JP5643650B2 - ゲノム同定システム - Google Patents

Description

関連出願に対するクロスリファレンス
［００１］本出願は、２００７年１１月２１日出願の米国仮出願第６０／９８９，６４１号に優先権を請求し、該出願の開示は、その全体が本明細書に援用される。

発明の分野
［００２］本発明は、生物同定のためのシステムおよび方法、そしてより詳細には、ハンドヘルドまたはより大きい電子デバイスにおける確率的データマッチングによる、核酸および他のポリマー性または鎖型分子の配列の決定に関する。

［００３］ＤＮＡまたはＲＮＡサンプルを分析し、そして配列決定することが有用であろう、生命を脅かす状況が非常に多様にあり、例えば、致死性の病原体が環境内に放出されているバイオテロリズム行為に応じた状況がある。過去には、こうした結果は多くの人々の関与を必要としており、これには非常に長い時間が掛かった。その結果、迅速性および正確さが劣る可能性がある。

［００４］バイオテロリストの攻撃または流行の出現の場合、第一の応答者、すなわち救急治療室の医師（そのオプションまたは臨床治療）、ならびに食品製造業者、卸業者、小売業者、および国中の公衆衛生職員が、迅速に、正確に、そして信頼性を持って病原体およびそれらが引き起こす疾患を同定することが重要である。病原体は、食品、空気、土、水、組織および病原体の臨床像などのサンプルソース中に含有されうる。病原体および／または潜在的な疾患は生命を脅かす可能性もあり、そして非常に伝染性が強い可能性もあるため、この同定プロセスは、迅速に行われなければならない。これは、現在の国土安全保障バイオテロリズム応答における重要な弱点である。

［００５］単一より多い生物を同定可能であり（多重化）そして種が存在するかどうかを、サンプル中に存在する核酸のゲノム比較に基づいて示しうる、システムおよび方法が必要である。

［００６］生物学的操作における迅速な進歩によって、ＤＮＡ配列決定ツール、すなわちＤＮＡ中の塩基の順序を決定する方法であるハイスループット配列決定の設計および能力に劇的な影響が与えられてきており、ヒト疾患の遺伝的基礎に対する手がかりを与えうる遺伝子変動マップが得られている。この方法は、任意の数のプライマーを用いて、ＤＮＡの多くの異なるテンプレートを配列決定するのに非常に有用である。生物学的操作のこれらの重要な進歩にも関わらず、配列［情報］を迅速に同定し、そしてより効率的にそして効果的にデータを転送する構築デバイスにはほとんど進歩がない。

［００７］伝統的なＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡ合成によるＤＮＡ鎖の伸長を停止する鎖終結阻害剤を用いる、サンガー法［Ｓａｎｇｅｒら、１９７７］と一般的に称されるダイデオキシ法によって達成された。

［００８］配列決定戦略のための新規方法が開発され続けている。例えば、ＤＮＡマイクロアレイの出現は、配列アレイを構築し、そしてハイブリダイゼーションによる配列決定と一般的に称されるプロセスにおいて、相補配列とハイブリダイズさせることを可能にする。現在の最新技術と見なされる別の技術は、プライマー伸張後、単一のヌクレオチドの各周期での周期的な添加、その後の取り込み事象の検出を使用する。一般的に合成による配列決定またはパイロシークエンスと称され、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）を含む技術は、実際には反復性であり、そしてプライマー伸張の反復周期の一連のプロセスを伴う一方で、ターゲットヌクレオチド配列を配列決定する。

Ｓａｎｇｅｒら、１９７７

［００９］したがって、応答を合理化し、価値ある医療用品を節約し、そしてバイオテロリズム、不注意の放出、および病原体流行の出現を封じ込めるための、核酸配列データ、臨床データ、療法介入、および適切な集団への目的に合わせた（ｔａｉｌｏｅｄ）療法剤送達の多方向電子通信を含む、迅速なゲノム同定法およびシステムに対する必要性が存在する。

［００１０］本システムは、生物学的材料を含有する任意のサンプルを分析して、サンプル中の種またはゲノムの存在を決定するように設計される。これは、生物学的材料の配列情報を入手して、そして当該配列情報をデータベースに対して比較することによって達成される。配列情報がマッチするならば、ゲノムまたは種が存在することが示される。確率的マッチングは、その種が存在する尤度を計算するであろう。該方法は、大規模平行配列決定システムに適用可能である。

発明の概要
［００１１］本発明の１つの側面は、生物学的材料を含むサンプルを入手すること、当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出すること、当該核酸分子から配列情報を生成すること、および当該配列情報とデータベース内の核酸配列とを確率に基づいて比較することを含む、サンプル中の生物学的材料を同定する方法である。生物学的材料を同定することには、限定されるわけではないが、サンプル中に存在するゲノムを検出し、そして／または決定すること、前記サンプル内に含有される核酸配列情報、生物学的材料の種を決定する能力、株、突然変異体および操作された生物間の変動を検出する能力、ならびに未知の生物および多型を性質決定することが含まれる。生物学的材料には、限定されるわけではないが、生物または病原体のＤＮＡ、ＲＮＡおよび関連する遺伝子情報が含まれる。

［００１２］本発明の１つの態様において、前記１以上の核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡから選択されうる。
［００１３］別の態様において、本発明は、長さｎのヌクレオチド断片を含む配列情報を生成すること、およびさらに前記長さｎの断片を、データベース内の核酸配列と比較することを含む。

［００１４］１つの態様において、「ｎ」は前記サンプルから入手される核酸分子の陽性同定に必要なヌクレオチド断片の最小限の長さに相当する。
［００１５］１つの態様において、「ｎ」は、１ヌクレオチド〜５ヌクレオチドの範囲であってもよい。

［００１６］本発明の別の態様において、長さｎのヌクレオチド断片の配列情報のマッチ確率がターゲットマッチの閾値より小さい場合に、長さｎ＋１、ｎ＋２・・・ｎ＋ｘのヌクレオチド断片を生成する。

［００１７］さらに別の態様において、本発明は、配列情報を生成する前に、前記１以上の核酸分子を増幅して複数（ｉ）の１以上の核酸分子を得ることを含む。増幅後に生成される配列情報は、複数（ｉ（ｎ））の断片が、データベース内の核酸配列と比較されるように、長さｎのヌクレオチド断片を含んでもよい。

［００１８］本発明の別の態様において、複数（ｉ（ｎ））の配列情報のマッチ確率がターゲットマッチの閾値より小さい場合に、複数のｉ（ｎ＋１）、ｉ（ｎ＋２）・・・ｉ（ｎ＋ｘ）の配列情報を生成する。

［００１９］本発明の１つの態様において、ヌクレオチド断片を、限定されるわけではないが、ベイズアプローチ、再帰ベイズアプローチまたはナイーブベイズアプローチを含む確率マッチングによってデータベース内の核酸配列に比較する。

［００２０］確率アプローチは、正確な結論に達するために２つの重要な因子を考慮するベイズ尤度を用いてもよい：（ｉ）Ｐ（ｔ_ｉ／Ｒ）は、試験パターンＲを示す生物が分類群ｔ_ｉに属する確率であり、そして（ｉｉ）Ｐ（Ｒ／ｔ_ｉ）は、分類群ｔ_ｉのメンバーが試験パターンＲを示す確率である。ツール内に組み込まれたスライディング・ウィンドウ内の最小限のパターンは、生物が遺伝的に修飾されている「かどうか」および「どのように」修飾されているかに関して、研究者を補助するであろう。

［００２１］本発明の１つの態様において、確率的マッチングによって、前記配列情報の種を同定するための階層型統計的フレームワークが与えられる。
［００２２］本発明の別の態様において、配列情報の比較を、リアルタイムで、または当該配列情報が生成されるのと同じ速さで、または生成された直後に実行する。

［００２３］本発明の別の態様において、前記１以上の核酸分子から追加の配列情報を生成し続けながら、前記配列情報の比較を、リアルタイムまたは配列情報が生成されるのと同じ速さで実行し、ここで前記追加の配列情報は、限定されるわけではないが、先に生成された配列情報と比較した際に、増加した、減少したまたは同じ長さの配列情報を含む、様々な長さのヌクレオチドを含んでもよい。

［００２４］本発明の別の態様において、方法は、生物学的材料を含むサンプルを入手すること、当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出すること、当該核酸分子から長さｎのヌクレオチド断片を含む配列情報を生成すること、およびリアルタイムまたは断片が生成されるのと同じ速さでデータベース内の核酸配列と比較し、長さｎ＋１、ｎ＋２・・・ｎ＋ｘの核酸断片を、当該１以上の核酸分子から生成し続け、そしてリアルタイムまたは断片が生成されるのと同じ速さでデータベース内の核酸配列と比較し続けることを含む。

