する方法は、単離細胞における新規合成トリグリセリドを検出するのに使用されてよく、したがって、トリグリセリド生合成の代謝活性を測定する診断アッセイとして使用され得る。

このセクションで引用した参考文献は全て、参照により全体が組み込まれるものである。

よって、好適な実施形態に適用されるものとして、本発明の根本的な新規の特徴を図示し、説明し、指摘してきたが、例示した装置の形態および詳細、ならびにそれらの操作における、さまざまな省略、置換、変更が、本発明の主旨から逸脱せずに当業者により行われ得ることが、理解されるであろう。例えば、同じ結果を得るために実質的に同じ方法で実質的に同じ機能を遂行する要素および／または方法工程の全ての組み合わせは、本発明の範囲内であることが、明白に意図されている。さらに、本発明の任意の開示形態または実施形態に関連して図示および／または説明された、構造および／または要素および／または方法工程は、デザイン選択の一般的事項として、任意の他の開示形態、説明形態、もしくは示唆形態または実施形態に組み込まれ得ることが認識されるべきである。したがって、請求項の範囲によって示されるようにのみ、制限されることが意図されている。

〔実施の態様〕
（１）アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の活性を抑制する化合物を識別する方法において、
ａ．前記化合物の存在下および非存在下で、安定同位体標識脂肪酸を細胞と接触させる工程と、
ｂ．イソプロピルアルコールで前記細胞を抽出する工程と、
ｃ．前記化合物の存在下で、安定同位体標識トリグリセリドのレベルを測定する工程と、
ｄ．前記化合物の非存在下で、安定同位体標識トリグリセリドのレベルを測定する工程と、
を含み、
前記安定同位体標識トリグリセリドのレベルの変化は、前記化合物がＤＧＡＴ活性を抑制することを示す、方法。
（２）実施態様１に記載の方法において、
前記安定同位体は、^１３Ｃである、方法。
（３）実施態様１に記載の方法において、
前記安定同位体標識脂肪酸は、^１３Ｃ_１８−オレイン酸である、方法。
（４）実施態様１に記載の方法において、
前記安定同位体標識トリグリセリドは、液体クロマトグラフィー‐質量分光光度計システムにより検出される、方法。
（５）トリグリセリド合成に関わる酵素の活性を計る方法において、
ａ．安定同位体標識脂肪酸を細胞と接触させる工程と、
ｂ．イソプロピルアルコールで前記細胞を抽出する工程と、
ｃ．安定同位体標識リゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、またはジアシルグリセロールもしくはトリグリセリドの存在を検出する工程と、
を含む、方法。

（６）実施態様５に記載の方法において、
前記酵素は、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である、方法。
（７）実施態様５に記載の方法において、
前記酵素は、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である、方法。
（８）実施態様５に記載の方法において、
前記酵素は、１−アシルグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）である、方法。
（９）実施態様５に記載の方法において、
前記酵素は、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）である、方法。
（１０）実施態様５に記載の方法において、
前記安定同位体は、^１３Ｃである、方法。

