JP5635204B2 - クロマトグラフィー精製法 - Google Patents

Description

本発明は、特にアフィニティークロマトグラフィーを使用した、また特に捕獲クロマトグラフィーについてのクロマトグラフィー精製法、このようなプロセスを設定する方法、およびこのようなプロセスを制御する方法に関する。

捕獲クロマトグラフィーは、上流製造後の初期精製工程として目的の生物製剤、医薬品、機能性食品、化学物質および他の生成物の製造に使用される。捕獲クロマトグラフィーの主な目的は、高処理量および高回収／収率を伴なう生成物の濃縮である。理想的な場合では、不純物が同時に大規模に除去される。

生物製剤の捕獲クロマトグラフィーについては、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー固定相で充填したカラムを使用する。アフィニティー材料は、標的分子と特異的に結合する固定化リガンドに基づくので、標的分子についての極めて高い選択性を提供し、一方で不純物には何ら影響を与えずにそれらを通過させる。典型的には極めて精巧なアフィニティーリガンドの製造コストは比較的高いので、アフィニティー材料は入手可能な固定相の中で最も高価である。

伝統的には、捕獲クロマトグラフィーは、単一カラムで、カラムを連続的に（ｉ）平衡化する、（ｉｉ）標的生成物を含有する供給液で負荷する、（ｉｉｉ）洗い出す、（ｉｖ）所望の標的生成物を回収するために溶出する、（ｖｉ）洗浄する、および（ｉ）次の実行のために再平衡化することを特徴とする不連続モードで実行する。カラムへの生成物の可能な最大負荷量は、固定相容量に強く依存する。平衡条件下（リガンドと標的分子との間の無限接触時間）で得られた全リガンドの標的分子による占有率に相当する静的容量と、流れ条件下（リガンドと標的分子との間の限定接触時間）での動的結合容量とを区別しなければならない。動的結合容量は、因子の中でも特に線形流量および物質伝達特性に依存する。

動的容量は、典型的にはいわゆる破過曲線、すなわち、連続負荷中にカラム出口で目的の生成物の経時的濃度または容積を測定することにより決定される。多くの場合、生成物濃度は、典型的には紫外線吸光度を測定することによりカラムの出口で、オンラインで決定することができる。オンライン検出器シグナルから破過負荷の完全性（すなわち、出口濃度が供給濃度に達した負荷値、飽和点とも呼ぶ）を決定するために、カラムの非存在下で同一検出器を使用した基準としての供給シグナルを決定することが有用である。

上記因子に依存して、動的結合容量は典型的には静的結合容量よりも顕著に低い。これは、単一カラムクロマトグラフィーの流れ条件下では、生成物損失を回避するために静的容量に達するずっと前に負荷を停止しなければならないので、固定相容量が完全かつ効率的には利用されないことを伴う。一方、線形負荷流量を高く設定するほど、処理量が大きくなるが、利用可能な動的結合容量が小さくなり、早期の生成物破過および低い有効固定相容量利用がもたらされる。他方、線形流量を小さく設定するほど、容量利用は大きくなるが、処理量は小さくなる。

２方向間の妥協を表す単一カラムクロマトグラフィーのための二重負荷流戦略が示されてきた。これらの戦略は、高処理量を維持するために高流量でカラムを負荷し始めること、次いで高容量利用を得るために流量を低下させることを含み、均一流量で負荷することに対する利点を示している。

固体相が完全には利用されていなくても、負荷工程の後で、カラムを洗い出し、溶出および洗浄する。カラム洗浄は固定相劣化の主な原因であるので、一定数のサイクル後にカラム充填剤を交換しなければならない。結果として、製造される生成物の量に対する固定相コストは、固定相の完全容量（すなわち、静的結合容量）が活用される場合よりも、動的条件下で顕著に高くなる。

固定相容量利用を増加させ、またプロセス生産性を増加させるために、連続向流クロマトグラフィーの概念もまた用途を見出し、多数のプロセスが、この概念がより長期間使用されてきた化学産業から導き出されてきた。

ほとんどのプロセスは、供給工程中に逐次的に負荷される複数の同一カラムの使用を示唆している。このアプローチの動機づけは、供給工程中、カラム入口に近いカラムの部分が、より長時間より高い生成物濃度と接触するので、カラム出口に近いカラムの部分よりもよく利用される（すなわち、これらが静的条件に相当する平衡により近い）ということである。したがって、複数の短い逐次接続カラムを単一の長いカラムの代わりに負荷すると、固定相の利用が最高である最上流のカラムを、負荷工程の最後ではるかに少ない程度しか負荷されない下流カラムと独立して溶出および洗浄することができる。したがって、容量利用が高い固定相のみを溶出させてその後洗浄する。完全に負荷されたカラムを溶出および洗浄しながら、次のカラムで逐次負荷が進行する。いったん先の上流カラムが溶出および再生工程を完了すると、これを最下流位置の逐次的に負荷されたカラムに結合する。したがって、その静的容量まで負荷されたカラムのみを溶出させることにより、固定相サイクル当たりの生産される生成物量が最大化される。

この原理に基づいて、細胞培養収穫物から治療用タンパク質を精製するために、多数の多重カラム逐次負荷プロセス、特に最大６本のカラムを用いるプロセスが記載されてきた。プロテインＡクロマトグラフィーを使用して細胞培養収穫物からモノクローナル抗体を捕獲するために８本のカラムを用いる模擬移動床式クロマトグラフィーの適用さえ記載されてきた。

逐次負荷プロセスは連続上流製造に限定されず、バッチ式上流製造にも同様に適用することができる。この場合、プロセス制御は、ほとんどの生成物が安定であるという事実、および上流プロセスは下流精製プロセスの開始前に完了しているために供給液中の生成物濃度が一定であるという事実により容易になる。

より長期間（数日、数週間、数か月）操業される生物製剤の連続上流製造では、供給液濃度の変動が典型的であり、下流の逐次負荷プロセスのための適当なプロセス分析ツールおよび制御戦略を要する。さらに、サイクル数にともなうカラム容量の緩やかな減少により、これらのツールおよび制御戦略が必要となる。他の型の周期的多重カラム連続プロセスのクロマトグラフィー工程の流量および持続時間を制御するための制御戦略は、ピーク保持時間、インライン分析およびアットライン分析のそれぞれに基づいて示唆されてきた。

周期的定常状態で各カラムの結合容量を連続的に決定することに基づく逐次負荷プロセスのための制御法はＷＯ２０１０／１５１２１４に記載されている。この方法は、カラムの入口に供給される供給材料の組成を表す供給液シグナルを測定する工程と、カラムからの溶出物の組成を表す溶出物シグナルを測定する工程と、供給液シグナルおよび溶出物シグナルを使用していわゆる「デルタシグナル」から結合容量を決定する工程とを含む。この方法の主な欠点は、供給液シグナルを第１の検出器を使用して決定し、溶出物シグナルを第２の検出器を使用して決定することである。検出器が同一型であるにもかかわらず、制御動作を得るために最終的に使用される破過および飽和点などのデルタシグナルからの有用な情報を得るために検出器を正確にかつ定期的に較正しなければならない。この方法は、その唯一の目的が供給液シグナルの決定である別の検出器により供給液シグナルを決定することを要する。そのため、要求される検出器の数はカラムの本数＋１に等しい。この方法は、例えば、供給液中の高不純物シグナルまたは低生成物シグナルまたはその両方のために、破過曲線を正確に監視することができない場合には使用することができない。

連続プロセスおよびその制御は、医薬品製造を理解および制御するためのプロセス分析ツールの開発および使用を強力に奨励する進行中の衛生管理のイニシアティブと完全に同調する。

ＷＯ２０１０／１５１２１４

本発明は、向流クロマトグラフィープロセスならびに逐次向流負荷クロマトグラフィープロセスの設計、設定、制御および最適化法に関する。

驚くべきことに、逐次負荷クロマトグラフィーの利点を革新的に組み合わせて、カラムの本数を２本に減らし、二重負荷流戦略を適用し、必要であれば、制御のために関連するシグナルを記録する同一検出器を使用したプロセス制御戦略を適用することにより、優れた生産性および容量利用性能を示す設計および制御法を含む新規なプロセスを開発きることが分かった。ツインカラム逐次負荷プロセスは、３本以上のカラムを用いた逐次負荷プロセスよりも必要とするハードウェア（バルブ、検出器、流体接続、カラム）が顕著に少ない。

このプロセスの制御法は、２本のカラムのみを伴う方法に適用可能なだけでなく、少なくとも２本のカラムをサイクルプロセスの１相で逐次負荷（直列接続）し、少なくとも１本のカラムをプロセスの第２の相で負荷するツイン、、三重および多重カラム向流捕獲プロセスにも等しく適用可能である。そのため、制御法は、上述のツインカラムプロセスの文脈において考えられるが、また、全く独立して、２本以上のカラムを用いる他の向流プロセスの文脈においても考えられる。記載される制御法においては、各クロマトカラムにカラム溶出物に相当するカラムの出口でのシグナルを記録することができるように取り付けられる検出器が要求される。

本発明の好ましい実施形態を、図面を参照して以下に記載するが、これらの図面は本発明のこの好ましい実施形態を説明する目的のためのものであり、本発明を限定することを目的としたものではない。

任意の起動相、サイクル相および停止相を含むツインカラム向流逐次負荷プロセスの概略図である。 図１の工程についての検出器ＵＶ１（黒色実線）によりカラム１の出口で記録されたＵＶシグナルの例を示す図である。非吸着不純物のプラトー値を水平点線で示す。 破過曲線（菱形は高流量での単一カラム破過曲線を示し、正方形は低流量での単一カラム破過曲線を示し、三角形は２本の直列相互接続カラムからの破過曲線を示す；溶出容積ＥＶ_１Ｈ、１、ＥＶ_１Ｌ、１、ＥＶ_{１Ｈ、７５}およびＥＶ_２を垂直実線で示す；供給液濃度を水平破線で示す）を示す図である。 実施例２の逐次向流負荷プロセスの５サイクルについての性能パラメータである収率、生産性、ＩｇＧ濃度および緩衝液消費（平均値）を示す図である。 ツインカラム逐次負荷クロマトグラフィープロセスのカラム出口に配置した２つのＵＶ検出器（ＵＶ１、ＵＶ２）によりサイクル２、３、４中に記録されたシグナルを示す図であり、（相互接続相を「ＩＣ」と表し、非接続相を「Ｂ」と表す；相境界を黒色の短い垂直破線で表す；サイクル境界を長い垂直の太い破線で表す；上流カラムからの破過に相当する面積を、ＵＶ２（カラム２が上流である）についてはＡ_{ＩＣ２Ｕ、ｎ}、ＵＶ１（カラム１が上流である）についてはＡ_{ＩＣ１Ｕ、ｎ}でそれぞれ示す。ここではｎはサイクル数を表し、例えば、Ａ_{ＩＣ１Ｕ、３}はカラム１が上流位置にあり、第３のサイクルのカラム１からの破過に相当する面積を指す；以前の相互接続相で上流位置にあったカラムからの溶出物に相当するピーク面積を、ＵＶ２（カラム２が以前の相互接続相で上流であった）についてはＡ_{ｐｅａｋ２、ｎ}、ＵＶ１（カラム１が以前の相互接続相で上流であった）についてはＡ_{ｐｅａｋ１、ｎ}でそれぞれ示す。ここではｎはサイクル数を表し、例えば、Ａ_{ｐｅａｋ１、３}は第３のサイクルのカラム１からの生成物溶出に相当する面積を指す；面積決定に使用するベースラインを細い破線で示す）である。 ツインカラム逐次負荷クロマトグラフィープロセスのカラム出口に配置した２つのＵＶ検出器（ＵＶ１、ＵＶ２）によりサイクル２および３中に記録されたシグナルを示す図である。相境界を短い垂直破線で表す；サイクル境界を長い垂直破線で表す；非吸着不純物の破過に相当する面積は検出器シグナルの非線形性により決定することができない；以前の相互接続相で上流位置にあったカラムからの生成物溶出に相当するピーク面積を、ＵＶ２（カラム２が以前の相互接続相で上流であった）についてはＡ_{ｐｅａｋｉ２、ｎ}、ＵＶ１（カラム１が以前の相互接続相で上流であった）についてはＡ_{ｐｅａｋ１、ｍ}でそれぞれ示す。ここではｎはサイクル数２または３を表す；例えば、Ａ_{ｐｅａｋ２、３}は第３のサイクルのカラム２からの生成物溶出に相当する面積を指す；面積決定に使用するベースラインを細い破線で示す。 １サイクル中（Ｂ１、ＩＣ１、Ｂ２、ＩＣ２）ＵＶ検出器ＵＶ２により記録されたツインカラム逐次負荷クロマトグラフィープロセスの２回の実行からのシグナルの重ね合わせを示す図である。単純化のために、サイクル指数ｎを省略する；第１の実行のシグナル（ＵＶ２−Ｉ、実線）は、４８ｇ／Ｌの負荷を用いた運転パラメータに相当し、第２の実行のシグナル（ＵＶ２−ＩＩ、点線）は、３０ｇ／Ｌの負荷を用いて運転パラメータに相当する（非接続相状態で供給流量）を減少させた）；相互接続相を「ＩＣ」で示し、非接続相を「Ｂ」で示す；相境界を黒色垂直破線で表す。非吸着不純物のプラトー値を水平−点破線で示す。実施例８の記載で言及する面積を矢印で示す。 負荷の関数として、実施例９に記載する最適化法（黒円）およびオフラインＨＰＬＣ分析（白の円）により決定される生産性（菱形）および収率を示す図である。 負荷の関数として、実施例１１によるＵＶ１（菱形）およびＵＶ２（正方形）からのピーク面積値Ａ_ｐｅａｋを示す図である；３つの最低負荷（ＵＶ１）および２つの最低負荷（ＵＶ２）に相当する値をそれぞれ線形関数を使用してあてはめた（図に示す式）；さらに、実施例１１に記載する最適化法（全円）およびオフラインＨＰＬＣ分析（空の円）により決定される収率を負荷の関数として示す。

クロマトグラフィー捕獲法：
本発明の第１の態様として、２本のクロマトカラムのみを用いる、図１に模式的に示すような向流逐次負荷クロマトグラフィープロセスを使用したクロマトグラフィー精製法を提案する。図中、相互接続相をＩＣと示し、非接続（バッチ）相をＢと示す。相互接続相は、カラムが直列接続である、すなわち、上流カラムの出口が下流カラムの入口と接続している工程を意味する。非接続（バッチ）相は、カラムが接続しておらず、入口を通して個々に供給液または単に溶媒が負荷され、出口が廃棄または生成物収集に向けられている工程を意味する。プロセスの１つのサイクルは２つの切換を含み、各切換が１つのＢ相および１つのＩＣ相を含む。第１の切換のＢ相中、カラム１に供給液が負荷される一方、カラム２が溶出され（生成物回収）、再生され、再生は、必要であれば以下に詳述するような供給液の事前の負荷を含む。

カラム１を負荷する間、流量を一定に保つことができる、または好ましい実施形態によると、高流量で始めて、所望のプロファイルにしたがってこの工程のカラム１の負荷の最後に向けて（例えば、双曲線プロファイルを使用することにより）流量を低下させることが可能である。または、この負荷の第１の相で高流量を用い、第２の最終相で、低流量を用いることが可能である（単一のまたは複数のステップ関数）。カラムを非接続モードで運転すると、相互接続相と比べて、クロマトグラフィー床高さ、およびそれによって背圧が約２分の1に低下するので、相互接続相の最大負荷流量よりも最大でほぼ２倍高い負荷流量を使用することが可能である。これにより、クロマトグラフィー物質移動が改善して、負荷プロセスの高速での負荷および効率的な初期相および遅い最終相が可能になり、最適な時間量でカラムにおける最適生成物プロファイルが得られる。

カラム２の生成物回収および再生相は、所望の生成物の溶出（回収）および次のステップのためのカラムの準備（再生）を意味する。具体的には、回収および再生相は、通常、以下の工程の継起を含む：
（ｉ）生成物が固定相から放出されない条件下で溶媒および／または緩衝液で洗い出す工程（この洗い出しは、異なる条件、例えば、変化するｐＨ、イオン強度、溶媒／緩衝液組成等を用いたいくつかの工程を含んでもよい；図中で「ｗａｓｈ」と示す）、
（ｉｉ）生成物が固定相から放出される条件下で溶媒および／または緩衝液で溶出させる工程（すなわち、ｐＨの変化、溶媒または溶媒組成の変化等による；この工程も異なる条件を用いるいくつかの工程を含んでもよい；図中「ｅｌｕ」と示す）。
(ｉｉｉ)適当な溶媒および／または緩衝剤を使用して定置洗浄（ＣＩＰ）して固定相から全て放出させ、任意選択により引き続いて衛生化する工程（これらの工程もいくつかの異なる条件、例えば、変化するｐＨ、イオン強度、溶媒、溶媒／緩衝液組成等を用いるいくつかの相を含んでもよい）。
（ｉｖ）典型的にはその後のプロセス工程と類似または同一の条件下で溶媒および／または緩衝液を使用することにより、平衡化する工程。ここでも異なる条件を用いるいくつかの工程を使用してカラムを可能な限り効率的に平衡化することができる（図中「ｅｑｕｉ」と示す）。

カラム２の生成物回収および再生相中、流量を相互接続相のカラムの流量と比べて増加させることができる。これは、カラムを非接続モードで運転すると、相互接続相と比べて、クロマトグラフィー床高さ、およびそれによって背圧が約２分の1に低下するので、最大でほぼ２倍の流量が可能である。回収および再生工程の流量増加は一般的に分離の質にとって重要な意味を持たないが、カラム１における最適分配のためには、このカラムの負荷流量を上記の明確に定義されたレベルまたはプロファイルで維持することが必要である。