［００２５］本発明の別の態様において、方法は、生物学的材料を含むサンプルを入手すること、当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出すること、長さｎのヌクレオチド断片の配列情報を生成する前に、当該１以上の核酸分子を増幅して複数（ｉ）の核酸分子を得ることを含み；複数（ｉ（ｎ））のヌクレオチド断片を、リアルタイムまたは断片が生成されるのと同じ速さでデータベース内の核酸配列と比較しながら、複数（ｉ（ｎ＋ｌ））、（ｉ（ｎ＋２））・・・（ｉ（ｎ＋ｘ））の核酸断片を、当該１以上の核酸分子から生成し続け、そしてリアルタイムまたは断片が生成されるのと同じ速さでデータベース内の核酸配列と比較し続けることをさらに含む。

［００２６］本発明の１つの態様において、配列情報には、限定されるわけではないが、クロマトグラム、標識ＤＮＡまたはＲＮＡ断片の画像、ヌクレオチド順序を決定するための核酸分子の物理的照合、ナノポア分析、および核酸鎖の配列を決定する当該技術分野に知られる他の方法が含まれる。

［００２７］本発明の１つの態様において、「ｘ」は、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０または９０〜１００ヌクレオチドより選択されてもよい。別の態様において、「ｘ」は、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００または４００〜５００ヌクレオチドであってもよい。

［００２８］本発明の別の態様において、長さｎのヌクレオチド断片の配列情報のマッチ確率がターゲットマッチの閾値より小さい場合に、ｎ＋ｘが、前記サンプルから入手される核酸分子の陽性同定のためのヌクレオチド断片の最少の長さに相当する。

［００２９］本発明の別の態様は、（１）生物学的材料を含むサンプルを入手すること、（２）当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出すること、（３）当該１以上の核酸分子からヌクレオチド断片の配列を含んでなる配列情報を生成すること、（４）当該ヌクレオチド断片の配列をデータベース内の核酸配列と比較することを含む、サンプル中の生物学的材料を同定する方法であって、当該ヌクレオチド断片の配列を比較した結果、当該サンプル中の生物学的材料を同定するマッチングが得られない場合、（５）当該１以上の核酸分子から、１の追加のヌクレオチドからなるヌクレオチド断片の配列を含む追加の配列情報を生成すること、（６）当該追加の配列情報の生成直後に、当該追加の配列情報をデータベース内の核酸配列と比較すること、そして、マッチングの結果、当該サンプル中の生物学的材料が同定されるまで工程（５）〜（６）を繰り返すことをさらに含む、上記方法である。

［００３０］本発明の別の態様は、（１）生物学的材料を含むサンプルを入手すること、（２）当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出すること、（３）当該１以上の核酸分子を増幅させて複数の１以上の核酸分子を得ること、（３）当該１以上の核酸分子からヌクレオチド断片の複数の配列を含んでなる複数の配列情報を生成すること、（４）当該ヌクレオチド断片の複数の配列をデータベース内の核酸配列と比較することを含む、サンプル中の生物学的材料を同定する方法であって、当該ヌクレオチド断片の複数の配列を比較した結果、当該サンプル中の生物学的材料を同定するマッチングが得られない場合、（５）当該１以上の核酸分子から、１の追加のヌクレオチドからなるヌクレオチド断片の配列を含む複数の追加の配列情報を生成すること、（６）当該追加の配列情報の生成直後に、当該追加の配列情報をデータベース内の核酸配列と比較すること、そして、マッチングの結果、当該サンプル中の生物学的材料が同定されるまで工程（５）〜（６）を繰り返すことをさらに含む、上記方法である。

［００３１］本発明はまた、（１）生物学的材料を含むサンプルを受容するように構成される、サンプル受容ユニット；（２）当該サンプルから少なくとも１の核酸分子を抽出するように構成される、サンプル受容ユニットと連結された抽出ユニット；（３）少なくとも１の核酸分子を当該抽出ユニットから受容し、少なくとも１の核酸分子から配列情報を生成するように構成される、当該抽出ユニットと連結された配列決定カセット；（４）参照核酸配列を含んでなるデータベース；および（５）当該配列決定カセットから当該配列情報を受信し、当該配列情報を当該参照核酸配列と比較するように構成される、当該配列決定カセットおよび当該データベースと連結された処理ユニットを含む、生物学的材料を検出するためのシステムにも関する。

［００３２］本発明の別の態様において、前記抽出ユニットは、前記長さｎの前記ヌクレオチド断片をデータベースと比較するように構成される。
［００３３］本発明の別の態様において、前記抽出ユニットは、確率的マッチングで前記長さｎのヌクレオチド断片をデータベースと比較するように構成される。

［００３４］本発明の別の態様において、前記抽出ユニットは、前記長さｎのヌクレオチド断片をリアルタイムまたは当該断片が生成されるのと同じ速さでデータベースと比較するように構成される。

［００３５］本発明の別の態様において、長さｎのヌクレオチド断片のマッチ確率がターゲットマッチの閾値より小さい場合に、前記配列決定カセットは、前記１以上の核酸分子から様々な長さ（例えば、先に生成された配列情報より増加した、減少したまたは同じ長さ）のヌクレオチド断片を含む配列情報を生成するように構成され、そして前記抽出ユニットは、当該様々な長さのヌクレオチド断片をデータベース内の核酸配列と比較するように構成される。

［００３６］本発明のさらに別の態様は、前記長さｎのヌクレオチド断片を、リアルタイムまたは当該長さｎの断片が生成されるのと同じ速さで前記参照核酸配列と比較し、配列決定ユニットが、長さｎ＋１、ｎ＋２・・・ｎ＋ｘのヌクレオチド断片の配列情報を、前記１以上の核酸分子から生成し続け、そして処理ユニットが、当該長さｎ＋１、ｎ＋２・・・ｎ＋ｘのヌクレオチド断片の配列情報を、リアルタイムまたは断片が生成されるのと同じ速さでデータベース内の核酸配列と比較する、システムを含む。

［００３７］システム内に含まれるさらなる変動は、以下の本発明の詳細な説明に記載される。

［００３８］付随する図に関連して、様々な態様が記載される。図中、同様の参照番号は、同一のまたは機能的に類似のコンポーネントを示す。
［００３９］図１は、開示するシステムの略図である。 ［００４０］図２は、図１のシステムのより詳細な略図である。 ［００４１］図３は、図１のシステムの態様における交換可能なカセットおよび他のコンポーネント間の機能的相互作用の略図である。 ［００４２］図４は、ハンドヘルド電子配列決定デバイスの態様の正面斜視図である。 ［００４３］図５は、図１のシステムの操作プロセスを例示するフローチャートである。 ［００４４］図６は、システムに潜在的に関与する様々なエンティティと図１のシステムの相互作用の略図である。 ［００４５］図７は、リモート分析センターとハンドヘルド電子配列決定デバイス間の機能的相互作用の略図である。 ［００４６］図８は、確率的ソフトウェアモジュールの全体の構築の略図である。 ［００４７］図９は、読み取り長の関数として固有配列パーセントを示す。 ［００４８］図１０は、配列決定の主な工程の要約である。

発明の詳細な説明
［００４９］本発明に記載する方法およびシステムは、性質決定されていないサンプル中の核酸混合物において、生成または収集された全配列情報に関連して最小の固有の長さ（ｎ）を有する、最小の固有の配列情報を用いる。固有の長さの配列に加えて、非固有の配列もまた比較する。ゲノム同定の確率は、多数のマッチとともに増加する。いくつかのゲノムは、他のゲノムよりも、より長い最小固有配列を有するであろう。短い長さ（ｎ）の配列のマッチング法は、配列情報生成または収集と平行して続く。比較は、続いて、より長い配列が生成または収集されるのと同じ速さ（リアルタイム）で起こる。配列情報生成／収集に関して、計算が早期に行われるため、これはかなりの決定空間減少を生じる。確率的マッチングには、限定されるわけではないが、完全マッチング、下位配列固有性、パターンマッチング、長さｎ以内での多数の下位配列マッチング、不正確マッチング、シードおよび伸長、距離測定および系統樹マッピングが含まれてもよい。これは、生成されるのと同じ速さまたはリアルタイムで、配列情報をマッチングさせる、自動化パイプラインを提供する。配列決定装置は、比較と平行して、より長くそしてより多い一続きの配列情報を収集し続けてもよい。続く配列情報もまた比較してもよく、そしてこの情報は、サンプル中のゲノムまたは種の同定の信頼度を増加させうる。この方法では、より長いコンティグへの短い読み取り値の配列情報アセンブリを待つ必要がない。

