CN112331268B - 目标物种特有序列的获取方法及目标物种检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及目标物种特有序列的获取方法及目标物种检测方法，目标物种特有序列的获取方法包括以下步骤：选择基因组数据库中目标物种的所有全基因组序列，并通过对目标物种的所有全基因组序列的比对，筛选出目标物种核心序列；过滤掉核酸数据库中的所述目标物种的所有核酸序列，得到非目标物种核酸序列数据库；将目标物种核心序列与非目标物种核酸序列数据库进行比对，过滤掉目标物种核心序列中比对到的核酸序列，最终得到目标物种特有序列。通过上述方法可获得目标物种特有序列，方法简单，且可靠性高，通过鉴定样本中是否有目标物种特有序列的存在，即可确定生物的目标物种及分类地位。因此只需扩增本发明目标物种特有序列的获取方法得到的目标物种特有序列，即可鉴定目标物种的存在或目标物种分类地位。

Description

目标物种特有序列的获取方法及目标物种检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及目标物种特有序列的获取方法及目标物种检测方法。

背景技术

传统中物种鉴定方法包括(1)基于16s(细菌)、18S(高等真核生物)或ITS(真菌)以及关键基因(病毒)鉴定物种：通过获取目标物种的DNA，进行PCR扩增，进行Sanger测序，将序列提交在线blastn进行序列比对。根据序列的相似性，确定物种的分类地位。该检测方法检测效率低下，需要获得纯化的单一物种的DNA，且需要进行测序和比对才能确定物种的分类地位；基于这种方法，分辨率较低，很多物种无法确定到种，只能鉴定到属或科。(2)基于全基因组鉴定物种：获取单一物种的基因组DNA，进行全基因组测序并组装，与数据库已有的基因组进行比对。根据全基因组的相似性，确定物种的分类地位。该方法需全基因组测序，成本高，需要获得单一物种的基因组DNA。(3)基于宏基因组鉴定物种：使用宏基因组测序的方式获取某一环境或生境的全部物种的DNA，进行测序并组装，通过与NCBI核酸数据库对比，确定宏基因组中可能包含的物种。该方法具有如下缺点：第一，为了保证尽可能获得物种的全面性，测序深度要求高，测序成本高，且后续组装和分析对计算平台的要求高，运算量大，时间久，一般小型服务器无法满足后续分析要求。第二，不同物种之间可能存在同源片段，一个宏基因组组装片段可能存在多个不同的物种分类地位，存在不确定性，影响物种鉴定的准确性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供目标物种特有序列的获取方法及目标物种鉴别方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种目标物种特有序列的获取方法，目标物种特有序列的获取方法包括以下步骤：

选择基因组数据库中目标物种的所有全基因组序列，并通过对所述目标物种的全基因组序列的比对，筛选出目标物种核心序列；

过滤掉核酸数据库中的所述目标物种的所有核酸序列，得到非目标物种核酸序列数据库；

将所述目标物种核心序列与所述非目标物种核酸序列数据库进行比对，过滤掉目标物种核心序列中比对到的核酸序列，得到目标物种特有序列。

本发明的有益效果是：通过上述方法可以获得目标物种特有序列，方法简单，且可靠性高，通过鉴定样本中是否有目标物种特有序列的存在，即可确定目标物种是否存在及其分类地位。因此只需扩增由本发明物种特有序列的获取方法得到的目标物种特有序列，即可鉴定目标物种的存在或目标物种的分类地位。无需进行全基因组测序，极大地降低了成本，且准确性高。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，目标物种核心序列中比对到的核酸序列为所述目标物种核心序列中与所述非目标物种核酸序列数据库中的核酸序列相似度大于等于30％的核酸序列。

采用上述进一步方案的有益效果是：上述相似度范围条件下获得的目标物种特有序列，可信度和准确性高。

进一步，在将所述目标物种核心序列与所述非目标物种核酸序列数据库进行比对前，先将所述目标物种核心序列与外源物种基因组进行比对，过滤掉目标物种核心序列中比对到的核酸序列，得到初滤后目标物种核心序列，将所述初滤后目标物种核心序列与所述非目标物种核酸序列数据库进行比对，过滤掉初滤后目标物种核心序列中比对到的核酸序列，得到目标物种特有序列。