（１１）実施態様５に記載の方法において、
前記安定同位体標識脂肪酸は、^１３Ｃ_１８−オレイン酸である、方法。

３オレオイル−^１３Ｃ_１８側鎖を有する^１３Ｃ標識トリオレインの抽出イオンクロマトグラムであり、これは、０分（Ａ）、３０分（Ｂ）、６０分（Ｃ）、１２０分（Ｄ）、および１８０分（Ｅ）の時点での、ＦＵ５ＡＨ細胞におけるトリグリセリドへの遊離^１３Ｃ_１８−オレイン酸の全体的な取り込みを示す。ＬＣ‐ＭＳ正負イオン切り替えを使用した、トリオレイン合成の中間体および最終生成物の同時観察：（Ａ）オレオイルリゾホスファチジン酸、（Ｂ）モノオレオイルグリセロール、（Ｃ）ジオレオイルホスファチジン酸（dioleoyl phosphatidyate）、（Ｄ）ジオレオイルグリセロール、および（Ｅ）トリオレオイルグリセロール。ＨＵＨ７肝細胞中の３つのオレオイル−^１３Ｃ_１８鎖を有する新規合成トリオレインに対する、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２抑制物質の効果の評価。３Ｔ３−Ｌ１分化脂肪細胞中の３つのオレオイル−^１３Ｃ_１８鎖を有する新規合成トリオレインに対する、ＤＧＡＴ１抑制物質の評価。ＨＵＨ７肝細胞中のＤＧＡＴ１抑制の際の、２つのオレオイル−^１３Ｃ_１８鎖を有するジグリセリドの一時的増加。ＭＣＦ７細胞中の３つのオレオイル−^１３Ｃ_１８鎖を有する新規合成トリオレインに対する、ＤＧＡＴ２抑制物質の評価。６０分間オレイン−^１３Ｃ_１８酸（oleic-¹³C₁₈ acid）で培養した後の、ＦＵ５ＡＨ細胞中の１つ、２つ、および３つのオレオイル−^１３Ｃ_１８側鎖を有するトリオレインの同時検出：（Ａ）ｍ／ｚ９０３．０で検出された内在性トリオレイン、（Ｂ）ｍ／ｚ９２１．０で検出された^１３Ｃ_１８−トリオレイン、（Ｃ）ｍ／ｚ９３９．０で検出された^１３Ｃ_３６−トリオレイン、および（Ｄ）ｍ／ｚ９５７．０で検出された^１３Ｃ_５４−トリオレイン。 ^１３Ｃ_１８−オレイン酸と共に、または^１３Ｃ_１８−オレイン酸なしで１２０分間インキュベートされたＴＨＰ−１単球中の、１つ、２つ、および３つのオレオイル−^１３Ｃ_１８側鎖を有するトリオレインの同時検出：（Ａ）^１３Ｃ_１８−トリオレインは、^１３Ｃ_１８−オレイン酸の非存在下ではｍ／ｚ９２１．０で検出されなかった；（Ｂ）^１３Ｃ_１８−トリオレインは、^１３Ｃ_１８−オレイン酸の存在下で観察された；（Ｃ）^１３Ｃ_３６−トリオレインは、^１３Ｃ_１８−オレイン酸の非存在下ではｍ／ｚ９３９．０で検出されなかった；（Ｄ）^１３Ｃ_３６−トリオレインは、^１３Ｃ_１８−オレイン酸の存在下で観察された；（Ｅ）^１３Ｃ_５４−トリオレインは、^１３Ｃ_１８−オレイン酸の非存在下ではｍ／ｚ９５７．０で検出されなかった；（Ｆ）^１３Ｃ_５４−トリオレインは、^１３Ｃ_１８−オレイン酸の存在下で観察された。

Claims

細胞内におけるアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）のインビボ活性を抑制する化合物を識別する方法において、
ａ．前記化合物の存在下および非存在下で、安定同位体標識脂肪酸を細胞と接触させる工程と、
ｂ．イソプロピルアルコールで前記細胞を抽出する工程と、
ｃ．前記化合物の存在下で、安定同位体標識ジアシルグリセロールおよびトリグリセリドのレベルを測定する工程と、
ｄ．前記化合物の非存在下で、安定同位体標識ジアシルグリセロールおよびトリグリセリドのレベルを測定する工程と、
ｅ．前記化合物の存在下での安定同位体標識ジアシルグリセロールおよびトリグリセリドのレベルを、前記化合物の非存在下での前記安定同位体標識ジアシルグリセロールおよびトリグリセリドのレベルと比較する工程と、
を含み、
前記化合物の存在下での安定同位体標識ジアシルグリセロールのレベルの上昇および前記安定同位体標識トリグリセリドのレベルの低下は、前記化合物がＤＧＡＴ活性を抑制することを示す、方法。
請求項１に記載の方法において、
前記安定同位体は、^１３Ｃである、方法。
請求項１に記載の方法において、
前記安定同位体標識脂肪酸は、^１３Ｃ_１８−オレイン酸である、方法。
請求項１に記載の方法において、
前記安定同位体標識トリグリセリドは、液体クロマトグラフィー‐質量分光光度計システムにより検出される、方法。
細胞内におけるトリグリセリド合成に関わる酵素のインビボ活性を計る方法において、
ａ．安定同位体標識脂肪酸を細胞と接触させる工程と、
ｂ．イソプロピルアルコールで前記細胞を抽出する工程と、
ｃ．抽出物中の安定同位体標識リゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、またはジアシルグリセロールもしくはトリグリセリドの存在を検出する工程と、
を含み、
前記安定同定標識リゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、ジアシルグリセロールまたはトリグリセリドの存在は、前記酵素の活性を示す、方法。
請求項５に記載の方法において、
当該方法は、安定同位体標識トリグリセリドの存在を検出し、
前記酵素は、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である、方法。
請求項５に記載の方法において、
当該方法は、安定同位体標識リゾホスファチジン酸の存在を検出し、
前記酵素は、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である、方法。
請求項５に記載の方法において、
当該方法は、安定同位体標識ホスファチジン酸の存在を検出し、
前記酵素は、１−アシルグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ）である、方法。
請求項５に記載の方法において、
当該方法は、安定同位体標識ジアシルグリセロールの存在を検出し、
前記酵素は、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）である、方法。
請求項５に記載の方法において、
前記安定同位体は、^１３Ｃである、方法。
請求項５に記載の方法において、
前記安定同位体標識脂肪酸は、^１３Ｃ_１８−オレイン酸である、方法。