［００５０］本明細書に開示するシステムおよび方法は、核酸取り込み、単離および分離、ＤＮＡ配列決定、データベースネットワーキング、情報処理、データ記憶、データディスプレイ、および関連するデータの送達を加速して、病原性突発および適切な応答のためのアプリケーションを用いた診断または生物の同定を可能にする、電子通信を提供する。この系には、核酸および他のポリマー性または鎖型分子の配列決定ならびに確率的データマッチングに関連して、生物の同定のため、データベースにデータを電子的に送信する、ポータブル配列決定デバイスが含まれる。

［００５１］図１および２は、ポータブル・ハンドヘルド電子配列決定デバイス１０５を含むシステム１００の態様を例示する。ポータブル電子配列決定デバイス１０５（本明細書において、「配列決定デバイス」と称される）は、ユーザー（Ｕ）が容易に持ち、そして用いるように構成され、そして通信ネットワーク１１０によって、多くの他の潜在的に関連するエンティティと通信可能である。

［００５２］デバイスは、それぞれ、対象サンプル（ＳＳ）および環境サンプル（ＥＳ）を受容するよう構成される。対象サンプル（血液、唾液など）には、対象のＤＮＡならびに対象中の任意の生物（病原性またはその他）のＤＮＡが含まれうる。環境サンプル（ＥＳ）には、限定されるわけではないが、環境（食品、空気、水、土、組織を含む）中、天然状態にある生物が含まれうる。両サンプル（ＳＳ、ＥＳ）とも、バイオテロリズム行為によって、または流行の出現によって影響を受けうる。両サンプル（ＳＳ、ＥＳ）とも、試験管またはスワブによって同時に収集され、そして膜またはスライド、プレート、キャピラリー、またはチャネル上、溶液または固体（ビーズとして）中に受容される。次いで、サンプル（ＳＳ、ＥＳ）を同時に配列決定する。状況特異的な状態では、サンプル（ＳＳ、ＥＳ）混合物で構成されるサンプルの分析が必要になりうる。確率的マッチが同定されたら、そして／またはリアルタイム・データ収集およびデータ解釈中に、第一の応答者に接触してもよい。時間が進むにつれて、配列の増加したパーセントを同定可能である。

［００５３］配列決定デバイス１０５には、図３に例示するような、以下の機能コンポーネントが含まることも可能であり、このコンポーネントは、デバイス１０５が対象サンプル（ＳＳ）および環境サンプル（ＥＳ）を分析し、生じた分析を通信ネットワーク１１０に通信することを可能にする。

［００５４］サンプルレシーバー１２０および１２２をＤＮＡ抽出および単離ブロック１３０につなぎ、これは次いで、フローシステムによってサンプルをブロック１３０に送達する。ブロック１３０はサンプルからＤＮＡを抽出し、そしてさらに処理および分析が可能であるように単離する。これは、試薬テンプレート（すなわち核酸の相補鎖合成のためのパターンとして働くＤＮＡ鎖）の使用によって達成可能であり、試薬テンプレートは、既知の流体輸送技術を用いて、サンプル１２０、１２２と合わせて送達可能である。サンプル１２０、１２２中の核酸は、抽出および単離ブロック１３０によって分離され、ヌクレオチド断片または増幅されない単一の分子の流れを生じる。態様には、増幅法の使用が含まれうる。

［００５５］交換可能なカセット１４０は、配列決定デバイス１０５およびブロック１３０に取り外し可能につながれうる。カセット１４０は、ブロック１３０から分子の流れを受容し、そしてＤＮＡを配列決定し、そしてＤＮＡ配列データを生じうる。

［００５６］交換可能なカセット１４０は、プロセッサー１６０につながれ、そしてＤＮＡ配列データをこのプロセッサーに提供することも可能であり、このプロセッサーで確率的マッチングが達成される。態様には、１Ｍｂ／秒の速度で転送されるデータ１６ＧＢの性能が含まれうる。配列情報を入手するための配列決定カセット１４０が好ましい。異なる配列決定法に相当する、異なるカセットと交換してもよい。確率的マッチングによって配列決定情報を比較する。超迅速マッチングアルゴリズムおよびあらかじめ生成された加重シグネチャーデータベースは、記憶された配列データにデノボ配列データを比較する。

［００５７］プロセッサー１６０は、例えば、１以上の特定の機能を達成するか、あるいは１以上の特定のデバイスまたはアプリケーションを可能にするよう設計された、アプリケーション特異的集積回路であってもよい。プロセッサー１６０は、配列決定デバイス１０５の他の機能要素のすべてを制御可能である。例えば、プロセッサー１６０は、データストア（メモリ）１７０中に記憶されるように、ＤＮＡ配列データを送信／受信してもよい。データストア１７０にはまた、プロセッサー１６０によって回収可能な形でデータを記憶するためのメモリの任意の適切なタイプまたは形も含まれてもよい。

［００５８］配列決定デバイス１０５には、さらに通信コンポーネント１８０が含まれてもよく、この通信コンポーネントに、データストア１７０から回収されたデータをプロセッサー１６０が送信してもよい。通信コンポーネント１８０には、有線、無線、衛星などの、通信ネットワーク１１０と通信するための任意の適切な技術が含まれてもよい。

［００５９］配列決定デバイス１０５には、ユーザー（Ｕ）がデバイス１０５にインプットを提供しうるユーザーインプットモジュール１５０が含まれてもよい。これにはボタン、タッチパッド等の任意の適切なインプット技術が含まれてもよい。最後に、配列決定デバイス１０５には、視覚的アウトプットおよび／または音声アウトプットデバイス用のディスプレイを含んでもよいユーザーアウトプットモジュール１５２が含まれてもよい。

［００６０］配列決定デバイス１０５にはまた、ポジショニング・データを受信し、そしてこのデータをプロセッサー１６０に進めうるグローバル・ポジショニング・システム（ＧＰＳ）レシーバー１０２、および配列決定デバイス１０５のアウトプット負荷または負荷群に電気的または他のタイプのエネルギーを供給するための電源１０４（すなわち電池、プラグインアダプター）も含まれてもよい。

［００６１］交換可能なカセット１４０を図３により詳細に模式的に例示する。カセット１４０は、配列決定デバイス１０５およびブロック１３０に取り外し可能につながれてもよく、そして最新式の配列決定法（すなわちハイスループット配列決定）を含む。カセット交換可能「プラグ＆プレイ」方式によって、デッキ上にウェット化学または固相状態に基づくシステムを構築してもよい。カセット１４０は、ブロック１３０からの分子の流れを受容し、そして配列決定法によってＤＮＡを配列決定し、そしてＤＮＡ配列データを生じうる。態様には、限定されるわけではないが、合成による配列決定、連結による配列決定、単一分子配列決定およびパイロシークエンスに基づく方法が含まれる。さらに別の態様には、電場１４２のための電源が含まれ、そして電場１４２を分子の流れに適用して、流れの中のＤＮＡの電気泳動を達成する。カセットには、ＤＮＡの流れを通じて、蛍光１４４を放出するための光源１４４が含まれる。カセットにはさらに、蛍光発光を検出し、そしてサンプルの流れの中のＤＮＡ配列を検出／決定するための生物医学的センサー（検出装置）１４６が含まれる。蛍光に加えて、生物医学的センサーは、配列決定のための標識部分に適したすべての波長で光を検出可能である。

［００６２］蛍光検出は、１以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の少なくとも１つの標識部分のシグナルの測定を含む。蛍光ヌクレオチドを用いた配列決定は、典型的には、添加されたヌクレオチドを検出した後での、蛍光標識の光退色を伴う。態様には、ビーズに基づく蛍光、ＦＲＥＴ、赤外標識、ピロホスファターゼ、標識ヌクレオチドまたはポリメラーゼを含むリガーゼ法、あるいは環状可逆的ターミネーターの使用が含まれうる。態様には、固定された単一分子を含むまたは溶液中のナノポアまたは光導波路の直接法が含まれてもよい。光退色法には、プライマー鎖への蛍光標識されたヌクレオチドの各付加とともに度合いが増していく、シグナル強度減少が含まれる。シグナル強度を減少させることによって、より長いＤＮＡテンプレートが場合によって配列決定される。

［００６３］光退色には、蛍光ヌクレオチドが取り込まれている核酸プライマーに、光パルスを適用することが含まれる。光パルスは、典型的には、関心対象の蛍光ヌクレオチドに吸収される光の波長と等しい波長を含む。パルスは、約５０秒間以下、約２０秒間以下、約１０秒間以下、約５秒間以下、約２秒間以下、約１秒間以下、または約０秒間、適用される。パルスは蛍光標識ヌクレオチドおよび／または蛍光標識プライマーまたは核酸の蛍光を破壊するか、あるいは許容されうるレベル、例えばバックグラウンドレベル、またはいくつかの周期に渡るシグナル構築を防止するのに十分に低いレベルに減少させる。