采用上述进一步方案的有益效果是：引入外源物种的比对，提高了后续运行效率，且外源物种最多10个，以保证运行效率的提高。

进一步，目标物种核心序列中比对到的核酸序列为所述目标物种核心序列中与所述外源物种基因组相似度大于等于30％的核酸序列，初滤后目标物种核心序列中比对到的核酸序列为初滤后目标物种核心序列中与所述非目标物种核酸序列数据库中核酸序列相似度大于等于30％的核酸序列。

采用上述进一步方案的有益效果是：上述相似度范围条件下获得的目标物种特有序列，可信度和准确性高。

进一步，所述目标物种为寄生物种时，所述外源物种包括所述目标物种的宿主。

采用上述进一步方案的有益效果是：所述目标物种为寄生物种时，所述外源物种包括所述目标物种的宿主能够显著提高寄生物种的目标物种特有序列筛选的准确性。

进一步，所述外源物种包括与所述目标物种同属生物中的至少一种、与所述目标物种同科生物中的至少一种、与所述目标物种同目生物中的至少一种、与所述目标物种同纲生物中的至少一种或与所述目标物种同门生物中的至少一种。

采用上述进一步方案的有益效果是：选用同界、同门、同纲、同目、同科、同属的生物作为外源物种，能够显著提高目标物种特有序列筛选的效率，优选度由高到低依次为同属、同科、同目、同纲、同门、同界的生物。

进一步，对所述目标物种的所有全基因组序列的比对，筛选序列相似度为100％的核酸序列，得到所述目标物种核心序列，所述目标物种特有序列大于等于200bp。

采用上述进一步方案的有益效果是：上述相似度范围条件下获得的目标物种核心序列，可信度高，使得到的目标物种特有序列的准确性高；限定目标物种特有序列的长度大于等于200bp，便于后续检测待检目标物种特有序列。

进一步，所述基因组数据库包括NCBI基因组数据库，所述核酸数据库包括NT数据库。

采用上述进一步方案的有益效果是：NCBI基因组数据库是准确全面的基因组数据库，NT数据库是准确全面的核酸序列数据库。

本发明还涉及一种目标物种检测方法，包括以下步骤：

提供所述获取方法获得的目标物种的目标物种特有序列；

检测待检样本是否包括所述目标物种特有序列，以鉴定所述待检样本是否包括所述目标物种。

采用上述进一步方案的有益效果是：通过上述方法进行目标物种鉴别，简单、快捷且可靠性高，通过鉴定样本中是否有目标物种特有序列的存在，即可确定目标物种的存在及分类地位。无需进行全基因组测序，极大的降低了成本，且准确性高。

进一步，检测待检样本是否包括所述目标物种特有序列的方法包括以下步骤：

以所述目标物种特有序列为靶序列，设计引物，后对所述待检样本包括的序列和所述引物进行多聚酶链式反应得到扩增序列，并对得到的所述扩增序列进行电泳或测序，检测是否包括所述目标物种特有序列，以检测所述待检样本是否包括所述目标物种。

采用上述进一步方案的有益效果是：以目标物种特有序列作为靶序列，根据目标物种特有序列设计引物进行PCR扩增，无需获得纯化的单一目标物种的DNA样品，根据电泳结果，确定有无目标物种特有序列这一目标条带的存在，即可确定目标物种是否存在，上述操作简单、检测的准确性高。

附图说明

图1为本发明目标物种特有序列鉴定软件流程图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

由病原微生物引起的感染性疾病是人医和动物临床面临的最常见的疾病之一，并且随着群体结构变化、环境污染以及药物滥用等因素的影响，病原体呈现多样化和复杂化的趋势，逐步威胁人类和动物健康。快速准确的诊断可以对病情进行监控，提供有效治疗，控制疾病的蔓延。目前，传统的镜检技术在检测微生物病原体(如病毒、细菌、衣原体、支原体等)方面存在很大不足。常用的病原微生物分子检测方法主要有：PCR技术(包括常规PCR以及qPCR)，基因芯片技术，NGS测序技术、质谱(MALDI-TOF-MS)、宏基因组技术(metagenomics)等，这些方法的分辨率高，但仍然存在各种不足(见下表)。为了提高病原检测的效率并降低成本，本项目以多种测序技术(全基因组测序，转录组测序，宏基因组测序和宏转录组测序等)的发展为背景，开发了物种特有序列的获得方法。通过该方法，可以获取该目标物种特有的DNA序列，通过组合多种常见病原的特有DNA序列，可以构建不同的病原Marker数据集，这些数据集可以作为后续的Marker用于检测各种测序数据中多种病原的存在。同时Marker集可以用作为PCR的靶片段，通过简单的PCR和电泳实验，即可鉴定病原是否存在。