また上記に照らして可能であることは、カラム２の回収および再生が供給液の事前負荷を含むことである。そのため、本出願の文脈では、カラム２の再生相も、洗浄および／または平衡化工程の少なくとも１つの工程の後にカラム２を事前負荷するために供給液を供給する最終工程を含むことができる。これは、上記の洗い出し、溶出、洗浄および／または平衡化の工程を高流量でかなり迅速に行うことができ、カラム２のアイドルタイムを回避するため、および可能な限り高い処理量を得るために、カラム２の事前負荷をこの再生工程に含めることができるために可能である。そのため、カラムの再生という用語は、本発明の文脈では、供給液で対応するカラムを事前負荷する末端工程も含むことができる。これは、第１の切換ならびに第２の切換に当てはまるので、第２の切換で、カラム１を再生相のバッチ工程で事前負荷することができる。

第１の切換のその後のＩＣ相中、カラム１およびカラム２は連続して負荷され、カラム１は上流位置、カラム２は下流位置にある。第２の切換のその後のＢ相中、カラム２は負荷され、カラム１は溶出（生成物回収）および再生される。

第２の切換のその後のＩＣ相中、カラム２およびカラム１は連続して負荷され、カラム２は上流位置、カラム１は下流位置にある。

サイクルは複数回反復され、これは図１では破線で１サイクルのフローシートを視覚的に囲むことにより示される。停止相では、最後のサイクルの後、最終生成物回収のためのＢ相と同様に、両カラムが溶出される。検出器は各カラムの出口に配置され、１つの検出器Ｄ１はカラム１の出口、１つの検出器Ｄ２はカラム２の出口とする。検出器は、例えば、ＵＶ検出器とすることができる。

クロマトグラフィープロセスのサイクルは、カラムの各々がその開始作業に再度達する前に達成することが必要な作業の継起として定義される。したがって、ツインカラムプロセスの完全なサイクルは２つの切り替えを含み、各切り替えは非接続相および相互接続相を含む。

サイクル定常状態は、生成物出口を通して回収される物質の平均量がサイクル間で一定である状態として定義される。典型的には、サイクル連続プロセスは、サイクル定常状態に達する前に多数のサイクル（２〜１０サイクル）にわたって運転されることを要する。

サイクル相に加えて、プロセスは、処理量および生成物出力の点からプロセス性能を改善する追加の相を含むことができる。追加の相は、次の相を含む：
− プロセスを開始する際に１回だけ行われ、カラムが相互接続相のように相互接続されるが、より多量の供給液が負荷されて、結果としてプロセスがサイクル定常状態により速く達する、起動相。より多量の供給液は、プロセス開始時に事前負荷されておらず生成物を欠くカラムを補てんする。起動相を使用する場合、ツインカラム逐次負荷プロセスは第２のサイクルでサイクル定常状態にある。
− ２本のカラムが非接続状態にあり、新たな供給液が負荷されず、カラムが、カラム中に存在する全生成物を回収するために並列または逐次的に溶出を含むクロマトグラフィーサイクル（すなわち、典型的には上記工程（ｉ）〜（ｉｖ））の残りの作業を行う、停止相。
− カラムが相互接続しており、次に溶出される上流カラムの介在液中に存在する生成物を吸着するために洗い出し溶液が両カラムに流される、洗い出し相。
を含む。

プロセスは、好ましくは、動的結合容量を改善し、高い容量利用を得るために、非接続状態においては、相互接続状態よりも低流速で運転される。一般的に、非接続状態において破過が起こりやすいので、非接続状態の持続時間は比較的長く、非接続状態においても相互接続状態の負荷流量の使用が防がれる。連続上流製造に適用する場合、ツインカラム逐次負荷プロセスの相互接続および非接続相の異なる供給流量は、プロセスを平均供給流量に調和した平均化容器に接続することが要する。

そのため、一般的に言えば、本発明の第１の態様によると、発明は２本のクロマトカラムのみを使用して、混合物から所望の生成物分画を単離する精製法であって、少なくとも１回、必要であれば数回行われる１サイクル中、好ましくは本質的に連続的に、以下の工程：
時間枠ｔ_Ｂ中、前記カラムが非接続状態にあり、
第１のカラムに第１の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}を使用してその入り口を介して供給液が負荷され、その出口は廃棄に向けられており、
その第２のカラムから、所望の生成物がその出口を介して回収され、その後第２のカラムが再生される（例えば、頁の一番上の図１示すように、これは連続プロセスの状況であり、もしこの工程がはじめて実行され、第２のカラムがアイドル状態であるか第１の工程Ｂ１に先行しているかのいずれかである場合、相互接続起動工程が行われ、ここでは第１および／または第２のカラムに供給液が負荷される）
第１のバッチ工程Ｂ１
を含む精製法に関する。

上記のように、第２のカラムのこの生成物回収および再生相中、流量を、並行運転している第１のカラムと比べて増加させることができる。これは最大２倍可能であるので、この相の第２のカラムの流量は、相互接続相の流量の２倍高くなり得る。同様に上記に照らして可能であることは、第２のカラムの回収が供給液による事前負荷を含むということである。そのため、本出願の文脈では、第２のカラムの再生相もまた洗浄、平衡化の工程の少なくとも１つの工程の後に、第２のカラムを事前負荷するために供給液を負荷する最終工程を含むことができる。そのため、上記のように、カラムの「再生」という用語は、本発明の文脈では、対応するカラムを供給液で事前負荷する末端工程も含むことができる。これは、第１の切り替えならびに第２の切り替えに当てはまる。

カラムの負荷に関しては、上記のように、流量を一定に保つことができる、または好ましい実施形態によると、高流量で始めて、所望のプロファイルにしたがってこの工程の第１のカラムの負荷の最後に向けて流量を低下させることが可能である。または、第１のカラムのこの負荷の第１の相で、高流量を用い、第２の最終相で、低流量を用いることが可能である。（ステップ関数）。

これに、相互接続時間枠ｔ_ＩＣ中、第１のカラムの出口が第２のカラムの入口と接続しており、第１のカラムに第１の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}以上の第２の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}を使用してその入口を介して供給液がその動的破過容量を超えて負荷され、
第２のカラムの出口が廃棄に向けられている第１の相互接続工程ＩＣ１が続く。

この相互接続工程では、必ず、上流カラム中で、非吸着生成物を運ぶ溶媒および／または緩衝液がその後のバッチ工程の初期相中の廃棄へと洗い流されずに、上流カラムまたは下流カラムの残りの空き容量のいずれかに洗い流され吸着されるようにするために、その後の洗い出し工程を有することが可能である。そのため、対応して、この相互接続工程中０秒以上のその後の洗い出し時間枠（ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}）中、第１のカラムの出口が第２のカラムの入口と接続しており、第１のカラムに供給材料を含まない溶媒および／または緩衝液が負荷され、第２のカラムの出口が廃棄に向けられるよう洗い出しを行うことが可能である。

この第１のバッチ工程Ｂ１および相互接続工程ＩＣ１に、本質的に類似であるが、カラムの位置が交換された、すなわち、上記第１のバッチ工程および第１の相互接続工程の第１のカラムが位置を交換して第２のカラムになり、上記の第１のバッチ工程および第１の相互接続工程の第２のカラムが位置を交換して第１のカラムになる工程が続く。換言すれば、上記第１のバッチ工程および第１の相互接続工程に、第１のバッチ工程Ｂ１と類似であるがカラムが交換された第２のバッチ工程Ｂ２が続き、結果として第１のバッチ工程Ｂ１の第１のカラム１が第２のバッチ工程Ｂ２の第２のカラム１になり、第１のバッチ工程Ｂ１の第２のカラムが第２のバッチ工程Ｂ２の第１のカラムになる。その後、これに第１の相互接続工程と類似であるがカラムが交換された第２の相互接続工程ＩＣ２が続き、結果として第１の相互接続工程ＩＣ１の上流カラムが第２の相互接続工程ＩＣ２の下流カラムになり、第１の相互接続工程ＩＣ１の下流カラムが第２の相互接続工程ＩＣ２の上流カラムになる。

バッチ時間枠ｔ_Ｂは、好ましい実施形態によると、それぞれのカラムの回収および再生に要する累積時間となるよう選択される。優先的には、この累積時間は、（ｉ）生成物が固定相から放出されない条件下で溶媒および／または緩衝液で洗い出す工程；（ｉｉ）生成物が固定相から放出される条件下で、溶媒で溶出させる工程（例えば、グラジエントをかけることによって、この工程は出口分画を含んでもよい）；(ｉｉｉ)溶媒および／または緩衝剤を使用して定置洗浄して固定相から全て放出させる工程；（ｉｖ）その後のプロセス工程と類似または同一の条件下で溶媒および／または緩衝液を使用することにより、平衡化する工程に要する累積時間により与えられる。通常、バッチ工程の律速要素は実際にはそれぞれのカラムからの生成物の回収および再生であることが分かった。これは、かなり長い時間がかかるものである。さらに意外なことには、バッチ工程中、回収および再生に供されていない他のカラム、すなわち、供給液を負荷されているカラムの流量を利用可能なタイムフレームの中で、可能な限り低いが可能な限り多くカラムを前負荷するのに十分高くなるよう適合させると、処理量の極端な増加を得ることができることが分かった。そのため、第１の好ましい実施形態によると、相互接続工程ＩＣ（すなわち、第１および第２の相互接続工程）で、第２の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}を第１の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}よりも大きくなるよう適合させる。好ましくは、第２の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}は第１の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}よりも少なくとも１０％大きい、より好ましくは少なくとも２５％大きい、最も好ましくは第１の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}よりも１．５〜２．５倍大きい。以下でさらに詳述するように、第２の流量を相互接続状況のために可能な限り高い値に設定し、第１の流量について適当に最適化された低い値（典型的には第２の流量の５０〜９０％の範囲にある）を選択することにより流量値を適合させる。

上に指摘したように、提案するプロセスの１つの重要な要素は、上流カラムをその破過点（破過点は負荷中に生成物が上流カラムから溶出し始める点に相当する）を超えて負荷して結果として下流カラムがすでに生成物の一定画分を取入れ、事前負荷されるようにすることにより、相互接続相の上流カラムの容量利用が最大化されるという事実である。この点についてより具体的にするため、また破過点を超えた相互接続相のこの実行を達成するために、好ましい実施形態によると、パラメータを以下のように適合させることができる：相互接続工程ＩＣで、第２の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}および／または相互接続時間枠ｔ_ＩＣを、相互接続時間枠ｔ_ＩＣの終わりに、上流カラムの出口での供給液濃度が上流カラムの入口での供給液濃度の３０〜９０％の範囲（破過値Ｘ）にあるように選択することができる。しかしながら、プロファイルに応じて、この条件は、この基準をとることにより、生成物がすでに下流カラムの出口から溶出する状況で問題となり得る。そのため、好ましくは、第２の流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}および／または相互接続時間枠ｔ_ＩＣの値を、接続時間枠ｔ_ＩＣの終わりに、下流カラムの出口での生成物濃度が０．２５〜５％、好ましくは１〜２．５％の破過値より下となるように適合させ、かつこの破過値に相当する溶出容積値に好ましくは６０〜９０％の範囲の安全率を乗ずるという条件付きで、上記基準をとるべきである。目標は、可能な限り高いＱ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}の値を有することであり、これはＥＶ_１Ｈ、ＸおよびＥＶ_Ｙの小さい方をとることにより可能である（Ｘは上流カラムの望ましい破過値である）。以下に示すさらなる詳細を参照されたい。

なお別の好ましい実施形態によると、非接続相は、カラムの１つの単純な洗浄を含んでもよく、カラムのより徹底的な洗浄を延長した非接続相で定期的にｍサイクル毎に（ここで、ｍは２以上である）、行ってもよい。

なお別の好ましい実施形態によると、カラムは、クロマトグラフィー固定相がビーズおよび／または膜および／またはモノリスの形態であり得るアフィニティークロマトグラフィー物質充填カラムである。

全て以下でさらに詳述するように、対応するプロセスを管理および監視し、またプロセスを設定するために、各カラムの出口に、成分を分析するための検出器を配置することができ、ここでは、好ましくは、両検出器は同一型のものである。これは、所望の生成物を検出するのに適した任意の型の検出器とすることができ、選択した運転条件下、少なくとも所望の生成物にとって、検出飽和に達しておらず、結果として定量的検出が可能であるように適合させるべきである。これらの検出器は、例えば、ＵＶ検出器、可視光検出器、ＩＲ検出器、蛍光検出器、光散乱検出器、屈折率検出器、ｐＨ検出器または導電率検出器から選択することができる。

上に指摘したように、これらのサイクルは、連続供給の場合、例えば、カラム材料の交換が必要になるまでまたは供給流が中断され停止を必要とするまで連続的かつ反復して行うことができる。

しかしながら、プロセスを設定するためには、好ましい実施形態によると、カラムが相互接続しており、本方法のサイクルの相互接続工程ＩＣと比べて大量の供給溶液が上流カラムに負荷される、第１のサイクルに先行する起動工程で始めることが賢明である。実際、このような起動工程では、上流カラムは、連続運転のようには、先行するバッチ工程のために既に事前負荷されていないので、この起動工程では、上流カラムは高い有効容量を有し次いで負荷されて第１のサイクルに入る。対応する時間を適合させ、設定を以下にさらに詳述する。

プロセスを停止しなければならない場合、なお別の好ましい実施形態によると、最終サイクルに、２本のカラムが非接続状態にあり、両カラムが生成物回収およびカラム再生に供される停止工程が続くことができる。

優先的には、所望の生成物は抗体、抗体断片、融合タンパク質、組換え糖タンパク質、および／または血漿タンパク質またはこれらの組み合わせの１つあるいは群である。したがって、一般的に言えば、プロセスは、１サイクルが以下の交互の相を含むサイクル様式で作動する：
− カラムが非接続状態にあり、先行する相互接続相で下流カラムであったカラムが、相互接続工程の第２の供給流量以下の第１の供給流量を使用して負荷され続け、先行する相互接続相で上流カラムであったカラムが、供給工程に従う典型的なクロマトグラフィーサイクルの作業（洗い出し、溶出、洗浄、再平衡化など）を行う、第１のバッチ相Ｂ１；
− 第１の供給液および任意選択によりその後の洗い出し溶液が事前負荷されたカラムに負荷され、カラムが相互接続されており、結果として事前負荷上流カラムから流出する流れが下流カラムに入る、第１の相互接続相ＩＣ１；
− カラムが非接続状態にあり、先行する相互接続相ＩＣ１で下流カラムであったカラムが相互接続工程よりも低流量で負荷され続け、先行する相互接続相ＩＣ１で上流カラムであったカラムが、供給工程に従う典型的なクロマトグラフィーサイクルの作業（洗い出し、溶出、洗浄、再平衡化など）を行い、負荷され続けているカラムがその後の相互接続相ＩＣ２で上流に配置される第２のバッチ相Ｂ２；
− カラムが先行する相互接続工程ＩＣ１と逆の順序で相互接続しており、第１の供給液および任意選択によりその後の洗い出し液がカラムのうち１本に負荷され、カラムが相互接続されており、結果として上流カラムから流出する流れが下流カラムに入る、第２の相互接続相ＩＣ２。

設定法：
上に概説したようなプロセスを設定するために、持続時間ｔおよび流量ＱをバッチＢおよび相互接続ＩＣ工程の各々について決定しなければならない。

上で指摘したように、バッチ工程内の律速工程は、一般的に供給液を負荷されていないカラムの回収および再生工程である。これらの工程に要する時間が非接続状態の持続時間ｔ_Ｂを決定する。同様に上で指摘したように、バッチ工程で利用可能な時間中、供給液を負荷されているカラムは、最適容量利用のために可能な限り低流量で供給されるべきであるが、非接続工程の最後で対応するカラムが、最適に、そのため生成物の破過がないか、または本質的にない程度まで生成物で満たされるべきであることが考慮されるべきである。対応する流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}を決定するためには、しかしながら、単一カラムの破過曲線を単に決定するだけでは、このカラムが下流カラムであった場合に先行する相互接続工程で既に事前負荷された事実を考慮しないために不十分である。そのため、バッチ工程供給流量は、先行する相互接続工程でカラムがすでにどの程度まで供給液で満たされているのかを考慮する必要がある。

他方、相互接続工程では、効率という理由のために、供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}は可能な限り高くあるべきであり、典型的には相互接続状態の対応するカラムのために指定された供給流量の上限となるよう選択される。そのため、相互接続状態についてのパラメータを決定する際の挑戦的な仕事は、この工程の流量ではなく持続時間ｔ_ＩＣである。持続時間は、上流カラムの容量がその破過点を超えて所望の程度まで（典型的には、入口での供給液濃度に対する上流カラムの出口での所望の生成物の濃度として表される、この比は通常は３０〜９０％の範囲になるよう選択される）満たされるが、同時に特に浅い破過プロファイルの場合には、確実に上流カラムのこの破過点に達する瞬間に、下流カラムの出口で既に溶出している生成物ないように持続時間を選択すべきである。そのため、プロセスの最適パラメータ化の設定は、決してささいなことではなく、以下で、体系的な方法でこのようなパラメータを見つけるためのプロトコルを与えるものとする。

そのため、より具体的には、本発明はまた上に概説するクロマトグラフィー法を設定する方法に関し、ここでは、
バッチ工程Ｂのバッチ工程持続時間ｔ_Ｂがそれぞれのカラムの回収および再生に要する累積時間となるよう設定され、バッチ工程Ｂのそれぞれのカラムに適用されるバッチ工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}が、先行する工程で、このカラムが既に事前負荷されたことを考慮して、バッチ工程持続時間ｔ_Ｂの最後で、カラムの出口で、所望の生成物の溶出がないよう設定される。他方、相互接続工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}は所望の値に設定され、相互接続工程持続時間ｔ_ＩＣは、相互接続工程持続時間ｔ_ＩＣの最後で、上流カラムの出口で、所望の生成物濃度が所望の範囲、好ましくはその入口での濃度の３０〜９０％の範囲になるよう、ただし、下流カラムの出口で、所望の生成物の溶出が本質的にないように設定される。