［００６４］センサー（検出装置）１４６は、核酸テンプレートからの少なくとも１つのシグナルを場合によって監視する。センサー（検出装置）１４６は、検出装置シグナル情報を配列決定結果情報、例えばヌクレオチド濃度、ヌクレオチドの同一性、テンプレートヌクレオチドの配列等に変換するためのソフトウェアを含むコンピュータを場合によって含むか、あるいはこうしたコンピュータに機能可能であるように連結される。さらに、例えば、既知のソースからのシグナルを監視することによって、微量流体システムを較正することにより、サンプルシグナルを場合によって較正する。

［００６５］図２に示すように、配列決定デバイス１０５は、通信ネットワーク１１０を通じて、バイオテロリスト行為または流行突発事象を通知するため、関連しうる様々なエンティティと通信可能である。これらのエンティティには、第一の応答者（すなわち研究室回答ネットワーク（すなわちリファレンスラボ、セミナルラボ、ナショナルラボ））、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、疾病管理センター（ＣＤＣ）、医師、公衆衛生職員、医療記録、調査データ、法的処置、食品製造業者、食品卸業者、および食品小売業者が含まれてもよい。

［００６６］上に論じる配列決定デバイス１０５の１つの例としての態様を、ここで、デバイスの前面像を例示する図４に関連して記載する。このデバイスは、ポータブル・ハンドヘルド配列決定デバイスであり、そしてコインＣのサイズと比較して例示される。デバイス１０５は長さおよそ１１インチであり、そして容易に運搬可能である。（図４において、コインは尺度のために示される。）２つのポート１５３、１５４は、デバイスの側面に位置し、そしてサンプルレシーバー１２０、１２２に相当する。ポート１５３は、分析しそして配列決定しようとする対象サンプル（ＳＳ）または環境サンプル（ＥＳ）を受容するためのものである。ポート１５４は、配列決定対照（ＳＣ）のためのものである。２つの異なるポートは、対象サンプル（ＳＳ）または環境サンプル（ＥＳ）が配列決定失敗を生じる材料を含有するか、配列決定失敗が生じたか、またはＣＬＩＡ能において機能しているかを決定するように設計される。デバイス１０５には、ユーザー（Ｕ）がデバイス１０５にインプットを提供しうるユーザーインプットモジュール１５０が含まれる。特定の態様において、ユーザーインプットモジュール１５０は、タッチパッドの形であるが、任意の適切な技術を用いてもよい。タッチパッドには、視覚的ディスプレイのためのボタン１５０ａ、データを記録するための１５０ｂ、１５０ｃ、リアルタイムデータ送信および受信のための１５０ｄ、ならびにデバイスを活性化させるかまたは不活性化させるための出力制御１５０ｅが含まれる。あるいは、キーパッドをディスプレイスクリーン内に取り込んでもよく、そしてすべての機能を液晶インターフェースによって制御してもよい。適切な技術は、本明細書にその全開示が援用される、米国特許出願第２００７／０２６３１６３号に記載される。これは、ブルートゥースが使用可能なデバイス・ペアリングまたは類似のアプローチによってであってもよい。機能には、削除キー、スペースキー、エスケープキー、プリントキー、エンターキー、上／下、左／右、さらなる文字およびユーザーが望む任意の他のものなど、電話キーパッド上の一般的な場所などで、アルファベット文字で標識された数字キーが含まれる。デバイスにはさらに、ユーザー（Ｕ）のために情報をディスプレイするための視覚的ディスプレイの形のユーザーアウトプットモジュール１５２が含まれる。望ましい場合、１５７ａおよび１５７ｂに例示するように、音声アウトプットデバイスもまた提供されてもよい。最後に、配列決定デバイス１０５には、データの送信または受信を示す、発光ダイオード１５５および１５６が含まれる。キー／ボタンの機能は、サンプル配列決定、データ送信および確率的マッチングおよびインターフェース制御のすべての側面を制御するものとし、限定されるわけではないが、オン／オフ、送信、ナビゲーションキー、ソフトキー、クリア、ならびにマッチの信頼性を列挙するアルゴリズムによって計算されたゲノムランクを伴うＬＣＤディスプレイ機能および視覚化ツールが含まれる。態様には、階層型ネットワークサーチエンジンに／から、多数のユーザーが同時にデータを送信／受信することも可能な、インターネットに基づくシステムが含まれる。

［００６７］図５は、上述のようなシステム１００の態様のシステム１００の操作プロセスを例示するフローチャートである。図５に示すように、デバイス操作のプロセスには、２００で、収集された対象サンプル（ＳＳ）および環境サンプル（ＥＳ）を、サンプルレシーバー１２０、１２２中に受容することが含まれる。２０２では、サンプルはＤＮＡ抽出および単離ブロック１３０に進み、ここでサンプルが分析され、そしてサンプルからＤＮＡが抽出され、そして単離される。２０３では、交換可能なカセット１４０が、ブロック１３０から単離されたＤＮＡを受容し、そしてＤＮＡを配列決定する。カセットに応じて、そして必要な場合、電場１４２および蛍光１４４を適用して、カセット１４０内の生物医学的センサー１４６がサンプルの流れのＤＮＡ配列を検出／決定する。２０４で、配列決定されたデータを処理し、そしてデータストア１７０に記憶させる。２０５で、配列決定されたデータを、確率的マッチングによって比較し、そしてゲノム同定を達成する。プロセスは、事実上、反復性である。生じた情報を通信ネットワーク１１０によって送信してもよい。ＧＰＳ（グローバル・ポジショニング・システム）データもまた、工程２０５で場合によって送信してもよい。２０６で、デバイスは、マッチングから電子的にデータを受信する。２０７で、デバイスは、ユーザーアウトプットモジュール１５２を通じて、マッチングから電子的に受信されたデータを視覚的にディスプレイする。さらなる分析が必要な場合、２０８で、通信ネットワークによって配列決定データをデータ解釈エンティティ（すなわち公衆衛生職員、医療記録など）に電子的に送信する。

［００６８］多方法研究アプローチは、事象に対する迅速な回答を増進し、そして生物検出と一次医療を統合する。三角的回答を利用してもよく、これは、ＤＮＡ配列決定由来の定量的な計器データを定性的な救急治療医療に収斂することを伴う。多数の場所に渡って現場で収集された観察チェックリストの基盤およびＤＮＡ配列決定データの監査を用いて、場所間で、生物の外見、例えば生物学的脅威（ｂｉｏ−ｔｈｒｅａｔ）を比較してもよい。ゲノムデータの推論による統計分析を医学的観察と組み合わせて、優先順位のカテゴリーを発展させてもよい。収集されそして医療センターおよびゲノムセンターのデータベース間で共有された情報によって、事象、事象の度合い、および罹患した人々への適切な時点での正しい介入の送達の三角化が可能になりうる。

［００６９］図６は、システム１００および様々な潜在的リソース・エンティティ間の相互作用を例示する。デバイス１０５は、無線または有線通信ネットワークを通じてこれらのリソース・エンティティと相互作用するよう構成される。デバイス１０５は、「サンプルデータ」、「患者データ」、および「治療介入」と示す三角化配列決定データ情報（３１０）を送信しうる。デバイス１０５は配列マッチング・リソース３２０にそしてそこからＤＮＡ配列データを送信しそして受信してもよく、こうしたリソースには、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）ならびにセンチネルラボ、リファレンスラボ、およびナショナルラボを含む研究室回答ネットワークが含まれる。

［００７０］研究室は各々、特定の役割を有する。センチネル研究室（病院および他のコミュニティ臨床ラボ）は、遭遇した境界線上の病原体を排除するかまたは近傍のＬＲＮリファレンスラボに照会する責任がある。リファレンス研究室（生物学的安全レベル３（ＢＳＬ−３）実施を順守する、州および地方自治体公衆衛生研究室）は、確証試験（認定（ｒｕｌｅ ｉｎ））を実行する。ナショナル研究室（ＢＳＬ−４）は、エボラおよび大痘瘡などのウイルス病原体を取り扱い可能な能力を維持し、そして最終的な性質決定を実行する。

［００７１］システム１００は、さらに、法的処置エンティティ、公衆衛生職員、医療記録、および調査データを含むデータ解釈リソース３３０にそしてこのリソースからデータを送信しそして受信することも可能である。最後に、デバイス１０５は、医者または救急治療室の医師を含む第一の応答者３２０にそしてこの応答者からデータを送信しそして受信することも可能である。システム１００は全体として、疾病対策センター（ＣＤＣ）３４０と通信して、適切な職員に適当な情報を提供するように構成される。