现有检测方法的劣势见表1。

表1

实施例1

弓形虫的鉴定：

以GCA_000006565.2(Toxoplasma gondii ME49)为参考基因组，加上弓形虫的其他基因组(弓形虫分类id--5811，5个基因组)，共同作为弓形虫的全基因组序列，并通过对所述弓形虫的所有全基因组序列的比对，筛选序列相似度为100％的核酸序列，得到弓形虫核心序列；

以猫的基因组(version 9)为外源物种基因组数据库，再根据弓形虫的分类号过滤掉NCBI的NT数据库中弓形虫的所有核酸序列。(本步骤首先排除猫(弓形虫寄主)个体的影响，过滤掉一部分弓形虫核心序列，提高了后续与NT核酸序列数据库的比对效率；此外，若外源物种基因组越多，越有利于提高后续比对效率)；

将所述弓形虫核心序列依次与外源物种基因组和所述非弓形虫核酸序列数据库进行比对，过滤掉弓形虫核心序列中与非弓形虫有相似性的核酸序列，所述与非弓形虫有相似性的核酸序列包括与所述外源物种基因组和所述非弓形虫核酸序列数据库中的核酸序列具有相似度大于等于30％的所述弓形虫核心序列，得到弓形虫特有序列，所述弓形虫特有序列大于等于200bp；

经上述步骤，共鉴定出22329条弓形虫特有序列。

以所述弓形虫特有序列为靶序列，设计引物，对所述待检样本进行多聚酶链式反应得到扩增序列，并对得到的扩增序列进行电泳，检测是否存在弓形虫的序列条带，如待检测样本条带中包含所述弓形虫特有序列的条带，则所述待检测样本中含弓形虫。

实施例2

犬布鲁氏菌(BrucellaCanis)的特有序列的获取方法，犬布鲁氏菌特有序列的获取方法包括以下步骤：

选择NCBI基因组数据库中犬布鲁氏菌的全基因组序列，并通过对所述犬布鲁氏菌的全基因组序列的比对，筛选出犬布鲁氏菌核心序列；其中，对所述犬布鲁氏菌的所有全基因组序列的比对，筛选序列相似度在100％的核酸序列，得到所述犬布鲁氏菌核心序列。

过滤掉NT核酸数据库中的所述犬布鲁氏菌(taxid--36855)的所有核酸序列，得到非犬布鲁氏菌核酸序列数据库；

以Brucella melitensis、Brucellasuis、Brucellaovis、犬基因组作为外源物种，先将所述犬布鲁氏菌核心序列与外源物种基因组进行比对，过滤掉犬布鲁氏菌核心序列中比对到的核酸序列，得到初滤后犬布鲁氏菌核心序列，将所述初滤后犬布鲁氏菌核心序列与所述非犬布鲁氏菌核酸序列数据库进行比对，过滤掉初滤后犬布鲁氏菌核心序列中比对到的核酸序列，得到犬布鲁氏菌特有序列，所述犬布鲁氏菌特有序列大于等于200bp。其中，犬布鲁氏菌核心序列中比对到的核酸序列为所述犬布鲁氏菌核心序列中与所述外源物种基因组相似度大于等于30％的核酸序列，初滤后犬布鲁氏菌核心序列中比对到的核酸序列为初滤后犬布鲁氏菌核心序列中与所述非犬布鲁氏菌核酸序列数据库中核酸序列相似度大于等于30％的核酸序列。

以所述犬布鲁氏菌特有序列为靶序列，设计引物，对所述待检样本进行多聚酶链式反应得到扩增序列，并对得到的扩增序列进行电泳，检测是否存在犬布鲁氏菌的特有序列条带，如待检测样本条带中包含所述犬布鲁氏菌的特有序列的条带，则所述待检测样本中含犬布鲁氏菌。

