JP5652842B2 - 環状二本鎖dnaおよびそれを用いたdnaの増幅方法 - Google Patents
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Description
Hutchison, CA., Smith, HO., Pfannkoch, C. & Venter, JC. Cell-free cloning using phi29 DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 17332-6 (2005). Marcy, Y., Ishoey, T., Lasken, R.S., Stockwell, T.B., Walenz, B.P., Halpern, A.L., Beeson, K.Y., Goldberg, S.M. & Quake, S.R. Nanoliter reactors improve multiple displacement amplification of genomes from single cells. PLoS Genet., 3, 1702-8 (2007).
さらに本発明は、他方のDNA鎖が2以上のニックを有する、前記の環状二本鎖DNAに関する。
一方の末端が脱リン酸化され、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖DNA断片を少なくとも1つ含む、1または2以上の直鎖状二本鎖DNA断片をライゲーションすることを含む、前記方法に関する。
さらに本発明は、直鎖状二本鎖DNA断片の両末端を脱リン酸化し、制限酵素でこれを切断することによって、一方の末端が脱リン酸化され、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖DNA断片とすることを含む、前記の方法に関する。
また本発明は、2以上の直鎖状二本鎖DNA断片のいずれをも、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖DNA断片とする、前記の方法に関する。
さらに本発明は、さらに、ライゲーションの後に反応液中の直鎖状DNAを分解処理する工程を含む、前記の方法に関する。
(1)一方の直鎖状二本鎖DNA断片を制限酵素(X)で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素(X)と異なる制限酵素(Y)で切断する工程、
(2)他方の直鎖状二本鎖DNA断片を前記制限酵素(Y)で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素(X)で切断する工程、
(3)工程(1)および(2)で得られた2つの直鎖状二本鎖DNA断片をライゲーションする工程、および
(4)反応液中の直鎖状DNAを分解処理する工程、
を含む、前記方法に関する。
さらに本発明は、前記の環状二本鎖DNA、または、前記の方法により製造された環状二本鎖DNAを製造するためのキットであって、
少なくとも、生理緩衝液、ATP、RecBCDヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼIを含む、前記キットに関する。
さらに本発明は、プライマーの5’末端から少なくとも1塩基がRNAである、前記の方法に関する。
また本発明は、プライマーが、鋳型DNA特異的プライマーである、前記の方法に関する。
さらに本発明は、プライマーが、ランダムプライマーである、前記の方法に関する。
さらに本発明は、前記の鎖置換型DNA合成によるDNA増幅方法によって増幅されたDNA増幅産物であって、
鋳型の環状二本鎖DNAの配列が、樹状構造状に105〜1013回繰り返した配列を有する、前記DNA増幅産物に関する。
(1)出発材料となる直鎖状二本鎖DNA断片の両末端を脱リン酸化する工程、
(2)工程(1)の後、制限酵素によって切断する工程
を含む方法によって製造することができる。また、本発明にかかる環状二本鎖DNAを製造するための直鎖状二本鎖DNA断片は、少なくとも1種が一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない状態であることが必要であるが、全種の直鎖状二本鎖DNA断片が前記の状態であることが好ましい。
本発明で用いる各種の制限酵素はとくに限定されないが、平滑末端に消化する制限酵素としては、例えば、SmaIやEcoRVなどが挙げられ、5’突出末端に消化する制限酵素としては、例えば、EcoRIやBamHIなどが挙げられ、3’突出末端に消化する制限酵素としては、例えば、PstIやKpnIなどが挙げられる。目的外結合産物の環状化を防止する点からは、複数の突出末端を用いるのが好ましく、特に平滑末端に消化する制限酵素を使用する場合、他の5’や3’突出末端に消化する制限酵素を組み合わせてが用いることが好ましい。