［００７２］図７は、ハンドヘルド電子配列決定デバイスとリモート分析センター間の機能的相互作用の略図である。デバイス１０５には、交換可能なカセット１４０に受信された配列決定を処理するためのベース呼出ユニット１０３が含まれてもよい。こうした配列およびＳＮＰ部位は、各種で見出される確率にしたがって、個々に加重される。これらの加重を理論的に（シミュレーションによって）または実験的にのいずれで計算してもよい。デバイスにはまた、ベース呼出ユニット１０３とつながれた確率的マッチングプロセッサー１０９も含まれる。確率的マッチングは、リアルタイム、あるいは配列ベース呼出または配列データ収集と同じ速さで行われる。確率的マッチングプロセッサー１０９は、ベイズアプローチを用いて、生じた配列および性質データを受信可能であり、そしてベース呼出ユニット１０３によって生成された配列決定性質スコアを考慮しつつ、各配列決定読み取りに関する確率を計算可能である。確率的マッチングプロセッサー１０９は、病原体の同定に使用する前に、生成されそして最適化されたデータベースを使用してもよい。警告システム１０７は、確率的マッチングプロセッサー１０９につながれ、そして確率的マッチングプロセッサー１０９から情報を収集し（現地で）、そしてリアルタイムで最適にマッチした生物をディスプレイすることも可能である。

［００７３］警告システム１０７は、患者データ、すなわち患者に関する医学的診断またはリスク評価、特に、イムノアッセイ、心電図、Ｘ線および他のこうした試験を含む、ケア地点診断試験またはアッセイからのデータにアクセスするよう構成され、そして医学的状態またはリスクまたはその欠如の指標を提供する。警告システムには、試験データを読み取るかまたは評価するための、そしてデータを診断またはリスク評価情報に変換するためのソフトウェアおよび技術が含まれてもよい。病原体のゲノム同一性および患者に関する医学的データに応じて、有効な「治療介入」を投与してもよい。治療は、病原体および／またはその二次的効果の有効な軽減または中和に基づき、そして禁忌いずれかがある場合、患者の病歴に基づくこともありうる。警告システムは発生の度合いおよび数に基づいてもよい。発生数は、病原体のゲノム同定に基づいてもよい。結果が、ＣＤＣまたはＤｏＤまたは国土安全保障省などの政府機関によって決定されるような閾値内であるか、またはこうした閾値を超えている場合、値を宣言してもよい。警告システムは、臨床医が、患者データとゲノム同定データの関数性を使用することを可能にするよう構成される。通信は、情報の迅速な流れおよび第一の応答者または他の臨床システムによる行為のための正確な意志決定を可能にする。

［００７４］デバイス１０５には、ベース呼出装置１０３につながれたデータ圧縮装置１０６がさらに含まれ、この圧縮装置は生じた配列および性質データを圧縮のために受信するよう構成される。データ記憶１７０は、圧縮装置１０６につながれ、そして配列および性質データを受信しそして記憶することも可能である。

［００７５］配列決定デバイス１０５は、リモート分析センター４００と相互作用し、このセンターは、有線および／または無線通信法によって、配列決定デバイス１０５の通信コンポーネント１８０から電子的に転送されたデータを受信可能である。リモート分析センター４００は、現在までに入手可能なヌクレオチドおよびアミノ酸配列ならびにＳＮＰデータを含む、巨大な配列データベースを含有する。このデータベースはまた、関連する疫学的および療法的情報（例えば抗生物質耐性）も含有する。リモート分析センター４００には、データ記憶４０１がさらに含まれる。データ記憶４０１は、配列決定デバイス１０５の通信コンポーネント１８０からの電子送信を通じて、解凍された配列データ情報を受信可能である。ゲノムアセンブリ４０２はデータ記憶４０１につながれ、そして解凍された配列データをアセンブリ可能であるし、そしてアセンブリする。さらなる分析前に、明らかな混入ＤＮＡ、例えばヒトＤＮＡをフィルタリングしてもよい。

［００７６］リモート分析センター４００にはさらに、確率的マッチング技術およびホモロジーサーチアルゴリズムを備えたプロセッサー４０３が含まれ、こうした技術およびアルゴリズムを使用して、アセンブリされた配列データを分析して、ターゲット病原体の存在の可能性４０３ａ、社会構造４０３ｂ、疫学的および治療情報４０３ｃを入手してもよい。ターゲット病原体のゲノム配列データを、ヒトおよびメタゲノムを含む非病原体ゲノムのものと比較して、ターゲット生物のみで生じる、ヌクレオチド配列および一塩基多型（ＳＮＰ）部位を同定する。配列決定デバイス１０５からのデータ転送中、オンザフライで、リモート分析センター４００での分析を行う。リモート分析センター４００には、通信ユニット４０４がさらに含まれてもよく、このユニットから、分析結果を、配列決定装置デバイス１０５内で警告システム１０７に、ならびに他の官庁（例えばＤＨＳ、ＣＤＣなど）に、電子的に転送し返す。

［００７７］確率的分類：本発明は、データベースエンジン、データベース設計、フィルタリング技術および拡張論理としての確率理論の使用を提供する。本方法およびシステムは、核酸配列決定によって産生されるデータに対する説得力がある論拠（決定）を行う確率理論原理を利用する。確率理論アプローチを用いて、本明細書に記載するシステムは、最小限の長さ（ｎ）のヌクレオチド数に到達すると同時に、データを分析し、そしてｎ量体の確率を計算し、さらに続く長さの増加（ｎ＋塩基対）各々を用いて、配列マッチの確率を計算する。各ｎ量体の計算および続くより長いｎ量体をさらに処理して、すべての増加する長さの確率を再計算して、ゲノムの存在を同定する。単位長さが増加するにつれて、ｎ量体内の多数のサブユニットをパターン認識に関して比較して、これはさらに、マッチの確率を増加させる。こうした方法は、他のベイズ法を含めて、マッチを排除すること、および完全ゲノム配列決定またはゲノムのアセンブリを完了させる必要を伴わずに、非常に短いヌクレオチド断片または読み取り値を含む生物学的サンプルの有意な数を同定ことを提供する。こうしたものとして、存在する生物に対するマッチの尤度の割り当ておよび次の核酸配列への移動は、マッチの尤度をさらに改善する。本明細書記載のシステムは、速度を増加させ、試薬消費を減少させ、小型化を可能にし、そして生物を同定するのに必要な時間の量を有意に減少させる。

［００７８］短い核酸配列に対して決定を行う確率的分類器を構築するため、着信配列決定データをまずフィルタリングしそして後に分類する、様々なアプローチを利用してもよい。この場合、ベイズネットワークの形式化を利用する。ベイズネットワークは、確率的分布に簡潔に相当する、有向非巡回グラフである。こうしたグラフにおいて、各ランダム変数をノードによって示す（例えば生物の系統樹）。２つのノード間の有向エッジは、親ノードによって示される変数から子のものへの確率的依存性を示す。その結果、ネットワークの構造は、ネットワーク中の各ノードが、親を所与として、非子孫に条件付きで独立であるという仮定を示す。これらの仮定を満たす確率分布を記載するため、ネットワーク中の各ノードは、条件付き確率表と関連し、この表は、親への任意の所定のありうる値の割り当てに対する分布を指定する。この場合、ベイズ分類器は、任意の配列決定システムによって提供される各ヌクレオチドの確率を計算する分類タスクに適用されるベイズネットワークである。各決定点で、ベイズ分類器は、ダイクストラまたはフロイドなどの最短経路グラフアルゴリズムのバージョンと組み合わされてもよい。

［００７９］現在のシステムは、ベイズ分類器（例えばナイーブベイズ分類器、ベイズ分類器および再帰ベイズ概算分類器）のシステムを実装し、そして生じたデータを決定データベースにおいて融合させうる。データが融合された後で、各分類器に、アップデートされた確率を含む新規セットの結果を供給してもよい。

［００８０］図８は、確率ソフトウェアモジュールの全体の構築の略図である。
［００８１］ＤＮＡ配列フラグメント：任意の配列決定法を用いて、配列フラグメント情報を生成してもよい。図２中のモジュール１６０または図７中の１０９は、交換可能なカセット中の配列決定モジュールから着信する処理データに関与する。データは、配列決定データならびに配列の開始および停止上の情報、配列ＩＤ、ＤＮＡ鎖ＩＤとともに封入されている。モジュールは、データをフォーマットし、そして分類フィルターモジュールに渡す。フォーマッティングには、システムデータの付加および大枠での整列化が含まれる。