实施例3

犬细小病毒(Canine parvovirus)的特有序列的获取方法，犬细小病毒特有序列的获取方法包括以下步骤：

选择NCBI基因组数据库中犬细小病毒的全基因组序列，并通过对所述犬细小病毒的全基因组序列的比对，筛选出犬细小病毒核心序列；其中，对所述犬细小病毒的所有全基因组序列的比对，筛选序列相似度在100％的核酸序列，得到所述犬细小病毒核心序列。

过滤掉NT核酸数据库中的所述犬细小病毒(分类id--10788)的所有核酸序列，得到非犬细小病毒核酸序列数据库；

以Chiropteranprotoparvovirus、Eulipotyphlaprotoparvovirus、犬基因组作为外源物种，先将所述犬细小病毒核心序列与外源物种基因组进行比对，过滤掉犬细小病毒核心序列中比对到的核酸序列，得到初滤后犬细小病毒核心序列，将所述初滤后犬细小病毒核心序列与所述非犬细小病毒核酸序列数据库进行比对，过滤掉初滤后犬细小病毒核心序列中比对到的核酸序列，得到犬细小病毒特有序列，所述犬细小病毒特有序列大于等于200bp。其中，犬细小病毒核心序列中比对到的核酸序列为所述犬细小病毒核心序列中与所述外源物种基因组相似度大于等于30％的核酸序列，初滤后犬细小病毒核心序列中比对到的核酸序列为初滤后犬细小病毒核心序列中与所述非犬细小病毒核酸序列数据库中核酸序列相似度大于等于30％的核酸序列。

以所述犬细小病毒特有序列为靶序列，设计引物，对所述待检样本进行多聚酶链式反应得到扩增序列，并对得到的扩增序列进行电泳，检测是否存在犬细小病毒的特有序列条带，如待检测样本条带中包含所述犬细小病毒的特有序列的条带，则所述待检测样本中含犬细小病毒。

将多个得到的所述目标物种特有序列建成目标物种特有序列库，得到目标物种特有序列库，即可对待检测目标物种进行全面鉴定，后续通过多重PCR的方法以及高通量测序等即可鉴定目标物种的种类及存在与否，成本低，且准确性高。

根据上述方法，可得到目标物种特有序列鉴定软件，其流程图如图1所示。

本专利的技术方案还可表述为：

第一步：从美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)、欧洲生物信息学研究中心(EBI)数据库、国家基因组科学数据中心(NGDC)等公共数据库收集关注目标物种的基因组序列；

第二步：随机选择两个基因组进行全基因组比对，鉴定两目标物种共有DNA序列；将鉴定的共有序列与第三个基因组进行全基因组比对，输出结果继续与第四个基因组进行比对，以此类推，最终获取该目标物种最保守的DNA序列；

第三步：从公共数据库获取所有的核酸序列数据，并过滤掉目标物种(即所要检测的目标物种)的序列；

第四步：第二步获得的目标物种核心序列与第三步经过过滤的核酸数据库进行比对，剔除比对到的核酸序列。最终结果即为目标物种特有的DNA序列。

本专利的技术方案还可表述为：

步骤1：目标物种基因组数据库搭建

通过公共数据库获得目标物种所有个体的全基因组序列信息，并构建相应的基因组数据库，为后续目标物种特有序列提取奠定基础。

步骤2：目标物种核心序列提取

在步骤1的基础上经叠加地比对目标物种的所有基因组，经严苛的过滤条件过滤，得到在目标物种内部高度保守的核酸序列，形成目标物种核心序列数据库。为后续特有序列提取奠定基础。

步骤3：非目标物种核酸序列数据库搭建

在获取公共数据库所有核酸序列的基础上，根据目标物种的物种分类号过滤掉其中属于该分类号的核酸序列，搭建非目标物种核酸序列的数据库。为后续避免目标物种序列污染，以及确保目标物种特有序列的高度特异性做好准备。

步骤4：目标物种特有序列提取

将步骤2获得的目标物种核心序列数据库与步骤3获得的非目标物种核酸序列数据库进行比对，过滤掉与目标物种核心序列具有相似性的目标物种核心序列，剩余的目标物种核心序列即为目标物种特有序列，对目标物种具有极高的代表性，可用于目标物种的快速检测与鉴定。该技术是测序技术和生物信息技术发展的与时俱进的产物，对于目标物种的快速鉴定和其他科学研究(如病原物种筛检、物种鉴定、流行病学)具有重要的意义。