バッチ工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}および相互接続工程持続時間ｔ_ＩＣを決定するために、好ましくは相互接続工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}を使用して単一カラムの少なくとも１つの破過曲線（または一連の破過曲線）を記録し（例えば、分画および分析を使用して）、使用する。必要であれば、特に相互接続工程の下流カラムの出口で生成物が溶出する危険性がある非常に浅い破過プロファイルの場合、さらに、相互接続工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}を使用した相互接続カラムの少なくとも１つの破過曲線を記録し使用することができる。さらに、相互接続工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}よりも小さいバッチ工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}を使用した単一カラムの少なくとも１つの破過曲線（または一連の破過曲線）がパラメータを決定するために記録および使用され、ここでは好ましくはこの破過曲線を決定するためのより小さいバッチ工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}は相互接続工程供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}の５０〜９０％となるよう選択される。

ツィンカラムプロセスについては、一般的に言えば、以下の運転パラメータを、プロセスを実行する前に決定しなければならない：
ｔ_ＩＣ（相互接続状態持続時間）、ｔ_{ＩＣ、ｗａｓｈ}（相互接続状態洗い出し持続時間、任意）、ｔ_Ｂ（非接続状態持続時間）、ｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}（起動持続時間、任意）、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}（相互接続相供給流量）、Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}（非接続相供給流量）、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ｓｔａｒｔｕｐ}（起動状態供給流量、任意）、非接続状態溶出パラメータ、および最終溶出パラメータ。

非接続状態溶出パラメータは、単一カラムクロマトグラフィーに関連し、生成物を回収し、新たな生成物の取り込みのためにカラムを準備するために負荷されたカラムに適用される洗い出し、溶出、ストリッピング、洗浄、衛生化および再平衡化工程の数、持続時間および流量を含む。非接続状態溶出パラメータは、通常は純度要件および／またはクロマトグラフィー専門機関の個々の標準的ガイドラインに基づくスクリーニングアプローチにより決定されるので、以下に記載するパラメータ決定手順の一部ではない。非接続状態手順の総持続時間を以下でｔ_Ｂと呼ぶ。

同じことが、生成物が２本のカラムから個々に回収される逐次カラム負荷プロセスの最終溶出パラメータに当てはまる（図１参照）。起動工程は任意であるが、これによりプロセスが定常状態に達するのに要する時間が短縮されるので有利である。

運転パラメータｔ_ＩＣおよびｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}を決定するために、好ましくは分画およびオフライン分析により分析される破過曲線の記録を要する。しかしながら、破過曲線の評価をクロマトグラムのみに基づき、オフライン分画分析に基づかないで行うと、さらにそれぞれの検出器により記録される供給シグナルを用いた破過シグナルの較正を行わなければならず、好ましくはカラムの非存在下で決定しなければならない。

要約すると、設計法は、以下の要素：
− 所望の最大負荷流量で２つの逐次相互接続カラムについて安全率を乗じた破過値に相当する溶出容積ＥＶ_２を実験的に決定する工程、
− 所望の最大流量で単一カラムについての破過曲線を実行し、低破過値に相当する溶出容積ＥＶ_１Ｈ、１を決定する工程、
− 所望の最大流量での単一カラムについての高破過値Ｘ（Ｘは好ましくは３０〜９０％である）に相当する、高流量での単一カラム破過曲線から溶出容積ＥＶ_１Ｈ、Ｘを決定する工程、
− 所望の最大流量よりも顕著に小さい流量で単一カラムについての第２の破過曲線を実行し、低破過値に相当する溶出容積ＥＶ_１Ｌ、１を決定する工程、
− ２つの値ＥＶ_１Ｈ、ＸおよびＥＶ_２の小さい方に等しい値ＥＶ_Ｙを決定する工程、
− ＥＶ_Ｙの供給容積が２本の直列したカラムに負荷された際の下流カラム中に存在する生成物の量に相当する事前負荷値ＰＬを決定する工程。この値は、上限としてＥＶ_Ｙを用いた積分によって単一カラムの破過曲線から計算される。
− 非接続相Ｂで事前負荷されたカラムに追加で負荷することができる生成物の量に相当する標的負荷値ＴＬを決定する工程。この値はＥＶ_１Ｌ、１およびＰＬから計算される。
− ＥＶ_１Ｌ、１およびＥＶ_Ｙを使用して相互接続状態持続時間ｔ_ＩＣを決定する工程。この計算は、上流カラムが相互接続状態に入る際に事前負荷されていること、および下流カラムがその後の非接続状態で供給液を負荷され続ける必要があることを考慮する。
− 任意選択により、ｔ_ＩＣおよびＥＶ_１Ｌ、１から起動時間ｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}を決定する工程、
− ２つの相互接続カラムの破過曲線を記録するために使用する流量と同じＱ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}およびＱ_{ｆｅｅｄ、ｓｔａｒｔｕｐ}を選択する工程、
− 洗い出し、溶出、洗浄、平衡化の異なる工程に要する時間の持続時間を合計することにより、非接続相Ｂの持続時間を決定する工程、
− ＴＬおよびｔ_Ｂの値を使用して非接続状態の供給流量を計算し、これを第２の破過曲線を決定するために使用する低流量と比較し、Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}として小さい値を選択する工程、
− 値Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}およびＶ_ｄｅａｄを使用して相互接続状態の負荷工程に続く洗い出し工程ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}の持続時間および流量を決定する工程を含む、

計算についてのさらなる詳細を以下でさらに好ましい実施形態に定める。

ソフトウェアを使用して上記および下記の設定工程を自動的に行うことができる。

検出器が検出器の線形範囲で少なくとも溶出ピーク面積および好ましくは破過面積を測定することを可能にするために、方法を開始する前に検出器の測定範囲を一度適合させるべきである（これは以下でさらに概説するように設定に当てはまるだけでなく、制御にもあてはまる）。例えば、タンパク質クロマトグラフィーに使用するＵＶ検出器については、２８０ｎｍ波長での吸収の決定が検出器の非線形範囲にある場合、波長を、例えば、タンパク質クロマトグラフィーで遭遇する典型的なタンパク質濃度のための検出器の線形範囲にある、たとえば３００ｎｍに変化させることができる。

設計法はまた、検出器が非線形範囲にある大きな不純物シグナルの場合にも適用可能である。この場合、オフライン分析を使用して破過曲線を評価しなければならないある。

制御および最適化法のための出発点としても役立ち得るツインカラム逐次向流負荷クロマトグラフィープロセスの初期運転パラメータ、ｔ_ＩＣ、ｔ_Ｂ、ｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}、ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}、Ｑ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}、Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ｓｔａｒｔｕｐ}をここでより詳細に以下の手順により決定する：
（ａ）典型的には洗い出し、溶出、洗浄、任意選択により衛生化、および再平衡化工程（上記も参照）を含むクロマトグラフィーサイクルのプロトコル後に、供給液を供給されていないカラムで行われる単一工程の持続時間を合計することにより、非接続状態持続時間ｔ_Ｂを計算する工程。
（ｂ）相互接続状態の所望の最大供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}を使用して２つの相互接続カラムの溶出容積破過値ＥＶ_２を決定する工程。流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}およびＱ_{ｆｅｅｄ、ｓｔａｒｔｕｐ}はそれぞれこの最大流量に相当し、これは通常、最高位値を使用して決定され、カラム材料または装置の製造者の仕様により与えられる。より正確には、この工程（ｂ）は、一定の破過値、例えば、供給濃度に対して１％破過〜最大５％破過に相当する溶出容積ＥＶを決定することと、（例えば、単一カラムクロマトグラフィーにも使用する値を使用して特定の条件および標的の両方に応じて）６０％〜９０％の間の安全率Ｚを溶出容積ＥＶに乗じることとを含む。Ｚを乗じた破過溶出容積値をＥＶ_２と命名する。ＥＶ_２（指数２は２本の相互接続カラムに関する）は、２本の逐次カラムの動的破過曲線（ＤＢＣ_２）を評価することにより、すなわち、クロマトグラムを使用することにより、または負荷中のフロースルーの分画およびオフライン分画分析により、決定される。基本的に、この測定を行って、相互接続状態のどの溶出容積で生成物が下流カラムの出口で溶出し始めるかを見つける。これにより、確実に相互接続工程持続時間がこの破過溶出プロファイルに照らして可能であるよりも長く選択されないようになる。
（ｃ）以前選択した供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}を使用して単一カラムの溶出容積破過値ＥＶ_１Ｈ、１（第１の指数１は単一カラムを表し、Ｈは高流量を表し、第２の指数１は１％の破過閾値を表す）を決定し、完全破過曲線ＤＢＣ_１（１つの単一カラムを用いた動的破過曲線）を記録する工程。単一カラムの一定の低破過値、好ましくは供給濃度に対して１％の破過に相当する溶出容積を完全破過曲線から決定する。単一カラムのこの低破過値溶出容積をＥＶ_１Ｈ、１と命名する。破過値は、クロマトグラムの評価により、または負荷中のフロースルーの分画およびオフライン分画分析により決定される。ＥＶ_１Ｈ、１の決定は義務ではないが、工程（ｆ）の限定積分の目的のためには、この値が利用可能であることが有利である。
（ｄ）単一カラムの高負荷に相当するＸ％の破過溶出容積ＥＶ_１Ｈ、Ｘを、工程（ｃ）で決定した破過曲線から決定する工程。Ｘは、典型的には３０〜９０％の間の数である。この溶出容積値をＥＶ_１Ｈ、Ｘと命名する。この目的は、相互接続相を終了させることが必要な瞬間を決定することである。しかしながら、ここで決定される値は、そのままでは、上流カラムが先行する工程で既に事前負荷されていることを考慮しておらず、また相互接続相中に下流カラムの出口で生成物が溶出することを防がなければならないことを考慮していない。後者を防ぐために、工程（ｅ）の条件を適用する。
（ｅ）２つの値ＥＶ_２およびＥＶ_１Ｈ、Ｘの小さい方を決定する工程。この値をＥＶ_Ｙと命名する。この条件の目的は、確実に相互接続相中に下流カラムの出口で溶出する生成物がないようにすることである。
（ｆ）式１：

にしたがって、ＥＶ_Ｙの上限を用いて、単一カラムの較正済み破過曲線ＤＢＣ_１（上記（ｃ）で決定される）と相互接続カラムの較正済み破過曲線ＤＢＣ_２（上記（ｂ）で決定される）の差を積分し、単一カラムのカラム容積で除すことにより計算される事前負荷値ＰＬを決定する工程。
積分のためのより低い出発点としてゼロを使用することも可能である。
換言すれば、この工程で、カラム容積当りの生成物質量を計算する。これにより、下流カラムが相互接続工程で起こる現象のために既に事前負荷されており、次にどれくらい多くの容量がバッチ工程の負荷のために残されているかを決定することが必要である。
（ｇ）以前の単一カラム破過決定よりも小さい流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＢＴ１Ｌ}を使用して、単一カラムの第２の破過値ＥＶ_１Ｌ、１を決定する工程。典型的には、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＢＴ１Ｌ}＝Ｗ％・Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}であり、Ｗ＝５０〜９０％である：少なくともＥＶ_Ｙまで完全破過曲線ＤＢＣ_１Ｌを決定し、一定の低破過値、好ましくは供給液濃度に対して１％の破過（高流量での単一カラム破過値の決定と同一の％値を選択することができる）に相当する溶容積を決定する。この溶出容積をＥＶ_１Ｌ、１と命名し、ここでは破過値を、クロマトグラムの評価により、または負荷中のフロースルーの分画およびオフライン分画分析によりＤＢＣ_１Ｌから決定する。この値は、バッチ工程の最後でカラムがどれくらいまで所望の生成物ですでに負荷されているかを示し、これにより（ｈ）で相互接続工程の可能な持続時間を決定することが可能になる。
（ｈ）式２：
ｔ_ＩＣ＝（ＥＶ_Ｙ−Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１）／Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}
（式２）
にしたがって、Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１をＥＶ_Ｙから減じ、完全な項を相互接続状態の供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}（すなわち、工程（ｂ）で２つの逐次カラムの破過曲線ＤＢＣ_２を記録するために使用した供給流量）で除することにより、相互接続状態切り替え時間ｔ_ＩＣを決定する工程。
（ｉ）式３：
ＴＬ＝（（Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１−Ｖ_ｄｅａｄ）・ｃ_ｆｅｅｄ）／Ｖ_ｃｏｌ−ＰＬ
（式３）

にしたがって、死容積を、安全率Ｚを乗じた値ＥＶ_１Ｌ、１の１％の破過に相当する溶出容積から減じ、差に供給液濃度値を乗じ、前記積をカラム容積で除し、ＰＬをこの値から減じることにより、事前負荷値ＰＬおよび単一カラムの破過曲線ＤＢＣ_１Ｌから、標的負荷値ＴＬを決定する工程。
したがって、この値は、バッチ工程供給液負荷中のカラムの実際に利用可能な容量、すなわち、相互接続工程中の事前負荷を考慮した利用可能な容量を表す。ここでこの値により、以下の工程（ｊ）でバッチ状態の供給流量を決定することが可能になる。
（ｊ）ＴＬにカラム容積を乗じ、供給液濃度で除し、洗い出し、溶出、洗浄および再平衡化工程、および任意選択により衛生化のさらなる工程を含むクロマトグラフィーサイクルについてのプロトコルにより決定される非接続状態の持続時間ｔ_Ｂで除すことにより、式４にしたがって、非接続状態の供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}を決定する工程。
Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}＝（ＴＬ・Ｖ_ｃｏｌ）／ｃ_ｆｅｅｄ・ｔ_Ｂ）
（式４）

この計算により決定される流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}が、低流量で単一カラム破過曲線を記録するために使用した流量よりも大きい場合、後者の流量はＱ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}を使用すべきである、すなわち、Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}＝Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＢＴ１Ｌ}。
（ｋ）式５にしたがって、Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１とＶ_ｄｅａｄの差を供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}で除し、この値をｔ_ＩＣに加算することにより、起動時間ｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}を任意で決定する工程。起動中の流量は相互接続相の供給流量と同一である。
相互接続状態起動工程は任意であるが、これを使用するとより速くサイクル定常状態に達することができる。
ｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}＝ｔ_ＩＣ＋（Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１−Ｖ_ｄｅａｄ）／Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}＝（ＥＶ_Ｙ−Ｖ_ｄｅａｄ）／Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}
（式５）

（ｌ）死容積を、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}と同一値のものであるが、供給液の代わりに洗い出し緩衝液を使用する流量Ｑ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}で除すことにより、相互接続相負荷工程に続く相互接続状態洗い出し工程の持続時間ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}を決定する工程（式６）：
ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}＝ｋ・Ｖ_ｄｅａｄ／Ｑ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}
（式６）

ｋは１以上の有理数である。
上記式中、死容積Ｖ_ｄｅａｄは、供給の点から検出の点までの非吸着成分の溶出容積に相当する（１カラムを含む）。これは、トレーサ実験により、または２本のカラムの逐次負荷で２つのＵＶ検出器により記録された不純物シグナルを評価することにより決定することができる。
上記方法を使用してｋ個のカラム逐次負荷プロセスについての運転パラメータを決定することもできる。ｋは２より大きく、典型的には洗い出し、溶出、洗浄、衛生化および再平衡化工程を含む非接続状態作業が２つ以上の相中に分配されている（ツインカラムプロセスの場合のように）という違いがある。

制御、監視および最適化法：
本発明はさらに、また上記２本のカラムプロセスおよび対応する設定手順と独立して、検出器比較を用いて監視するクロマトグラフィー逐次負荷プロセスに使用する方法に関する。制御および監視法は、相互接続状態と非接続状態で交互に運転され、相互接続状態と非接続状態のこのような継起後に位置を切り換える少なくとも２本のカラムが存在することを要する。さらに、制御および監視法は、所望の生成物が検出器を通過する際にこれを検出することができる検出器を各カラムの下流に配置することを要する。好ましくは、検出器を、プロセスの全相中に、すなわち、望ましくない不純物に直面した場合のほか、所望の生成物に直面した場合に、定量レジームで運転するよう適合させるべきである。

管理および制御法の趣旨は、相互接続状態と非接続状態の反復サイクルを使用することにより、存在する少なくとも２つの検出器の差を補正すること、ならびに２本のカラム、およびそれゆえに２つの検出器が同一機能を交互に引き継ぐという事実を利用することである。検出器が実際に関連するカラムの同一機能により同一結果を示すはずである状況で、カラムに関連する検出器の結果を比較することにより、特に、この状況における２つの検出器の結果の間の対応する比を計算し、同一比が得られるはずのプロセスの異なる位置に同一比が当てはまるかどうかをチェックすることにより制御が可能になる。

この点で、これらのプロセスの従来の制御および監視は、生成物溶出中に出口で任意の生成物が存在するかどうかをチェックすることにより（単にイエス／ノー検出であり、定量的ではない）、または単一カラムの出口と入口を、これらの位置の２つの検出器を使用して比較することにより、従来は行われていたに過ぎない。しかしながら、これは、これらの２つの検出器の較正の問題を本質的に提起する。提案する単純かつ直接のプロセスによりこの全てが回避される。

少なくとも２本のカラムを用いたクロマトグラフィー多重カラム逐次負荷プロセスのための監視および制御法は、好ましくは、少なくとも、各カラムの出口に配置された検出器により記録される、目的の生成物に相当する、少なくとも単一サイクルのオンライン溶出ピークシグナル「Ａ_{ｐｅａｋｉ}」（検出器ｉにより測定される）を決定する工程と、適当なアルゴリズムを用いてシグナルを評価する工程と、そこから制御動作を誘導する工程とを含む。