［００８２］ＤＮＡ配列決定モジュールは２つのインターフェースを有する。このモジュールは、ＤＮＡ調製モジュールおよび分類フィルターにつながれている。
Ｉ． ＤＮＡ調製インターフェース：試料調製を達成するためのいくつかの商業的に入手可能な方法が微量流体技術を通じて組み込まれてもよい。典型的な試料調製は、溶液に基づき、そしてこれには細胞溶解および阻害剤除去が含まれる。核酸を回収するかまたは抽出し、そして濃縮する。溶解の態様には、界面活性剤／酵素、機械的、電子レンジ、圧、および／または超音波法が含まれる。抽出の態様には、固相アフィニティおよび／またはサイズ排除が含まれる。
ＩＩ．分類フィルター：分類フィルターは２つの主なタスクを有する：（ｉ）可能な限り多くの生物を除去して、分類器モジュールをより小さい決定空間に限定し、そして（ｉｉ）機械学習技術の使用を伴い、ベイズネットワークの構造を決定するのを補助する。

［００８３］系統樹フィルター：分類フィルターのこのサブモジュールは、「決定データベース」とインターフェース接続して、先のラウンドの分析結果を学習する。結果がまったく見られない場合、モジュールは新規データを分類モジュールに渡す。結果が見られる場合、分類フィルターは、ありうる決定スペースを限定するように分類器データを調整する。例えば、先のデータが、検査しているのがウイルスＤＮＡ配列であることを示すならば、分類器のための決定スペースをウイルスデータのみに縮小する。これは、操作中に収集されるデータベイズ分類器を修飾することによって行われうる。

［００８４］機械学習：機械学習アルゴリズムは、アルゴリズムの所望の結果に基づいて、分類に構成される。（ｉ）教師あり学習−アルゴリズムがインプットを所望のアウトプットにマッピングする関数を生成する。教師あり学習タスクの１つの標準的な公式化は、分類問題である：学習者は、関数のいくつかのインプット−アウトプット例を見ることによって、ベクター［Ｘ_１、Ｘ_２、・・・Ｘ_Ｎ］をいくつかのクラスの１つにマッピングする関数の振る舞いを学習する（近似する）必要がある。（ｉｉ）半教師付き学習−標識および非標識例を組み合わせて、適切な関数または分類器を生じる。（ｉｉｉ）強化学習−アルゴリズムが、世界の観察を所与として、どのように振る舞うかの方針を学習するもの。すべての行為は、環境に何らかの影響を及ぼし、そして環境は学習アルゴリズムを導くフィードバックを提供する。（ｉｖ）変換−トレーニング中に入手可能な、トレーニングインプット、トレーニングアウトプット、およびテストアウトプットに基づいて、新規アウトプットを予測する。（ｖ）学習するための学習−アルゴリズムが、先の経験に基づいて、それ自体の誘導性バイアスを学習する。

［００８５］分類キャッシュモジュール：このモジュールは、分類フィルターによって産生された分類情報をキャッシュする。このモジュールは、分類フィルター、およびＳＱＬデータベース中のすべての情報を保持する分類データベース間のインターフェースとして作用しうる。分類キャッシュは、マイクロ秒応答タイミングのメモリ中データベースとして実装される。ＳＱＬデータベースへのクエリーは、サブモジュールの残りからの別個のスレッド中で取り扱われる。キャッシュ情報には、分類フィルターモジュールによって生成されるネットワークグラフが含まれる。グラフは、システムが分析を開始する際、全分類を含有する。ＤＮＡ配列分析は、データサイズの減少および適切なデータセットの除去を実装する分類キャッシュを伴う分類グラフを減少させる。

［００８６］分類器セレクター：本システムは、平行して実行される多数の分類技術を利用してもよい。分類器セレクターは、異なる分類アルゴリズム間のデータアービターとして作用しうる。分類器セレクターは、決定データベースから情報を読み取り、そしてこうした情報を、ＤＮＡ配列決定モジュールから分析のために受信されたすべてのＤＮＡ配列決定単位を含む分類モジュールに送り込むことも可能である。分類フィルターは、ＤＮＡ配列決定データに関して、データが通過するにつれて作用する。

［００８７］再帰的ベイズ分類器：再帰的ベイズ分類器は、着信測定値および数学的プロセスモデルを用いて、長期に渡って再帰的に未知の確率密度関数を予測するための確率的アプローチである。モジュールは、分類器セレクターから、そして先の決定が記憶されている決定データベースからデータを受信する。データセットを、データベースおよびフィルタリングが起こるモジュールの局所メモリに置かれた先の決定同定から受信する。分類器はＤＮＡ配列を採用し、そしてマッチしない生物のファミリーを迅速に取り除くことによって、分類データベースから、存在するシグネチャー、バーコードなどとともにまたはこれらを伴わずマッチさせるよう試みる。アルゴリズムは、多数の信念の確率を計算し、そして着信データに基づいて信念を調整することによって、働く。このモジュールで用いられるアルゴリズムには、逐次モンテカルロ法およびサンプリング重要度リサンプリング（ｓａｍｐｌｉｎｇ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ）が含まれてもよい。また、隠れマルコフモデル、アンサンブルカルマンフィルターおよび他の粒子フィルターを、ベイズ最新技術とともに用いてもよい。

［００８８］ナイーブベイズ分類器：ベイズ定理の適用に基づく、単純な確率的分類器。この分類器は、スタートアップ時にユーザーインプットとして提供されるあらかじめ決定された規則セットに基づいてすべての決定を行う。モジュールは、分析を実行している間、新規規則セットで再初期化されてもよい。新規規則セットはユーザーから来てもよいし、または結果融合モジュールの規則融合の産物であってもよい。

［００８９］ベイズネットワーク分類器：ベイズネットワーク分類器は、変数セットおよびその確率的独立性に相当する、確率的グラフモデルとしてベイズネットワーク（または信念ネットワーク）を実装する。

［００９０］決定データベース：決定データベースは、システム中の大部分のモジュールのための作業キャッシュである。大部分のモジュールは、このリソースに直接のアクセスを有し、そしてその個々の領域を修飾しうる。しかし、結果融合モジュールのみがすべてのデータにアクセス可能であり、そしてしたがってベイズ規則セットを修飾しうる。

［００９１］ベイズ規則データ：モジュールはすべてのベイズ規則をバイナリのプリコンパイル型で収集する。規則はすべてのベイズ分類器ならびに分類フィルターおよび結果融合モジュールに読み書きされる。規則は、変化が起こると、動的に再コンパイルされる。

［００９２］結果融合：モジュールは、多数のベイズ分類器ならびに用いられる他の統計的分類器からデータを融合する。結果融合モジュールは、各分類器に関して生成された答えの間の平均分散を見て、そして必要であればデータを融合する。

［００９３］データベース・インターフェース：ＳＱＬデータベースに対するインターフェース。インターフェースは、異なるスレッドに分かれ、読み書き機能を備えてプログラム的に実装される。ＭｙＳＱＬが選択されるデータベースであるが、より迅速なデータベース速度のため、ｓｑＬｉｔｅを用いてもよい。

［００９４］分類データベース：データベースは、多数の内部データベースを保持するであろう：分類ツリー、インデックス付き前処理ツリー、ユーザーインプットおよび規則。

［００９５］キャッシュされた規則：ユーザーによって提供される、後処理された規則のインメモリキャッシュ。
［００９６］規則管理：モジュールに対するグラフ管理インターフェース。

［００９７］ユーザーインプット：ユーザーが生成するインターフェース規則。この規則は、決定するためにベイズ分類器によって用いられる。
［００９８］本発明のシステムおよび方法は、様々な異なる関数を実行するコードを有するコンピュータプログラム中に包埋されているように本明細書に記載される。特定の最高クラスの技術（存在するかまたは新たに興る）が、認可されたコンポーネントでありうる。ＤＮＡ抽出のための現存する方法には、フェノール／クロロホルムの使用、塩析、カオトロピック塩およびシリカ樹脂の使用、アフィニティ樹脂の使用、イオン交換クロマトグラフィおよび磁気ビーズの使用が含まれる。方法は、米国特許第５，０５７，４２６号、第４，９２３，９７８号、欧州特許０５１２７６７ Ａ１およびＥＰ ０５１５４８４Ｂ、ならびにＷＯ ９５／１３３６８、ＷＯ ９７／１０３３１およびＷＯ ９６／１８７３１に記載され、その全開示が本明細書に援用される。しかし、システムおよび方法は、電子媒体に限定されず、そして様々な機能を、あるいは、手動設定で実行可能であることを理解しなければならない。インターネットを用いたネットワーク通信によって、プロセスと関連するデータを電子的に送信してもよい。上述のシステムおよび技術は、以下に記載するものを含む多くの他の背景で有用でありうる。