对本发明的涉及部分名词作如下解释：

物种：是生物分类学研究的基本单元与核心，是一群可以交配并繁衍后代的个体。在生物信息数据库(如：NCBI、EBI)中，一个物种的基因组序列往往包含了许多个体的基因组数据，包括全基因组DNA测序数据、转录组测序数据、以及各种组装水平的基因组组装序列(contig、scaffold、chromosome，其中染色体水平的组装在完整度、连续性上都最好)等全基因组核酸序列。因此物种基因组数据库中包含了许多个体的基因组序列信息。

序列相似性：在进行序列比对时，两(或多)条序列在核酸上的一致性程度。

目标物种特有序列：在目标物种的所有个体中高度保守(一致性程度很高)，且仅在目标物种中出现的核酸序列。这些序列可以唯一地识别到目标物种，对目标物种的快速识别具有重要的作用。

公共数据库：包括美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)、欧洲生物信息学研究中心(EBI)数据库、日本核酸数据库(DDBJ)、国家基因组科学数据中心(NGDC)等在内的生物信息公共数据库。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种目标物种特有序列的获取方法，其特征在于，所述目标物种特有序列的获取方法包括以下步骤：

选择基因组数据库中目标物种的所有全基因组序列，并通过对所述目标物种的全基因组序列的比对，筛选出目标物种核心序列；

过滤掉核酸数据库中的所述目标物种的所有核酸序列，得到非目标物种核酸序列数据库；

将所述目标物种核心序列与所述非目标物种核酸序列数据库进行比对，过滤掉目标物种核心序列中比对到的核酸序列，得到目标物种特有序列；

目标物种核心序列中比对到的核酸序列为所述目标物种核心序列中与所述非目标物种核酸序列数据库中的核酸序列相似度大于等于30％的核酸序列；

在将所述目标物种核心序列与所述非目标物种核酸序列数据库进行比对前，先将所述目标物种核心序列与外源物种基因组进行比对，过滤掉目标物种核心序列中比对到的核酸序列，得到初滤后目标物种核心序列，将所述初滤后目标物种核心序列与所述非目标物种核酸序列数据库进行比对，过滤掉初滤后目标物种核心序列中比对到的核酸序列，得到目标物种特有序列；

目标物种核心序列中比对到的核酸序列为所述目标物种核心序列中与所述外源物种基因组相似度大于等于30％的核酸序列，初滤后目标物种核心序列中比对到的核酸序列为初滤后目标物种核心序列中与所述非目标物种核酸序列数据库中核酸序列相似度大于等于30％的核酸序列；

对所述目标物种的所有全基因组序列的比对，筛选序列相似度在100％的核酸序列，得到所述目标物种核心序列，所述目标物种特有序列大于等于200bp。

2.根据权利要求1所述目标物种特有序列的获取方法，其特征在于，所述目标物种为寄生物种时，所述外源物种包括所述目标物种的宿主。

3.根据权利要求1所述目标物种特有序列的获取方法，其特征在于，所述外源物种包括与所述目标物种同属生物中的至少一种、与所述目标物种同科生物中的至少一种、与所述目标物种同目生物中的至少一种、与所述目标物种同纲生物中的至少一种或与所述目标物种同门生物中的至少一种。

4.根据权利要求1-3任一项所述目标物种特有序列的获取方法，其特征在于，所述基因组数据库包括NCBI基因组数据库，所述核酸数据库包括NT数据库。

5.一种目标物种检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供权利要求1-4任一项所述获取方法获得的目标物种特有序列；

检测待检样本是否包括所述目标物种特有序列，以鉴定所述待检样本是否包括所述目标物种。

6.根据权利要求5所述目标物种检测方法，其特征在于，检测待检样本是否包括所述目标物种特有序列的方法包括以下步骤：

以所述目标物种特有序列为靶序列，设计引物，后对所述待检样本包括的序列和所述引物进行多聚酶链式反应得到扩增序列，并对得到的所述扩增序列进行电泳或测序，检测是否包括所述目标物种特有序列，以检测所述待检样本是否包括所述目标物种。

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