検出器シグナルは、生成物質量および／または濃度を定量的に表すべきである。

以下の方法の説明および好ましい実施形態に使用する用語は、一般性を失うことなく、ＵＶ検出器により測定される面積に関し、以下に説明される：
ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}は、溶出ピーク曲線と平衡化された空のカラムの値に相当する水平ベースライン（図２および図５参照）または運転パラメータ変化の点（例えば、洗い出し工程の終了、洗浄工程の開始）などの他の基準により規定されるベースラインにより限局される面積として定義される。

図２では、不純物シグナルプラトー値が水平点線により示される。シグナルプラトーは非吸着不純物に相当する。破過面積Ａ_ＩＣｉＵ、Ａ_ＩＣｉＤおよびＡ_Ｂｉは、破過曲線および水平ベースラインにより限局され、それぞれ２つの矢印により示される。「Ｂ」および「ＩＣ」はそれぞれ相互接続相および非接続相を示す。図２では、第１のＢ相Ｂ１のプラトーレベルより上の面積は、「Ａ_Ｂ１」と命名される。「Ａ_Ｂ１」は、非接続相の負荷工程中のカラム１からの生成物損失に相当する。第１のＩＣ相ＩＣ１のプラトーレベルより上の面積は、Ａ_ＩＣ１Ｕと命名される（「ＩＣ」は「相互接続相」を表し、「１」はカラム／検出器の数を表し、「Ｕ」は上流を表す）。面積Ａ_ＩＣ１Ｕは、相互接続相中に上流カラムを出る生成物に相当するが、生成物は第２のカラムに入るので、これは系を出る生成物に相当はしない。第２のＢ相の生成物溶出ピークは、「Ａ_{ｐｅａｋ 1}」と命名され、第２のＩＣ相のプラトーレベルより上の面積はＡ_ＩＣ１Ｄと呼ばれる（「Ｄ」は下流を表す）。第２のＩＣ相では、カラム１は下流であり、上流カラム２から溶出した生成物を受け取る。面積Ａ_ＩＣ１Ｄは、上流カラム２から溶出した全生成物がカラム１に吸着された場合を示す、カラム１がＩＣ２相で下流位置にある場合で、カラム１からのゼロ損失に相当する提示した場合にはゼロである。

本方法は、カラムの相互接続負荷相の下流カラムの破過面積、Ａ_ＩＣｉＤ（カラムｉについて検出器ｉにより測定される）と、生成物の損失を反映する、非接続相の負荷されたカラムの破過面積Ａ_Ｂｉと、カラムの相互接続負荷相の上流カラムの破過面積、Ａ_ＩＣｉＵとを識別する。述べたように、後者の面積は、上流から下流カラムに運ばれる物質を表し、生成物損失を反映するわけではない。

Ａ_ＩＣｉＤ、Ａ_ＩＣｉＵおよびＡ_ＢｉおよびＡ_{ｐｅａｋｉ}を比較する場合、面積の記録中の潜在的に異なる流量を考慮する必要がある。流量と乗算することにより、異なる流れについて面積を正規化することができる。

監視および制御法は、以下および好ましい実施形態にさらに記載するように、異なるサイクルおよび／または異なる検出器間で少なくともピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}を比較することに基づく。本方法は、Ａ_ＩＣｉＤ、Ａ_ＩＣｉＵおよびＡ_Ｂｉを測定することができない不純物シグナルが大きい場合にも使用することができる。本方法は、サイクル間でカラム容量および供給液濃度変化を監視し、測定面積から制御動作を得ることができる。

長期プロセス運転では、供給液濃度の減少および同時に起こるカラムの劣化などの異なる原因が、パラメータのみと同一の破過およびピーク面積への効果をもたらし、同一の制御作用を引き起こすことがある。プロセス制御の成功のために効果の原因についての詳細な知識を要しないことが提示する方法の利点である。制御作用の目的は、一般的に、一定生成物濃度を保証するために一定収率または一定負荷を維持することである。その後のクロマトグラフィーサイクルまたはサイクル相において負荷を適合させるための可能な制御作用には、それだけに限らないが、Ｂおよび／またはＩＣ相の供給流量の変化、負荷持続時間、相Ｂおよび／またはＩＣの持続時間、あるいは供給液濃度の変化が含まれる。収率は、負荷を変化させることによっても適合させられる。例えば、より高い収率を得るためには、負荷を低下させなければならない。

本発明の別の実施形態は、プロセスの負荷および処理量を最大化するための最適化法に関する。このアプローチは、プロセスの生産性を最大化する、およびプロセスをスケールアップする際に装置を適当にサイズ調整するためのプロセス開発に関連する。

最適化法は、プロセスの異なるサイクルからの少なくとも溶出ピークシグナルおよび／または破過シグナルを比較することを含み、評価するシグナルは、そこから制御作用を得るために、連続していてもよいが、間隔があいていてもよい。図２に関して、最適化は、続くサイクルでＡ_Ｂｉを最小に維持しながら、Ａ_{ｐｅａｋｉ}を最大化することを目的とするであろう。Ａ_Ｂｉを最小化すると、Ａ_ＩＣｉＤは自動的に最小化される。

監視および制御するプロセスの場合のように、負荷をその後のクロマトグラフィーサイクルまたはサイクル相に適合させるための可能な制御または最適化実行には、それだけに限らないが、Ｂおよび／またはＩＣ相の供給流量の変化、負荷持続時間、相Ｂおよび／またはＩＣの持続時間、あるいは供給液濃度の変化が含まれる。

プロセス性能を最大化するために、負荷をサイクル間で段階的に増加させる。工程変化後に新たに記録した面積を、以前のサイクルの面積と比較し、新たな値を使用してプロセス性能を再計算する。好都合な検出器シグナルにより破過面積およびピーク溶出面積の測定が可能な場合、単一サイクルの面積決定に基づいて、プロセス性能を改善することができる。（大きな不純物シグナルのために）ピーク溶出面積しか測定することができない場合、プロセスの最適化可能性を決定し、最適化を実行するために同一実行のより早いまたはより遅いサイクルからの追加のデータを要する。さらなる最適化法の詳細は、好ましい実施形態に規定される。

本方法を有利に使用して、時間のかかる実験的決定手順を回避して、計算により適当な運転パラメータを決定することができる。

相互接続状態の下流カラムおよび非接続状態の負荷カラムから、溶出ピーク面積および破過面積を決定することにより、生成物損失および収率をオンラインで定量化することができる。供給シグナルを要しない。

制御作用は同一検出器で記録されたシグナル、または検出器の各々により記録されたシグナル間の比の計算を通して正規化した異なる検出器から記録されたシグナルのいずれかから決定されるので、検出器較正の退屈な作業も要しない。先行技術の記載に対する別の主な利点は、プロセス制御および最適化のための基礎としてピーク面積を使用することにより、本方法を、検出器の非線形範囲内にあるので破過シグナルの測定が出来ない非常に大きな不純物シグナルをもたらす供給材料から生成物を精製するためのプロセスの制御に適用することができることである。

逐次負荷の概念は、常に、最下流カラムからの生成物損失に相当するＡ_ＩＣｉＤの存在を伴うので、記載する制御および最適化法を、３つ以上のカラムを用いる他の全ての逐次負荷クロマトグラフィープロセスにも使用することができる。インライン検出器により測定され、上流から下流カラムに運ばれる生成物に相当する面積Ａ_ＩＣｉＵの数は、より多くのカラムが相互接続されるにつれて変化し得るが、これらの面積は生成物損失を反映はしない（図２参照）。面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}は、全ての共通する多重カラム逐次負荷プロセスにおいて単一カラムからの生成物回収に相当する。面積Ａ_Ｂｉは、多重カラムプロセスが、カラムの１つまたは複数が他のカラムから切断されていながら負荷されている工程を含む場合に存在する。このような工程を含む多重カラムプロセスもあるが、含まないプロセスもある。

全プロセスについて、制御の共通の目的は、Ａ_{ｐｅａｋｉ}、Ａ_ＩＣｉＤおよびＡ_Ｂｉ、おそらくはＡ_ＩＣｉＵも、特定の規格限界内に維持することである。最適化の共通の目的は、Ａ_ＩＣｉＤおよび存在する場合には面積Ａ_Ｂｉも最小に維持しながら、Ａ_{ｐｅａｋｉ}を最大化することである。

より具体的には、不純物シグナルが小さいために、Ａ_ＩＣｉＤおよびＡ_Ｂｉが検出器による定量的測定を利用できる場合、プロセスを監視および／または制御および／または最適化する提案する方法は、以下の要素を含む：
（ａ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の非接続状態の生成物溶出位置において全カラム（ｉ）の溶出物に相当する非接続相シグナルＡ_{ｐｅａｋ１}を測定する工程；
（ｂ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の相互接続状態上流および／または下流位置において全カラム（ｉ）の溶出物に相当する相互接続相シグナルＡ_ＩＣｉＵを測定する工程；
（ｃ）好ましくは異なる検出器の非接続相シグナルＡ_{ｐｅａｋｉ}間の比を計算することにより、２つの検出器間の非接続相シグナルＡ_{ｐｅａｋｉ}を比較する工程；
（ｄ）好ましくは異なる検出器の相互接続相シグナルＡ_ＩＣｉＵ間の比を計算することにより、２つの検出器間の相互接続相シグナルＡ_ＩＣｉＵを比較する工程；
（ｅ）シグナルの大きさの差の程度を定量化するために、２つの検出器間で、工程（ｃ）の非接続相シグナルＡ_{ｐｅａｋｉ}の比較の値および（ｄ）相互接続相シグナルＡ_ＩＣｉＵの比較の値を比較し、制御および／または監視のために、この比およびまたは（ｃ）および／または（ｄ）の比を使用する工程。具体的には、制御作用はこの差に基づくことができる、例えば、クロマトグラフィープロセスの少なくとも１つの将来のサイクルのために実施する動作はこの差に基づくことができ、クロマトグラフィープロセスは例えば、カラムの劣化および／または不十分な供給液などにより停止することができ、ならびに／あるいはこれを使用してプロセスのステップタイミング、流量、負荷、収率（回収）、処理量、緩衝液消費のパラメータを最適化することができる。

特に、不純物シグナルが小さいために、Ａ_ＩＣｉＤおよびＡ_Ｂｉが検出器による定量的測定を利用でき、供給液中の生成物濃度が一定である場合（多数の用途に当てはまる）、監視および／または制御および／または最適化の別のプロセスによると、以下の要素を含む縮小したプロセスを使用することが可能である：
（ａ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の相互接続状態上流および／または下流位置において少なくとも２つの、好ましくは全カラム（ｉ）の溶出物に相当する相互接続相シグナルＡ_ＩＣｉＵを測定する工程；
（ｂ）好ましくは異なる検出器の相互接続相シグナルＡ_ＩＣｉＵ間の比を計算し、制御および／または監視のためにこの比を使用することにより、少なくとも２つの、好ましくは全検出器間の相互接続相シグナルＡ_ＩＣｉＵを比較する工程。具体的には、制御作用は、この差／比に基づくことができる、例えば、クロマトグラフィープロセスの少なくとも１つの将来のサイクルのために実施する動作はこの差に基づくことができ、クロマトグラフィープロセスは例えば、カラムの劣化および／または不十分な供給液などにより停止することができ、これを使用してプロセスのタイミング、流量、負荷、収率（回収）、処理量、緩衝液消費のパラメータを最適化することができる。

特に、不純物シグナルが大きいために、Ａ_ＩＣｉＤおよびＡ_Ｂｉが検出器による定量的測定を利用できず、供給液濃度が一定である場合（多数の用途に当てはまる）、プロセスの負荷および処理量を最適化するための監視および／または制御および／または最適化の提案したプロセスは以下の要素を含む：
（ａ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の非接続状態の生成物溶出位置において全カラムの溶出物に相当する非接続相シグナルＡ_{ｐｅａｋｉ}を測定する工程；
（ｂ）好ましくは異なる検出器の非接続相シグナルＡ_{ｐｅａｋｉ}間の比を計算することにより、２つの検出器間の非接続相シグナルＡ_{ｐｅａｋｉ}を比較する工程；
（ｃ）シグナルの大きさの差の程度を定量化するために、２つの検出器間で、少なくとも１つのサイクルの非接続相シグナルＡ_{ｐｅａｋｉ}の値またはその比を比較し、制御および／または監視のためにこの差を使用する工程。具体的には、制御作用は、この差に基づくことができる、例えば、クロマトグラフィープロセスの少なくとも１つの将来のサイクルのために実施する動作はこの差に基づくことができ、クロマトグラフィープロセスは例えば、カラムの劣化および／または不十分な供給液などにより停止することができ、これを使用してプロセスのタイミング、流量、負荷、収率（回収）、処理量、緩衝液消費のパラメータを最適化することができる。

上記制御法では、好ましくは、制御作用は、サイクルプロセスの１つまたは複数の相で供給流量を減少または増加させることによりカラム負荷を変化させることである。別の好ましい実施形態では、制御作用は、相互接続相または非接続相の持続時間をそれぞれ変化させることである。

他の実施形態では、制御作用は、供給間隔持続時間を減少または増加させること、供給液組成を変化させること（例えば、希釈による）を含む。

本発明のさらなる実施形態は、従属請求項に規定される。

［実施例１］ツインカラム向流逐次負荷プロセスのための運転パラメータの初期決定
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、清澄化細胞培養収穫物からＩｇＧを精製するためのツインカラム向流逐次負荷プロセスのための初期運転パラメータを上に概説した手順に基づいて決定した。Ｐｏｒｏｓ Ａ／２０カラム（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用したオフラインプロテインＡ分析により、破過曲線を記録、分画および分析してＩｇＧ濃度を決定した。供給液中のＩｇＧ濃度は１．０ｇ／Ｌであった。カラムは、内径０．５ｃｍおよび長さ５．０ｃｍのものであった。負荷カラムを溶出および再生するのためのプロトコルは、６分の洗い出し工程、７分の溶出工程、６分の洗浄工程、３分の第１の平衡化工程、および３分の第２の平衡化工程を含めて、全て１ｍＬ／分の流量で展開した。したがって、溶出および再生工程の全持続時間はｔ_Ｂ＝２５分であった。

単一カラムについての第１の破過曲線を１ｍＬ／分の供給流量で記録し、単一カラムについての第２の破過曲線を０．５ｍＬ／分の供給流量で、また直列の２本のカラムについての第３の破過曲線を１ｍＬ／分の供給流量で記録した。負荷率Ｘ＝７５％および安全率Ｚ＝９０％で、以下の溶出容積値を得た（上記記載および式を参照されたい）：
ＥＶ_１Ｈ、１＝１９．９ｍＬ、ＥＶ_１Ｌ、１＝２３．４ｍＬ、ＥＶ_{１Ｈ、７５}＝４８．４ｍＬおよびＥＶ_２＝６０．８ｍＬ。

溶出容積値についての印と共にオフライン分析結果の重ね合わせを図３に示す。ＥＶ_{１Ｈ、７５}＜ＥＶ_２であるので、ＥＶ_ＹをＥＶ_{１Ｈ、７５}に等しく設定した。事前負荷値ＰＬを、台形公式を使用した積分近似により計算したところＰＬ＝１１．２ｇ／Ｌとなり、標的負荷値はＴＬ＝１６．３ｇ／Ｌと決定された。非接続状態の供給流量は０．５３ｍＬ／分と決定された。この流量は第２の破過曲線を決定するために使用した流量よりも大きかったので、後者の値を供給流量Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}＝０．５０ｍＬ／分として選択した。逐次負荷プロセスの相互接続相の持続時間はｔ_ＩＣ＝２５分と計算され、起動相の持続時間はｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}＝４７．５分であった。両場合の供給流量はＱ_{ｆｅｅｄ、ｓｔａｒｔｕｐ}＝Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}＝１ｍＬ／分であった。相互接続洗い出し工程持続時間はｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}＝１分であり、流量はＱ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}であった。

［実施例２］ツインカラム向流逐次負荷工程の運転
内径０．５ｃｍおよび長さ５．０ｃｍの２本のカラムに負荷したプロテインＡアフィニティー固定相を使用して、清澄化細胞培養収穫物からＩｇＧモノクローナル抗体を捕獲するために、ツインカラム向流逐次負荷プロセスを使用した。プロセスを、スイスＣｈｒｏｍａＣｏｎ ＡＧ製のＣｏｎｔｉｃｈｒｏｍ Ｌａｂ−１０装置で以下のパラメータを用いて運転した。ＵＶ検出波長は３０５ｎｍであった。プロセスを実施例１で決定した運転パラメータ（表１に要約する）を用いて実行した。
表１：起動相を含む実施例２のツインカラム向流逐次負荷プロセスについての運転パラメータ。Ｑ_ｆｅｅｄは供給流量を示し、Ｑ_{ｂｕｆｆｅｒ}は他の全相の流量を示す；ｔはそれぞれ非連続相Ｂおよび相互接続相ＩＣのサブステップの持続時間である。最終溶出についてのパラメータは、供給流量（最終溶出工程中ゼロである）を除くＢパラメータに相当する。

クロマトグラフィープロセスの運転パラメータ（供給流量および切り替え時間など）は実行の間中変えなかった。供給液濃度をサイクル毎に０．０１〜０．０２ｇ／Ｌ人工的に増加させて（表２参照）上流プロセスの微妙な変化をシミュレートした。

初期起動相後、最終溶出相で溶出させる前に５サイクルにわたって、精製プロセスを連続的に実行した。ＩｇＧ濃度を決定するために、供給液、生成物分画、分画を通した供給流および洗浄分画に相当する溶出物をオフラインプロテインＡ ＨＰＬＣ分析により分析した。画分容積および生成物濃度から、生成物質量および性能パラメータを計算した。