［００９９］疾患関連研究：多くの一般的な疾患および状態は、表現型ともまた呼ばれる、相互作用してその疾患の視覚的特徴を生じるような、複雑な遺伝要因を伴う。多くの遺伝子および制御領域がしばしば、特定の疾患または症状と関連する。所定の状態を持つ多くの個体のゲノムまたは選択した遺伝子を配列決定することによって、疾患の根底にある原因突然変異を同定することも可能でありうる。この研究によって、疾患検出、防止および治療においてブレークスルーが生じうる。

［００１００］癌研究：癌遺伝学は、遺伝的および後天的突然変異ならびに他の遺伝的改変の影響を理解することを伴う。癌の診断および治療の困難は、個々の患者の変動および薬剤療法に対する予測困難な応答によってさらに増大する。少量のサンプルまたは腫瘍細胞生検に基づいて、癌に寄与するゲノムの後天的変化を性質決定する低コストゲノム配列決定が利用可能であれば、癌診断および治療の改善が可能になりうる。

［００１０１］薬学的研究および開発：ゲノミクスの１つの展望によって、より有効な新規薬剤の発見および開発が加速されてきている。この分野におけるゲノミクスの影響は、ゆっくりと現れてきており、これは生物学的経路、疾患機構および多剤ターゲットが複雑であるためである。単一分子配列決定は、有望な薬剤リードをよりよく同定するために、大規模遺伝子発現分析を用いて、費用効率が高い方式で、ハイスループットスクリーニングを可能にしうる。臨床開発において、開示される技術を潜在的に用いて、療法に対するありうる応答、毒性学または副作用のリスクに関する価値ある情報を提供しうる個々の遺伝子プロフィールを生成し、そして場合によって患者スクリーニングおよび療法の個別化を促進することも可能である。

［００１０２］感染性疾患：すべてのウイルス、細菌および真菌は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する。単一分子レベルで病原体由来のＤＮＡまたはＲＮＡが検出および配列決定できれば、感染の診断、治療および監視のため、そして潜在的な薬剤耐性を予測するため、医学的および環境的に有用な情報が提供されうる。

［００１０３］自己免疫状態：多発性硬化症および狼瘡から移植拒絶リスクに渡る、いくつかの自己免疫状態は、遺伝的コンポーネントを有すると考えられる。これらの疾患に関連する遺伝的変化を監視すると、よりよい患者管理が可能になりうる。

［００１０４］臨床的診断：同じ疾患症状を提示する患者は、しばしば、その根底にある遺伝的相違に基づいて、異なる予後および薬剤に対する応答を有する。患者特異的遺伝情報の送達は、遺伝子または発現に基づく診断キットおよびサービス、特定の療法を選択しそして監視するためのコンパニオン診断製品、ならびに初期疾患検出および疾患監視のための患者スクリーニングを含む、分子診断法を含む。より有効で、そしてターゲティングされた分子診断法を生成し、そして試験をスクリーニングするには、遺伝子、制御因子および他の疾患または薬剤関連因子のよりよい理解が必要であり、開示する単一分子配列決定技術は、これを可能にする潜在能力を有する。

［００１０５］農業：農業研究は、遺伝的に優れた動物および作物の発見、開発および設計のため、ますますゲノミクスに頼りつつある。アグリビジネス産業は、変種または集団に渡る関連する遺伝的変動を同定するための遺伝的技術、特にマイクロアレイの大きな消費者となってきている。開示する配列決定技術は、この産業のための遺伝子発現分析および集団研究に対する、より強力、直接的で、そして費用効率的なアプローチを提供しうる。

［００１０６］わずかな遺伝的変動の検出にこの方法を適用する、反復配列適用の分野に、さらなる機会があるであろう。種に渡る拡張比較ゲノム分析は、ヒトゲノムの構造および機能、そしてその結果、ヒト健康および疾患の遺伝学に大きな洞察を生じうる。ヒト遺伝的変動、ならびに健康および疾患に対するその関係の研究は、拡大しつつある。これらの研究の大部分は、既知の比較的一般的な変動パターンに基づく技術を用いる。これらの強力な方法は、重要な新規情報を提供するが、これらは個々のヒトゲノムの完全な隣接配列を決定するよりも情報量が少ない。例えば、現在の遺伝子型決定法は、いかなる特定のゲノム部位でも人々の間の稀な相違を見逃す可能性があり、そして長範囲の再編成を決定する能力が限られている。癌に寄与するゲノムの体細胞変化の性質決定は、現在、（非常にわずかの遺伝子に関する）配列データに加えて、コピー数変化、再編成、またはヘテロ接合性の喪失に関する限定された情報を得る技術の組み合わせを使用する。こうした研究には、ゲノムの劣った解像度および／または不完全なカバー度という欠点がある。腫瘍サンプルの細胞不均質は、さらなる困難を提示する。おそらく単一の細胞であってもよい非常に少量のサンプルからの、低コストの完全ゲノム配列決定は、研究室から診療所まで、すべての側面において、癌に対する闘いを改変するであろう。最近立ち上げられた癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）パイロットプロジェクトは、望ましい方向に動いているが、配列決定コストによって著しく制限されたままである。各種の個々の変動、異なる家畜化品種、およびいくつかの野生変種を研究するために、農業的に重要な動物および植物のさらなるゲノム配列が必要である。多くのメンバーが培養不能である微生物コミュニティの配列分析は、医学的および環境的に有用な情報の豊かなソースを提供するであろう。そして正確で迅速な配列決定は、バイオテロリズム脅威の迅速な検出および軽減を含む、食品および環境の微生物監視に最適なアプローチである可能性もある。

［００１０７］ゲノム配列決定はまた、キーシグネチャー配列の選択に有用なイントロン領域を含む単離核酸も提供しうる。現在、キーシグネチャー配列は、エクソン領域にターゲティングされている。

［００１０８］ＤＮＡ技術の基本的適用は、ＤＮＡポリメラーゼによって産生されるＤＮＡの標識のための様々な標識戦略を伴う。これは、マイクロアレイ技術：ＤＮＡ配列決定、ＳＮＰ検出、クローニング、ＰＣＲ分析、および多くの他の適用に有用である。

［００１０９］本発明の様々な態様が上述されてきているが、これらが例示のためにのみ提示されており、そして限定のためでないことを理解しなければならない。したがって、本発明の大きさおよび範囲は、上述の態様のいずれによっても限定されず、以下の請求項およびその同等物にしたがってのみ定義されなければならない。本発明は、その特定の態様に関連して特に示され、そして記載されてきているが、型および詳細における様々な変化が作製可能であることが理解されるであろう。

実施例１
［００１１０］目的：８〜１８程度に少ないヌクレオチドでゲノム同定を可能にするためのキーシグネチャーおよび／またはバーコードの使用、ならびにリアルタイムでの非常に短い配列データ（読み取り値）の分析。

［００１１１］線形時間サフィックスアレイ構築アルゴリズムを用いて、固有性分析を計算した。この分析は、いくつかのモデルゲノムにおいて、固有であるすべての配列のパーセントを決定した。ゲノム中のすべての配列長を分析した。ゲノム中に１度しか出現しない配列をカウントする。サフィックスアレイアルゴリズムは、２塩基対スライディング・ウィンドウに基づいて、配列内に特定の下位配列が出現する頻度を分析する反復スコアプロットを計算することによって働く。ＧｅｎＢａｎｋに記憶されるゲノム情報をコンピュータ分析に用いた。ウイルスゲノム、ラムダファージ、細菌ゲノム、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＭＧ１６５５、およびヒトゲノムを分析した。固有の読み取り値のパーセントは配列長の関数である。明白なマッチしか生じない配列、およびゲノムを再構築する明白なオーバーラップを生じる配列に関する仮定を行う。固有の読み取り値は、７〜１００ヌクレオチドのサイズ範囲であった。固有のサイズの大部分は、それぞれ、９、１３、および１８ヌクレオチドより短かった。

［００１１２］結果：結果は、ファージゲノムの１２ｎｔのランダム配列が、ファージに９８％固有であることを示す。これはゆっくりと増加し、４００ｎｔ配列は、ファージに９９％固有である。１０ｎｔのファージ配列に関しては、これは８０％に減少する。ゲノムの１８ｎｔの細菌（大腸菌）配列に関しては、大腸菌に９７％固有である。ヒトゲノムに関しては、２５ｎｔの配列はヒトに８０％固有であり、そして４５ｎｔに増加すると、ゲノムの９０％が固有となる結果を生じる。

Claims (24)