直鎖状DNAの分解処理には、環状DNAは分解せずに直鎖状DNAを特異的に分解する酵素、例えば、RecBCDヌクレアーゼ(エクソヌクレアーゼV,各社)、エキソヌクレアーゼI(各社)、Lambdaエキソヌクレアーゼ(各社)などを用いることができる。とくに、直鎖状DNAの末端形状を考慮する必要性がないことから、ATPを添加した生理緩衝液(組成:33mMトリス塩酸、66mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム)において、RecBCDヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼIを用いるのが好ましい。
また、各処理の後のDNAの回収には、通常行われる各種のDNA精製・回収方法を用いることができる。
プライマーの長さは、とくに限定されないが、長すぎるとプライマーの二次構造によるアニーリング効率の低下があり、短すぎるとプライマーの融解温度(Tm)の低下によるアニーリング効率の低下があるため、例えば、6〜50塩基、好ましくは6〜30塩基、とくに好ましくは6〜7塩基の長さである。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
プラスミドDNAであるpUC19は制限酵素BamHIで、ラムダDNAは制限酵素EcoRIで切断処理をそれぞれの至適反応液中で37℃3時間行った。各制限酵素処理液を熱処理により、酵素を失活させた後、牛腸由来アルカリフォスファターゼ(タカラバイオ社)を用いて、至適反応液中において脱リン酸化反応を37℃1時間行った。
Claims (12)
- 鎖置換型DNA合成によるDNA増幅方法に用いられる鋳型としての環状二本鎖DNAを製造する方法であって、
直鎖状二本鎖DNA断片の両末端を脱リン酸化し、制限酵素でこれを切断することによって、一方の末端が脱リン酸化され、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖DNA断片を得ること、および、
得られた直鎖状二本鎖DNA断片を少なくとも1つ含む、1または2以上の直鎖状二本鎖DNA断片をライゲーションすること
を含む、前記方法。 - 2以上の直鎖状二本鎖DNA断片のいずれをも、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない直鎖状二本鎖DNA断片とする、請求項1に記載の方法。
- さらに、ライゲーションの後に反応液中の直鎖状DNAを分解処理する工程を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 2つの直鎖状二本鎖DNA断片を用いて鎖置換型DNA合成によるDNA増幅方法に用いられる鋳型としての環状二本鎖DNAを製造する方法であって、
(1)一方の直鎖状二本鎖DNA断片を制限酵素(X)で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素(X)と異なる制限酵素(Y)で切断する工程、
(2)他方の直鎖状二本鎖DNA断片を前記制限酵素(Y)で切断した後、両末端を脱リン酸化し、さらに前記制限酵素(X)で切断する工程、
(3)工程(1)および(2)で得られた2つの直鎖状二本鎖DNA断片をライゲーションする工程、および
(4)反応液中の直鎖状DNAを分解処理する工程、
を含む、前記方法。 - 請求項3または4に記載の方法により製造された環状二本鎖DNAからなる、鎖置換型DNA合成によるDNA増幅反応用の鋳型DNAの溶液。
- 請求項3または4に記載の方法により製造された環状二本鎖DNAからなる、鎖置換型DNA合成によるDNA増幅反応用の鋳型DNAの溶液を製造するためのキットであって、
少なくとも、生理緩衝液、ATP、RecBCDヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼIを含む、前記キット。 - 請求項5に記載の鋳型DNAの溶液に含まれる環状二本鎖DNAを鋳型とし、DNAプライマー、RNAプライマーまたはRNA/DNAキメラプライマーとして用いてなる、鎖置換型DNA合成によりDNAを増幅する方法。
- プライマーの5’末端から少なくとも1塩基がRNAである、請求項7に記載の方法。
- プライマーが、鋳型DNA特異的プライマーである、請求項7または8に記載の方法。
- プライマーが、ランダムプライマーである、請求項7または8に記載の方法。
- 請求項8〜10のいずれか一項に記載の鎖置換型DNA合成によるDNA増幅方法のためのキットであって、少なくとも、RNAプライマー、鎖置換型DNA合成酵素および鎖置換型DNA合成反応用緩衝液を含む、前記キット。
- 請求項8〜10のいずれか一項に記載の鎖置換型DNA合成によるDNA増幅方法によって増幅されたDNA増幅産物であって、
鋳型の環状二本鎖DNAの配列が、樹状構造状に105〜1013回繰り返した配列を有する、前記DNA増幅産物。
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