生成物画分中の生成物質量と供給液画分中の生成物質量を比較することにより収率を計算した。生成物質量（１サイクルで得た）をサイクル持続時間および総カラム容積（すなわち、２本のカラムを合わせた容積）で除することにより生産性を計算した。１サイクル中に使用した緩衝液の全体容積をそのサイクルの生成物分画中の生成物質量で割ることにより、緩衝液消費を計算した。供給液濃度および性能パラメータを表２に要約し、経時的発展を図４に示す。実施例は、供給液濃度の微妙な変化にもかかわらず、記載したプロセスを使用して高い収率および生産性値を得ることができることを示している。
表２：プロセスの５サイクルについての平均値としての逐次向流負荷プロセスの供給液濃度、ＩｇＧ濃度、収率、生産性および緩衝液消費。

［実施例３］検出器比較、低不純物シグナル
ツインカラム向流逐次負荷プロセスをスイスＣｈｒｏｍａＣｏｎ ＡＧ製のＣｏｎｔｉｃｈｒｏｍ Ｌａｂ−１０装置で以下のパラメータを用いて運転した。同一試料について異なるシグナルを与える２つの検出セルを実証のために使用した。運転パラメータを表３に要約する。
表３：実施例３のツインカラム向流逐次負荷プロセスについての運転パラメータ。Ｑ_ｆｅｅｄは供給流量を示し、Ｑ_{ｂｕｆｆｅｒ}は他の全工程の流量を示す； ｔはそれぞれ非接続相Ｂおよび相互接続相ＩＣのサブステップの持続時間である。最終溶出についてのパラメータは、供給流量（最終溶出工程中ゼロである）を除くＢパラメータに相当する。ＵＶ検出器波長は３００ｎｍであった。

サイクル２、３および４中記録した、各カラムの出口に配置したＵＶ検出器ＵＶ１およびＵＶ２からのクロマトグラムを図５に示す。プロセスはサイクル３および４でサイクル定常状態であった。

相互接続相中、ＵＶ検出器は、それぞれ、上流カラムおよび下流カラムの負荷貫流に相当するシグナルを記録する。サイクル定常状態のプロセスのクロマトグラムを、１００分で開始するサイクル２を参照して説明する。

以下では、指数ｎを使用してプロセスの第ｎのサイクルを記載する。したがって、例えば、面積Ａ_{ｐｅａｋ２、３}は、第３のサイクルのカラム２について記録した溶出ピーク面積（検出器２による）に相当する。

非接続相Ｂで、生成物をカラム２から回収した。非接続相は、典型的には溶出前の少なくとも１つの洗い出し工程、典型的にはストリップおよび／または洗浄工程、引き続き少なくとも１つの再平衡化工程を含む。生成物ピークをＡ_{ｐｅａｋ２、２}（ＵＶ２により記録する）により示す。カラム２の洗い出し、溶出、洗浄および再平衡化と並行して、カラム１を、相互接続状態の供給流量としての低流量の供給液で負荷した。シグナルＵＶ１は、貫流した非吸着不純物に相当する。シグナルは一定プラトーに達し、Ｂ相中に生成物が破過していないことを示した。

その後の相互接続相ＩＣでは、両カラムを相互接続し、カラム１を上流位置に配置し、負荷し続けた。相互接続相の最後でカラム１の出口で記録した上昇シグナル（ＵＶ１）は、生成物が破過していることを示した（Ａ_{ＩＣ１Ｕ、２}）。しかしながら、この生成物は損失せず、下流カラム２で再吸着された。破過はカラム１（ＵＶ１）で検出されたが、破過はカラム２（ＵＶ２）で検出されず、全生成物が再吸着されたことを示した。相互接続相ＩＣの最後で、カラム１を新鮮な緩衝液で洗い出して、結果として上流カラム１の液体容積中に存在する生成物が下流カラム２で吸着されるようにした。

続く非接続相Ｂでは、生成物を、カラム２について以前の非接続相で使用した洗い出し、溶出、ストリップおよび／または洗浄、再平衡化工程の同一プロトコルを使用して、カラム１から回収した。生成物ピークをＡ_{ｐｅａｋ１、２}（ＵＶ１により記録）で示す。同時に、カラム２を、相互接続状態の供給流量としての低流量の供給液で負荷した。シグナルＵＶ２は、貫流した非吸着不純物に相当する。再度、シグナルは一定プラトーに達し、生成物が破過していないことを示した。

その後の相互接続相ＩＣでは、カラム２を負荷し続け、相互接続相の最後での上昇シグナル（ＵＶ２）は、生成物がカラム２から破過していることを示した（Ａ_{ＩＣ２Ｕ、２}）。しかしながら、この生成物は損失せず、下流カラムで再吸着された。破過はカラム２（ＵＶ２）で検出されたが、破過はカラム１（ＵＶ１）で検出されず、全生成物が再吸着されたことを示した。相互接続相ＩＣの最後で、カラム２を新鮮な緩衝液で洗い出して、結果としてカラム２の液体容積中に存在する生成物が下流カラム１で吸着されるようにした。

相互接続相が完了した後、新たなサイクルを開始した。

本プロセスでは、非接続相で洗い出しおよび溶出する前、それぞれのカラムは相互接続相の上流位置にあり、生成物が再吸着される下流カラムに破過しているように負荷される（実施例２参照）。相互接続相の破過は、図５でＡ_{ＩＣ２Ｕ、ｎ}（ＵＶ２、カラム２）およびＡ_{ＩＣ１Ｕ、ｎ}（ＵＶ１について、カラム１）（ｎはサイクル数）と命名した面積と比例する。

図５では、さらに、以前非接続相で上流位置にあった非接続相のカラムの溶出に相当するピーク面積を示し、Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ}（ＵＶ１について、カラム１）およびＡ_{ｐｅａｋ２、ｎ}（ＵＶ２、カラム２）と命名する（ｎはサイクル数）。ピーク面積についてのベースラインを、溶出ピーク開始から非接続状態の溶出工程の最後に相当するＵＶシグナル点まで引いた。ＵＶシグナルはこの点でゼロではないので、ベースラインは水平ではなかった。しかしながら、Ａ_ｐｅａｋについての比較可能な結果を得るために、水平なベースラインを引くよりもむしろ各サイクルの各ピークについて一貫した様式でベースラインを引くことがより重要である。

決定した面積を表１に列挙する。

全く同一のカラムおよび検出器の理想的な場合では、Ａ_{ＩＣ１Ｕ、ｎ}（表４、１列）はＡ_{ＩＣ２Ｕ、ｎ}（表４、３列）と等しく、Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ}（表４、２列）はＡ_{ｐｅａｋ２、ｎ}（表３、４列）と等しいであろう。実際には、両カラムおよび検出器は顕著に異なるので、ほとんどの場合、面積Ａ_ＩＣ１ＵおよびＡ_ＩＣ２Ｕは顕著に異なり、Ａ_{ｐｅａｋ１}およびＡ_{ｐｅａｋ２}は互いに顕著に異なる。

これは、各単一サイクルについて計算した比Ａ_ＩＣ２Ｕ／Ａ_ＩＣ１Ｕ（表４、５列）により確認される。比は、サイクル定常状態のＡ_ＩＣ２Ｕ（サイクル３および４）がＡ_ＩＣ１Ｕよりも約１．３倍大きい（３０％）ことを示す。異なる面積の場合、この差が異なる特性、例えば、増幅を有する検出器のためであるかどうか、またはこれが異なる、潜在的に劣化した容量を有するカラムのためであるかどうかを決定することは非常に重要である。異なる面積にのみ基づいて判断することは、実際に許容可能な容量を有するカラムの誤った交換をもたらし得る。

比Ａ_{ｐｅａｋ２}／Ａ_{ｐｅａｋ１}（表４、６列）を比較することにより、Ａ_{ｐｅａｋ２}がＡ_{ｐｅａｋ１}よりも約１．３倍大きい（３０％）ことも明確になる。また、破過およびピーク面積の和の比（Ａ_{ＩＣ２Ｕ、ｎ}＋Ａ_{ｐｅａｋ２、ｎ}）／（Ａ_{ＩＣ１Ｕ、ｎ}＋Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ}）は約１．３である（表３、１０列）。

合わせて、この情報は、ＵＶ２の検出器シグナルが一般にＵＶ１の検出器シグナルよりも１．３倍大きいことを示している。

比Ａ_ＩＣ２Ｕ／Ａ_ＩＣ１ＵおよびＡ_{ｐｅａｋ２}／Ａ_{ｐｅａｋ１}が異なっていたような場合、これはカラムの容量が異なることを示していたであろう。その場合、破過およびピーク面積の和の比（表３、１０列）を使用して検出器シグナルの差を決定したであろう。
表４：図５から得られた面積および比（［ｍＡＵ分］で示す）。「比」で示した５〜１０列は、他の列に列挙する値の比を表す。例えば、比３／１（５列）は、３列の値を１列の値で除することを表す（したがってＡ_{ｐｅａｋ２}／Ａ_{ｐｅａｋ１}）。

［実施例４］カラム容量監視、低不純物シグナル
実施例３のツインカラム向流逐次負荷プロセスを、カラム容量変化について評価した。供給は実行中変化せず、供給濃度は一定であった。したがって、カラム容量のみが、例えば、汚損または荒い洗浄のために潜在的に変化していた。説明は、図５に使用した用語を指す。

両カラムについてのＡ_{ＩＣｉＵ、ｎ}＝Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ−１}および／またはＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＝Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}（実施例２参照）がカラム容量を示すという事実は、１サイクルから他サイクルまで一定のままであったことを示している。

Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}＞Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ−１}および／またはＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＜Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}が顕著な差で測定されたのであれば、これはカラム容量が減少していることを示したであろう。典型的には、面積決定の精度は１％であるので、１％を超えるＡ_{ＩＣｉＵ、ｎ}の増加または１％を超えるＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}の減少を容量の損失に帰属させることはできない。

本方法を使用して逐次的でないサイクルのカラム性能を評価することもできる。

［実施例５］カラム容量監視、高不純物シグナル
ツインカラム向流逐次負荷プロセスを、不純物含量が高い供給材料から生成物を捕獲するために運転した。供給材料は全実行の間中同一であった（供給液中一定の生成物濃度）。運転パラメータを表５に要約する。
表５：実施例５のツインカラム向流逐次負荷プロセスについての運転パラメータ。Ｑ_ｆｅｅｄは供給流量を示し、Ｑ_{ｂｕｆｆｅｒ}は他の全工程の流量を示す； ｔはそれぞれ非接続相Ｂおよび相互接続相ＩＣのサブステップの持続時間である。最終溶出についてのパラメータは、供給流量（最終溶出工程中ゼロである）を除くＢパラメータに相当する。ＵＶ検出器波長は３０５ｎｍであった。

供給材料の不純物含量が大きいために、検出器は図６に示すように検出の非線形範囲にあり（過飽和）、プロセスの相のいずれかの生成物破過に相当する面積（Ａ_ＩＣｉＵ、Ａ_Ｂｉ）を決定することは不可能であった。

しかしながら、ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}にのみ基づいて、カラム容量が１サイクルから他サイクルまでに劣化したかどうかを決定することが可能であった。プロセスの第２および第３のサイクルについての生成物溶出ピークは、Ａ_{ｐｅａｋ２、２}＝７５６ｍＡＵ分、Ａ_{ｐｅａｋ２、３}＝７６４ｍＡＵ分、Ａ_{ｐｅａｋ１、２}＝８０５ｍＡＵ分、Ａ_{ｐｅａｋ１、３}＝８０９ｍＡＵ分と決定された。比Ａ_{ｐｅａｋ２、３}／Ａ_{ｐｅａｋ２、３}およびＡ_{ｐｅａｋ１、３}／Ａ_{ｐｅａｋ１、２}をそれぞれ計算することにより、面積が、面積決定の精度に相当する１％の差で同一であることが明らかになる。これは、カラム容量が最大１％の差で同一であることを意味する。これは、典型的には容量がその後の２つのサイクル中に劇的には変化しないためであると予測される。本方法を使用して逐次的でないサイクルのカラム性能を評価することもできる。

不純物シグナルが大きい場合、Ａ_{ｐｅａｋｉ}データのみに基づいて２つのカラムの容量が異なるかどうか、または検出器が同一生成物濃度について異なるシグナルを与えるかどうかを決定することは不可能であることに注目しなければならない。しかしながら、Ａ_{ｐｅａｋｉ}測定を一定供給液濃度で行う場合、負荷が生成物吸着の線形範囲にあれば、負荷を変化させることによりこれを試験することができる。２サイクルのＡ_{ｐｅａｋｉ}測定中には劇的なカラム容量減少は起こらないと仮定される。負荷が生成物吸着の線形範囲にあり、各検出器からの少なくとも２つのピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}間で比較を行う場合、Ａ_{ｐｅａｋ２、ｎ}／Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ}の比の平均を形成することにより検出器シグナル差を決定することができる。比較Ａ_{ｐｅａｋ２、ｎ}／Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ}をさらなるサイクルについて行うと、検出器シグナル差測定はより正確になる。

生成物吸着の線形範囲についてのさらなる情報を実施例１０に示す。

［実施例６］供給液濃度およびカラム容量監視、低不純物シグナル
実施例３のツインカラム向流逐次負荷プロセスを、供給液材料の生成物濃度変化および同時のカラム容量変化の効果について評価した。

クロマトグラフィープロセスの運転パラメータ（供給流量および切り替え時間など）はサイクルにわたって変化しなかったが、供給液濃度は可変性であると仮定し、カラム容量は一定または減少すると仮定する。可能なカラム劣化についての異なるシナリオおよび可能な供給液濃度変化を表５に要約する。

実施例３では、２つの連続サイクル（３および４）で、両カラムについて、破過面積は同一Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}＝Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ−１}であり、ピーク面積は同一Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＝Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}であり、供給液品質もカラム性能も１サイクルから他サイクルまで顕著には減少しなかったことを示している。

以下では、供給液濃度およびカラム容量に関するＡ_ＩＣｉＵおよびＡ_{ｐｅａｋｉ}の相対的挙動ならびに考えられる原因のより多くの例を示す。

Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}＜Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ−１}およびＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＜Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}が検出された場合、供給液濃度は減少したはずである。カラム容量は１サイクルから他サイクルまで同一のままであったかもしれないが減少したかもしれない。１サイクルから他サイクルまで比Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}／Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}が増加していることは、カラム品質が一定のままであること、または容量がカラム負荷よりも少ない程度に減少していることを示す。１サイクルから他サイクルまで比Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}／Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}が減少していることは、カラム品質が一定のままであること、または容量がカラム負荷よりも強い程度に減少していることを示す。

Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}＞Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ−１}およびＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}≧Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}が測定された場合、供給液濃度が増加したはずである。カラム容量は１サイクルから他サイクルまで同一のままであったかもしれないが減少したかもしれない。１サイクルから他サイクルまで比Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}／Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}が増加していることは、カラム品質が一定のままであること、または容量が、カラム負荷が増加するよりも少ない程度に減少していることを示す。１サイクルから他サイクルまで比Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}／Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}が減少していることは、カラム品質が一定のままであること、または容量がカラム負荷よりも強い程度に減少していることを示す。

Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}＞Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ−１}およびＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＜Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}が測定された場合、カラム容量が減少したにちがいない。供給液濃度を、負荷が、カラム容量が減少したよりも強い程度に増加するように変化したにちがいない。理論的には、カラム容量は効果が相殺するように負荷の増加と同程度まで減少する可能性がある。その場合、同一検出器について、２つの異なるサイクルについて溶出している総生成物に相当する面積の比（Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＋Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ}）／（Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}＋Ａ_{ＩＣｉＵ、ｎ−１}）を計算することが推奨される。この比が＞１なら、供給液濃度は１サイクルから他のサイクルについて増加したはずである。
表６：サイクルｎ−１からｎまでのカラム容量および供給液濃度の変化ならびにクロマトグラムから決定される面積Ａ_ＩＣｉＵおよびＡ_{ｐｅａｋｉ}への効果。カラム容量変化は、容量減少「↓」、一定容量「＝」を含む；供給液中の生成物濃度変化は以下：増加「↑」、減少「↓」、変化なし「＝」を含む。

［実施例７］供給液濃度およびカラム容量監視、高不純物シグナル
実施例５のツインカラム向流逐次負荷プロセスを、供給材料の生成物濃度変化および同時のカラム容量変化の効果について評価した。以下では、供給液中の生成物濃度を「供給液濃度」と省略する。

クロマトグラフィープロセスの運転パラメータ（供給流量および切り替え時間など）はサイクルにわたって変化しなかったが、供給液濃度は可変性であると仮定し、カラム容量は一定または減少すると仮定する。

供給材料の不純物含量が大きいために、検出器は図６に示すように検出の非線形範囲にあり（過飽和）、プロセスの相のいずれかの生成物破過に相当する面積（Ａ_ＩＣｉＵ、ＡＢｉ）を決定することは不可能であった。

両カラムについてＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＝Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}という事実は、ａ）供給液濃度もカラム性能も顕著には減少しなかったこと、あるいはｂ）カラムの両方または一方についてのカラム容量が、供給液濃度がｎ−１サイクルからｎサイクルまでの間に増加したのと同程度まで減少したことを示す。

カラムの両方または一方についてＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＞Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}が検出された場合は、カラムの両方または一方について、供給液濃度がｎ−１サイクルからｎサイクルまでの間に増加し、カラム容量一定のままであるか、または供給液濃度が増加したよりも少ない程度に減少したことを示す。

カラムの両方または一方についてＡ_{ｐｅａｋｉ、ｎ}＜Ａ_{ｐｅａｋｉ、ｎ−１}が検出された場合は、供給液濃度がｎ−１サイクルからｎサイクルまでの間に減少したか、またはカラム容量が減少したかのいずれかである、あるいは供給液濃度とカラム容量の両方が減少した。供給液濃度がｎ−１サイクルからｎサイクルまでの間に増加したが、カラム容量がより強い程度に減少したという可能性もある。