1. 生物学的材料を複数含有するサンプル中の生物学的材料を同定する方法であって、
   （ａ）生物学的材料を複数含むサンプルを入手すること、
   （ｂ）当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出すること、
   （ｃ）第１の数の個々の配列要素を含んでなる第１配列を、当該核酸分子から生成すること、
   （ｄ）当該第１配列を、確率的マッチングによって、データベース内の既知の生物学的材料の参照核酸配列と比較すること、
   （ｅ）データベース内の既知の生物学的材料の参照核酸配列と第１配列とのマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値と同じかそれより大きい場合、既知の生物学的材料を含むサンプルであると同定すること、
   （ｆ）データベース内の参照核酸配列のいずれに対しても第１配列のマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値より小さい場合、（１）核酸分子の次の個々の配列要素を決定し、（２）当該次の個々の配列要素を、当該第１配列に追加し、（３）既知の生物学的材料を含有するものとして当該サンプルが同定されるまで、当該次の個々の配列が追加された第１配列を第１配列として工程（ｄ）〜（ｆ）を繰り返すこと、
   を含む、上記方法。
2. 前記第１配列が長さｎのヌクレオチド配列であり、前記核酸分子の次の個々の配列要素が核酸分子の次のヌクレオチドであり、前記次の個々の配列を前記第１配列に追加することによって長さｎ＋１のヌクレオチド配列が生成される、請求項１に記載の方法。
3. 生物学的材料を複数含有するサンプル中の生物学的材料を同定する方法であって、
   （ａ）生物学的材料を複数含むサンプルを入手すること、
   （ｂ）当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出すること、
   （ｃ）当該核酸分子から、長さｎのヌクレオチドフラグメント配列である第１配列を生成すること、
   （ｄ）当該第１配列を、確率的マッチングによって、データベース内の既知の生物学的材料の参照核酸配列と比較すること、
   （ｅ）当該核酸分子から、長さｎ＋１のヌクレオチドフラグメント配列である第２配列、長さｎ＋２のヌクレオチドフラグメント配列である第３配列、・・・長さｎ＋ｘのヌクレオチドフラグメント配列である第ｘ配列を生成させること、ここで、第２配列、第３配列、・・・第ｘ配列のそれぞれについて長さｎのヌクレオチドフラグメントは同じである、
   （ｆ）データベース内の既知の生物学的材料の参照核酸配列と第１配列とのマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値と同じかそれより大きい場合、既知の生物学的材料を含むサンプルであると同定すること、
   （ｇ）データベース内の参照核酸配列のいずれに対しても第１配列のマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値より小さい場合、第２配列、第３配列、・・・第ｘ配列とデータベース内の既知の生物学的材料の参照核酸配列とのマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値と同じかそれより大きくなり、既知の生物学的材料を含有するものとして同定されるまで、確率的マッチングによって、第２配列、第３配列、・・・第ｘ配列を参照核酸配列と比較すること、
   を含む、上記方法。
4. 前記配列の生成工程が、パイロシークエンシングを含む、請求項１または３に記載の方法。
5. 前記配列の生成工程が、ハイブリダイゼーションによるシークエンシングを含む、請求項１または３に記載の方法。
6. 前記確率的マッチングによって統計的フレームワークが与えられて、前記配列情報の種が同定される、請求項１または３に記載の方法。
7. 前記第１配列を生成する前に、前記１以上の核酸分子を増幅して複数の核酸分子を得ることをさらに含む、請求項１または３に記載の方法。
8. 前記長さｎおよびｎ＋１のヌクレオチド配列の生成が、パイロシークエンシングを含む、請求項２に記載の方法。
9. 前記長さｎおよびｎ＋１のヌクレオチド配列の生成が、ハイブリダイゼーションによるシークエンシングを含む、請求項２に記載の方法。
10. 長さｎのヌクレオチド配列を生成する前に、前記１以上の核酸分子を増幅して複数（ｉ）の核酸分子を得ることをさらに含む、請求項２に記載の方法。
11. データベース内の参照核酸配列と比較する前に、複数（ｉ）の長さｎのヌクレオチドを生成する、請求項１０に記載の方法。
12. データベース内の参照核酸配列と比較する前に、複数（ｉ）の長さｎ＋１のヌクレオチドを生成する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記確率的マッチングを、ベイズアプローチによって実行する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
14. 前記確率的マッチングを、再帰ベイズアプローチによって実行する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
15. 前記確率的マッチングを、ナイーブベイズアプローチによって実行する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
16. 前記確率的マッチングによって統計的フレームワークが与えられて、長さｎおよびｎ＋１のヌクレオチド配列の種が同定される、請求項２に記載の方法。
17. 生物学的分子を複数含有するサンプル中の生物学的材料を検出するためのシステムであって、
    （１）生物学的材料を複数含むサンプルを受容するように構成される、サンプル受容ユニット、
    （２）当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出するように構成される、サンプル受容ユニットと連結された抽出ユニット、
    （３）１以上の核酸分子を抽出ユニットから受容し、核酸分子から第１の数の個々の配列要素を含んでなる第１配列を生成するように構成される、抽出ユニットと連結された配列決定カセット、
    （４）既知の生物学的材料の参照核酸配列を含んでなるデータベース、および
    （５）下記をするように構成される、配列決定カセットおよびデータベースと連結された処理ユニット：
    （ａ）配列決定カセットから当該第１配列を受信し、
    （ｂ）確率的マッチングによって、当該第１配列を参照核酸配列と比較し、
    （ｃ）データベース内の既知の生物学的材料の参照核酸配列と第１配列とのマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値と同じかそれより大きい場合、既知の生物学的材料を含むサンプルであると同定すること、
    （ｄ）データベース内の参照核酸配列のいずれに対しても第１配列のマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値より小さい場合、（１）核酸分子の次の個々の配列要素を決定し、（２）当該次の個々の配列要素を当該第１配列に追加し、（３）データベース内の既知の生物学的材料を含有するものとして当該サンプルが同定されるまで、当該次の個々の配列が追加された第１配列を第１配列として工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すこと、
    を含む、上記システム。
18. 生物学的材料を複数含有するサンプル中の生物学的材料を検出するためのシステムであって、
    （１）生物学的材料を複数含むサンプルを受容するように構成される、サンプル受容ユニット、
    （２）当該サンプルから１以上の核酸分子を抽出するように構成される、サンプル受容ユニットと連結された抽出ユニット、
    （３）１以上の核酸分子を抽出ユニットから受容し、長さｎのヌクレオチドフラグメント配列である第１配列、長さｎ＋１のヌクレオチドフラグメント配列である第２配列、長さｎ＋２のヌクレオチドフラグメント配列である第３配列、・・・長さｎ＋ｘのヌクレオチドフラグメント配列である第ｘ配列を核酸分子から生成させるように構成される、抽出ユニットと連結された配列決定カセット、ここで、第１配列、第２配列、第３配列、・・・第ｘ配列のそれぞれについて長さｎのヌクレオチドフラグメントは同じである、
    （４）既知の生物学的材料の参照核酸配列を含んでなるデータベース、および
    （５）下記をするように構成される、配列決定カセットおよびデータベースと連結された処理ユニット：
    （ａ）配列決定カセットから、第１配列、第２配列、第３配列、・・・第ｘ配列を受信し、
    （ｂ）確率的マッチングによって、当該第１配列を参照核酸配列と比較し、
    （ｃ）データベース内の既知の生物学的材料の参照核酸配列と第１配列とのマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値と同じかそれより大きい場合、既知の生物学的材料を含むサンプルであると同定し、
    （ｄ）データベース内の参照核酸配列のいずれに対しても第１配列のマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値より小さい場合、第２配列、第３配列、・・・第ｘ配列とデータベース内の既知の生物学的材料の参照核酸配列とのマッチ確率が、ターゲットマッチの閾値と同じかそれより大きくなり、既知の生物学的材料を含有するものとして同定されるまで、確率的マッチングによって、第２配列、第３配列、・・・第ｘ配列を参照核酸配列と比較すること、
    を含む、上記システム。
19. 前記配列決定カセットにより受信された配列を処理するように構成される、ベース呼び出しユニットをさらに含む、請求項１７または１８に記載のシステム。
20. 前記ベース呼び出しユニットが、前記処理ユニットと連結している、請求項１９に記載のシステム。
21. 前記処理ユニットが、前記ベース呼出ユニットが生成する配列決定クオリティスコアを考慮しつつ、ベイズアプローチを利用し、得られた配列を受信し、各配列決定リードの確率を計算するように構成される、請求項２０に記載のシステム。
22. 前記処理ユニットが、病原体を同定するために予め生成および最適化されたデータベースを使用する、請求項２０に記載のシステム。
23. 前記処理ユニットが、配列内容に応じて変化する加重スコアを使用する、請求項２０に記載のシステム。
24. 前記処理ユニットと連結された記憶ユニットを含み、前記処理ユニットが、前記配列情報をデータ記憶ユニットに送信し、その後、この配列情報をデータ記憶ユニットから処理のために読み出すように構成される、請求項１７または１８に記載のシステム。

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