［実施例８］プロセス制御、低不純物シグナル
不純物含量が高い供給材料から生成物を捕獲するためのツインカラム向流逐次負荷プロセスを、供給材料中の生成物濃度変化および同時のカラム容量変化の効果について評価した。以下では、供給液中の生成物濃度を「供給液濃度」と省略する。ツインカラム向流逐次負荷プロセス条件を表７に列挙する。
表７：実施例８のツインカラム向流逐次負荷プロセスについての運転パラメータ。Ｑ_ｆｅｅｄは供給流量を示し、Ｑ_{ｂｕｆｆｅｒ}は他の全工程の流量を示す；ｔはそれぞれ非接続相Ｂおよび相互接続相ＩＣのサブステップの持続時間である。Ｑ_ｆｅｅｄはそれぞれ０．８２ｍＬ／分および０．１９ｍＬ／分であった。最終溶出についてのパラメータは、供給流量（最終溶出工程中ゼロである）を除くＢパラメータに相当する。ＵＶ検出器波長は３００ｎｍであった。

面積Ａ_ＩＣｉＵ、Ａ_ＢｉおよびＡ_{ｐｅａｋｉ}に基づいて、一定レベルのＡ_{ｐｅａｋｉ}（生成物プール中の目的の生成物の濃度に相当する）を維持するための制御動作を誘導することができる。

実施例６に概説したように、Ａ_ＩＣｉＵおよびＡ_{ｐｅａｋｉ}は、供給液濃度およびカラム容量変化に応じて一定の傾向を経験する。プロセス制御の目的は、Ａ_{ｐｅａｋｉ}を一定の定義された限界以内に維持することである。可能な制御動作は負荷の変化を含み、上に詳細に列挙されている。

面積Ａ_ＩＣｉＵおよびＡ_{ｐｅａｋｉ}の傾向に基づく制御作用を以下に要約する：
・ 供給液濃度が一定のままであり、カラム品質が一定のままである場合、制御作用を要しない。
・ 供給液濃度が減少し、カラム容量が同一のままであるまたは減少した場合、負荷を増加させてＡ_{ｐｅａｋｉ}を増加させることができる（以下に報告する制約を参照）。
・ 供給液濃度が増加しており、カラム品質が同一のままであるかまたはより少ない程度に減少した場合、Ａ_{ｐｅａｋｉ}の所望のレベルを維持するために負荷を減少させなければならない。
・ 供給液濃度が等しいままであり、カラム容量が減少した場合、負荷を増加させてＡ_{ｐｅａｋｉ}を増加させることができる（以下に報告する制約を参照）。
・ 供給液濃度が増加しており、カラム容量がより大きな程度に減少している場合、以下に説明する制約を考慮しながら、負荷を増加させてＡ_{ｐｅａｋｉ}の所望のレベルを維持することができる。

上記の場合は、周期的向流負荷プロセスにおけるカラム容量劣化および供給液濃度変化の効果を、負荷のみを変化させることにより制御することができることを示している。上記制御作用を要約すると、Ａ_{ｐｅａｋｉ}が指定された限界を超えて減少した場合、負荷を増加させるべきであり（以下の制約を参照）、Ａ_{ｐｅａｋｉ}が指定された限界を超えて増加した場合、負荷を減少させるべきである。

負荷増加の制約は、動的結合容量により与えられる。相互接続状態の下流カラムの容量および非接続状態の負荷されているカラムの容量を超えるほど、多くの生成物が損失し、プロセスの最終回収率が低くなる。

生成物損失を回避するために、非接続状態中に負荷されているカラムからの生成物の破過、および相互接続状態の下流カラムからの生成物の破過を最小化しなければならない。

プロセスクロマトグラムでは、これらの制約は、非接続状態中に負荷されているカラムからのシグナル、および相互接続状態の下流カラムからのシグナルが、吸着されない不純物のレベルに相当するプラトー値を超えてはならないことを意味する。この制約を、２つの異なる負荷を用いた実行のクロマトグラムについて図７に図示する（実行Ｉ：４８ｇ／Ｌ、実行ＩＩ：３０ｇ／Ｌ、検出器ＵＶ２のシグナルのみ示す）。

図７は、相互接続相ＩＣ１の下流カラムからのシグナル（ＵＶ２−ＩおよびＵＶ２−ＩＩ）が非吸着不純物に相当するプラトー値（３０ｇ／Ｌと４８ｇ／Ｌの両負荷について、相ＩＣ１について図７の矢印参照）に達することを示している。したがって、シグナル曲線と不純物プラトーにより限局される面積Ａ_{ＩＣ２Ｄ−１}およびＡ_{ＩＣ２Ｄ−ＩＩ}はゼロ以下であり、相互接続状態中に下流カラムからの実行のいずれでも生成物は損失していない。

非接続相Ｂ２では、破過曲線と不純物プラトーベースラインとの間の面積は、実行ＩＩについてはゼロである（シグナル曲線および不純物プラトーベースラインが正確に一致しているので、面積は図７に示されていない）。したがって、実行Ｉでは、Ｂ相中に廃棄に溶出（および損失）している生成物はない。対照的に、実行Ｉについては、Ａ_Ｂ２−Ｉで示されている面積は、ゼロより大きく、非接続相の負荷工程での生成物破過（すなわち、生成物損失）に相当する。

相互接続相ＩＣ２では、相互接続状態の上流カラムのシグナル曲線と不純物プラトーベースラインとの間の面積を、それぞれＡ_{ＩＣ２Ｕ−Ｉ}およびＡ_{ＩＣ２Ｕ−ＩＩ}と命名する。相ＩＣ２では、以前に負荷されたカラムからの破過は開始する（３０ｇ／Ｌ負荷、ＵＶ２−ＩＩ）かまたはそれぞれ継続する（４８ｇ／Ｌ負荷、ＵＶ２−Ｉ）が、カラムは上流位置にあり、カラムを離れた生成物は下流カラムに完全に吸着される。そのため、相互接続相の上流カラム出口で記録された面積Ａ_{ＩＣ２Ｕ−Ｉ}およびＡ_{ＩＣ２Ｕ−ＩＩ}に相当する生成物は系に残っており、損失していない。

生成物損失に相当する、積分により得られる面積値を表８に列挙する。

生成物損失がサイクル定常状態で顕著であったかどうかを推定するために、面積Ａ_ＩＣｉＤおよびＡ_Ｂｉを、実行ＩおよびＩＩの各々について表８に列挙する面積値を使用して、カラム１については生成物損失比ＰＬＲ１＝（Ａ_Ｂ１＋Ａ_ＩＣ１Ｄ）／（Ａ_{ｐｅａｋ１}＋Ａ_Ｂ１＋Ａ_ＩＣ１Ｄ）（シグナルは図７に図示せず）、またカラム２についてはＰＬＲ２＝（Ａ_Ｂ２＋Ａ_ＩＣ２Ｄ）／（Ａ_{ｐｅａｋ２}＋Ａ_Ｂ２＋Ａ_ＩＣ２Ｄ）を計算することによりそれぞれの溶出ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}と比較した。この場合、両実行ＩおよびＩＩについてＡ_ＩＣ１Ｄ＝Ａ_ＩＣ２Ｄ＝０であるので、式をＰＬＲ１＝Ａ_Ｂ１／（Ａ_{ｐｅａｋ１}＋Ａ_Ｂ１）およびＰＬＲ２＝Ａ_Ｂ２／（Ａ_{ｐｅａｋ２}＋Ａ_Ｂ２）へと容易にすることができる。次いで、平均生成物損失比をＰＬＲａｖｇ＝（ＰＬＲ１＋ＰＬＲ２）／２として計算した。４８ｇ／Ｌの負荷を用いる実行については、ＰＬＲ１は１４．５％であり、ＰＬＲ２は１１．４％であり、平均比ＰＬＲａｖｇは約１３％であり、顕著な生成物損失を示した。対応する生成物収率はＹ＝１００％−ＰＬＲａｖｇ＝８７％であった。対照的に、３０ｇ／Ｌの実行（実行ＩＩ）については、全生成物損失比はＡ_Ｂ１＝Ａ_Ｂ２＝０のためにゼロであり、結果として収率は１００％であった。

収率値は、オフラインＨＰＬＣプロテインＡ分析により、９０％（実行Ｉ）および１００％（実行ＩＩ）であることが確認され、これはオンライン面積評価により決定された値とよく一致している。提示した場合では、評価をＣｏｎｔｉｃｈｒｏｍ評価ソフトウェア（ＣｈｒｏｍａＣｏｎ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ）を使用した手動積分によりオンラインで行ったが、適当な積分アルゴリズムを使用して完全に自動化し、その後のサイクルのための制御動作を自動的に誘発することができる。

結果として、オンライン分析結果に基づいて、実行Ｉで、将来のサイクルで生成物損失を回避するために、負荷を適当な制御作用によって低減されるであろう。可能な制御作用には、それだけに限らないが、上にさらに記載するように非接続状態の供給流量の減少、相互接続状態の供給流量の減少、および相互接続状態持続時間の減少が含まれる。

個々のカラム容量および検出器較正に依存して、面積Ａ_Ｂ１およびＡ_Ｂ２Ｂが顕著に異なり得ることに注目すべきである。生成物損失の可能性が大きく、制御作用を要するかどうかを確実に推定するためには、面積Ａ_Ｂ１およびＡ_Ｂ２を、それぞれ対応するピーク面積Ａ_{ｐｅａｋ１}およびＡ_{ｐｅａｋ２}と共に視野に入れ、平均生成物損失比を両カラム／検出器に基づいて推定すべきである。同じことが面積Ａ_ＩＣ１ＤおよびＡ_ＩＣ２Ｄにも当てはまる。さらに、Ａ_Ｂ１およびＡ_Ｂ２がゼロである場合、Ａ_ＩＣ１ＤおよびＡ_ＩＣ２Ｄもゼロでなければならないことに注目すべきである（実行ＩＩの場合を参照）。
表８：ツインカラム逐次負荷クロマトグラフィープロセスの２つの運転点からのサイクル定常状態からのデータ。実行Ｉ：４８ｇ／Ｌ負荷、実行ＩＩ：３０ｇ／Ｌ負荷。決定した面積は、ＵＶ２について図７に示す面積に相当する。ＵＶ１についての面積も評価したが、明確性のために図７には示していない。２列はプロセスの非接続状態の供給流量を示している。

［実施例９］ツインカラム向流逐次負荷プロセスの最適化、低不純物シグナル
プロセス性能を最適化するためには、同一カラムを使用して同一の時間量で複数材料を処理するために実行の負荷を最大化することが望ましい。

以前の実施例では、生成物損失を同定するための適当な基準を詳細に説明してきた。基準はプロセスの最大負荷を定義するので、最適化として役立ち得る。基準に基づいて、プロセスの負荷を、生成物損失が起こり始めるちょうどその点まで増加させることができる。

最適化手順を示すために、内径０．５ｃｍおよび長さ５．０ｃｍの２本のカラムに負荷したプロテインＡアフィニティー固定相を使用して、清澄化細胞培養収穫物からＩｇＧモノクローナル抗体を捕獲するために、ツインカラム向流逐次負荷プロセスを実行した。

プロセスをスイスＣｈｒｏｍａＣｏｎ ＡＧ製のＣｏｎｔｉｃｈｒｏｍ Ｌａｂ−１０装置で表９に列挙するパラメータを用いて運転した。
表９：実施例９のツインカラム向流逐次負荷プロセスについての運転パラメータ。Ｑ_ｆｅｅｄは供給流量を示し、Ｑ_{ｂｕｆｆｅｒ}は他の全相の流量を示す；ｔはそれぞれ非接続相Ｂおよび相互接続相ＩＣのサブステップの持続時間である。Ｑ_ｆｅｅｄは２サイクル毎に増加した。最終溶出についてのパラメータは、供給流量（最終溶出工程中ゼロである）を除くＢパラメータに相当する。ＵＶ検出波長は３００ｎｍであった。

実行の間中、同一供給材料を使用した。相互接続状態の供給流量は１．０ｍＬ／分で実行の間中一定であった。

非接続状態の負荷流量を０．０ｍＬ／分から０．８２ｍＬ／分まで工程中全２サイクル後に増加させた（表１０、１列参照）。流量は２６ｇ／Ｌ〜４８ｇ／Ｌの負荷に相当する（表１０、２列参照）。実施例３に記載するように、カラム１については、面積Ａ_{ｐｅａｋ１}、Ａ_Ｂ１、Ａ_ＩＣ１Ｄを決定し（表１０、３〜５列参照）、カラム２については、面積Ａ_{ｐｅａｋ２}、Ａ_Ｂ２、Ａ_{ＩＣ１２Ｄ}を決定した（表１０、６〜８列参照）（注：２６ｇ／Ｌ負荷については、ＵＶ２の面積は決定しなかった）。

ＵＶ１およびＵＶ２から決定した面積から、平均生成物損失比ＰＬＲａｖｇおよび収率を計算した（表１０、９、１０列参照）。比較のために、収率をオフラインＨＰＬＣ分析により決定した（表１０、１１列参照）。生産性（表１０、１２列参照）を、オフライン分析値に基づいて、１サイクル中に生産された生成物の量をサイクルの持続時間および総カラム容積で除した値として計算した。

緩衝液消費（表１０、１３列参照）を、オフライン分析値に基づいて、精製した生成物１ｇ当たりの消費された緩衝液の量（Ｌ）として計算した。

表１０は、負荷が増加するとともに、生産性が顕著に増加し、緩衝液消費が減少することを示している。負荷が２６ｇ／Ｌから４３ｇ／Ｌまで増加すると（これは、６５％超の増加に相当する）、９７％超の収率で生成物回収が可能になる。４８ｇ／Ｌまで負荷をさらに増加させると、少なくとも１０％の顕著な生成物損失がもたらされ、結果として生成物収率は９０％未満になる。提示した場合では、５％を超える損失を許容できないとみなしたので、４３ｇ／Ｌの試験条件が、２６ｇ／Ｌの基準の場合より６５％高い生産性を有し、６５％超の緩衝液消費減少を有する最適負荷となった。オンラインおよびオフライン分析により決定したプロセス収率、ならびに生産性を、図８に負荷の関数として示す。

要約すると、提示した実施例は、負荷を連続的に増加させることにより、また潜在的生成物損失の位置に相当するシグナル曲線下の面積を監視および評価することにより、どのように逐次負荷プロセスを最適化することができるかを示している。

負荷増加制御作用の効果は、新たな制御作用の可能性をもたらす以下のサイクルで明らかになる。提示した実施例では、供給液濃度は一定であったが、供給液濃度が変化するまたはカラム容量がカラム間で異なる、および／またはカラム容量が減少している場合にも最適化法を適用することができる。本方法は、適当な積分アルゴリズムを使用して完全に自動化し、その後のサイクルのために制御作用を自動的に誘発することができる。好ましくは、プロセス最適化のための負荷増加のステップサイズは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用したＩｇＧ捕獲については５〜１０ｇ／Ｌの範囲にある。プロセスの負荷の連続的増加を通して、高収率に相当する運転空間を探索する。許容できない収率を有する運転点が見つかり次第、プロセス条件を、１００％収率に相当する以前の運転点に戻すべきである。所望であれば、より小さい増分で再度負荷を増加させることによりプロセス最適化を継続することができる、または最適化を継続しないことにより負荷安全マージンを残すことができる。

好ましくは、プロセス最適化を中間負荷に相当する点から開始する。しかしながら、ごくわずかなプロセス知識しかない場合、最適化開始点は、非接続相の０ｇ／Ｌ負荷に相当する運転パラメータにより定義される。
表１０：ツインカラム逐次負荷クロマトグラフィープロセスの最適化手順データ（実施例９）。１列は、プロセスの非接続状態の供給流量を示す；２列は負荷を示す；３〜５列はそれぞれ供給流量変化後の第２のサイクルで決定したＵＶ１の面積Ａ_{ｐｅａｋ１}、Ａ_Ｂ１、Ａ_ＩＣ１Ｄを示す；６〜８列は供給流量変化後の第２のサイクルで決定したＵＶ２の面積Ａ_{ｐｅａｋ２、}Ａ_Ｂ２、Ａ_ＩＣ２Ｄを示す；９列は平均生成物損失比ＰＬＲａｖｇを示す；１０列は実施例に記載する面積評価法によりオンラインで決定した収率を示す；１１列はＨＰＬＣオフライン分析を通して決定した収率を示す；１２列は生産性を示し、１３列はオフライン分析に基づく緩衝液消費を示す。

［実施例１０］プロセス制御、高不純物シグナル
本実施例は、不純物シグナルが大きく（図６参照）、全実行の間中目的の生成物濃度が変化する供給材料から生成物を捕獲するためのツインカラム向流逐次負荷プロセスの制御を記載する。

実施例５に示すように、Ａ_Ｂ１およびＡ_ＩＣ１ＤならびにＡ_Ｂ２およびＡ_ＩＣ２Ｄは不純物シグナルシグナルが大きいために測定することができない。

しかしながら、カラム容量がゆっくりとしか減少せず、負荷のための安全域が実施される頻繁に観察される場合では、ツインカラムの周期的向流プロセス中に損失する生成物がないと仮定することができる。安全マージンは、生成物濃度決定のためのオフライン分析を用いて決定することができる。したがって、実施例９を参照して、Ａ_Ｂ１およびＡ_ＩＣ１ＤならびにＡ_Ｂ２およびＡ_ＩＣ２Ｄはゼロであると仮定することができる。

記載する場合では、面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}は、例えば、供給液濃度の変化による、負荷に依存してのみ変化する。

結果として、ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}および少なくとも２サイクルにわたるその発展の比較のみに基づいて、プロセス性能を監視し、生成物プール中の目的の生成物の所望の濃度に相当する一定レベルのＡ_{ｐｅａｋｉ}を維持するために制御作用を導出することができる。

供給液濃度が一定のままである場合、ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}はサイクルにわたって一定のままであり（Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ}＝Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ−１}およびＡ_{ｐｅａｋ２、ｎ}＝Ａ_{ｐｅａｋ２、ｎ−１}）、制御作用を要しない。

供給液濃度が増加した場合、ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}はサイクルにわたって増加し（Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ}＞Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ−１}およびＡ_{ｐｅａｋ２、ｎ}＞Ａ_{ｐｅａｋ２、ｎ−１}）、ピーク面積が規格外になれば負荷を減少させる必要がある。

供給液濃度が減少した場合、ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}はサイクルにわたって減少し（Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ}＜Ａ_{ｐｅａｋ１、ｎ−１}およびＡ_{ｐｅａｋ２、ｎ}＜Ａ_{ｐｅａｋ２、ｎ−１}）、ピーク面積が規格外になれば負荷を増加させる必要がある。

制御作用は、非連続的サイクルまたはサイクルの部分の面積を比較することに基づいてもよい。

［実施例１１］ツインカラム向流逐次負荷プロセスの最適化、高不純物シグナル
本実施例は、不純物シグナルが大きく（図６参照）、全実行の間中、目的の生成物濃度が一定の供給材料から生成物を捕獲するためのツインカラム向流逐次負荷プロセスの最適化を記載する。最適化法を、実施例５に記載するような大きな不純物シグナルの存在をシミュレートするために、面積Ａ_Ｂ１、Ａ_ＩＣ１ＤおよびＡ_Ｂ２、Ａ_ＩＣ２Ｄの値を使用しないで、実施例９に示す実験データに基づいて記載する。

しかしながら、プロセス性能を最適化するためには、同一カラムを使用して同一の時間量でより多量の材料を処理するために負荷を最適化することが望ましい。

負荷の連続的増加は、カラム容量を超過すると、必然的に生成物損失をもたらす。不純物シグナルが大きいために、生成物損失を面積Ａ_Ｂ１、Ａ_ＩＣ１ＤおよびＡ_Ｂ２、Ａ_ＩＣ２Ｄそれぞれにより直接同定することはできない。

それにもかかわらず、異なる負荷を用いた運転点のピーク面積を評価すると、ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}にのみ基づくプロセス最適化が可能である。

プロセス最適化の出発点は、破過が存在しない負荷、すなわち、２本の逐次的なカラムの破過値よりはるかに小さい値に相当する相互接続状態中の負荷であって、非接続状態中にゼロの供給流量を有する負荷に相当する。出発負荷値は２６ｇ／Ｌに相当する（表１１、２列参照）。実施例９に記載するように、負荷をここで２サイクル毎に増加させ、面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}を、クロマトグラムを積分することにより決定した（表１１、３列（ＵＶ１）および６列（ＵＶ２））。それぞれ３つの負荷（２６ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌおよび３７ｇ／Ｌ）および２つの負荷（Ａｐｅａｋ２、３０ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ、第１の負荷からのピーク面積は測定しなかった）に相当するピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}を記録した後、面積値を負荷の関数としてプロットし、データを２つの直線であてはめた（図９参照）。ピーク面積Ａ_{ｐｅａｋ１}を直線であてはめることができたという事実は、２６ｇ／Ｌで出発して、追加の負荷生成物によりピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}の比例的増加がもたらされたこと、または換言すれば、負荷された全ての追加の生成物も吸着されること、および生成物損失が無視できることを示している。提示した場合では、２６ｇ／Ｌ〜３７ｇ／ＬのＡ_{ｐｅａｋ１}の線形相関はまた、２つの点のみ（３０ｇ／Ｌ、３７ｇ／Ｌ）を使用して決定したＡ_{ｐｅａｋ２}の線形相関を使用することを正当化した。ピーク面積と負荷との間の得られた線形相関を使用してより高い負荷についての予測ピーク面積を外挿した（表１１の４列（ＵＶ１）および７列（ＵＶ２））。負荷が増加したさらなる点を記録し、決定したピーク面積を、相関を用いて計算した予測ピーク面積と比較した。４３ｇ／Ｌおよび４８ｇ／Ｌ負荷で、測定面積は、相関を用いて予測した面積よりも小さかった。固定容量が限定されており、これは線形相関により考慮されていないので、より高い負荷で差の発生が予測される。予測と測定ピーク面積間の面積差（ＵＶデルタ）を表１１の５列（ＵＶ１）および８列（ＵＶ２）に示す。ここで、ＵＶデルタを各ＵＶについての対応する予測ピーク面積で除し、ＵＶ１およびＵＶ２の値の平均を作成することにより、平均生成物損失比（ＰＬＲ）を計算することができる。収率（オンライン、提示した最適化法により決定される、表１１の１０列参照）は、１００％−ＰＬＲにより、または２つの検出器の測定と予測ピーク面積の比の平均をとることにより計算することができる。比較のために、オフラインＨＰＬＣ分析を使用して決定した収率も示す（図９参照）。２つの収率（オンライン、オフライン）の比較は、ピーク面積のみの評価に基づいて選択された最適化法が、無視できる生成物損失に相当する負荷およびより大きい生成物損失に相当する負荷を同定することができたことを示している。提示した最適化法とオフライン分析の両方に基づいて、４８ｇ／Ｌ負荷を用いた運転点は許容できない生成物損失（＞５％）のために除外され、４３ｇ／Ｌに相当する運転点が選択されたであろう。実施例９に記載するように、４３ｇ／Ｌ負荷は、２６ｇ／Ｌ負荷の基準の場合よりも６５％大きい生産性に相当し、緩衝液消費の６５％減少に相当する。

Ａ_{ｐｅａｋｉ}のみに基づいて、２つのカラムの容量が異なるかどうか、または検出器が異なるシグナルの大きさを有するかどうかを決定することは不可能であることに注意すべきである。しかしながら、本方法に概説するように、Ａ_{ｐｅａｋｉ}測定を測定範囲の線形領域で、一定供給濃度で行い、各検出器からの３つ以上のピーク面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}間で比較を行う場合、両検出器較正およびカラム容量減少についての情報を得ることができる。

要約すると、提示した実施例は、負荷を変化させ、破過曲線下の面積を評価する必要なしにピーク面積のみを監視および評価することにより、どのように逐次負荷プロセスを最適化することができるかを示している。この方法については、カラム容量を超過したかどうかを決定するために、連続サイクルの情報を要する。本方法の利点は、不純物シグナルが検出器の測定範囲を超えている場合にも適用することができることである。顕著なカラム劣化が予測される時間枠にわたってプロセスを運転する場合、これまでの運転点に相当する性能データを動的に検証することが推奨される。この目的のために、負荷を一時的に変化させてもよい。

提示した両方の最適化法（実施例９および実施例１１）は、検出器較正を要しない。
表１１：ツインカラム逐次負荷クロマトグラフィープロセスの最適化手順データ（実施例１１）。１列はプロセスの非接続状態の供給流量を示す；２列は負荷を示す；３列はＵＶ１のクロマトグラムの積分により決定した面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}を示す；４列はＵＶ１について実施例および図９に記載する線形相関から推定される面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}を示す；５列はＵＶ１の４列および３列の２つの面積間の差を示す；６列はＵＶ２のクロマトグラムの積分により決定した面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}を示す；７列はＵＶ２について実施例および図９に記載する線形相関から推定される面積Ａ_{ｐｅａｋｉ}を示す；８列はＵＶ２の７列および６列の２つの面積間の差を示す；９列は平均生成物損失比ＰＬＲａｖｇを示す；１０列は実施例に記載する面積評価法によりオンラインで決定した収率を示す；１１列はＨＰＬＣオフライン分析を通して決定した収率を示す；１２列は生産性を示す；また１３列はオフライン分析に基づく緩衝液消費を示す。

Ｂ 逐次負荷プロセスの非接続状態または相（バッチ状態）
ＩＣ 逐次負荷プロセスのス相互接続状態または相
ｔ_Ｂ 逐次負荷プロセスの非接続状態の持続時間
ｔ_ＩＣ 逐次負荷プロセスの相互接続状態の持続時間
ｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ} 逐次負荷プロセスの起動相の持続時間
ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ} 逐次負荷プロセスの水洗相の持続時間
Ｑ_ｆｅｅｄ 供給流量、一般的
Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ} 第２の流量、逐次負荷プロセスの相互接続相中の供給流量
Ｑ_{ｗａｓｈ、ＩＣ} 逐次負荷プロセスの相互接続相中の洗い出し流量
Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ} 第１の流量、逐次負荷プロセスの非接続相中の供給流量
Ｑ_{ｆｅｅｄ、ｓｔａｒｔｕｐ} 逐次負荷プロセスの起動相中の供給流量
Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＢＴ１Ｌ} 最大の所望の供給流量より顕著に低い単一カラム運転についての供給流量
ＥＶ_１Ｈ、１ Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}について記録した単一カラム破過曲線に基づく低破過に相当する溶出容積
ＥＶ_１Ｌ、１ Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＢＴ１Ｌ}について記録した単一カラム破過曲線に基づく低破過に相当する溶出容積
ＥＶ_１Ｈ、Ｘ Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}について記録した単一カラム破過曲線に基づく高破過に相当する溶出容積
ＥＶ_２ 安全率Ｚを乗じた、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}について記録した逐次相互接続カラム破過曲線に基づく低破過に相当する溶出容積
ＥＶ_Ｙ ２つの値ＥＶ_１Ｈ、Ｘ、ＥＶ_２の小さい方
Ｘ 破過の大きさ、典型的には３０〜９０％
Ｗ Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＢＴ１Ｌ}とＱ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}の比、典型的には５０〜９０％
Ｚ 負荷のための安全率、典型的には６０〜９０％
Ｖ_ｄｅａｄ 死容積、１つのカラム中の介在液の容積
Ｖ_ｃｏｌ 空のカラム容積
ｃ_ｆｅｅｄ 供給液濃度
ＤＢＣ_１Ｈ（ＥＶ） 単一カラム破過曲線、溶出容積の関数として、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}で記録される
ＤＢＣ_２（ＥＶ） ２つの相互接続カラムの破過曲線、溶出容積の関数として、Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}で記録される
ｄＥＶ 積分のための溶出容積増分
ＴＬ 逐次負荷プロセスの非接続相の標的負荷値
ＰＬ 逐次負荷プロセスの相互接続相の事前負荷値
Ａ_ｐｅａｋ 溶出ピーク曲線と平衡化した空のカラムの値に相当する水平ベースラインまたは運転パラメータ変化の点などの他の基準により定義されるベースラインにより限局される面積
ｉ カラム指数、検出器指数
ｎ サイクル数
Ａ_Ｂｉ 破過曲線と非接続相Ｂ中に検出器ｉによりカラムｉの出口で測定された非吸着不純物のプラトーシグナル値に相当する水平ベースラインにより限局される面積
Ａ_ＩＣｉＵ 破過曲線と、カラムｉが上流位置にある場合に相互接続相ＩＣ中に検出器ｉによりカラムｉの出口で測定された非吸着不純物のプラトーシグナル値に相当する水平ベースラインにより限局される面積
Ａ_ＩＣｉＤ 破過曲線と、カラムｉが下流位置にある場合に相互接続相ＩＣ中に検出器ｉによりカラムｉの出口で測定された非吸着不純物のプラトーシグナル値に相当する水平ベースラインにより限局される面積
ＰＬＲ 生成物損失比

Claims (29)

1. ２本のクロマトカラム（１、２）を使用して、混合物から所望の生成物画分を単離するクロマトグラフィー精製法であって、
   前記精製法は、少なくとも１回行われる１サイクルにおいて、
   第１のバッチ工程（Ｂ１）、
   第１の相互接続工程（ＩＣ１）、
   第２のバッチ工程（Ｂ２）、及び
   第２の相互接続工程（ＩＣ２）を有し、
   前記第１のバッチ工程（Ｂ１）は、
   バッチ時間枠（ｔ_Ｂ）中、前記カラムが非接続であり、
   第１のカラム（１）に、第１の流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）で入り口から供給液が負荷され、その出口は廃棄に向けられており、
   第２のカラム（２）から、所望の生成物がその出口から回収され、その後第２のカラム（２）が再生される；
   前記第１の相互接続工程（ＩＣ１）は、
   相互接続時間枠（ｔ_ＩＣ）中、第１のカラム（１）の出口が第２のカラム（２）の入口と接続しており、
   第１のカラム（１）に第１の流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）以上の第２の流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）でその入口から供給液がその動的破過容量を超えて負荷され、
   第２のカラム（２）の出口が廃棄に向けられており、
   ０秒以上のその後の洗い出し時間枠（ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}）中、
   第１のカラム（１）の出口が第２のカラム（２）の入口と接続しており、
   第１のカラム（１）に供給材料を含まない溶媒および／または緩衝液が負荷され、
   第２のカラム（２）の出口が廃棄に向けられている；
   前記第２のバッチ工程（Ｂ２）は、
   第１のバッチ工程（Ｂ１）と類似であるが、カラムの位置が交換されており、第１のバッチ工程（Ｂ１）の第１のカラム（１）が第１のバッチ工程（Ｂ１）の第２のカラム（２）の作業を行い、第１のバッチ工程（Ｂ１）の第２のカラム（２）が第１のバッチ工程（Ｂ１）の第１のカラム（１）の作業を行い；
   前記第２の相互接続工程（ＩＣ２）は、
   第１の相互接続工程（ＩＣ１）と類似であるが、カラムの位置が交換されており、第１の相互接続工程（ＩＣ１）の上流カラム（１）が第２の相互接続工程（ＩＣ２）の下流カラムになり、第１の相互接続工程（ＩＣ１）の下流カラム（２）が第２の相互接続工程（ＩＣ２）の上流カラムになる；
   クロマトグラフィー精製法。
2. 相互接続工程（ＩＣ）おいて、第２の流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）が第１の流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）よりも大きい、請求項１に記載のクロマトグラフィー精製法。
3. 相互接続工程（ＩＣ）において、第２の流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）と相互接続時間枠（ｔ_ＩＣ）の少なくとも１つが、相互接続時間枠（ｔ_ＩＣ）の終わりで、上流カラムの出口での供給液濃度が上流カラムの入口での供給液濃度の３０〜９０％の範囲となるように設定される、ただし第２の流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）と相互接続時間枠（ｔ_ＩＣ）の少なくとも１つの値が、接続時間枠（ｔ_ＩＣ）の終わりで、下流カラムの出口での供給積濃度が０．２５〜５％の破過値より小さくなるようにする、請求項１または２に記載のクロマトグラフィー精製法。
4. バッチ時間枠（ｔ_Ｂ）が、それぞれのカラムの回収および再生に要する累積時間となるよう選択される、請求項１から３のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法。
5. カラムがアフィニティークロマトグラフィー物質充填カラムである、請求項１から４のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法。
6. 各カラムの出口に、出口で成分を分析するための検出器が配置される、請求項１から５のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法。
7. 最初のサイクルの前に、カラムが相互接続しており、前記サイクルの相互接続工程（ＩＣ）と比べて大量の供給溶液が上流カラムに負荷される起動工程が先行する、および／または
   最終サイクルの後に、２つのカラムが非接続であり、両カラムが生成物回収とカラム再生される停止工程が続く、請求項１から６のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法。
8. 所望の生成物が、化学反応生成物、化学分離生成物、生化学反応生成物、生物学的生成物の１つまたは混合である、請求項１から７のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法。
9. バッチ工程（Ｂ）のバッチ工程持続時間（ｔ_Ｂ）がそれぞれのカラムの回収および再生に要する累積時間になるよう設定され、バッチ工程（Ｂ）のそれぞれのカラムに適用されるバッチ工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）が、先行する工程で、このカラムがすでに事前負荷されたことを考慮して、バッチ工程持続時間（ｔ_Ｂ）の最後で、カラムの出口で、所望の生成物の溶出がないよう設定され、
   相互接続工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）が所望の値に設定され、相互接続工程持続時間（ｔ_ＩＣ）が、相互接続工程持続時間（ｔ_ＩＣ）の最後で、上流カラムの出口で、所望の生成物濃度がその入口での濃度の所望の範囲になるよう、ただし、下流カラムの出口で、所望の生成物の溶出がないよう設定され、
   バッチ工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）および相互接続工程持続時間（ｔ_ＩＣ）を決定するために、相互接続工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）を使用して単一カラムの少なくとも１つの破過曲線を記録および使用し、任意選択により、相互接続工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）を使用した相互接続カラムの少なくとも１つの破過曲線を記録および使用し、相互接続工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）よりも低い供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）を使用した単一カラムの少なくとも１つの破過曲線記録および使用する、
   請求項１から８のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法を設定する方法。
   
10. 以下の工程を行う、請求項９に記載のクロマトグラフィー精製法を設定する方法：
    （ａ）供給液を供給されていないカラムで行われる回収および再生工程の持続時間を合計することにより、非接続状態持続時間（ｔ_Ｂ）を計算する工程；
    （ｂ）２本の逐次カラムの動的破過曲線（ＤＢＣ_２）を測定し、所望の破過値に相当する溶出容積（ＥＶ）を決定することにより、相互接続状態の所望の最大供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）を使用して２本の相互接続カラムの溶出容積破過値（ＥＶ_２）を決定する工程；
    （ｃ）供給流速Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}を使用して単一カラムの溶出容積破過値を決定する工程であって、完全破過曲線（ＤＢＣ_１Ｈ）を記録し、任意選択により単一カラムの所望の低破過値に相当する溶出容積（ＥＶ_１Ｈ、１）を決定する工程；
    （ｄ）単一カラム負荷運転の所望の最大流量を使用して単一カラムの高負荷に相当するＸ％の破過溶出容積（ＥＶ_１Ｈ、Ｘ）を、工程（ｃ）で決定した破過曲線から決定する工程；
    （ｅ）工程（ｂ）の溶出容積破過値（ＥＶ_２）と工程（ｄ）の破過溶出容積値（ＥＶ_１Ｈ、Ｘ）の２つから小さい方（ＥＶ_Ｙ）を決定する工程；
    （ｆ）式１にしたがって、工程（ｅ）で決定された値の上限（ＥＶ_Ｙ）を用いて、単一カラムの較正済み破過曲線（ＤＢＣ_１Ｈ）（工程（ｃ）で決定される）と相互接続カラムの較正済み破過曲線（ＤＢＣ_２）（工程（ｂ）で決定される）の差を積分し、単一カラムのカラム容積で除することにより計算される前負荷値ＰＬを決定する工程であって、
    積分のためのより低い出発点としてゼロを使用することも可能な工程；
    

    

    （ｇ）低い供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ．ＢＴＩＬ}）を選択し、完全破過曲線（ＤＢＣ_１Ｌ）を記録し、所望の低破過値に相当する溶出容積を決定することにより、単一カラムの第２の破過値（ＥＶ_１Ｌ、１）を決定する工程；
    （ｈ）式２にしたがって、安全率を乗じた第２の破過値（Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１）を工程（ｅ）で決定した値（ＥＶ_Ｙ）から減じ、完全な項を相互接続状態の供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）で除することにより、相互接続状態切り替え時間（ｔ_ＩＣ）を決定する工程；
    ｔ_ＩＣ＝（ＥＶ_Ｙ−Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１）／Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ} （式２）
    （ｉ）式３にしたがって、死容積（Ｖ _ｄｅａｄ ）を、安全率Ｚを乗じた所望の破過に相当する溶出容積から減じ、差に供給液濃度値を乗じ、前記積をカラム容積で除し、ＰＬをこの値から減じることにより、単一カラムの２つの破過曲線（ＤＢＣ_１）および（ＤＢＣ_１Ｌ）から、標的負荷値（ＴＬ）を決定する工程；
    ＴＬ＝（（Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１−Ｖ_ｄｅａｄ）・ｃ_ｆｅｅｄ）／Ｖ_ｃｏｌ−ＰＬ （式３）
    （ｊ）標的負荷値（ＴＬ）にカラム容積を乗じ、供給液濃度で除し、非接続状態の持続時間（ｔ_Ｂ）で除することにより、式４にしたがって、非接続状態の供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）を決定する工程
    Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}＝（ＴＬ・Ｖ_ｃｏｌ）／ｃ_ｆｅｅｄ・ｔ_Ｂ） （式４）。
    
11. 以下の工程（ｋ），（ｌ）の少なくとも１つを行う、請求項９または１０に記載のクロマトグラフィー精製法を設定する方法。
    （ｋ）式５にしたがって、安全率を乗じた第２の破過値（Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１）と単一カラムの死容積（Ｖ_ｄｅａｄ）の差を供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）で除し、この値を相互接続工程の持続時間（ｔ_ＩＣ）に加えることにより、起動時間（ｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}）を決定する
    ｔ_{ｓｔａｒｔｕｐ}＝ｔ_ＩＣ＋（Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１−Ｖ_ｄｅａｄ）／Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}＝（ＥＶ_Ｙ−Ｖ_ｄｅａｄ）／Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ} （式５）
    （ｌ）式６にしたがって、少なくとも死容積（Ｖ_ｄｅａｄ）を、流量（Ｑ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}）で除し、相互接続相負荷工程に続く相互接続状態洗い出し工程の持続時間（ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}）を決定する
    ｔ_{ｗａｓｈ、ＩＣ}＝ｋ・Ｖ_ｄｅａｄ／Ｑ_{ｗａｓｈ、ＩＣ} （式６）
    （式中、ｋは１以上の有理数である）
12. 以下の工程を含む、請求項１から８のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法を制御および／または監視および／または最適化する方法であって、
    前記クロマトグラフィー精製法は相互接続状態と非接続状態で交互に運転される少なくとも２本のカラムを含み、前記カラムは相互接続状態と非接続状態の流れの後に位置を切り替え、各カラムの下流に、検出器を通過した際に所望の生成物および／または不純物を検出することができる検出器が配置される方法。
    （ａ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の非接続状態の生成物溶出位置において、全カラムの溶出物に相当する非接続面積（Ａ_{ｐｅａｋｉ}）を測定する工程；および／または
    （ｂ）カラム出口で検出器を使用して、少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の相互接続状態の上流位置および／または下流位置において、全カラムの溶出物に相当する相互接続面積（Ａ_ＩＣｉＵ）を測定する工程；および
    （ｃ）２つの検出器間の非接続面積（Ａ_{ｐｅａｋｉ}）を比較する工程；および／または
    （ｄ）２つの検出器間の相互接続面積（Ａ_ＩＣｉＵ）を比較する工程；および
    （ｅ）シグナルの大きさの差の程度を定量化するために、２つの検出器間で、工程（ｃ）の非接続面積（Ａ_{ｐｅａｋｉ}）の比較の値および工程（ｄ）の相互接続面積（Ａ_ＩＣｉＵ）の比較の値を比較し、少なくとも１つのプロセスパラメータの制御および／または監視および／または最適化のためにこの差を使用する工程
13. （ａ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の非接続状態の生成物溶出位置における全カラムの溶出物に相当する非接続面積（Ａ_{ｐｅａｋｉ}）を測定する工程；および
    （ｃ）少なくとも２つの検出器間の非接続面積（Ａ_{ｐｅａｋｉ}）を比較する工程；および
    （ｅ）シグナルの大きさの差の程度を定量化するために、工程（ｃ）の非接続面積（Ａ_{ｐｅａｋｉ}）の値を比較し、少なくとも１つのプロセスパラメータの制御および／または監視および／または最適化のためにこの差を使用する工程
    を含む、請求項１２に記載の方法。
14. （ｂ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の相互接続状態の上流位置および／または下流位置において、全カラムの溶出物に相当する相互接続面積（Ａ_ＩＣｉＵ）を測定する工程；および
    （ｄ）少なくとも２つの検出器間の相互接続面積（Ａ_ＩＣｉＵ）を比較する工程；および
    （ｅ）シグナルの大きさの差の程度を定量化するために、少なくとも２つの検出器間で、工程（ｄ）の相互接続面積（Ａ_ＩＣｉＵ）の比較の値を比較し、少なくとも１つのプロセスパラメータの制御および／または監視および／または最適化のためにこの差を使用する工程
    を含む、請求項１２に記載の方法。
15. 少なくとも２サイクルの検出器またはオフライン分析からのシグナルの微分および／または比に基づく数値評価に基づく、請求項１から１４のいずれかに記載の方法を自動的に設計および／または制御および／または監視および／または最適化するよう適合された、コンピュータプログラム。
    
16. 相互接続工程（ＩＣ）おいて、第２の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、ＩＣ} ）が第１の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、Ｂ} ）よりも少なくとも１０％大きい、請求項１に記載のクロマトグラフィー精製法。
17. 相互接続工程（ＩＣ）おいて、第２の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、ＩＣ} ）が第１の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、Ｂ} ）よりも少なくとも２５％大きい、請求項１に記載のクロマトグラフィー精製法。
18. 相互接続工程（ＩＣ）おいて、第２の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、ＩＣ} ）が第１の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、Ｂ} ）よりも第１の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、Ｂ} ）よりも１．５〜４．０倍大きい、請求項１に記載のクロマトグラフィー精製法。
19. 相互接続工程（ＩＣ）において、第２の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、ＩＣ} ）と相互接続時間枠（ｔ _ＩＣ ）の少なくとも１つが、相互接続時間枠（ｔ _ＩＣ ）の終わりで、上流カラムの出口での供給液濃度が上流カラムの入口での供給液濃度の３０〜９０％の範囲となるように設定される、ただし第２の流量（Ｑ _{ｆｅｅｄ、ＩＣ} ）と相互接続時間枠（ｔ _ＩＣ ）の少なくとも１つの値が、接続時間枠（ｔ _ＩＣ ）の終わりで、下流カラムの出口での供給積濃度が１〜２．５％の破過値より小さく、かつこの破過値に相当する溶出容積が６０〜９０％の範囲の安全率を乗じられる、請求項１または２に記載のクロマトグラフィー精製法。
20. 累積時間が、（ｉ）生成物が固定相から放出されない条件下で溶媒および／または緩衝液で洗い出す工程；（ｉｉ）生成物が固定相から放出される条件下で、溶媒および／または緩衝液で溶出させる工程；(ｉｉｉ) 溶媒および／または緩衝剤を用いて、固定相から全てを放出させる定置洗浄工程；（ｉｖ）その後のプロセス工程と類似または同一の条件下で溶媒および／または緩衝液を使用して平衡化する工程、に要する累積時間である、請求項４に記載のクロマトグラフィー精製法。
21. クロマトグラフィー固定相が、粒子、ビーズ、膜およびモノリスの少なくとも１つの形態である、請求項５に記載のクロマトグラフィー精製法。
22. 各カラムの検出器が同一型のものであり、これら検出器が、ＵＶ検出器、可視光検出器、ＩＲ検出器、蛍光検出器、光散乱検出器、屈折率検出器、ｐＨ検出器、導電率検出器、アットラインＨＰＬＣ分析、および質量分析検出器から選択される１つまたは組み合わせである、請求項６に記載のクロマトグラフィー精製法。
23. 最終サイクルの後に、２つのカラムが非接続であり、両カラムが生成物回収とカラム再生される停止工程が続く、請求項１から６のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法。
24. 前記所望の生成物が、天然生成物、金属、抗体、抗体断片、融合タンパク質、組換え糖タンパク質、血漿タンパク質、またはこれらの誘導体の１つまたは混合である、請求項８に記載のクロマトグラフィー精製法。
25. バッチ工程（Ｂ）のバッチ工程持続時間（ｔ_Ｂ）がそれぞれのカラムの回収および再生に要する累積時間になるよう設定され、バッチ工程（Ｂ）のそれぞれのカラムに適用されるバッチ工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）が、先行する工程で、このカラムがすでに事前負荷されたことを考慮して、バッチ工程持続時間（ｔ_Ｂ）の最後で、カラムの出口で、所望の生成物の溶出がないよう設定され、
    相互接続工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）が所望の値に設定され、相互接続工程持続時間（ｔ_ＩＣ）が、相互接続工程持続時間（ｔ_ＩＣ）の最後で、上流カラムの出口で、所望の生成物濃度がその入口での濃度の３０〜９０％の範囲になるよう、ただし、下流カラムの出口で、所望の生成物の溶出がないよう設定され、
    バッチ工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）および相互接続工程持続時間（ｔ_ＩＣ）を決定するために、相互接続工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）を使用して単一カラムの少なくとも１つの破過曲線を記録および使用し、任意選択により、相互接続工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）を使用した相互接続カラムの少なくとも１つの破過曲線を記録および使用し、相互接続工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）よりも低い供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）を使用した単一カラムの少なくとも１つの破過曲線記録および使用し、この破過曲線を決定するためのより低いバッチ工程供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）が相互接続工程供給流速（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）の５０〜９０％となるよう選択される、
    請求項１から８のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法を設定する方法。
    
26. 以下の順序で以下の工程を行う、請求項９に記載のクロマトグラフィー精製法を設定する方法：
    （ａ）供給液を供給されていないカラムで行われる回収および再生工程の持続時間を合計することにより、非接続状態持続時間（ｔ_Ｂ）を計算する工程；
    （ｂ）２本の逐次カラムの動的破過曲線（ＤＢＣ_２）を測定し、供給濃度に対して１％破過〜最大５％破過に相当する溶出容積（ＥＶ）を決定して、任意選択により０．５〜１．０の間の範囲の安全率を乗じるることにより、相互接続状態の所望の最大供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）を使用して２本の相互接続カラムの溶出容積破過値（ＥＶ_２）を決定する工程；
    （ｃ）供給流速Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}を使用して単一カラムの溶出容積破過値を決定する工程であって、完全破過曲線（ＤＢＣ_１Ｈ）を記録し、任意選択により、単一カラムの、供給濃度に対して１％の破過に相当する溶出容積（ＥＶ_１Ｈ、１）を決定する工程；
    （ｄ）単一カラム負荷運転の所望の最大流量を使用して単一カラムの高負荷に相当するＸ％（Ｘは、典型的には５０〜９０％の間の数である）の破過溶出容積（ＥＶ_１Ｈ、Ｘ）を、工程（ｃ）で決定した破過曲線から決定する工程；
    （ｅ）工程（ｂ）の溶出容積破過値（ＥＶ_２）と工程（ｄ）の破過溶出容積値（ＥＶ_１Ｈ、Ｘ）の２つから小さい方（ＥＶ_Ｙ）を決定する工程；
    （ｆ）式１にしたがって、工程（ｅ）で決定された値の上限（ＥＶ_Ｙ）を用いて、単一カラムの較正済み破過曲線（ＤＢＣ_１Ｈ）（工程（ｃ）で決定される）と相互接続カラムの較正済み破過曲線（ＤＢＣ_２）（工程（ｂ）で決定される）の差を積分し、単一カラムのカラム容積で除することにより計算される前負荷値ＰＬを決定する工程であって、
    積分のためのより低い出発点としてゼロを使用することも可能な工程；
    

    

    （ｇ）工程（ｃ）で使用した供給流量の５０〜９０％の供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ．ＢＴＩＬ}）を選択し、完全破過曲線（ＤＢＣ_１Ｌ）を記録し、供給液濃度に対して１％の破過に相当する溶出容積を決定し、より高流量で単一カラム破過値の決定と同一値を選択することにより、単一カラムの第２の破過値（ＥＶ_１Ｌ、１）を決定する工程；
    （ｈ）式２にしたがって、安全率を乗じた第２の破過値（Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１）を工程（ｅ）で決定した値（ＥＶ_Ｙ）から減じ、完全な項を相互接続状態の供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ}）で除することにより、相互接続状態切り替え時間（ｔ_ＩＣ）を決定する工程；
    ｔ_ＩＣ＝（ＥＶ_Ｙ−Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１）／Ｑ_{ｆｅｅｄ、ＩＣ} （式２）
    （ｉ）式３にしたがって、死容積（Ｖ _ｄｅａｄ ）を、安全率Ｚを乗じた１％の破過に相当する溶出容積から減じ、差に供給液濃度値を乗じ、前記積をカラム容積で除し、ＰＬをこの値から減じることにより、単一カラムの２つの破過曲線（ＤＢＣ_１）および（ＤＢＣ_１Ｌ）から、標的負荷値（ＴＬ）を決定する工程；
    ＴＬ＝（（Ｚ％・ＥＶ_１Ｌ、１−Ｖ_ｄｅａｄ）・ｃ_ｆｅｅｄ）／Ｖ_ｃｏｌ−ＰＬ （式３）
    （ｊ）標的負荷値（ＴＬ）にカラム容積を乗じ、供給液濃度で除し、非接続状態の持続時間（ｔ_Ｂ）で除することにより、式４にしたがって、非接続状態の供給流量（Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}）を決定する工程
    Ｑ_{ｆｅｅｄ、Ｂ}＝（ＴＬ・Ｖ_ｃｏｌ）／ｃ_ｆｅｅｄ・ｔ_Ｂ） （式４）。
    
27. 以下の工程を含む、請求項１から８のいずれかに記載のクロマトグラフィー精製法を制御および／または監視および／または最適化する方法であって、
    前記クロマトグラフィー精製法は相互接続状態と非接続状態で交互に運転される少なくとも２本のカラムを含み、前記カラムは相互接続状態と非接続状態の流れの後に位置を切り替え、各カラムの下流に、検出器を通過した際に所望の生成物および／または不純物を検出することができる検出器が配置される方法。
    （ａ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の非接続状態の生成物溶出位置において、全カラムの溶出物に相当する非接続面積（Ａ _{ｐｅａｋｉ} ）を測定する工程；および／または
    （ｂ）カラム出口で検出器を使用して、少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の相互接続状態の上流位置および／または下流位置において、全カラムの溶出物に相当する相互接続面積（Ａ _ＩＣｉＵ ）を測定する工程；および
    （ｃ）検出器の非接続面積（Ａ _{ｐｅａｋｉ} ）間の比を計算することにより、２つの検出器間の非接続面積（Ａ _{ｐｅａｋｉ} ）を比較する工程；および／または
    （ｄ）検出器の相互接続面積（Ａ _ＩＣｉＵ ）間の比を計算することにより、少なくとも２つの検出器間の相互接続面積（Ａ _ＩＣｉＵ ）を比較する工程；および
    （ｅ）シグナルの大きさの差の程度を定量化するために、少なくとも２つの検出器間で、工程（ｃ）の非接続面積（Ａ _{ｐｅａｋｉ} ）の比較の値および工程（ｄ）の相互接続面積（Ａ _ＩＣｉＵ ）の比較の値を比較し、少なくとも１つのプロセスパラメータの制御および／または監視および／または最適化のためにこの差を使用する工程
28. （ａ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の非接続状態の生成物溶出位置における全カラムの溶出物に相当する非接続面積（Ａ _{ｐｅａｋｉ} ）を測定する工程；および
    （ｃ）検出器の非接続面積（Ａ _{ｐｅａｋｉ} ）間の比を計算することにより、少なくとも２つの検出器間の非接続面積（Ａ _{ｐｅａｋｉ} ）を比較する工程；および
    （ｅ）シグナルの大きさの差の程度を定量化するために、工程（ｃ）の非接続面積（Ａ _{ｐｅａｋｉ} ）の値を比較し、少なくとも１つのプロセスパラメータの制御および／または監視および／または最適化のためにこの差を使用する工程
    を含む、請求項１２に記載のクロマトグラフィープロセスを制御および／または監視および／または最適化する方法。
29. （ｂ）カラム出口で検出器を使用して少なくとも１サイクルまたは１サイクルの一部の相互接続状態の上流位置および／または下流位置において、全カラムの溶出物に相当する相互接続面積（Ａ _ＩＣｉＵ ）を測定する工程；および
    （ｄ）検出器の相互接続面積（Ａ _ＩＣｉＵ ）間の比を計算することにより、少なくとも２つの検出器間の相互接続面積（Ａ _ＩＣｉＵ ）を比較する工程；および
    （ｅ）シグナルの大きさの差の程度を定量化するために、少なくとも２つの検出器間で、工程（ｄ）の相互接続面積（Ａ _ＩＣｉＵ ）の比較の値を比較し、少なくとも１つのプロセスパラメータの制御および／または監視および／または最適化のためにこの差を使用する工程
    を含む、請求項１２に記載のクロマトグラフィープロセスを制御および／または監視および／または最適化する方法。

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